HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ I

Transkrypt

1 Wpływ Nowotworowa Choroba penicyliny A. Biopsja G. R. Warchala niedrożność Gravesa Gajer Zych na procesy wątroby i i i Basedowa wsp. WIADOMOŚCI jelita enzymatyczne grubego LEKARSKIE 2006, LIX, VARIA Dorota M. Olszewska-Słonina, Tomasz A. Drewa HODOWLA KOMÓREK, INŻYNIERIA TKANKOWA I MEDYCYNA REGENERACYJNA. CZĘŚĆ I Z Katedry i Zakładu Biologii Medycznej Collegium Medicum im. Ludwika Rydygiera w Bydgoszczy Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu Inżyniera tkankowa jest interdyscyplinarną dziedziną, która przystosowała zasady rządzące inżynierią oraz hodowlą komórek w celu wytworzenia biologicznych materiałów zastępczych, mogących odbudować, utrzymać bądź poprawić funkcje tkanek. Połączeniem inżynierii z medycyną naukowcy interesują się już od co najmniej 2 stuleci. W jakim celu hodowano komórki? Pierwotnie dla postępu w zakresie badań podstawowych, a następnie w badaniach toksykologicznych i wirusologicznych. Prowadzenie badań in vitro podyktowane jest m.in. problemami z przeprowadzaniem doświadczeń na zwierzętach. W niniejszej pracy przybliżono starania lekarzy, anatomopatologów, embriologów i biologów, które przyczyniły się do szybkiego rozwoju inżynierii tkankowej. [Wiad Lek 2006; 59(7 8): ] Słowa kluczowe: hodowla tkankowa, hodowla komórkowa, inżynieria tkankowa. Inżynieria tkankowa staje się głównym motorem rozwoju medycyny regeneracyjnej. Prace w tym zakresie skupiały się na możliwościach połączenia komórek otrzymywanych w hodowli in vitro z biodegradowalnymi matrycami przestrzennymi [1,2]. Do produkcji matryc stosuje się różne polimery, np. kwas polimlekowy czy poliglikolowy. Matryce przestrzenne ułatwiają wzrost i namnażanie komórek, które swoją budową imitują tkankę. Dotychczasowe doświadczenia w inżynierii tkankowej prowadzono przede wszystkim z użyciem zróżnicowanych komórek diploidalnych, mają one jednak ograniczone zdolności podziału. Medycyna regeneracyjna jest dyscypliną nową, wywodzącą się z prac doświadczalnych prowadzonych pod koniec lat 90. ubiegłego wieku na bazie inżynierii tkankowej. Jej zadaniem jest szeroko pojęte wspomaganie procesów gojenia i naprawy tkanek poprzez stosowanie czynników wzrostu, terapii genetycznej oraz przeszczepów komórek [3,4,5]. Medycyna regeneracyjna jest dziedziną interdyscyplinarną, obecny jej rozwój wskazuje, iż w niedługim czasie stanie się odrębną specjalnością medyczną. Komórka to najmniejsza jednostka strukturalna żywego organizmu zwierzęcego lub roślinnego, stanowiąca podstawę budowy wszystkich roślin i zwierząt. Zbudowana jest z zamkniętej błoną komórkową masy cytoplazmatycznej, zawierającej jądro komórkowe [6]. Tkanka jest zbiorem podobnych komórek wraz z substancją międzykomórkową je otaczającą [7]. Termin hodowla tkankowa ma charakter uniwersalny i odnosi się zarówno do hodowli komórkowej, jak i hodowli eksplantu tkanki. Zagadnieniami budowy świata organicznego zajmowali się już starożytni atomiści, m.in. Anaksagoras z Kladzomen (ok p.n.e.), grecki filozof, którego poglądy podjął i rozwinął później Lukrecjusz. Zdaniem Anaksagorasa, rzeczywistość jest zbudowana z materii złożonej z nieskończonych i niezmiennych nasion rzeczy (gr. homojomerie) oraz nieskończonego, wiecznego, jedynego, wszystkowiedzącego i samowładnego rozumu (gr. nous), wprawiającego w ruch elementy Ryc. 1. Mikrografia tkanki roślinnej korka, uzyskana przez Roberta Hooke a (1665 r).

2 586 Inżynieria tkankowa Nr 7 8 materii i powodującego ich łączenie i rozłączanie. Dzieło Anaksagorasa O przyrodzie znane jest tylko we fragmentach. Rzymianin Titus Lucretius Carus był kontynuatorem filozofii Epikura. Napisał poemat O naturze wszechrzeczy, w którym wszystkie zjawiska tłumaczył za pomocą teorii atomistycznych [8]. W 1665 r. Robert Hooke obserwował obecność w tkankach kompartmentów (łac. cellula). Swoje badania opublikował w dziele Mikrografia (ryc. 1) [9,10]. Ryc. 4. Rudolf Virchow ( ). Ryc. 2. Matthias Schleiden ( ). Ryc. 3. Theodor Schwann ( ). Po raz pierwszy komórkę obserwowano w mikroskopie dopiero 170 lat później (1830 r.). Matthias Schleiden i Theodor Schwann (ryc. 2, 3) rozwinęli teorię komórkową. Przyjęto, że wszystkie organizmy zbudowane są z komórek. Rudolf Virchow (ryc. 4) jest autorem słów Omnis cellula a cellula (wszystkie komórki pochodzą z komórek). Na funkcjonowanie komórki mogą wpływać zaburzenia w budowie i funkcji jednego z jej licznych organelli (ryc. 5). Jądro komórkowe zawiera chromosomy z informacją genetyczną w postaci DNA prawdziwą pamięć komórki reprezentowaną przez około genów (genom). Informacja genetyczna pozwala na identyczny przebieg podziałów komórek i ich prawidłowe funkcjonowanie; DNA zawiaduje syntezą białek i wszelkich innych substancji niezbędnych do życia komórce. Może on podlegać modyfikacjom czy mutacjom. Główną konsekwencją mutacji jest nabycie przez komórkę cech nieśmiertelności, co oznacza, że może ona namnażać się w hodowli in vitro w sposób nieskończony, w przeciwieństwie do komórek prawidłowych, umierających po określonej liczbie podziałów, co zaobserwował Alexis Carrel. Z nieprawidłowej komórki posiadającej liczne mutacje mogą powstać komórki nowotworowe. Ryc. 5. Komórka i organella komórkowe.

3 587 Rozwój biologii komórki, biologii molekularnej, inżynierii tkankowej i wielu dziedzin pokrewnych pozwala poznać strukturę i funkcję komórek oraz ich organelli, a także określić wpływ wielu substancji na morfologię komórek, ich ultrastrukturę, aktywność wielu enzymów, zdolność do podziałów, czyli tzw. aktywność mitotyczną oraz zdolność do przemieszczania się komórek. Próbę hodowli komórek zwierzęcych pierwszy podjął Alfred Vulpian ( ; ryc. 6). Prowadził on prace kliniczne z dziedziny neurofizjologii (m.in. odkrył mechanizm działania kurrary na komórki nerwowe). Jego prace poprzedziły doświadczenia Carla F.W. Ludwiga ( ), który opracował techniki perfuzji narządów po ich usunięciu z ciała (1856). Pobrane narządy były utrzymywane ex vivo dzięki przepompowywaniu przez nie krwi. W 1859 r. Vulpian wyizolował fragmenty ogona kijanki i próbował hodować je w wodzie. Mimo iż komórki przeżyły, nie namnażały się. Doświadczenie to dostarczyło jedynie informacji o możliwości przeżycia komórek poza organizmem [11]. Ryc. 6. Alfred Vulpian ( ). W latach angielski lekarz Sydney Ringer ( ; ryc. 7) prowadził doświadczenia nad wpływem składników krwi na pracę mięśnia sercowego zwierząt. Opracował skład roztworu soli nieorganicznych, który pozwolił na uzyskanie regularnych skurczów zanurzonego w nim serca żaby. Początkowo stosowano 0,75% roztwór NaCl, do którego stopniowo Ringer Ryc. 7. Sydney Ringer ( ). wprowadzał dodatkowe substancje (np. krew i albuminę), obserwując ich wpływ na bijące serce. Wykazano, że przedłużający się rozkurcz komór, indukowany czystym roztworem chlorku sodu, jest odwracalny po dodaniu krwi i albuminy. Ringer zademonstrował także, że do utrzymania normalnej akcji serca ex vivo konieczne jest dodanie małych ilości wapnia do płynu, w którym jest ono zanurzone. Badacz udowodnił, iż funkcjonowanie izolowanych narządów przez długi okres czasu jest możliwe dzięki niewielkim ilościom potasu dodanym do normalnego roztworu chlorku sodu [12,13]. W 1885 r. embriologowi niemieckiemu, Wilhelmowi Roux ( ), udało się utrzymać w ogrzewanym roztworze soli płytkę nerwową uzyskaną z zarodka kurczaka. Próby hodowli komórek in vitro zostały uwieńczone sukcesem w 1903 r. Francuz Justin Jolly ( ) wykorzystując prace botanika niemieckiego Gotlieba Haberlanda (które zakończyły się porażką w hodowli komórek roślinnych Haberland opracował pożywkę hodowlaną, dzięki której uzyskał zwiększenie rozmiarów komórek, lecz nie ich namnażanie) prowadził hodowlę jądrzastych krwinek czerwonych trytona. Krwinki in vitro ulegały podziałom przez 15 dni, po czym rytm podziałów komórkowych stopniowo ulegał zwolnieniu, a po kilku miesiącach zatrzymaniu [14]. Trzy lata później Charles William Beebe ( ) wraz z Jamesem Ewingiem ( ) zdołali utrzymać in vitro komórki chłoniakomięsaka pochodzące od psa. Pożywką dla komórek było osocze [15,16]. Największym problemem był dobór podłoża odpowiedniego do wzrostu danej linii komórkowej. Opracowana w 1910 r. przez Maurice Vejux Tyrode ( ) receptura roztworu soli nieorganicznych, mniej specyficznego niż roztwór Ringera, znalazła zastosowanie w pierwotnej hodowli komórek ssaków [17]. Roztwór ten służył do rozcieńczania białkowych składników podłoży do hodowli pochodzenia naturalnego i jest do dziś używany jako płyn nawadniający, służący do transportowania i rozcieńczania zawiesin komórkowych z zachowaniem wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej równowagi osmotycznej. W 1907 r. w Stanach Zjednoczonych Ross G. Harrison uzyskał in vitro zróżnicowane komórki nerwowe nerwu promieniowego embrionów płazów. Pierwsze obserwacje Harissona dotyczyły żaby, której komórki nie są wymagające w hodowli. Badacz wykorzystał komórki żaby, zwierzęcia zmiennocieplnego, ponieważ nie wymagały one inkubacji. Zademonstrował wzrost żyjącej tkanki zwierzęcej poza organizmem, izolując fragment struny nerwowej kijanki i umieszczając go w kropli limfy. Wykazał, że komórki nerwowe charakteryzują się własnym wzrostem i wydłużają się zależnie od potrzeb [18,19]. Opracował technikę hodowli komórek w kropli wiszącej, a wraz z Montrose T. Burrows technikę hodowania komórek w kropli zakrzepłego na mikroskopowym szkiełku podstawowym osocza. Har-

4 588 Inżynieria tkankowa Nr 7 8 rison był dwukrotnie w 1917 i 1933 r. kandydatem do nagrody Nobla, nigdy jednak jej nie otrzymał: w 1917 r. jury nie przyznało żadnej nagrody w dziedzinie medycyny, zaś w 1933 r. wartość opracowanych przez niego metod hodowli tkankowej uznano za ograniczoną. Ross Harrison przez wielu uważany jest za twórcę metod stosowanych w hodowli komórkowej. Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w 1912 r. otrzymał Alexis Carrel ( ; ryc. 8). Jego badania dotyczyły głównie chirurgii eksperymentalnej, transplantacji tkanek i całych narządów [20]. Carrel specjalizował się w chirurgii klatki piersiowej, a zwłaszcza we wszczepianiu zastawek do serca. Współpracował on z wieloma naukowcami, m.in. z Burrowsem i Geyem. Montrose Thomas Burrows, asystent Carrela, został przez niego wysłany do laboratorium Harrisona, aby nauczyć się technik hodowli komórkowej, które można by później zaadaptować do badań nad zwierzętami stałocieplnymi. W latach Burrows i Carrel z powodzeniem utrzymywali w hodowli eksplanty pochodzące od dorosłych psów, kotów, szczurów i świnek morskich, a także tkanki nowotworowe. Carrel starał się udoskonalić aseptyczne techniki hodowli i wykazał, że dzięki wykorzystaniu ekstraktu z zarodków, możliwe jest utrzymywanie komórek ex vivo przez długie lata. Carrel uzyskał hodowlę ciągłą przez regularne pasażowanie fibroblastów z serca kurczaka do świeżej pożywki hodowlanej. Sukces osiągnął dzięki użyciu pożywki podstawowej, jaką było osocze krwi, do którego dodał wyekstrahowane z płodów czynniki wzrostu [21]. Hodowlę linii komórkowej stworzonej przez Carrela kontynuował przez 34 lata Albert H. Ebeling. Używał on tej hodowli do testowania środków bakteriobójczych [22]. Dziesięć lat później Ebelingowi udało się założyć hodowlę komórek nabłonkowych. Opracowano techniki hodowli komórkowej w płaskich naczyniach hodowlanych, tzw. T-flasks (1923 r.). W 1933 r. Carrel wraz z George Otto Geyem przedstawili technikę hodowli w butelkach w kształcie walca, tzw. roller tube. Badania te dały podstawy eksperymentom wirusologicznym i stworzeniu szczepionek, m.in. przeciwko wirusowi poliomyelitis i odry. Dzięki osiągnięciom Alexisa Carrela możliwe stało się hodowanie komórek na dużą skalę. W 1916 r. Peyton Rous (ryc. 9) i S.F. Jones po raz pierwszy użyli enzymu proteolitycznego, trypsyny, w celu oddysocjowania pojedynczych komórek od Ryc. 8. Alexis Carrel ( ). Ryc. 9. Peyton Rous ( ). fragmentów tkanki. Oddysocjowane komórki umieszczono w pożywce hodowlanej, uzyskując zawiesinę żywych komórek [23]. Wcześniej hodowle otrzymywano z niewielkich eksplantów tkanki, które przytwierdzano do ściany naczynia. Z takiego eksplantu komórki spełzały i pokrywały powierzchnie naczynia hodowlanego. Komórki takie nie są w stanie odtworzyć struktury tkankowej. Eksplant początkowy ulegał dezorganizacji i obumierał. Były to więc hodowle komórkowe, a nie tkankowe. Hodowle takie były możliwe, ponieważ większość hodowanych komórek charakteryzuje się wzrostem zależnym od zakotwiczenia. Pierwsza połowa ubiegłego stulecia zaowocowała wieloma sukcesami w dziedzinie rozwoju hodowli komórkowej (tab. I), lecz dopiero w latach 50. opanowanie metod zakładania pierwotnych hodowli komórek ptaków i ssaków (zwierzęta stałocieplne) przyczyniło się do szybkiego rozwoju technik hodowli tkankowej. Piśmiennictwo [1] Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science 1993; 260: [2] Skalak R, Fox CF (eds.). Tissue Engineering, Alan R. Liss Inc., New York 1988, preface page xx. [3] Vacanti JP, Langer R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet 1999; 354(supl. 1): SI32 SI34. [4] Sipe JD. Tissue engineering and reparative medicine. Ann N Y Acad Sci 2002; 961: 1 9. [5] Langer R, Vacanti JP. Artificial organs. Sci Am 1995; 273(3): [6] Stedman TL. Stedman s Medical Dictionary. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1982, 241. [7] Stedman TL. Stedman s Medical Dictionary. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1982, [8] Lukrecjusz [Titus Lucretius Carus]. O naturze wszechrzeczy. Przekł. E. Szymański, komentarz K. Leśniak. PWN. Warszawa [9] Hooke R. Micrographia: or some physiological descriptions of minute bodies made by magnifying glasses [10] Mulligan L. Robert Hooke s Memoranda : memory and natural history. Ann Sci 1992; 49,

5 589 [11] Pearce JM. Edmé Félix Alfred Vulpian ( ). J Neurol 2002; 249(12): [12] Zimmer HG. Sydney Ringer, serendipity and hard work. Clin Cardiol 2005; 28: [13] Orchard CH, Eisner DA, Allen DG. Sydney Ringer viewed in a new light. Cardiovasc Res 1994; 28: [14] Laubry C. Justin Jolly ( ). Rev Hematol 1953; 8(2): [15] Huvos AG. James Ewing: cancer man. Ann Diagn Pathol 1998; 2(2): [16] Zantinga AR, Coppes MJ. James Ewing ( ): the chief. Med Pediatr Oncol 1993; 21(7): [17] Tyrode MV. The mode of action of some purgative salts. Arch Int Pharmacodyn Ther 1910; 20: [18] Harrisson RG. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med 1907; 4: [19] Gahwiler BH. Nerve cells in culture: the extraordinary discovery of Ross Granville Harrison. Brain Res Bull 1999; 50(5 6): [20] Carrel A. On the permanent life of tissue outside the organism. J Exp Med 1912; 15: [21] Carrel A. The preservation of tissues and its applications in surgery Clin Orthop 1992; 278: 2 8. [22] Ebeling, AH. The permanent life of connective tissue outside of the organism. J Exp Med 1913; 17: [23] Rous P, Jones FS. A method for obtaining suspensions of living cells from fixed tissues, and for the plating out of individual cells. J Exp Med 1916; 23: Adres autorów: Dorota Olszewska-Słonina, Katedra i Zakład Biologii Medycznej CM UMK, ul. Karłowicza 24, Bydgoszcz, tel. (0-52) , fax (0-52) , dorolsze@poczta.onet.pl CELL CULTURE, TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE. PART I Summary Tissue engineering is an interdisciplinary field that applies the principles and methods of engineering and the cell culture toward the development of biomaterials that restore, maintain or improve tissue function. The amalgamation of engineering and medicine has interested many scientists for at last two hundred years. What was the goal of cell culture? First, for progress in life sciences achievement and subsequent for virology and toxicology development. In vitro studies are done because of many problems with carrying out animal experiments. In this work the authors present the attempts of physicians, anatomopathologists, embryologists and biologists which contributed to fast development of new area in medicine tissue engineering. Key words: tissue culture, cell culture, tissue engineering.