WPŁYW INHIBITORÓW Z NASION ROŚLIN SPOŻYWANYCH PRZEZ CZŁOWIEKA NA AKTYWNOŚĆ ENTEROPEPTYDAZY I AKTYWACJĘ TRYPSYNOGENU PRZEZ TEN AKTYWATOR

Transkrypt

1 BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. XLI, 2008, 3, str Marta Siergiejuk, Alicja Karwowska 1), Marek Gacko, Anna Worowska WPŁYW INHIBITORÓW Z NASION ROŚLIN SPOŻYWANYCH PRZEZ CZŁOWIEKA NA AKTYWNOŚĆ ENTEROPEPTYDAZY I AKTYWACJĘ TRYPSYNOGENU PRZEZ TEN AKTYWATOR Klinika Chirurgii Naczyń i Transplantacji Akademii Medycznej w Białymstoku Kierownik: dr hab. M Gacko 1) Zakład Analizy Instrumentalnej Akademii Medycznej w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. K. Worowski Ekstrakt z nasion fasoli hamuje aktywność enteropeptydazy. Aktywację trypsynogenu przez trypsynę hamują ekstrakty z nasion wszystkich 14 badanych gatunków roślin. Hasła kluczowe: nasiona roślin, enteropeptydaza, aktywacja trypsynogenu. Key words: plant seeds, enteropeptidase, trypsinogen activation. Podstawowe znaczenie w trawieniu białek w soku dwunastniczym posiada aktywacja trypsynogenu do trypsyny przez enteropeptydazę (1). Trypsyna aktywuje trypsynogen, a także chymotrypsynogen, proelastazę, prekarboksypeptydazę A, prekarboksypeptydazę B i profosfolipazę A (2). Ekstrakty z nasion wielu gatunków roślin hamują aktywność trypsyny, chymotrypsyny i elastazy oraz proteaz wchodzących w skład preparatu Kreon, Neo-Pancreatin i Panzakrat (3, 4). Celem pracy było określenie wpływu ekstraktu z nasion 14 gatunków roślin spożywanych przez człowieka na aktywność enterpeptydazy i aktywację trypsynogenu przez ten aktywator. MATERIAŁ I METODY Enteropeptydaza i trypsynogen firmy Sigma (USA); H-Gly-(Asp) 4 -Lys-βNA i Bz- L-Arg-pNA firmy Bachem (Szwajcaria). Nasiona: bobu właściwego (Vicia faba major), fasoli zwykłej (Phaseolus vulgaris), grochu siewnego (Pisum sativum), gryki zwyczajnej (Fagopyrum sagittatum), jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare), kukurydzy zwyczajnej (Zea mays), owsa siewnego (Avena sativae), prosa zwyczajnego (Panicum miliaceum), pszenicy zwyczajnej (Triticum aestivum), ryżu siewnego (Oryza sativae), słonecznika zwyczajnego (Helianthus napus), soczewicy jadalnej (Lens culinaris), soi zwyczajnej (Glycine max) i żyta zwyczajnego (Secales cereale) rozdrabniano w młynku elektrycznym i ekstrahowano 0,15 mol/dm 3 NaCl w stosunku 1:9 w/v w ciągu 2 godz.,

2 266 M. Siergiejuk i inni Nr 3 stosując ciągłe mieszanie. Płyn nadosadowy otrzymany przez wirowanie (1500 g, 4 C, 30 min.), doprowadzony do ph 8,5 użyto do badań. Wpływ ekstraktu z nasion na aktywność enteropeptydazy oceniano wg Antonowicza i współpr. (5). Do 0,2 cm 3 enteropeptydazy (0,9%) dodawano 0,2 cm 3 ekstraktu z nasion (w kontroli 0,2 cm 3 0,15 mol/dm 3 NaCl, ph 8,5) i próby preinkubowano 30 min. w temp. 37 C. Następnie dodawano 0,6 cm 3 6,25 mmol/dm 3 H-Gly-(Asp) 4 - Lys-βNA inkubowano w tej samej temperaturze w ciągu 2 h. Reakcję przerywano przez dodanie 1 cm 3 2 mol/dm 3 HCl. Po odwirowaniu składników nierozpuszczalnych, uwolniony βna poddawano diazowaniu. Do 0,2 cm 3 płynu nadosadowego dodawano w odstępach 2 min. kolejno: 0,2 cm 3 0,1% azotanu (III) sodu, 0,2 cm 3 0,5% siarczan (IV) amonu i 0,4 cm 3 0,05% N-(1-naftylo)etylenodiaminy. Po 3 min. mierzono absorbancję przy 560 nm. Ilość uwolnionej β-naftyloaminy odczytywano z wykresu kalibracyjnego sporządzonego przy użyciu wzorcowych roztworów tego związku. W badaniach nad wpływem ekstraktów z nasion na aktywację trypsynogenu przez enteropeptydazę posłużono się jako substratem trypsyny Bz-L-Arg-pNA (6). Oceniano ilość produktu reakcji jakim jest p-nitroanilina (pna). W celu ustalenia hamowania aktywacji trypsynogenu, hamowania aktywności trypsyny i hamowania równocześnie obu procesów przez ekstrakty z nasion posłużono się trzema testami (7). Wszystkie testy zawierały 0,2 cm 3 trypsynogenu. Do testu 1 i 3 dawano 0,2 cm 3 enteropeptydazy i 0,2 cm 3 buforu Tris-HCl o ph 8,6 zawierającego 0,01 mol/dm 3 CaCl 2. Do testu 3 dawano 0,2 cm 3 ekstraktu z nasion i 0,2 cm 3 enteropeptydazy. Wszystkie testy preinkubowano 30 min. w temp. 37 C. Do testu 1 i 3 dodawano 0,2 cm 3 buforu, a do testu 2 0,2 cm 3 ekstraktu z nasion. Do wszystkich testów dodawano 0,2 cm 3 4,0 mmol/cm 3 Bz-L-Arg-pNA i inkubowano je 30 min. w temp. 37 C. Reakcję przerywano przez dodanie 1 cm 3 10% kwasu trichlorooctowego. W otrzymanym przez wirowanie płynie nadosadowym mierzono absorbancję przy 410 nm i odczytywano ilość uwolnionej p-nitroaniliny z wykresu kalibracyjnego sporządzonego przy użyciu wzorcowych roztworów tego związku. WYNIKI I ICH OMÓWIENIE Jak wynika z tab. I tylko ekstrakt z nasion fasoli posiada inhibitor hamujący aktywność enteropeptydazy w jej działaniu na specyficzny syntetyczny substrat. Występowanie inhibitora enteropeptydazy w nasionach fasoli opisali wcześniej inni autorzy (8). O hamowaniu aktywacji trypsynogenu decyduje hamujący wpływ ekstraktów nie tylko na aktywność enteropeptydazy ale także na aktywność trypsyny, która dokonuje autoaktywacji tego proenzymu (2). Z porównania wyników uzyskanych w teście, w którym nie dodano ekstraktu z nasion (test 1) i w którym dodano ekstrakt z nasion po preinkubacji (test 2) wynika, że hamują one aktywację trypsynogenu (tab. II). Z porównania wyników uzyskanych w teście, w którym ekstrakty dodano po preinkubacji (test 2) i przed inkubacją (test 3) wynika, że hamowanie aktywacji trypsynogenu przez enteropeptydazę dokonuje jedynie inhibitor występujący w nasionach fasoli. Inhibitory występujące w ekstraktach z nasion pozostałych roślin hamują autoaktywację trypsynogenu przez trypsynę.

3 Nr 3 Inhibitory z nasion roślin a aktywność enteropeptydazy 267 Tabela I. Wpływ ekstraktu z nasion na aktywność enteropeptydazy Table I. The effect of seed extracts on enteropeptidase activity Ekstrakt z nasion Aktywność enteropeptydazy, βna μmol/cm 3 /1h Hamowanie, % Bób 6,4 1,5 Fasola 3,6 44,6 Groch 6,2 4,6 Gryka 6,5 0,0 Jęczmień 6,6 0,0 Kukurydza 6,5 0,0 Owies 6,7 0,0 Proso 6,3 3,1 Pszenica 6,6 0,0 Ryż 6,6 0,0 Słonecznik 6,2 4,6 Soczewica 6,1 6,2 Soja 6,5 0,0 Żyto 6,3 3,1 Kontrola (bez ekstraktu) 6,5 0,0 Tabela II. Wpływ ekstraktów z nasion na aktywację trypsynogenu przez enteropeptydazę Table II. The effect of seed extracts on tripsinogen activation by enteropeptidase Test 1 Test 2 Test 3 Ekstrakt z nasion pna nmol/cm 3 /30 min (hamowanie, %) Bób 51,2 (20,2) 36,8 (42,7) Fasola 28,2 (56,1) 19,7 (69,3) Groch 38,8 (39,6) 27,3 (57,5) Gryka 47,3 (26,3) 38,0 (40,8) Jęczmień 51,0 (20,6) 46,9 (26,9) Kukurydza 48,3 (24,8) 40,6 (36,8) Owies 54,2 (15,6) 46,2 (28,0) 64,2 (0,0) Proso 39,6 (38,3) 28,6 (55,5) Pszenica 50,3 (21,7) 42,3 (34,1) Ryż 66,7 (0,0) 48,6 (24,3) Słonecznik 42,3 (34,1) 38,6 (39,9) Soczewica 36,4 (43,3) 29,6 (53,9) Soja 52,3 (18,5) 42,7 (33,5) Żyto 35,6 (44,5) 26,4 (55,9)

4 268 M. Siergiejuk i inni Nr 3 Znaczna oporność inhibitorów proteaz występujących w nasionach na podwyższoną temperaturę, zakwaszenie i działanie pepsyny wskazuje, że mogą one hamować trawienie białek w dwunastnicy zwłaszcza chorych z przewlekłą niewydolnością trzustki (9, 10), a także przyjmujących substytuty tych enzymów (4). Problematyka wpływu inhibitorów proteaz w trawieniu pokarmów białkowych podejmowana jest przez wielu autorów (3, 4, 11, 12). WNIOSKI Ekstrakty z nasion roślin spożywanych przez człowieka hamują aktywność trypsynogenu: 1. Ekstrakt z nasion fasoli hamuje aktywność trypsynogenu przez enteropeptydazę i autoaktywację tego proenzymu. 2. Ekstrakty z nasion innych roślin strączkowych i nasion zbóż hamują wyłącznie autoaktywację trypsynogenu. M. Siergiejuk, A. Karwowska 1), M. Gacko, A. Worowska THE EFFECT OF INHIBITORS FROM THE SEEDS OF PLANTS CONSUMED BY HUMANS ON THE ENTEROPEPTIDASE ACTIVITY AND TRYPSINOGEN ACTIVATION BY THIS ACTIVATOR Summary Extract from the seeds of kidney bean inhibits enteropeptidase activity. Extracts from the seeds of broad bean, pea, buckwheat, barley, mize, oat, millet, wheat, rice, sunflower, lentis, soya bean and rye inhibit trypsinogen autoactivation by tripsin. PIŚMIENNICTWO 1. Sadler J. E.: Enteropeptidase, in: Handbook of proteolytic enzymes, ed. Barret A.J., Rawling N.D., Woessner J.F. Elsevier, Amsterdam, 2004; 2: Antonow V.K.: Chemistry of proteolysis. Springer Verlag, Berlin, 1993; Billings P.C., Longnecker M.P., Keary M., Taylor P.R.: Proteinase inhibitor content of human dietary samples. Nutr. Canc., 1990; 14: Bruzgo M., Gacko M., Guzowski A., Chlabicz M., Bańkowska A.: Wpływ inhibitorów z nasion roślin spożywanych przez człowieka na aktywność proteaz preparatów stosowanych w substytucyjnym leczeniu niewydolności zewnątrzwydzielniczej trzustki. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.): Antonowicz I., Itesford F.I., Green I.R., Grogg P., Hadorn B.: The application of a new synthetic substrate to the determination of enteropeptidase in rat small intestine and human intestinal biopsies. Clin. Chim. Acta., 1980; 101: Somarin O., Tokura S., Nishi N., Noguchi J.: The action of trypsin on synthetic chromogenic arginine substrates. J. Biochem., 1979; 85: Worowski K., Gabryelewicz A., Roszkowska W., Bajko K.: The action of potato inhibitors on activation of zymogen forms of digestive system proteases. Acta Hepato-Gastroenterol., 1979; 26: Jacob R.T., Bhat P.G., Pattabiraman T.N.: Isolation and characterization of a specific enterokinase inhibitor from kidney bean (Phaseolus vulgaris). Biochem. J., 1983; 209: Chlabicz M., Gacko M., Guzowski A., Krupkowska A., Bańkowska A.: Termostabilność roślinnych inhibitorów proteaz przewodu pokarmowego. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.): Karwowska A., Gacko M., Guzowski A., Krupkowska A., Chojnacka-Zdrodowska A.: Inaktywacja roślinnych inhibitorów trypsyny i chymotrypsyny przez pepsynę. Bromat. Chem. Toksykol., 2005; 37 (supl.):

5 Nr 3 Inhibitory z nasion roślin a aktywność enteropeptydazy Leontowicz H., Kulasek G.: Naturalne pokarmowe inhibitory enzymów trawiennych. Med. Wet., 1998; 54: Birk Y.: Protease inhibitors of plant origin and role of protease inhibitors in human nutrition, in: Protease inhibitors as cancer chemopreventive agents, ed. W. Troll, R. Kennedy. Plenum Press, New York, 1993; Adres: Białystok, ul. M. Skłodowskiej-Curie 24A.