SESJA 5 STRUKTURA, MODYFIKACJE I FUNKCJE BIAŁEK WYKŁADY

Transkrypt

1 SESJA 5 STRUKTURA, MODYFIKACJE I FUNKCJE BIAŁEK WYKŁADY

2 90 SESJA 5 WYKŁADY W05-01 ROZPOZNANIE LIGANDÓW BIAŁKOWYCH PRZEZ RECEPTORY INTEGRYNOWE Czesław Cierniewski Zaklad Biofizyki Akademii Medycznej, Łódź Centrum Mikrobiologii i Wirusologii PAN w Łodzi Receptory integrynowe rozpoznają krótkie motywy sekwencyjne i dzięki temu mogą tworzyć odwracalne kompleksy z licznymi białkami adhezyjnymi. Przebieg tej reakcji kontrolowany jest przez kationy dwuwartościowe, które decydują nie tylko o kinetyce, ale także o rodzaju przyłączanego bialłka. Do tej pory poznano budowęprzestrzenną tylko kilku fragmentów różnych receptorów integrynowych, które tworzą tzw. domenęi (np. M, L, 2). Domena I tworzy kieszeń wiażącą ligandy białkowe, a także kationy (Ca 2+,Mg 2+, lub Mn 2+ ). Jest to tzw. miejsce adhezyjne zależne od kationów (MIDAS). W tej grupie receptorów motyw MIDAS osadzony jest na domenie utworzonej z siedmiu segmentów o powtarzającej sięsekwencji aminokwasowej, które prawdopodobnie przyjmują strukturę -propeller. Receptory integrynowe zawierające podjednostkę 3(receptor fibrynogenu aiib/b3 i witronektyny av/b3) pozbawione są typowej domeny I. N-końcowy region podjednostki 3, mimo małego podobieństwa w strukturze I-rzędowej, wykazuje jednak znaczną homologię pod względem struktury II-rzędowej z domeną I. Przypuszcza się więc, że może przyjmować zbliżony do niej układ przestrzenny. Z modelu fragmentu b3(95 373), sporządzonego przy pomocy SiliconGraphics wynika, że rdzeń tego regionu może przyjmować strukturędomeny I, która wystepuje w podjednostkach Mi L. Różnica sprowadza siędo występowania w b3(93 373) trzech dodatkowych pętli, które wychodzą na zewnątrz z rdzenia cząsteczki. Jedna z nich, leżąca po przeciwnej stronie cząsteczki od motywu MIDAS, utworzona jest w znacznej części przez segment Q206 E220. Właśnie w tym regionie zidentyfikowalismy ostatnio dodatkowe miejsce wiążące kationy, które po przyłączenię jonu Ca 2+ blokuje wiązanie ligandu białkowego z receptorem.

3 STRUKTURA, MODYFIKACJE I FUNKCJE BIAŁEK 91 W05-02 WYSOKOROZDZIELCZA STRUKTURA KRYSTALICZNA MUTANTA BPTI Mariusz Jaskólski Zakład Krystalografii, Wydział Chemii UAM, Centrum Badań Biokrystalograficznych IChB PAN BPTI, białkowy inhibitor trypsyny z trzustki, wiąże sięz enzymem za pomocą eksponowanej pętli, w której centralną rolęodgrywa reszta K15. W badanym mutancie (Otlewski, Inst. Bioch. i Biol. Mol. UWr) dwie reszty w pętli (T11, P13) skrócono do alaniny, w pozycji 15 umieszczono argininę, oraz dokonano zmiany M52L. W przeciwieństwie do natywnego białka, mutant ten krystalizuje łatwo a kryształy rozpraszają promieniowanie rentgenowskie z bardzo wysoką rozdzielczością. Dane dyfrakcyjne o rozdzielczości 0.86 A zmierzono w temp. 100 K używając promieniowania synchrotronowego. Ogromna liczba obserwacji pozwoliła na udokładnienie anizotropowe (R=0.103) bez więzów geometrycznych w najlepiej uporządkowanych obszarach. Z drugiej strony okazało się, że aż 20% reszt wykazuje znaczną swobodę konformacyjną. Dotyczy to również jednego z mostków dwusiarczkowych (14 38), który współistnieje w odmianie prawo- i lewoskrętnej. Choć obie grupy terminalne są uporządkowane i związane mostkiem solnym, tandem GG poprzedzający końcową alaninęposiada podwójną konformację. Przez oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe nieuporządkowanie tego odcinka skorelowane jest z zachowaniem łańcucha bocznego R1, a poprzez oddziaływania sieciowe z udziałem K26, również z nieuporządkowaniem łańcucha głównego L26. Pięć cząsteczek wody zaokludowanch we wnętrzu białka posiada doskonałą gęstość elektronową pozwalającą przypisać im atomy H i ustalić sposób powiązań wodorowych. Atomy H widoczne są też w obszarach arkuszy (w tym w arkuszu międzycząsteczkowym) potwierdzając udział wiązań C -H..O w dodatkowej stabilizacji tych struktur. Zaobserwowano niezwykłe wiązania N-H..B z układem aromatycznym Y35. Nietypowa konformacja dwu reszt asparaginowych może być wytłumaczona oddziaływaniami dipolowymi. Uzyskane wyniki wskazują, że niektóre więzy stosowane w udokładnianiu są niezupełnie poprawne lub zbyt sztywne. Dotyczy to kontaktów niewiążących oraz planarności układu peptydowego, który w zbadanej strukturze wykazuje odstępstwa od idealnej płaskości dochodzące do 201. Także kąt walencyjny N-C -C wykazuje znaczny rozrzut.

4 92 SESJA 5 WYKŁADY W05-03 KWAŚNY FIBROBLASTYCZNY CZYNNIK WZROSTOWY (afgf) MECHANIZM WNIKANIA DO KOMÓRKI Jrrgen Wesche A, Antoni Więdłocha A, PDl Falnes A, Senyon Choe B, Sjur Olsnes A A: Department of Biochemistry, Institute for Cancer Research at The Norwegian Radium Hospital, Montebello, Oslo, Norway B: Structural Biology Laboratory, The Salk Institute, La Jolla, USA Kwaśny fibroblastyczny czynnik wzrostowy (afgf) jest silnym induktorem proliferacji, różnicowania i migracji komórek. Dużą aktywność afgf obserwuje siępodczas różnicowania embrionalnego i rozwoju płodowego. Ponadto, znany jest jako aktywator waskularyzacji oraz angiogenezy. Polipeptyd ten wiąże siędo swoistego receptora o aktywności kinazy tyrozyny, powodując jego aktywację. afgf nie posiada sekwencji liderowej, co powoduje, że nie jest on wydzielany na zewnątrz komórki drogą przez ER i aparat Golgiego. Cechą charakterystyczną tego czynnika wzrostu jest zdolność do transportu i kumulacji w jądrze komórkowym, zarówno jako białka endo- jak i egzogennego (co tłumaczy obecność NLS przy jego N-końcu). Egzogenny afgf jest transportowany do jądra podczas fazy G1 cyklu komórkowego. Jego obecność w jądrze bezpośrednio koreluje z aktywacją programu syntezy DNA. Utworzenie kompleksu ligand-receptor na powierzchni komórki jest wydarzeniem rozpoczynającym penetracjęafgf do wnętrza komórki. Mechanizm tego procesu jest słabo poznany. Przedstawione wyniki badań dowodzą, że egzogenny afgf jest translokowany do cytosolu bez fazy rozfałdowania, charakterystycznej dla wszystkich dotąd poznanych systemów transportu białek przez błonę. Jednocześnie wskazują one na istnienie nowego mechanizmu translokanji błonowej pewnych polipeptydów.

5 STRUKTURA, MODYFIKACJE I FUNKCJE BIAŁEK 93 W05-04 CHARAKTERYSTYKA KALRETYNINY MÓZGOWEGO BIAŁKA WIĄŻĄCEGO JONY WAPNIA Jacek Kuźnicki Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN, Warszawa Wśród występujących w mózgu białek wiążących wapń, najliczniejszą i najważniejszą grupę stanowią białka zawierające motywy EF-hand. Kalretynina posiada sześć takich motywów. Jej funkcja w neuronach nie jest wyjaśniona: może być ona zarówno buforem jak i sensorem wapniowym. Celem naszych badań jest wyjaśnienie struktury i funkcji kalretyniny oraz mechanizmów ekspresji jej genu. Wykorzystując takie metody jak NMR, FPLC, CD, fluorescencja, pomiary hydrofobowości, stabilności i podatności na ograniczoną proteolizęstwierdziliśmy, że rekombinowana kalretynina wyprodukowana w P. pastoris lub E. coli zmienia konformacjępo związaniu jonów wapnia. Taka właściwość charakteryzuje białka będące sensorami wapniowymi (np. kalmodulinę). Zidentyfikowaliśmy rejony cząsteczki odpowiedzialne za niektóre zmiany konformacyjne. Pokazaliśmy, że pierwsza domena kalretyniny, zawierająca I i II motyw EF-hand, ma inne właściwości niż homologiczna domena kalbindyny D28k, białka zawierającego również 6 motywów EF-hand. Różnice te mogą być odpowiedzialne za różne właściwości biologiczne obu białek. Ponadto wykazaliśmy, że białko fuzyjne kalretynina-gfp nie posiada właściwości buforu wapniowego w hodowanych komórkach glejaka C6. Stosując znakowane 15N i 13C domeny kalretyniny oznaczamy ich strukturę, zdolność do wzajemnych oddziaływań i do rekonstytucji aktywnego białka. W równolegle prowadzonych badaniach dotyczących ekspresji kalretyniny, zidentyfikowaliśmy rejon promotora genu tego białka oraz wiążący sięz nim czynnik transkrypcyjny odpowiedzialny za aktywność genu kalretyniny w neuronach. Doświadczenia wykonali: K. Billing-Marczak, P. Groves, A. Kaleta, J. Kuźnicki, M. Palczewska.