PL B1. UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI, Kraków, PL BUP 05/14. TOMASZ GOSIEWSKI, Kraków, PL MONIKA BRZYCHCZY-WŁOCH, Kraków, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) C07H 21/04 ( ) C12N 15/10 ( ) C07K 11/00 ( ) (54) Sposób izolowania DNA drobnoustrojów z krwi (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 05/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/15 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET JAGIELLOŃSKI, Kraków, PL (72) Twórca(y) wynalazku: TOMASZ GOSIEWSKI, Kraków, PL MONIKA BRZYCHCZY-WŁOCH, Kraków, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Grażyna Padée

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania DNA drobnoustrojów z krwi, mający na celu uzyskanie wysokiej jakości matrycy do reakcji amplifikacji DNA. Mikrobiologiczna diagnostyka krwi jest jednym z najbardziej problematycznych wyzwań diagnostycznych. Obecność we krwi bakterii (bakteriemia) lub grzybów (fungemia) bardzo często skutkuje sepsą, czyli ogólnoustrojowym stanem zapalnym wywołanym zakażeniem. Sepsa stanowi jeden z najbardziej palących problemów współczesnej medycyny. Śmiertelność powodowana przez zakażenia krwi o etiologii bakteryjnej czy grzybiczej jest bardzo duża także w naszym kraju [Martin G.S., Mannino D.M., i Moss M., The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through N Engl J Med, : str ; Zieliński A. i Czarkowski M.P., Choroby zakaźne w Polsce w 2005 roku. Przegl Epidemiol, : str ]. Lever i wsp. donoszą, że w USA w ciągu roku na sepsę zapada osób i jest ona przyczyną ponad zgonów [Lever A. i M. I., Sepsis: definition, epidemiology and diagnosis. Clinic Rev, (27): str ]. W Unii Europejskiej z powodu ciężkiej sepsy umiera rocznie 146 tys. chorych, w samej tylko Wielkiej Brytanii śmiertelność z jej powodu waha się w przedziale 30 do 50/ w ciągu roku, co plasuje ją w czołówce dziesięciu najczęstszych przyczyn śmierci [Zieliński A. i Czarkowski M.P., 2007]. W krajach rozwiniętych u 2-4/1000 żywo urodzonych dzieci rozwija się sepsa i jest ona główną przyczyną ich śmierci [Baltimore R.S., Neonatal sepsis: epidemiology and managment. Paediatr Drugs, (11): str ; Watson R.S. i Carcillo J.A., Scope and epidemiology of pediatric sepsis. Pediatr Crit Care Med, (3): str. 3-5]. W Polsce brak jest dokładnych danych epidemiologicznych, ale Zieliński i wsp. podają że w 2005 roku z powodu sepsy nastąpiło 967 zgonów w tym 43 zgony dzieci. W leczeniu zakażeń krwi najważniejszym i najtrudniejszym problemem decydującym o skuteczności terapii i, w konsekwencji, o kosztach i czasie hospitalizacji jest skuteczna diagnostyka czynników wywołujących ogólnoustrojową odpowiedź zapalną w przebiegu sepsy. Oznaczenie czynnika etiologicznego pozwala na zastosowanie skutecznej, celowanej antybiotykoterapii. Materiałem poddawanym badaniu diagnostycznemu jest krew pobrana od pacjenta manifestującego objawy kliniczne sepsy. Do tej pory tzw. złotym standardem diagnostycznym są hodowle krwi prowadzone na specjalnych podłożach, najlepiej w systemach hodowli automatycznej. Do zalet tejh metody należy ich prostota oraz względnie niski koszt wykonania badania. Słabą stroną metody opartej na hodowli krwi jest jej czasochłonność, sięgająca nawet 5 dni (do czasu wydania wyniku badania) oraz niska czułość, która powoduje, że jedynie w ok % hodowli udaje się uzyskać wzrost mikroorganizmów [Jamal W. i in., Comparative evaluation of BacT/ALERT 3D and BACTEC systems for the recovery of pathogens causing bloodstream infections. Med Princ Pract, (3): str ]. Aby zwiększyć szansę na wykrycie czynników mikrobiologicznych we krwi podejmowane są próby oparcia ich detekcji na metodach genetycznych. Czułość metod molekularnych znacznie przewyższa czułość metody hodowlanej, poza tym wcześniejsze zastosowanie antybiotykoterapii nie wpływa na wynik badania z uwagi na to, że nie ma potrzeby uzyskania wzrostu bakterii czy grzybów na podłożu hodowlanym, a jedynie wykrycie ich sekwencji DNA czy RNA [Klouche M. i Schroder U., Rapid methods for diagnosis of bloodstream infections. Clin Chem Lab Med, (7): str ]. Klasyczna metoda izolacji DNA z komórek polega na tym, że materiał wyjściowy roztwarza się w warunkach denaturujących i redukujących, często stosując jednocześnie enzymy rozkładające proteiny, a następnie frakcje kwasów nukleinowych oczyszcza się na drodze ekstrakcji fenolowo- -chloroformowej i wydziela się je z wodnej fazy za pomocą dializy lub strącania alkoholem (Sambrock J., Fritsch E.F., Manitias T, 1989, CSH, Molecular Cloning ). Metoda ta jest jednak pracochłonna i czasochłonna, a ponadto wymaga stosowania rozpuszczalników organicznych, szczególnie toksycznego fenolu. Sposób zaproponowany w opisie patentowym US przewiduje izolowanie DNA bez użycia toksycznych rozpuszczalników. Zgodnie z tym sposobem w mieszaninie antykoagulanta i środka utrwalającego zawiesza się próbkę krwi, kontaktuje się tę próbkę z buforem realizującym lizę erytrocytów, następnie z buforem realizującym lizę jąder komórkowych, a w kolejnym kroku - z proteinazą K oraz z alkoholem. Bufor lizy erytrocytów zawiera chlorek amonu, diwęglan amonu i związek chelatujący, taki jak EDTA. Również w opisie zgłoszenia patentowego WO zaprezentowano metodę, w której unika się stosowania toksycznych rozpuszczalników, a także soli chaotropowych. Zgodnie z tym wy-

3 PL B1 3 nalazkiem przeprowadza się lizę czerwonych ciałek krwi, po czym usuwa się z mieszaniny białe ciałka krwi, przepłukuje się je i poddaje lizie, a następnie z mieszaniny wytrąca się białka. Wszystkie wyżej wymienione etapy prowadzi się z użyciem wodnych roztworów. Roztwór wykorzystywany do lizy erytrocytów składa się z chlorku amonu, diwęglanu sodu i EDTA. Roztwór wykorzystywany do lizy leukocytów zawiera środek powierzchniowo czynny, taki jak laurylosulfonian sodowy. Roztwór wykorzystywany do strącania białek zawiera sól organiczną, taką jak octan amonu. Opisane wyżej metody są przeznaczone do izolacji DNA eukariotycznego np. z leukocytów, ale nie są skuteczne w przypadku grzybów, ze względu na posiadanie przez nie ściany komórkowej o odmiennym składzie chemicznym. Analogiczny sposób izolacji DNA grzybów został przedstawiony w opisie zgłoszenia patentowego US Sposób ten realizuje się w następujących po sobie etapach: dezintegracji komórek krwi, izolacji nienaruszonych komórek grzybów, dezintegracji wyizolowanych komórek grzybów, izolacji DNA grzybów. Wstępną dezintegrację erytrocytów przeprowadza się przez osmotyczną hemolizę, a leukocytów przez enzymatyczne trawienie. Dezintegrację komórek grzybów przeprowadza się na drodze lizy alkalicznej i podziałania enzymem. Izolację DNA grzybów realizuje się przez wytrącenie białek za pomocą octanu potasu i następnie wytrącenie DNA z nadsączu za pomocą zimnego izopropanolu. Uzyskane tą metodą DNA nadaje się do amplifikacji, z wykorzystaniem metody PCR. Niestety, metody biologii molekularnej napotykają trudności podczas prowadzenia diagnostyki mikrobiologicznej krwi. Trudność sprawia wyizolowanie odpowiedniej jakości matrycy DNA, gdzie konieczne jest otrzymanie jego możliwie najwyższego stężenia. Bakterie oraz grzyby, które mogą być czynnikami indukującymi sepsę, charakteryzują się zróżnicowaną podatnością na lizę komórek i co za tym idzie, możliwością pozyskania z nich DNA. W przypadku bakterii możemy wyróżnić Gram ujemne oraz Gram dodatnie - jest to związane z budową ich ściany komórkowej. Ściana bakterii Gram dodatnich jest grubsza i oporna na degradację, co powoduje konieczność zastosowania specjalnej lizy enzymatycznej (lizozym, mutanolizyna i/lub lizostafina), aby możliwe było uwolnienie zawartości wewnątrzkomórkowej. Ściana komórkowa grzybów posiada zupełnie odmienny skład chemiczny niż bakteryjna, zatem standardowe postępowanie stosowane w przypadku bakterii zawodzi. Ponadto grzyby drożdżopodobne mają zupełnie inną budowę ściany komórkowej niż grzyby pleśniowe, co znacznie komplikuje proces izolacji DNA. Dodatkową trudność sprawia to, że krew w swoim składzie zawiera hem, który jest bardzo silnym inhibitorem enzymów polimeraz DNA używanych w metodzie PCR [Abu A1 - Soud P. i Randstrom P., Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells. J Clinic Microbiol, (2): str ]. Większość dostępnych procedur preparatyki krwi nie pozwala na pozbycie się efektu inhibicji polimeraz, co w konsekwencji prowadzi do uzyskania wyniku fałszywie negatywnego [Akane A., Matsubara K., i Nakamura H., Identification of the heme compound copurified with deoxyribonucleic acid (DNA) from bloodstains a major inhibitor of polymerase chain reaction amplification. J Forensic Sci, : str ]. Hem powoduje oddysocjowywanie DNA od polimerazy (rozpad kompleksu enzym - substrat), a także blokuje kieszeń katalityczną enzymu. W literaturze można odnaleźć doniesienia na temat różnego rodzaju preparatyki próbek, aby wyeliminować efekt inhibicji PCR. Zazwyczaj są to sposoby polegające na bardzo dokładnym przepłukiwaniu próbek czy też ich rozcieńczaniu lub dodawaniu do mieszaniny reakcyjnej np. albuminy wołowej (BSA), glicerolu czy dekstranu, które stanowią dla inhibitorów dodatkowy cel i zmniejszają ich oddziaływanie na polimerazę DNA [Kreader C., Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein. Appl. Environ. Microbiol, : str ; Rådström P., Abu A1 - Soud P., i Lantz P., A sample preparation method which facilitates detection of bacteria in blood cultures by the polymerase chain reaction. J Microbiol Methods : str ; Michael D., i in., Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. J Microbiol Methods, : str ]. Takie działania powodują jednak zmniejszenie czułości metody PCR, a co za tym idzie jej niniejszą skuteczność diagnostyczną. Istnieje także możliwość dobrania konkretnego enzymu polimerazy z szeregu termostabilnych polimeraz DNA stosowanych w PCR (Taq, Pwo, Pfu, Tfl i in.) o różnej wrażliwości na działanie inhibitorów [Abu A1 - Soud P., i Lantz P., 1998]. W literaturze naukowej oraz patentowej brakuje opisu metody izolacji DNA z krwi skutecznej zarówno w przypadku bakterii, jak i grzybów. Wszystkie opisy sprowadzają się albo tylko do izolacji DNA eukariotycznego z leukocytów lub też osobno z bakterii albo z grzybów [Chiba N., Murayama S. Y., Morozumi M., Nakayama E., Okada T., Iwata S., Sunakawa K., Ubukata K., Rapid detection of eight

4 4 PL B1 causative pathogens for the diagnosis of bacterial meningitis by real-time PCR. J Infect Chemother, : str ; Sugita S., Kamoi K., Ogawa M., Watanabe K., Shimizu N., Mochizuki M., Detection of Candida and Aspergillus species DNA using broad-range real-time PCR for fungal endophthalmitis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, : str ; Badiee P. and Alborzi A., Detection of Aspergillus species in bone marrow transplant patients. J Infect Dev Ctries : str ]. Na rynku funkcjonuje od kilku lat produkt Roche SeptiFast Lys Kit wraz z urządzeniem MagNA- Lyser, którego zasada działania opiera się prawdopodobnie na mechanicznej degradacji komórek i następnie na oczyszczeniu DNA z białek przy pomocy enzymu proteazy. Poddane lizie próbki są inkubowane w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do lizy. Po dodaniu buforu wiążącego mieszanina jest przenoszona do kolumny wirującej z zawierającym włókno szklane wkładem filtrującym. Ludzki genomowy DNA i bakteryjny/grzybiczy docelowy DNA wiążą się z powierzchnią włókna szklanego. Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego, zostają usunięte w dwóch etapach przepłukiwania. Po zakończeniu przepłukiwania zaadsorbowane kwasy nukleinowe ulegają wymywaniu w podwyższonej temperaturze. Eluaty są poddawane analizie PCR. Bufor lizujący i bufor wiążący mają taki sam skład i zawierają tiocyjanian guanidyny, Tris-HCl (chlorowodorek tri(hydroksymetylo)aminometanu) oraz niejonowy surfaktant - eter polimeru glikolu polietylenowego (PEG) i p-t-oktylofenolu (Triton X-100). Jako enzym stosuje się proteinazę K. Sposób według wynalazku jest rozwiązaniem umożliwiającym jednoczesne izolowanie DNA drobnoustrojów z krwi. W sposobie izolowanie DNA realizuje się na drodze kompilacji lizy enzymatycznej, lizy mechanicznej oraz termicznej. Takie podejście umożliwia uzyskanie DNA ze wszystkich typów drobnoustrojów, bez względu na budowę ich komórek. Sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy: a) do próbki pełnej krwi dodaje się wodny roztwór chlorku amonu o stężeniu 0,10-0,25 M, w proporcji 1:3-6 w stosunku do objętości próbki krwi, próbkę inkubuje się w temperaturze od 35 C do 40 C, w czasie od 15 minut do 30 minut, następnie poddaje się ją wirowaniu i usuwa się nadsącz; b1) ewentualnie osad otrzymany w etapie (a) zawiesza się w roztworze lizozymu, o stężeniu od 2 mg/ml do 5 mg/ml i lizostafiny o stężeniu od 0,2 mg/ml do 0,5 mg/ml, w buforze PBS, zawiesinę poddaje się wirowaniu lub wytrząsaniu i usuwa się nadsącz; c) materiał otrzymany w etapie (a) lub (b1) poddaje się dezintegracji mechanicznej; b2) w przypadku przeprowadzenia etapu (b1) materiał inkubuje się w temperaturze od 35 C do 39 C, w czasie od 20 minut do 50 minut, po czym d) dodaje się roztwór NaOH lub KOH o stężeniu od 0,65 mm do 0,8 mm, w proporcji od 1:1 do 1:3 w stosunku do objętości materiału z etapu c), materiał inkubuje się w temperaturze od 80 C do 95 C, w czasie od 5 minut do 10 minut, zawiesinę poddaje się wirowaniu i usuwa się nadsącz; dodaje się bufor o ph około 7,5, zawierający Tris HCL, EDTA i -merkaptoetanol, oraz litykazę o aktywności enzymatycznej od 30 U do 50 U, próbkę inkubuje się w temperaturze od 35 C do 39 C, w czasie od 20 minut do 50 minut, i/albo e) zawiesinę poddaje się wirowaniu i usuwa się nadsącz. Etap dezintegracji mechanicznej (czyli etap c) korzystnie prowadzi się z wykorzystaniem szklanych kulek. W etapie (d) korzystnie stosuje się bufor składający się z 50 mm Tris HCL, 10 mm EDTA, 28 mm -merkaptoetanolu. Otrzymany sposobem według wynalazku osad traktuje się zgodnie z wytycznymi producenta zestawu do izolacji DNA. Zwykle jest to liza przy pomocy proteinazy K i następnie nałożenie na kolumny do izolacji DNA, gdzie odpłukuje się zanieczyszczenia. W sposobie według wynalazku wstępne potraktowanie próbki krwi chlorkiem amonu (etap a) zapewnia rozbijanie (hemolizę) erytrocytów, co powoduje uwalnianie hemoglobiny i następnie jej odseparowanie wraz z nadsączem. W dalszych etapach hem jest obecny w śladowych ilościach, natomiast obecne w próbce pozostałości erytrocytów nie są przeszkodą w skutecznej izolacji DNA. Po usunięciu hemu do próbki wprowadza się enzymy degradujące ściany komórkowe bakterii Gram dodatnich: lizozym i lizostafinę. Przed inkubacją próbki z enzymami przeprowadza się mechaniczną lizę, uzyskując dodatkowe naruszenie ścian komórkowych zarówno bakterii, jak i grzybów. W etapie (d)

5 PL B1 5 dodatek NaOH lub KOH rozluźnia ściany komórkowe grzybów w wysokiej temperaturze, litykaza trawi ściany komórkowe grzybów, a merkaptoetanol działa degradująco na białka wspomagając działanie litykazy w przypadku trawienia ścian grzybów. Osad zawierający strawione komórki drobnoustrojów i leukocytów odseparowuje się w etapie (e). Uzyskany osad jest mieszaniną kwasów nukleinowych z białkami. Produkt ten może być poddany obróbce dowolnym zestawem do izolacji DNA, polegającej na strawieniu i usunięciu białek z preparatu i oznaczeniu kwasów nukleinowych. Sposób według wynalazku może być stosowany w pełnej wersji, w wyniku której izoluje się DNA bakterii i grzybów, jak również w wariantach ograniczonych, w celu uzyskania DNA tylko bakterii lub tylko grzybów. W wyniku zastosowania opracowanej metodyki preparatyki krwi otrzymuje się materiał, z którego można wyizolować wysokooczyszczone DNA wszystkich drobnoustrojów przy pomocy komercyjnych zestawów do izolacji DNA. Otrzymywane izolaty DNA są tak dobrze oczyszczone z hemu, iż nie ma potrzeby stosowania dodatkowych substancji mających działanie ochronne wobec enzymu polimerazy DNA wykorzystywanego w późniejszej reakcji amplifikacji. Dodatkową zaletą wynalazku jest to, że próbki krwi poddane procesowi według wynalazku mogą być oczyszczane z użyciem dowolnego, komercyjnie dostępnego zestawu do izolacji DNA, podczas gdy zazwyczaj określony zestaw do izolowania DNA pozwala na uzyskanie DNA tylko bakterii albo grzybów albo leukocytów. Próby wykorzystania gotowych zestawów bez wstępnej preparatyki krwi, która jest przedmiotem zgłoszenia patentowego, skutkowały otrzymaniem DNA wysoko zanieczyszczonego hemem oraz uniemożliwiały uzyskanie kwasów nukleinowych z komórek grzybów. Próbki bez wstępnego przygotowania sposobem według wynalazku oraz po takim przygotowaniu poddano dalszej obróbce z wykorzystaniem pięciu gotowych, dostępnych na rynku zestawów do izolacji DNA (oznaczonych dalej literami A, B, C, D, E). W przypadku najbardziej przydatnego zestawu A uzyskano czułość oznaczenia drobnoustrojów we krwi na poziomie: E. coli CFU/ml; S. aureus - 3x10 2 CFU/ml; C. albicans - 4x10 2 CFU/ml; Aspergillus spp. 1,2x10 2 CFU/ml. Wyniki oznaczeń na przykładzie pięciu komercyjnych zestawów do izolacji DNA przedstawiono na rysunku, na którym: Fig. 1 przedstawia stopień oczyszczenia izolatów DNA z hemu w wyniku zastosowania wstępnego przygotowania próbek krwi sposobem według wynalazku oraz bez takiego wstępnego przygotowania. Fig. 2 przedstawia wartości uzyskanego w wyniku przeprowadzonej reakcji PCR parametru C(t) - numer cyklu reakcji w którym zarejestrowany liniowy przyrost produktu amplifikacji przeciął ustaloną arbitralnie linię bazową (na poziomie 30 jednostek fluorescencji), dla DNA Staphylococcus aureus, przy zastosowaniu wstępnego przygotowania próbek krwi sposobem według wynalazku. Fig. 3 przedstawia wartości uzyskanego w wyniku przeprowadzonej reakcji PCR parametru C(t) - numer cyklu reakcji w którym zarejestrowany liniowy przyrost produktu amplifikacji przeciął ustaloną arbitralnie linię bazową (na poziomie 30 jednostek fluorescencji), dla DNA Escherichia coli, przy zastosowaniu wstępnego przygotowania próbek krwi sposobem według wynalazku. Fig. 4 przedstawia wartości uzyskanego w wyniku przeprowadzonej reakcji PCR parametru C(t) - numer cyklu reakcji w którym zarejestrowany liniowy przyrost produktu amplifikacji przeciął ustaloną arbitralnie linię bazową (na poziomie 30 jednostek fluorescencji), dla DNA Candida albicans, przy zastosowaniu wstępnego przygotowania próbek krwi sposobem według wynalazku. Fig. 5 przedstawia wartości uzyskanego w wyniku przeprowadzonej reakcji PCR parametru C(t) - numer cyklu reakcji w którym zarejestrowany liniowy przyrost produktu amplifikacji przeciął ustaloną arbitralnie linię bazową (na poziomie 30 jednostek fluorescencji), dla DNA Aspergillus spp., przy zastosowaniu wstępnego przygotowania próbek krwi sposobem według wynalazku. Sposób według wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach. P r z y k ł a d 1 Izolacja DNA dowolnego gatunku drobnoustroju z krwi: 1. 1,5 ml pełnej krwi dodać do 6 ml 0,17 M chlorku amonu, 2. Próbki inkubować w temperaturze 37 C przez 20 minut, 3. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut, 4. Wylać nadsącz, 5. Osad zawiesić w 100 l roztworu lizozymu (2 mg/ml) i lizostafiny (0,2 mg/ml) w buforze PBS, 6. Próbki przenieść do probówek z kulkami szklanymi m i poddać dezintegracji mechanicznej przez 20 sekund, z prędkością 4,0 m/s,

6 6 PL B1 7. Próbki inkubować przez 30 minut w 37 C, 8. Dodać 200 l 75 mm NaOH, 9. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 95 C, 10. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut, 11. Odrzucić nadsącz, 12. Dodać do osadu 500 l buforu składającego się z 50 mm Tris HCL, 10 mm EDTA, 28 mm -merkaptoetanolu, o ph = 7,5 oraz litykazę (5,0 l stock: 4000U), 13. Inkubować 30 minut w 37 C, 14. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut. Uzyskany osad poddaje się dalszej preparatyce, przy wykorzystaniu komercyjnego zestawu do izolacji DNA, zgodnie z protokołem postępowania dostarczonym przez producenta. W wyniku procedury otrzymuje się DNA gotowe do dalszych etapów analiz, np. przeprowadzenia reakcji PCR celem wykrycia drobnoustrojów. P r z y k ł a d 2 Izolacja DNA bakteryjnego z krwi: 1. 1,5 ml pełnej krwi dodać do 6 ml 0,17 M chlorku amonu, 2. Próbki inkubować w 37 C przez 20 minut, 3. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut, 4. Wylać nadsącz, 5. Osad zawiesić w 100 l roztworu lizozymu (2 mg/ml) i lizostafiny (0,2 mg/ml) w buforze PBS, 6. Próbki przenieść do probówek z kulkami szklanymi m i poddać dezintegracji mechanicznej w czasie 20 sek., z prędkością 4,0 m/s, 7. Próbki inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 C, 8. Wirować z prędkością rpm w czasie 10 minut. Uzyskany osad poddaje się dalszej preparatyce, przy wykorzystaniu komercyjnego zestawu do izolacji DNA, zgodnie z protokołem postępowania dostarczonym przez producenta. W wyniku procedury otrzymuje się DNA gotowe do dalszych etapów analiz, np. przeprowadzenia reakcji PCR celem wykrycia bakterii. P r z y k ł a d 3 Izolacja DNA grzybiczego z krwi: 1. 1,5 ml pełnej krwi dodać do 6 ml 0,17 M chlorku amonu, 2. Próbki inkubować w 37 C przez 20 minut, 3. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut, 4. Wylać nadsącz, 5. Próbki przenieść do probówek z kulkami szklanymi m i poddać dezintegracji mechanicznej przez 20 sek., z prędkością 4,0 m/s, 6. Dodać 200 l 50 mm NaOH, 7. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 95 C, 8. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut, 9. Odrzucić nadsącz, 10. Dodać do osadu 500 l buforu składającego się z 50 mm Tris HCL, 10 mm EDTA, 28 mm -merkaptoetanolu, o ph = 7,5 oraz litykazę (5,0 l stock: 4000U), 11. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 C, 12. Wirować z prędkością rpm przez 10 minut. Uzyskany osad poddaje się dalszej preparatyce, przy wykorzystaniu komercyjnego zestawu do izolacji DNA, zgodnie z protokołem postępowania dostarczonym przez producenta. W wyniku procedury otrzymuje się DNA gotowe do dalszych etapów analiz, np. przeprowadzenia reakcji PCR celem wykrycia komórek grzybów.

7 PL B1 7 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób izolowania DNA drobnoustrojów z krwi, z wykorzystaniem lizy enzymatycznej, lizy mechanicznej oraz lizy termicznej, znamienny tym, że: a) do próbki pełnej krwi dodaje się wodny roztwór chlorku amonu o stężeniu 0,10-0,25 M, w proporcji 1:3-6 w stosunku do objętości próbki krwi, próbkę inkubuje się w temperaturze od 35 C do 40 C, w czasie od 15 minut do 30 minut, następnie poddaje się ją wirowaniu i usuwa się nadsącz; b1) ewentualnie osad otrzymany w etapie (a) zawiesza się w roztworze lizozymu, o stężeniu od 2 mg/ml do 5 mg/ml i lizostafiny o stężeniu od 0,2 mg/ml do 0,5 mg/ml, w buforze PBS, zawiesinę poddaje się wirowaniu lub wytrząsaniu i usuwa się nadsącz; c) materiał otrzymany w etapie (a) lub (b1) poddaje się dezintegracji mechanicznej; b2) w przypadku przeprowadzenia etapu (b1) materiał inkubuje się w temperaturze od 35 C do 39 C, w czasie od 20 minut do 50 minut, po czym d) dodaje się roztwór NaOH lub KOH o stężeniu od 0,65 mm do 0,8 mm, w proporcji od 1:1 do 1:3 w stosunku do objętości materiału z etapu c), materiał inkubuje się w temperaturze od 80 C do 95 C, w czasie od 5 minut do 10 minut, zawiesinę poddaje się wirowaniu i usuwa się nadsącz; dodaje się bufor o ph około 7,5, zawierający Tris HCL, EDTA i -merkaptoetanol, oraz litykazę o aktywności enzymatycznej od 30 U do 50 U, próbkę inkubuje się w temperaturze od 35 C do 39 C, w czasie od 20 minut do 50 minut i/albo e) zawiesinę poddaje się wirowaniu i usuwa się nadsącz. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (c) prowadzi się z wykorzystaniem szklanych kulek. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (d) stosuje się bufor składający się z 50 mm Tris HCL, 10 mm EDTA, 28 mm -merkaptoetanolu.

8 8 PL B1 Rysunki

9 PL B1 9

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)