PL B1. INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO IM. PROF. WACŁAWA DĄBROWSKIEGO, Warszawa, PL

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (13) B1 (51) Int.Cl. C12R 1/24 ( ) C12R 1/25 ( ) C12N 1/20 ( ) A23L 1/218 ( ) A23B 7/155 ( ) (54) Bakteryjna kultura starterowa do kiszenia ogórków (73) Uprawniony z patentu: INSTYTUT BIOTECHNOLOGII PRZEMYSŁU ROLNO-SPOŻYWCZEGO IM. PROF. WACŁAWA DĄBROWSKIEGO, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 14/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/14 (72) Twórca(y) wynalazku: KRYSTYNA STECKA, Warszawa, PL BEATA CHABŁOWSKA, Warszawa, PL ANNA MISIEWICZ, Warszawa, PL JOANNA ROZMIERSKA, Piaseczno, PL KATARZYNA PIASECKA-JÓŹWIAK, Warszawa, PL ROMAN A. GRZYBOWSKI, Warszawa, PL HANNA ZŁOTKOWSKA, Warszawa, PL JACEK URBANEK, Łowicz, PL JUSTYNA GÓRKA, Łaźniki, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Karyna Kuciak-Próchniak

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest bakteryjna kultura starterowa do kiszenia ogórków składająca się z bakterii fermentacji mlekowej wyizolowanych z kiszonych ogórków, poddanych fermentacji spontanicznej. Konserwowanie surowca roślinnego poprzez kiszenie (fermentację) jest jedną z najstarszych, znanych człowiekowi, metod przechowywania żywności. Obecnie fermentacja warzyw nie stanowi już wyłącznie metody konserwacji surowców lecz jest jednym ze sposobów uatrakcyjniania asortymentu produktów spożywczych. Dużą wagę przykłada się do zachowania tradycyjnego smaku i zapachu kiszonych produktów [Clark, 2004; Sieczko,2009]. Kiszonki zawierają kwas mlekowy, który nadaje produktom przyjemny, orzeźwiający smak i obniża ph w jelitach, co stwarza korzystne warunki dla rozwoju naturalnej mikroflory jelitowej, hamuje rozwój bakterii gnilnych, pomaga oczyścić przewód pokarmowy z toksyn i wspomaga trawienie. Swoje prozdrowotne i organoleptyczne właściwości kiszonki zawdzięczają procesowi fermentacji prowadzonemu przez bakterie fermentacji mlekowej (LAB) [Usajewicz, 2005; Chan-Ho-Lee et al.,2008]. Jakość kiszonek warzywnych otrzymanych w wyniku naturalnej fermentacji mlekowej, jest w znacznym stopniu zależna od mikroorganizmów bytujących na surowcu (Desai, Sheit,1997; Akpinar-Bayizit et al.,2007). W niekorzystnych warunkach glebowo-klimatycznych, warzywa mogą być w znacznym stopniu zakażone bakteriami przetrwalnikującymi, patogenami z rodzajów Salmonella, Shigella, Escherichia, Listeria, bakteriami śluzowymi i drożdżami, co może powodować zdominowanie bakterii fermentacji mlekowej przez te drobnoustroje, które powodują obniżenie jakości kiszonek (Gomez i in. 2002, Yaakoubi i in. 2009). Dlatego też celowym jest inicjowanie fermentacji poprzez wprowadzenie kultur starterowych o odpowiednio dobranym składzie [Caplice, Fitzgerald, 1999; Desai, Sheit, 1997; Savard et al., 2000, Leros, De Vuyst, 2005;]. Stosowanie kultur starterowych, w porównaniu z prowadzeniem fermentacji spontanicznej, zapewnia właściwy rozwój mikroflory odpowiedzialnej za fermentację, większą możliwość wpływu na cechy smakowo-zapachowe, a zatem stałą jakość kiszonek. Stosowanie kultur starterowych jest powszechną praktyką w mleczarstwie, w produkcji fermentowanych wędlin, a także pieczywa. W sprzedaży istnieją kultury starterowe przeznaczone do pieczywa, szczepionki mleczarskie oraz przeznaczone do kiszenia pasz. Badacze włoscy (Cagno et al.2008] porównali efekt kiszenia marchwi i fasoli przy użyciu kultur starterowych, złożonych ze szczepów bakterii wyizolowanych z tych warzyw (bakterii autochtonicznych) z produktami otrzymanymi przy użyciu kultur starterowych pochodzących z międzynarodowych kolekcji (bakterii allochtonicznych). Wyżej został oceniony zapach produktów uzyskanych z zastosowaniem szczepów bakterii autochtonicznych. Również wielu konsumentów uważa, że wyroby otrzymywane z zastosowaniem szczepów bakterii allochtonicznych tracą swój tradycyjny, charakterystyczny smak i zapach. Zatem idealna kultura starterowa powinna umożliwić otrzymywanie kiszonek dorównujących smakowitością dobrej jakości kiszonkom uzyskanym W wyniku fermentacji spontanicznej. Dlatego też najkorzystniej jest jeśli w skład kultury starterowej wchodzą autochtoniczne bakterie fermentacji mlekowej wyizolowane z naturalnie fermentujących kiszonek warzywnych. Zastosowanie w kulturze starterowej odpowiednio dobranych szczepów bakterii, charakteryzujących się wyjątkowo wysoką aktywnością antybakteryjną, między innymi skierowaną przeciwko szczepom bakterii patogennych z gatunków E.coli, Salmonella sp. zapewnia bezpieczeństwo wyrobów kiszonych. Antymikrobiologiczną aktywność wykazują także olejki roślinne. Wykazano, że wyekstrahowane z niektórych roślin jak na przykład: kolendra, rozmaryn, mięta, oregano, goździki, cebula, czosnek, kminek, chili, olejki charakteryzują się udowodnionymi właściwościami antybakteryjnymi; np. allicyna wobec bakterii z rodzajów Escherichia, Salmonella, Staphylococcus, Klebsiella, Clostridium, eugenol i geraniol wobec gatunków Escherichia coli, Salmonella typhimurium. Listeria monocytogenes, tymol wobec w/w gatunków i Listerii monocytogenes. Olejki roślinne, jako produkty naturalne, charakteryzują się statusem GRAS, ponadto, w przeciwieństwie do antybiotyków łatwo ulegają biodegradacji. Wrażliwość poszczególnych gatunków bakterii na obecność olejków roślinnych jest zróżnicowana.

3 PL B1 3 Bakterie wchodzące w skład kultur powinny charakteryzować się m.in. zdolnością do szybkiego opanowywania środowiska, syntezy związków o właściwościach antymikrobiologicznych oraz związków pozytywnie wpływających na cechy organoleptyczne kiszonych ogórków. Poszukiwanie nowych szczepów bakterii fermentacji mlekowej endogennie występujących w różnych produktach fermentowanych, a zatem nie modyfikowanych genetycznie, charakteryzujących się oczekiwanymi, cennymi technologicznie właściwościami jest wciąż przedmiotem badań. Selekcja mikroorganizmów i opracowanie składu kultur starterowych jest ekonomicznym wymogiem produkcji przemysłowej. Ze względu na warunki panujące podczas przemysłowego kiszenia warzyw istotną cechą bakterii fermentacji mlekowej jest zdolność do wzrostu i syntezy kwasu mlekowego w szerokim zakresie temperatur od 10 C do 30 C. Celem wynalazku było wyselekcjonowanie, z naturalnie fermentujących ogórków, szczepów bakterii fermentacji mlekowej, charakteryzujących się zdolnością do hamowania rozwoju bakterii patogennych, zwłaszcza z gatunków E.coli i Salmonella sp. oraz prowadzenia fermentacji mlekowej, w wyniku której powstaje produkt o walorach smakowo-zapachowych charakterystycznych dla ogórków kiszonych metodą tradycyjną poprzez prawidłowo przebiegającą fermentację spontaniczną. Kultura starterowa według wynalazku zawierająca mieszaną kulturę bakterii fermentacji mlekowej w postaci biomasy ewentualnie w postaci granulatu charakteryzuje się tym, że w jej skład wchodzą szczepy: Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p i Lactobacillus plantarum KKP 2033p, przy czym stosunek poszczególnych szczepów w mieszaninie wynosi jak od 1 do 2 : od 1 do 2 : od 0,5 do 2, najkorzystniej jak 1:1:1. Ponadto kultura może zawierać olejek tymiankowy i/lub rozmarynowy i w ilości 0,1-1% wagowych. Kultura według wynalazku zawiera co najmniej jtk/g bakterii w biomasie i co najmniej 5,0x10 9 jtk/g bakterii w granulacie. Szczepy Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p i Lactobacillus plantarum KKP 2033p zostały zdeponowane w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechinologii Przemysłu Rolno-Spożywczego. Szczepy będące przedmiotem wynalazku należą do gatunku L.plantarum, są to Gram-dodatnie fakultatywnie anaerobowe pałeczki. W wyniku prowadzonej przez te heterofermentacyjne bakterie fermentacji mlekowej, z cukrowców oprócz kwasu mlekowego powstają również inne produkty jak etanol i kwas octowy. Szczep KKP 2031P syntetyzuje 0,50 g/100 ml kwasu mlekowego z glukozy (podłoże MRS 20 g/l) po 3 dobach hodowli, KKP 2032p syntetyzuje w tych warunkach 2,43 g kwasu mlekowego) zaś szczep KKP 2033p 2,45 g. Wszystkie szczepy charakteryzują się opornością na niskie ph środowiska tj. po inkubacji w ph 3 (5 h) ich liczba w stosunku do kontroli zmniejsza się o dwa rzędy wielkości (z poziomu do poziomu 10 9 ). KKP 2031P charakteryzuje się zdolnością do hamowania wzrostu Salmonella CO, Listeria innocua, Salmonella Enteritidis, E. coli po 24, 48 i 72 godzinach w zakresie temperatur C. KKP 2032p charakteryzuje się zdolnością do hamowania wzrostu Salmonella D, Salmonella CO, Listeria innocua, Salmonella Enteritidis po 24, 48 i 72 godzinach w zakresie temperatur C. KKP 2033p charakteryzuje się zdolnością do hamowania wzrostu Salmonella CO, Listeria innocua, Salmonella Enteritidis, po 24, 48 i 72 godzinach w zakresie temperatur C. Wzrost w niskiej temperaturze 10 C w podłożu MRS był porównywalny ze wzrostem w temperaturach 30 C i 37 C w przypadku wszystkich szczepów. Zastosowane w wynalazku szczepy bakterii fermentacji mlekowej wyizolowano z poddanych samorzutnej fermentacji ogórków i wybór ich jest wynikiem wcześniejszej selekcji spośród grupy nowo wyizolowanych kilkudziesięciu szczepów, które przy pomocy testów biochemicznych przypisano do gatunków Lactobacillus plantarum oraz Lactobacillus brevis. Szczepy selekcjonowano pod względem zdolności do syntezy kwasu mlekowego, zdolności do hamowania wzrostu bakterii patogennych i technologicznie niepożądanych. Szczepy bakterii zostały następnie zidentyfikowane poprzez analizę sekwencji 16S rdna. Af i- liację taksonomiczną szczepów bakterii do gatunku Lactobacillus plantarum potwierdzono na podstawie porównania z sekwencjami bakteryjnych odcinków 16S rdna, zdeponowanymi w bazie GenBank stwierdzenia ich zgodności w 99%., (różnicowanie międzygatunkowe wewnątrzgatunkowe RAPD-PCR).

4 4 PL B1 Wyselekcjonowane szczepy bakterii w postaci monokultur i kultur mieszanych zastosowano do kiszenia ogórków. W trakcie prowadzenia wielu prób w skali laboratoryjnej i technicznej nieoczekiwanie okazało się, że cel wynalazku został osiągnięty jedynie przy użyciu mieszanej kultury start e- rowej zawierającej bakterie Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p i Lactobacillus plantarum KKP 2033p. Ponadto okazało się, że dodatek olejków: tymiankowego i/lub rozmarynowego spowodował przyspieszenie wystąpienia efektu antybakteryjnego kultury starterowej. Nie stwierdzono hamującego wpływu olejków na szczepy L.plantarum KKP 2031 p, L.plantarum KKP 2032p i L.plantarum KKP 2033p, natomiast strefy zahamowania wzrostu bakterii wskaźnikowych z rodziny Enterobacteriaceae, przez szczepy wchodzące w skład kultury pojawiły się już po 20 godzinach. Skomponowane wananty kultur starterowych zostały zastosowane w próbach kiszenia ogórków w skali laboratoryjnej i technicznej. Fermentację ogórków z udziałem kultur starterowych z dodatkiem olejków lub bez prowadzono w temperaturze 15 lub 25 C przez 4-7 dni. Otrzymane kiszonki sprawdzono pod względem mikrobiologicznym oraz poddano ocenie organoleptycznej. Obecność bakterii z grupy coli (gatunki Escherichia coli, Shigella, Salmonella) w kiszonych ogórkach, otrzymanych przy zastosowaniu kultur starterowych złożonych z poszczególnych szczepów bakterii w monokulturach oraz z kilku szczepów (kultury wieloskładnikowe) określano na początku procesu fermentacji oraz po 4, 7 i 10 dniach fermentacji. Wszystkie kultury starterowe dodawano w ilości 10 6 jtk/ml zalewy. Wykonano również próbę kontrolną - bez dodatku kultury starterowej oraz po dwa powtórzenia każdego wariantu. Czas kiszenia wynosił 7 dni, a dodatek soli 3% wagowych. T a b e l a 1 Ocena mikrobiologiczna ogórków kiszonych otrzymanych przy zastosowaniu wyselekcjonowanych wstępnie kultur starterowych w porównaniu do kultury starterowej według wynalazku Rodzaj próby Grupy drobnoustrojów Grupa coli Salmonella Suma bakterii z rodzajów Escherichia i Salmonella Początek fermentacjtacji Początek fermen- Po 7 dniach fermentacji Fermentacja spontaniczna (próba kontrolna) 3,0x10 4 2,0x ,0x10 3 L.plantarum KKP ,5x10 4 3,5x10 4 2,2x10 3 L.plantarum KKP ,0x10 4 1,5x10O 4 1,0x10 1 L.plantarum KKP ,0x10 4 2,0x10 4 4,0x10 3 L.plantarum KKP ,0x10 4 6,0x10 4 6,4x10 4 L.plantarum KKP ,0x10 4 2,2x10 4 6,0x10 1 L.plantarum KKP ,0x10 4 4,0x10 4 1,0x10 4 L.plantarum KKP ,2x10 4 2,5x10 4 6,0x10 3 L.plantarum KKP 2031 p 3,0x10 4 2,0x10 4 3,0x10 4 L.plantarum KKP 2032p 5,0x10 4 5,0x10 4 7,2x10 4 L.plantarum KKP 2033p 7,0x10 4 6,0x10 4 5,0x10 3 L.plantarum KKP 1838 L.brevis KKP 1839, Pediococcus pentosaceus KKP 1840 L.plantarumKKP 1838, L.plantarumKKP 1841, L.plantarum KKP 1842, L.plantarum KKP 1843, L.plantarum KKP ,0x10 4 1,5x10 4 * 1,4x10 5 2,0x10 4 1,6x10 4 2,8x10 5

5 PL B1 5 ciąg dalszy tabeli L.plantarum KKP 1838, L.brevis KKP 1839, P.pentosaceus KKP 1840, L.plantarum KKP 1841, L.plantarum KKP 1842, L.plantarum KKP 1843, L.plantarum KKP o1844 6,0x10 4 1,2x10 5 1,0x10 3 L.plantarum KKP 1838, L.brevis KKP 1839, P. KKP 1840, L.plantarum KKP 1844 Kultura starterowa według wynalazku L.plantarum KKP 2031 p, L.plantarum KKP 2032p, L.plantarum KKP 2033p Kultura starterowa według wynalazku z olejkiem rozmarynowym L plantarum KKP 2031 p, L.plantarum KKP 2032p, L.plantarum KKP 2033p 8,0x10 4 2,0x10 5 1,5x10 3 2,4x10 5 1,2x10 5 brak 4,4x10 5 1,4x10 5 brak już po 4 dniach T a b e l a 2 Ocena organoleptyczna ogórków kiszonych otrzymanych przy zastosowaniu kultur starterowych składających się z różnych szczepów LAB Rodzaj kultury starterowej Składowe oceny sensorycznej Barwa i wygląd Zapach Smak konsystencja Ocena hedoniczna Fermentacja spontaniczna (próba kontrolna) 4,8 4,5 4,3 4,6 6,3 L.plantarum KKP ,8 4,1 4,2 4,4 6,7 L.plantarum KKP ,8 3,9 3,9 4,7 6,0 L.plantarum KKP ,9 3,8 3,8 4,7 6,3 L.plantarum KKP ,0 3,5 3,3 3,5 4,0 L.plantarum KKP ,6 4,1 3,9 4,7 5,4 L.plantarum KKP ,0 4,1 4,9 5,1 7,4 L.plantarum KKP ,8 3,7 3,8 4,7 6,0 L.plantarum KKP 2031 p 4,0 3,5 3,7 3,5 5,1 L.plantarum KKP 2032p 4,8 3,4 4,0 5,0 6,7 L.plantarum KKP 2033p 4,7 3,1 3,2 4,3 3,7 L.plantarum KKP 1838 L.brevis KKP 1839, Pediococcus pentosaceus KKP 1840 L.plantarumKKP 1838, L.plantarumKKP 1841, L.plantarum KKP 1842, L.plantarum KKP 1843, L.plantarum KKP 1844 L.plantarum KKP 1838, L.brevis KKP 1839, P.pentosaceus KKP 1840, L.plantarum KKP 1841, L.plantarum KKP 1842, L.plantarum KKP 1843, L.plantarum KKP o1844 4,5 4,3 4,0 4,4 5,9 4,9 3,9 4,1 5,0 6,1 5,1 4,6 4,6 4,9 7,2

6 6 PL B1 ciąg dalszy tabeli L.plantarum KKP 1838, L.brevis KKP 1839, P. KKP 1840, L.plantarum KKP 1844 Kultura starterowa według wynalazku L.plantarum KKP 2031 p, L.plantarum KKP 2032p, L.plantarum KKP 2033p Kultura starterowa według wynalazku z olejkiem rozmarynowym L.plantarum KKP 2031 p, L.plantarum KKP 2032p, L.plantarum KKP 2033p 5,2 4,1 4,9 5,1 7,4 4,9 4,4 4,6 5,0 7,8 5,0 4,5 4,6 5,0 8,0 Wynalazek ilustrują przykłady wykonania, nie ograniczające jego zakresu. P r z y k ł a d I Kulturę starterową do kiszenia ogórków w postaci biomasy otrzymano w ten sposób, że w przypadku każdego szczepu oddzielnie namnażano inokulum (stadium probówkowe oraz stadium koibkowe w trzech etapach), prowadzono hodowlę bakterii w podłożu płynnym w bioreaktorach. Po zakończeniu hodowli biomasę wydzielono przez odwirowanie. W biomasie poszczególnych szczepów oznaczano liczbę bakterii. Następnie biomasy poszczególnych szczepów charakteryzujące się liczbą bakterii w gramie (1-3) jtk/g mieszano proporcjach podanych w poniższej tabeli. Przykład I a Przykład I b Przykład I c Przykład I d T a b e l a 3 Przykłady otrzymania preparatu bakteryjnego w postaci biomasy Szczepy bakterii Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus plantarum KKP 2031P plantarum KKP 2032p plantarum KKP 2033p 10 g biomasy 10 g biomasy Sg biomasy 3,0 x ,0 x g biomasy 3,0 x , 3,0 x g biomasy 1 2, proporcje 1:2:2 2:2:1 2:2:0,5 1:1:1 P r z y k ł a d Il Kulturę starterową do kiszenia ogórków w postaci granulatu otrzymano w ten sposób, że w przypadku każdego szczepu oddzielnie namnażano inokulum, prowadzono hodowlę bakterii i wydzielano biomasę bakterii jak w przykładzie I. Następnie mieszano biomasę każdego szczepu z nośnikami składającymi się z surowców sacharydowych, a następnie poddawano procesowi granulowania i suszenia metodą fluidyzacyjną. Podczas suszenia w złożu fluidalnym temperatura nie przekraczała 3 C. Po wysuszeniu kontrolowano zawartość bakterii w preparacie poprzez wykonanie posiewów mikrobiologicznych. Otrzymano preparaty o zawartości bakterii co najmniej 1 x 10 9 jtk/g. Wysuszone preparaty poszczególnych szczepów bakterii: Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p, i Lactobacillus plantarum KKP 2033p zmieszano w stosunku wagowym jak 1:1:1.

7 PL B1 7 P r z y k ł a d III Kulturę starterową do kiszenia ogórków w postaci granulatu otrzymano w ten sposób, że hodowlę bakterii i wydzielanie biomasy prowadzono sposób analogiczny jak w przykładzie I. Następnie mieszano biomasę każdego szczepu z nośnikami składającymi się z surowców sacharydowych i olejkiem tymiankowym w ilości 0,3% wagowych, a następnie poddawano procesowi granulowania i suszenia metodą fluidyzacyjną. Podczas suszenia w złożu fluidalnym temperatura nie przekraczała 37 C. Po wysuszeniu kontrolowano zawartość bakterii w preparacie poprzez wykonanie posiewów mikrobiologicznych. Otrzymano preparaty o zawartości bakterii co najmniej 1x 10 9 jtk/g. Wysuszone preparaty poszczególnych szczepów bakterii: Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p, i Lactobacillus plantarum KKP 2033p zmieszano w stosunku wagowym jak 1:2:2. P r z y k ł a d IV Preparaty kultury starterowej otrzymane według przykładu Il i iii rozpuszczono w proporcji 63 g/100 ml wody. Otrzymany roztwór dodano do 1000 I zalewy solankowej, którą zalano 630 kg ogórków przygotowanych do kiszenia. Fermentację ogórków prowadzono w temperaturze 15 C przez 7 dni. Otrzymane kiszonki oceniono pod względem mikrobiologicznym i organoleptycznym w otrzymanych ogórkach kiszonych nie stwierdzono obecności bakterii z gatunków E.coli i Salmonella sp. Jakość sensoryczną uzyskanych kiszonek, w porównaniu do kiszonki bez dodatku preparatu, oceniono stosując 6-cio punktową skalę do oceny wyglądu, zapachu, smaku, konsystencji oraz 9-cio punktową skalę hedoniczną do oceny ogólnej akceptowalności produktu, wg PN-ISO 4121:1998. Ocenę sensoryczną przeprowadził panel dziewięciu osób. Wyniki analizy sensorycznej poddano analizie statystycznej korzystając z programu STATISTICA 8, wyniki te podano w tabeli 2. Zastrzeżenia patentowe 1. Bakteryjna kultura starterowa do kiszenia ogórków zawierająca mieszaną kulturę bakterii fermentacji mlekowej w postaci biomasy ewentualnie w postaci granulatu, znamienna tym, że w jej skład wchodzą szczepy; Lactobacillus plantarum KKP 2031 p, Lactobacillus plantarum KKP 2032p i Lactobacillus plantarum KKP 2033p, przy czym stosunek poszczególnych szczepów w mieszaninie wynosi jak od 1 do 2 : od 1 do 2 : od 0,5 do 2, najkorzystniej jak 1:1:1 a ponadto kultura starterowa ewentualnie zawiera olejek tymiankowy i/lub rozmarynowy w ilości w ilości 0,1-1% wagowych. 2. Bakteryjna kultura starterowa według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej jtk/g bakterii w biomasie i co najmniej 5,0 x 10 9 jtk/g bakterii w granulacie.

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)