HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ II

Transkrypt

1 732 WIADOMOŚCI LEKARSKIE 2006, Nowotworowa LIX, Choroby I Lewy-Trenda Choroba D. niedrożność Dybowska układu trzewna krążenia i wsp. jelita grubego Nr 9 10 Dorota M. Olszewska-Słonina*, Tomasz A. Drewa*, Jan Styczyński**, Rafał Czajkowski*, *** HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ II Z *Katedry Biologii Medycznej, z **Katedry i Kliniki Pediatrii, Hematologii i Onkologii oraz z ***Katedry i Kliniki Dermatologii Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Nauka i technika zawsze były ważnymi składowymi kultury ludzkiej. Nauka zarządzała innowacjami technicznymi, a technologia przyspieszała postęp nauki. Coraz liczniejsze dokonania w dziedzinie inżynierii tkankowej umożliwiły utrzymanie ex vivo nie tylko izolowanych komórek, lecz również tkanek i narządów. Inżynieria tkankowa, prężnie rozwijająca się od ponad stu lat, wnosi swój wkład w rozwój genetyki, transplantologii, diagnostyki onkologicznej, farmakologii, toksykologii i wielu innych nauk medycznych. Niniejsza praca podsumowuje osiągnięcia w dziedzinie inżynierii tkankowej, jakie odnotowano w drugiej połowie ubiegłego stulecia. [Wiad Lek 2006; 59(9 10): ] Słowa kluczowe: hodowla tkankowa, hodowla komórkowa, inżynieria tkankowa. W drugiej połowie XX wieku rozwinięto metody hodowli neotkanek i konstruowania neonarządów. Opracowywanie nowych pożywek hodowlanych i technik hodowli umożliwiło utrzymanie ex vivo już nie tylko izolowanych komórek, lecz tkanek i narządów. Opracowane podłoża do hodowli stwarzają in vitro warunki środowiskowe przypominające te, które panują in vivo. Podłoże jest źródłem składników odżywczych, przyczynia się do utrzymania stałych fizykochemicznych, takich jak ph czy osmolalność. Skład podłoży do hodowli podlega ciągłym modyfikacjom z powodu coraz lepszej znajomości czynników odpowiedzialnych za zachowanie wszystkich funkcji komórki. Pierwsze syntetyczne podłoże opracował w 1948 r. Fischer. Od tego czasu opisano skład mniej lub bardziej złożonych, licznych podłoży syntetycznych, a ich nazwy w większości przypadków wywodzą się od nazwiska naukowca lub nazwy instytutu, w którym je opracowano. Doceniając znaczenie hodowli komórkowej w dziedzinie badań nad chorobami nowotworowymi, wirusowymi i genetycznymi, Harry Eagle ustalił składniki niezbędne do utrzymania wzrostu komórek ssaków w hodowli [1]. Wykrył, iż poza niezidentyfikowanymi czynnikami w dializowanej surowicy podstawowymi komponentami były: 13 aminokwasów, 6 rodzajów jonów, 8 witamin oraz glukoza [2]. Opracowane przez niego w 1955 r. podstawowe podłoże hodowlane (minimum essential medium MEM) stało się jedną z najszerzej używanych syntetycznych pożywek do hodowli komórek. Osiągnięcie Eagle a otworzyło drogę do 30 lat wyjątkowych badań z dziedziny biochemii, biologii molekularnej, a także genetyki prawidłowych i nowotworowych komórek ssaków. Wprowadzenie tego podłoża zapoczątkowało również nieustanne modyfikowanie i udoskonalanie egzogennego środowiska do hodowli nowych typów komórek ssaków (tab. I). Skład podłoża Eagle a pierwotnie dostosowany został do hodowli mysich komórek L oraz komórek HeLa [3,4]. Pierwotną linię komórek L założył W.R. Earle w 1940 r. z komórek tkanki łącznej myszy. Tabela I. Najważniejsze osiągnięcia w dziedzinie opracowywania podłoży do hodowli komórek Rok 1880/ Wydarzenie Ringer buforowany roztwór soli Tyrode buforowany roztwór soli do hodowli komórek ssaków Fischer pierwsze podłoże do hodowli określone chemicznie, zwane CMRL 1066 Morgan, Morton, Parker całkowicie określony skład podłoża odżywczego do hodowli komórek (Medium 199) Eagle, Fischer i Waymouth udoskonalają istniejące metody i podłoża do hodowli tkankowej; Harry Eagle opracowuje skład MEM (Minimal Essential Medium) McCoy i wsp. opublikowali wymagania aminokwasowe komórek raka wątrobowokomórkowego Novikoff (Novikoff hepatoma) Ham po raz pierwszy opisuje podłoża pozbawione surowicy Moore i wsp. z Roswell Park Memorial Institute opracowują podłoże RPMI 1640 przeznaczone pierwotnie do hodowli w zawiesinie komórek limfoblastycznych; znalazło ono szerokie zastosowanie w prowadzeniu hodowli świeżych ludzkich limfocytów, w dokonywaniu fuzji komórek i hodowaniu hybryd komórkowych Guilbert i Iscove opublikowali modyfikację podłoża DMEM (dodano selen, dodatkowe witaminy i aminokwasy, pirogronian sodu, bufor HEPES)

2 Nr 9 10 Inżynieria tkankowa 733 Étienne Wolff wdrożył technikę i opracował podłoże hodowlane pozwalające na rozwój bardzo młodych zawiązków organów izolowanych in vitro, od momentu ich pojawienia się, aż do całkowitego zróżnicowania (np. piszczel, kość udowa, elementy szkieletu, narządy i przewody płciowe) [5]. Hodowla tkanek i narządów zwierząt jest możliwa w przypadku małych fragmentów narządów lub kilkumilimetrowych organów płodu, pod warunkiem, że ograniczy się dostarczanie komórkom czynników wzrostu (aby uniknąć niekontrolowanych podziałów komórek). Hodowla taka musi być właściwie napowietrzana, co umożliwia komórkom oddychanie, mimo iż nie występuje czynnościowe nawadnianie. Umieszczając w hodowli substrat hamujący przemieszczanie się komórek, np. żel agarowy, należy uniemożliwić komórkom migrację poza narząd. Stosując analogiczne metody, Wolff otrzymał hodowle ludzkich komórek nowotworowych in vitro, niezależne od organizmu i narządu dawcy. Udało się również wyhodować komórki tych samych nowotworów w pożywkach syntetycznych, których skład jest ściśle określony i różni się zależnie od typu nowotworu. Dzięki opanowaniu opisanych metod możliwe stało się przeprowadzanie badań in vitro na izolowanych komórkach nowotworowych. Zmutowane komórki w początkowym stadium kancerogenezy wykorzystano do badań pozwalających obserwować je w warunkach naturalnych albo stworzonych sztucznie. Przemieszczanie i wzrost izolowanych z naturalnego środowiska komórek nowotworowych pozwala na obserwacje, które są niemożliwe w środowisku guza pierwotnego. Interesujące możliwości stwarza przeszczepianie komórek nowotworowych zwierzętom, np. do kieszeni jarzmowej chomika, pod torebkę nerkową myszy albo do otrzewnej myszy zwanych nagimi, które tolerują przeszczepy obcogatunkowe. Hodowle komórek w naczyniach z masy plastycznej (np. polipropylen lub polistyren) oferują jeszcze inne możliwości, tym większe, im lepsze są warunki hodowli. Zdolność komórki do wzrostu in vitro zależy od jej pochodzenia: komórki krwi spontanicznie wolne oraz komórki tkanki łącznej (fibroblasty) rosną łatwiej niż komórki nabłonka, których wzrost zależy od złożonych warunków otoczenia. Warunków takich nie można całkowicie odtworzyć. Alexis Carrel zaobserwował, iż żywotność komórek nowotworowych jest zwiększona, co ułatwia ich hodowlę. Komórki uzyskane z nowotworów nisko zróżnicowanych rosną lepiej niż pobrane z nowotworów wysoko zróżnicowanych. Linie komórek immortalizowane (unieśmiertelnione) mogą być utrzymywane nawet wiele dziesięcioleci. Najpopularniejszymi hodowlami ciągłymi komórek nowotworowych są 2 linie komórkowe: KB, wyizolowana przez Eagle a z ludzkiego nabłoniaka jamy ustnej, oraz szczep HeLa, wyizolowany przez Geya z raka nabłonkowego szyjki macicy [6,7]. Komórki HeLa pochodzą z raka szyjki macicy zmarłej w 1951 r. 31-letniej, czarnoskórej, amerykańskiej pacjentki Henrietty Lacks, od której imienia wywodzi się nazwa komórek. Ich złośliwość pozostaje niezmieniona po kolejnych pasażach. Komórek tych linii można używać do dziś. W 1953 r. Scherer, Syverton i Gey opracowali metodę rozpraszania rosnących komórek HeLa z użyciem trypsyny. Frisch i Jentoft użyli tego samego enzymu proteolitycznego do uzyskania zawiesiny komórek z tkanki jąder małpy. Rok później Younger zastosował trypsynę do rozproszenia komórek nerki pochodzących od małpy. Inną metodę rozerwania pojedynczej warstwy komórek opracował ówcześnie Zwilling, który użył do tego celu wersenianu sodu [8]. Dokumentacją filmową hodowli komórkowej zajmował się Charles Pomerat ( ). Pierwsze jego filmy rejestrują zachowanie komórek tkanki nerwowej w hodowli [9]. Pomerat wniósł olbrzymi wkład w rozwój neuroanatomii, farmakologii, toksykologii i onkologii, umożliwił dokonanie charakterystyki i obserwację zachowania się komórek wielu tkanek in vitro (m.in. zachowanie się 2 różnych linii komórkowych w tym samym naczyniu hodowlanym, wpływ szoku termicznego na hodowle tkankowe) [10]. W 1954 r. Pomerat wraz z Leake zaproponowali użycie krótkoterminowych hodowli tkankowych do badań nad cytotoksycznością różnych związków chemicznych [11]. Warunki hodowli organotypowej (narządowopodobnej) można stosować w doświadczeniach, w których konieczne jest zachowanie struktury hodowanych tkanek. Przykładem mogą być hodowle komórek nowotworowych Étienne i Émilienne Wolff: komórki przerzutów wątrobowych gruczolakoraka przewodu pokarmowego (Z 200) i nabłoniaka błony śluzowej jelita zstępującego (Z 516), które proliferują bardzo intensywnie od lat 1962 i Wykazanie, że komórki pobrane z tkanki nowotworowej człowieka również mogą dzielić się nieskończenie wiele razy i powstają z nich linie komórkowe, stanowi początek nowej ery badań w onkologii, farmakologii, cytologii, genetyce. Badania te doprowadziły do powstania tak wąskich dziedzin, jak cytofizjologia, nekrobiologia komórki, onkologia doświadczalna, inżynieria tkankowa i wiele innych. Hodowle komórkowe pozwoliły zaobserwować charakterystyczne cechy komórek nowotworowych: przylegają do siebie słabiej niż komórki prawidłowe, tracą zdolność hamowania kontaktowego, które zatrzymuje rozwój komórki prawidłowej, gdy pozostaje ona w styczności z inną. Kolejną zaletą hodowli jest możliwość stwierdzenia, jakie substancje wydzielane przez komórkę nowotworową odpowiedzialne są np. za inwazję i zdolność do tworzenia przerzutów. Zjawisko hamowania kontaktowego opisał Abercrombie w 1954 r.

3 734 D. Olszewska-Słonina i wsp. Nr 9 10 stwierdzając, że ruchliwość diploidalnych komórek Schwanna w hodowli jednowarstwowej ustaje, gdy zetkną się one z komórkami sąsiednimi [12]. Ideę genetycznego zaprogramowania procesu starzenia propagował w latach 60. ubiegłego stulecia biolog Leonard Hayflick [13]. W 1961 r. Hayflick i Paul Moorhead doświadczalnie badając fibroblasty zarodka ludzkiego udowodnili, że każda komórka nienowotworowa posiada zaprogramowaną określoną liczbę podziałów, zależną od wieku dawcy (około 50 pasaży w hodowli). Po przekroczeniu tej liczby komórka ginie. Jedynie transformowane komórki nowotworowe w hodowli ciągłej zdolne są do nieskończonej liczby podziałów [14]. W 1965 r. Mary Weiss i Howard Green z powodzeniem dokonali fuzji komórek mysich z ludzkimi, a 2 lata później opracowali technikę utrzymywania komórek ludzkich i mysich w tej samej hodowli. Technikę hybrydyzacji komórek (zwaną hybrydyzacją somatyczną) wykorzystali do badań nad mapowaniem genomu ludzkiego [15]. Nad techniką fuzji komórek i syntezy przeciwciał monoklonalnych przełomowe badania prowadził również César Milstein, lekarz argentyński. Dokonując fuzji limfocytów B produkujących przeciwciała z nieśmiertelnymi komórkami nowotworowymi, w swoim laboratorium wytworzył hybrydy, które w sposób ciągły zdolne były do syntezy przeciwciał. Wszystkie produkowane przez ten typ hybryd przeciwciała były identyczne z produkowanymi przez limfocyty B, które użyto do przeprowadzenia fuzji. Ponieważ wyprodukowane przeciwciała pochodziły z pojedynczego klonu hybryd komórkowych, nazwano je przeciwciałami monoklonalnymi. Technikę ich produkcji udoskonalił w 1975 r. Georges Kohler [16]. Wykorzystanie tej właściwości komórek nowotworowych pozwoliło na przeprowadzenie fuzji między komórkami prawidłowymi i nowotworowymi (technika hybrydyzacji komórkowej) oraz produkcję przeciwciał monoklonalnych i jej komercjalizację. W jakim celu hodowano komórki? Pierwotnie dla postępu w zakresie badań podstawowych, następnie dla potrzeb przemysłu, badań toksykologicznych (zwłaszcza z powodu problemów z przeprowadzaniem doświadczeń na zwierzętach). Mimo postępu technik hodowli komórek in vitro nie można odnieść ich wyników do otrzymywanych w trakcie eksperymentów prowadzonych na zwierzętach, dlatego badań na zwierzętach nie da się uniknąć. Dzięki hodowlom komórkowym i tkankowym można też łatwiej analizować, jakie substancje są niezbędne do życia komórkom, czyli niezbędne do prowadzenia hodowli, a jakich brak utrudnia hodowlę. Prowadzenie hodowli komórkowej może służyć do badań aktywności wewnątrzkomórkowej badań syntezy DNA i białek, mechanizmów powstawania energii, funkcji receptorów i enzymów, powstających metabolitów, a także do badania interakcji międzykomórkowych z uwzględnieniem podziałów, hamowania wzrostu i adhezji. Zastosowania kliniczne hodowli komórek nowotworowych to badanie mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych, jak również zjawisk chemioi radiooporności. Do pożywki hodowlanej można dodawać leki przeciwnowotworowe w różnych stężeniach, aby obserwować chemowrażliwość komórek. Komórki pochodzące od chorych poddawane są działaniu promieniowania jonizującego w różnych warunkach, aby określić ich promienioczułość. Można także hodować komórki prawidłowe, zwłaszcza immunologicznie kompetentne lub cytotoksyczne razem z nowotworowymi (kokultury), aby je namnożyć albo pobudzić i użyć w leczeniu nowotworów metodami cytoimmunoterapii. Odrębnym zagadnieniem jest wykorzystanie metod hodowli komórek i inżynierii tkankowej w transplantologii. Możliwe jest odtwarzanie naskórka potrzebnego do autoprzeszczepów (leczenie rozległych oparzeń i przewlekłych owrzodzeń). Przeszczepy komórek autologicznych, szczególnie komórek macierzystych, stosowane są w leczeniu ognisk niedokrwienia w sercu czy w leczeniu cukrzycy. Inżynieria tkankowa daje też możliwość przeszczepiania chondrocytów (uzupełnianie ubytków na powierzchni stawów) [17], a ponadto umożliwia konstruowanie narządów zastępczych (np. neobladder, neoskin, neovessels). Tkanka może być budowana in vivo poprzez stymulowanie organizmu do regeneracji z użyciem właściwych biometriałów lub ex vivo, gdy komórki namnażane są w hodowli, łączone z rusztowaniem wykonanym z materiałów naturalnych, takich jak kolagen, lub z biodegradowalnych matryc polimerowych i wszczepiane do organizmu gospodarza. Komórki mogą być heterologiczne (różne gatunki), allogeniczne (ten sam gatunek, różne osobniki) lub autologiczne (tego samego osobnika). Preferuje się komórki autologiczne, aby zminimalizować odpowiedź immunologiczną, a tym samym konieczność stosowania środków immunosupresyjnych [18]. Transplantacja wątroby jest jedynym skutecznym sposobem leczenia w końcowym stadium jej niewydolności. Ze względu na ograniczenia związane z poszukiwaniem dawców, od 1986 r. opracowuje się techniki hodowania autologicznych i allogenicznych hepatocytów, które mogą zastąpić uszkodzoną tkankę. Technika ta polega na pobraniu z wątroby komórek miąższowych, przeniesieniu ich na syntetyczne, biodegradowalne, trójwymiarowe polimery, np. wysoce mikroporowaty kwas poliglikolowy (PGA), i wszczepieniu tej konstrukcji do organizmu biorcy. Podczas wbudowywania konstrukcji polimerowo- -komórkowej do organizmu biorcy rusztowanie polimerowe ulega biodegradacji, pozostawiając jedynie nową tkankę [19].

4 Nr 9 10 Inżynieria tkankowa 735 Obiecującą alternatywną metodą leczenia zespołu krótkiego jelita powstającego po resekcji długiego odcinka jelita cienkiego jest przeszczepianie jego komórek z użyciem rusztowań z biopolimerów. Istnieje pogląd, iż zasadniczym warunkiem prawidłowej proliferacji, różnicowania i przeżycia komórek krypt jelitowych jest nabłonkowo-mezenchymalna interakcja między komórkami. Inżynieria tkankowa wykorzystuje do implantacji komórki krypt jelitowych, które są jednostką nabłonkowo-mezenchymalną, zwaną też jelitową nabłonkową jednostką organoidalną. Jednostka taka, przeniesiona na rusztowanie o kształcie rury utworzone z włókien PGA, zostaje wszczepiona do omentum, gdzie ulega waskularyzacji, proliferuje i tworzy struktury podobne do cyst i kosmków na wewnętrznej powierzchni neośluzówki [20]. Rekonstrukcja zastawek serca z wykorzystaniem metod inżynierii tkankowej pozwala uniknąć wielu ograniczeń związanych z ich chirurgicznym zastępowaniem (jak incydenty zatorowo-zakrzepowe, odrzucenie czy zainfekowanie przeszczepianej tkanki). Pobierane do hodowli komórki pochodzą z tętnicy szyjnej lub udowej. Z małych sześciennych fragmentów tętnicy po 8 10 tygodniach hodowli uzyskuje się mieszane populacje komórek nabłonkowych i mięśni gładkich, które następnie zostają rozdzielone z użyciem metod immunohistochemicznych. Komórki przypominające miofibroblasty przenosi się na rusztowanie biopolimerowe codziennie przez 12 dni, po czym pokrywa się je komórkami nabłonkowymi. Płatek zastawki wytworzony metodą inżynierii tkankowej wykazuje prawidłową architekturę i obecność macierzy pozakomórkowej podobnej do macierzy naturalnej zastawki [17]. Największym osiągnięciem inżynierii tkankowej jest rekonstrukcja palca ludzkiego. Staw jest strukturą złożoną, składającą się z różnych typów tkanek i specyficznych dla nich macierzy. W dotychczasowych doświadczeniach wykorzystywano 3 rodzaje komórek osteoblasty, chondrocyty i tenocyty, oraz 2 typy rusztowań polimerowych PGA i PLLA (kwas poli-l- -mlekowy). Udało się uzyskać nową strukturę o kształcie i rozmiarach ludzkich paliczków i stawów [21]. Trwają badania doświadczalne oraz kliniczne dotyczące rekonstrukcji cewki moczowej. Potencjalnym zastosowaniem klinicznym inżynierii tkankowej może być budowanie w całości od nowa pęcherza moczowego (neobladder) [22]. Odtworzenie ściany pęcherza moczowego może nastąpić metodą regeneracji tkanek in vivo, która wykorzystuje zdolność pęcherza do szybkiej odbudowy i naprawy po ostrym uszkodzeniu. Podczas operacji implantuje się materiał biologiczny (warstwę podśluzówkową jelita cienkiego lub bezkomórkową macierz pęcherza), ulegający przebudowie i zasiedleniu przez komórki. Ostatecznie dochodzi do odtworzenia ściany pęcherza [23,24]. Wiele potencjalnych powikłań konwencjonalnej enterocystoplastyki (uzupełnienie ściany pęcherza moczowego jelitem) spowodowanych jest nieprzydatnością nabłonka jelitowego. Wynalezienie technik umożliwiających skuteczne oddzielenie nabłonka dróg moczowych od zrębu oraz zastosowanie podłoży bez surowicy pozwoliły na hodowanie komórek tego nabłonka w sposób rutynowy [25]. Wyhodowane komórki tworzące płaty autologicznego nabłonka z naczynia hodowlanego przenosi się na siateczkę poliglaktynową, która służy jako vehiculum do przenoszenia na ścianę jelita uzupełniającą ubytek. Metoda ta, wiążąca się z potrzebą wyhodowania in vitro tylko jednego komponentu ściany pęcherza, nosi nazwę cystoplastyki złożonej (kompozytowej) i wymaga jeszcze wielu badań. Jednym z najambitniejszych projektów badawczych w dziedzinie inżynierii tkankowej jest uzyskanie wytworzonego in vitro elementu filtrującego zastępującego nerki. Największą trudność stanowi fakt, iż nefrony powstają w całości między 6 a 36 tygodniem wewnątrzmacicznego życia płodu. Większe nadzieje mogłaby stworzyć metoda, w której stosuje się komórki macierzyste lub płodowe komórki macierzyste, mające zdolność wielokierunkowego różnicowania się. Komórki do tego celu można uzyskać drogą klonowania terapeutycznego przez transfer jąder [26]. Podjęto wstępne badania nad możliwościami wykorzystania inżynierii tkankowej do tworzenia giętkich protez chrząstkowych, na bazie prętów polimerowych z rozsianymi w nich autologicznymi chondrocytami, implantowanych w obręb ciał jamistych prącia. In vitro wyhodowano też komórki tkanki jamistej, które rozsiano w syntetycznej macierzy polimerowej i wykorzystano do zastąpienia tkanki ciał jamistych u królików [27]. Lata 90. XX i początek XXI wieku przyniosły rozwój inżynierii tkankowej, stwarzającej dziś wiele nowych możliwości, takich jak badania chromosomów (określanie np. kariotypu płodu) czy hodowla wirusów (diagnostyka lub produkcja szczepionek). Ogromne znaczenie ma też stosowanie modeli komórkowych in vitro w ocenie cytotoksyczności materiałów używanych do produkcji sprzętu medycznego i endoprotez, m.in. silikonu i lateksu. Olbrzymi postęp w dziedzinie inżynierii tkankowej sugeruje, iż w przyszłości może ona mieć coraz szersze zastosowanie kliniczne i stanowić alternatywę terapeutyczną dla osób potrzebujących zastąpienia bądź naprawy uszkodzonego narządu.

5 736 D. Olszewska-Słonina i wsp. Nr 9 10 Tabela II. Najważniejsze wydarzenia w rozwoju hodowli komórek Rok Wydarzenie Xavière Bichat bada i nazywa tkanki kładąc nacisk na znaczenie badań nad różnymi tkankami, z których zbudowany jest organizm Carl F.W. Ludwig utrzymuje narządy zwierzęce poza organizmem przepompowując przez nie krew Sydney Ringer uzyskuje i zachowuje regularne skurcze serca żaby w buforowanym roztworze soli Wilhelm Roux usuwa część płytki nerwowej z embrionu kurczaka i utrzymuje ją w ogrzewanym roztworze soli przez kilka dni Justin Jolly hoduje leukocyty trytona i dokonuje szczegółowych obserwacji komórek in vitro Charles W. Beebe i James Ewing hodują komórki psiego chłoniakomięsaka we krwi Ross G. Harrison demonstruje in vitro rozwój żywej tkanki zwierzęcej pobierając fragment struny nerwowej żaby i umieszczając go w kropli osocza; opracowuje technikę hodowli w kropli wiszącej ; z Montrose Burrows prowadzi hodowle komórek w zakrzepłym na szkiełku mikroskopowym osoczu Maurice V. Tyrode opracowuje skład buforowanego roztworu soli do hodowli komórek ssaków M.R. Lewis i W.H. Lewis opracowują skład pierwszych płynnych pożywek hodowlanych składających się z wody morskiej, surowicy, ekstraktu z zarodków, soli i peptonów; obserwują ograniczony wzrost pojedynczej warstwy komórek Montrose T. Burrows i Alexis Carrel z powodzeniem hodują eksplanty pochodzące z organizmów dojrzałych psów, kotów, szczurów i świnek morskich, a także komórki nowotworowe; Carrel zakłada hodowlę linii komórek z mięśnia sercowego embrionu kurzego, która kontynuowana jest przez 34 lata przez Alberta H. Ebelinga E. Steinhardt, C. Israeli i R.A. Lambert wykazują, że wirus krowianki może przeżyć wiele tygodni we fragmentach rogówki królika David Thompson rozpoczyna doświadczenia z hodowlą narządów, pobierając m.in. zawiązki piór i soczewki oka z zarodków kurzych Peyton Rous i S.F. Jones po raz pierwszy używają enzymu proteolitycznego trypsyny, do sporządzenia zawiesiny z oddysocjowanych od zbitej masy komórek Albertowi Ebelingowi udaje się hodować komórki nabłonkowe M.T. Burrows i A. Carrel wykazują, że ekstrakt z zarodków ułatwia hodowlę komórek; Carrel opracowuje technikę hodowli komórek w naczyniach hodowlanych (T-flasks) Robert F. Parker i wsp. wykazują, że wirus krowianki może namnażać się w hodowli komórkowej Honor B. Fell bada rozwój kości i stawów in vitro, używając fragmentów rozwijających się narządów pochodzących z zarodków kurzych W latach 20. Honor B. Fell i T.S.P. Strangeways opracowują techniki hodowli narządów A. Carrel i George O. Gey opracowują technikę hodowli komórek w naczyniach w kształcie walca (roller tube) Franck Macfarlane Burnet i W.I. Beveridge opisują hodowlę wirusów i riketsji w tkankach zarodków kurzych Konferencja Hodowli Tkankowej, która odbyła się w Hershey (Pensylwania), zapoczątkowuje założenie Amerykańskiego Towarzystwa Hodowli Tkankowej (American Tissue Culture Association) John F. Enders, Thomas H. Weller i Frederick C. Robbins udowadniają, że wirus poliomyelitis może być hodowany in vitro bez obecności tkanki nerwowej (w naczyniach o kształcie walca) Katherine Sanford, W.R. Earle i G.D. Likely zakładają hodowlę klonów pochodzących z pojedynczych komórek Piśmiennictwo [1] Eagle H. The growth requirements of two mammalian cell lines in tissue culture. Trans Assoc Am Physicians 1955; 68: [2] Eagle H. Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science 1955; 122(3168): [3] Eagle H. The specific amino acid requirements of a mammalian cell (strain L) in tissue culture. J Biol Chem 1955; 214(2): [4] Eagle H. The specific amino acid requirements of a human carcinoma cell (Stain HeLa) in tissue culture. J Exp Med 1955; 102(1): [5] Wolff E, Haffen K. Method for culture of embryonic organs. Tex Rep Biol Med 1952; 10(2): [6] Eagle H. Propagation in a fluid medium of a human epidermoid carcinoma, strain KB. Proc Soc Exp Biol Med 1955; 89(3): [7] Gey G, Bang F, Gey M. Responses of a variety of normal and malignant cells to continuous cultivation, and some practical applications of these responses to problems in the biology of disease. Ann N Y Acad Sci 1954; 58(7): [8] Ross JD, Syverton JT. Use of tissue cultures in virus research. Annu Rev Microbiol 1957; 11: [9] Pomerat CM. Cinematography, indispensable tool for cytology. Int Rev Cytol 1961; 11: [10] Pomerat CM. Tissue culture in experimental biology and medicine. J Am Vet Med Assoc 1956; 129(10): [11] Pomerat CM, Leake CD. Short term cultures for drug assays: general considerations. Ann N Y Acad Sci 1954; 58(7): [12] Abercrombie M. Contact inhibition: the phenomenon and its biological implications. Natl Cancer Inst Monogr 1967; 26: [13] Hayflick L. Antecedents of cell aging research. Exp Gerontol 1989; 24: [14] Hayflick L, Moorhead PS. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 1961; 25: [15] Weiss M, Green H. Human-mouse hybrid cell lines containing partial complements of human chromosomes and functioning human genes. Proc Natl Acad

6 Nr 9 10 Inżynieria tkankowa 737 Sci USA 1967; 58(3): [16] Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256(5517): [17] Grikscheit TC, Vacanti JP. The history and current status of tissue engineering: The future of pediatric surgery. J Pediatr Surg 2002; 37(3): [18] Hipp J, Atala A. Tissue engineering, stem cells, cloning, and parthenogenesis: new paradigms for therapy. J Exp Clin Assist Reprod 2004; 1(1): 3 ( [19] Terada S, Sato M, Sevy A, Vacanti JP. Tissue engineering in the twenty-first century. Yonsei Med J 2000; 41(6): [20] Choi RS, Riegler M, Pothoulakis C, Kim BS, Mooney D, Vacanti M, Vacanti JP. Studies of brush border enzymes, basement membrane components, and electrophysiology of tissue-engineered neointestine. J Pediatr Surg 1998; 33(7): ; discussion [21] Isogai N, Landis W, Kim TH, Gerstenfeld LC, Upton J, Vacanti JP. Formation of phalanges and small joints by tissue-engineering. J Bone Joint Surg Am 1999; 81(3): [22] Cross WR, Thomas DF, Southgate J. Tissue engineering and stem cell research in urology. BJU Int 2003; 92(2): [23] Kropp BP, Cheng EY, Lin HK, Zhang Y. Reliable and reproducible bladder regeneration using unseeded distal small intestinal submucosa. J Urol 2004; 172 (4 Pt 2): [24] Sievert KD, Tanagho EA. Organ-specific acellular matrix for reconstruction of the urinary tract. World J Urol 2000; 18(1): [25] Southgate J, Masters JR, Trejdosiewicz LK. Culture of human urothelium. W: Culture of Epithelial Cells. 2 nd ed. Red. Freshney RI, Freshney MG. J Wiley and Sons. New York [26] Lanza RP, Chung HY, Yoo JJ, Wettstein PJ, Blackwell C, Borson N, Hofmeister E, Schuch G, Soker S, Moraes CT, West MD, Atala A. Generation of histocompatible tissues using nuclear transplantation. Nat Biotechnol 2002; 20(7): [27] Kwon TG, Yoo JJ, Atala A. Autologous penile corpora cavernosa replacement using tissue engineering techniques. J Urol 2002; 168(4 Pt 2): Adres autorów: Dorota Olszewska-Słonina, Katedra Biologii Medycznej CM UMK, ul. Karłowicza 24, Bydgoszcz, tel. (0-52) , fax (0-52) , dorolsze@poczta.onet.pl D. Olszewska-Słonina, T. Drewa, J. Styczyński, R. Czajkowski TISSUE ENGINEERING YESTERDAY AND TODAY. PART II Summary Science and technology is always an important component of human culture. Science directs technological innovation and technology accelerates the progress of science. Increasing number of achievements in tissue engineering domain make possible ex vivo maintaining not only the isolated cells, but also tissues and organs. Tissue engineering powerfully expanding from over hundred years, contribute to the development of genetics, transplantology, oncological diagnostics, pharmacology, toxicology and many other medical sciences. Presented paper summarizes the scientists accomplishments in the field of tissue engineering which were noted in the second half of twentieth century. Key words: tissue culture, cell culture, tissue engineering.