PL B1. Kokryształ mirycetyna kofeina oraz sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 311/30 ( ) A61K 31/452 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Kokryształ mirycetyna kofeina oraz sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 12/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/16 (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL UNIWERSYTET WROCŁAWSKI, Wrocław, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MICHAŁ SOWA, Wrocław, PL EWA MATCZAK-JON, Wrocław, PL KATARZYNA ŚLEPOKURA, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Meissner

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kokryształ mirycetyna kofeina znajdujący zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym i/lub kosmetycznym oraz sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina. Mirycetyna (3,5,7,3,4,5 -heksahydroksyflawon, wzór 1) jest związkiem biologicznie czynnym pochodzenia roślinnego, należącego do grupy flawonoidów i podgrupy flawonoli, izolowanym m.in. z kory woskownicy (Myrica). Z publikacji Kokryształy farmaceutyczne naturalnego przeciwciała mirycetyny znany jest kryształ mirycetyna-kofeina. W publikacjach Wang, S., Melnyk, J.P, Tsao, R. & Marcone, M.F. (2011). Food Res. Int. 44, 14 22, German, J.B. & Walzem, R.L. (2000). Annu. Rev, Nutr. 20, , Harnly, J.M., Doherty, R.F., Beecher, G.R., Holden, J.M., Haytowitz, D.B., Bhagwat, S. & Gebhardt, S. (2006). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, , Mattivi, F., Guzzon, R., Vrhovsek, U., Stefanini, M. & Velasco, R. (2006). J. Agric. Food Chem. 54, ujawniono, iż mirycetyna występuje w skórkach czerwonych winogron, herbacie, jagodach oraz w czerwonym winie. Z kolei w publikacjach Surh, Y.J. (2003). Nat. rev. 3, , Morel, I., Abalea, V., Sergent, O., Cillard, P. & Cillard, J. (1998). Biochem. Pharmacol. 55, , Ko, C.H, Shen, S.C., Lee, T.J. & Chen, Y.C. (2005). Molecular Cancer Therapeutics. 4, wykazano, że mirycetyna wykazuje właściwości przeciwnowotworowe, przeciwutleniające i przeciwzapalne. W publikacji Huang, J.H., Huang, C.C., Fang, J.Y., Yang, C., Chan, C.M., Wu, N.L, Kang, S.W. & Hung, C.F. (2010). Toxicol. In Vitro. 24, opisano, że mirycetyna chroni keratynocyty przed uszkodzeniem przez promieniowanie UV-B. Ponadto zgodnie z publikacją Phillips, P. A., Sangwan, V., Borja-Cacho, D., Dudeja, V., Vickers, S.M. & Saluja, A.K. (2011). Cancer Lett. 308, mirycetyna wspomaga apoptozę komórek raka trzustki. Dodatkowo stosownie do publikacji Chen, W., Li, Y., Li, J, Han, Q., Ye, L, & Li, A, (2011). Food Chem Toxicol, 49, mirycetyna wykazuje ochronne działanie przed utleniającym uszkodzeniem DNA, związane z wychwytem wolnych rodników. W publikacji Liu, I. M., Tzeng, T.F., Liou S.S. & Lan T.W. (2007). Life Sci. 81, wspomniano, iż mirycetyna obniża odporność na insulinę oraz stężenie cukru we krwi w przypadku szczurów, których dieta jest bogata we fruktozę. W publikacji Rostagno, M.A., Manchon, N., D Arrigo, M., Guillamon, E., Villares, A., Garcia- -Lafuente, A., et al. (2011). Analytica Chimica Acta, 685, opisano, że kofeina (1,3,7-trimetyloksantyna, wzór 2) jest naturalnym alkaloidem roślinnym, występującym m.in. w kawie, czekoladzie, herbacie i nasionach kakaowca. Jako związek biologicznie czynny, znana jest ze stymulacji ośrodkowego układu nerwowego oraz przyspieszania metabolizmu. Kofeina znajduje się na liście związków dopuszczonych do bezpiecznego stosowania jako dodatki do produktów spożywczych (tzw. lista GRAS tworzona przez FDA Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków), dzięki czemu może być stosowana jako składnik preparatów farmaceutycznych i suplementów diety. Kokrystalizacja od kilku lat jest jedną z obiecujących metod modyfikowania niekorzystnych parametrów fizykochemicznych substancji farmaceutycznie czynnych. W roku 2011 opublikowano pierwszą publikację dotyczącą kokrystalizacji flawonoidów w aspekcie farmaceutycznym. Otrzymany kokryształ kwercetyny i kofeiny charakteryzuje się 14-krotnie zwiększoną rozpuszczalnością i 10-krotnie zwiększoną biodostępnością w porównaniu z kwercetyną. W następnej publikacji Aitipamula, S., et al. (2012). Cryst. Growth Des. 12, wykazano, że Termin kokryształ nie posiada jednoznacznej definicji i jest przedmiotem rozległej debaty. Jedna z definicji zakłada, że kokryształ jest strukturalnie homogenicznym ciałem stałym, zawierającym dwa składniki w określonej stechiometrii, które pozostają w obojętnej elektrycznie formie a w warunkach pokojowych są ciałami stałymi. Głównym składnikiem kokryształu jest substancja farmaceutycznie czynna (ang. API), dragi zwany jest koformerem. Niewystarczająca biodostępność mirycetyny stoi na przeszkodzie ku opracowywaniu skutecznych leków, preparatów farmaceutycznych oraz suplementów diety i jest związana z niewielką rozpuszczalnością w środowiskach wodnych. Próby modyfikacji rozpuszczalności mirycetyny podejmowane były na drodze kompleksowania z modyfikowanymi ß-cyklodekstrynami, co opisano w publikacji

3 PL B1 3 Kwon, Y., Kim, H., Park, S, & Jung, S. (2010), Bull. Korean Chem. Soc. 31, , z publikacji wytwarzania mikroemulsji Zhang, Y., Wang, S., Xu, K., Yang, R., Wu, S. & Liu, Q. (2010) Shenyang Yaoke Daxue Xuebao 27, oraz stałych dyspersji zgodnie z publikacją By Wang, M., Wang, S, & Hou, W. (2012) Shiyong Yaowu Yu Linchuang 15, Literatura zawiera opis kokryształów farmaceutycznych kwercetyny Smith, A, J., Kavuru, P., Wojtas, Ł., Zaworotko, M.J. & Shytle, R.D. (2011). Mol. Pharm. 8, , hesperytyny Kavuru, P. (2008). MSc Thesis, University of South Florida, USA oraz bajkaleiny Sowa, M., Ślepokura, K. & Matczak-Jon, E. (2012). Acta Cryst. C68, Przykłady niektórych ze znanych kokryształów ujawniono w amerykańskim zgłoszeniu patentowym US Zwiększenie rozpuszczalności mirycetyny na drodze kokrystalizacji nie było dotychczas przedmiotem badań. Istotą rozwiązania według wynalazku jest sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina o wzorze 3 polegający na tym, że mirycetynę o wzorze 1 w ilości od 25 do 50 mg oraz kofeinę o wzorze 2 w ilości od 15 do 30,5 mg miesza się z od 5 do 10 ml metanolu lub etanolu (99.8%), po czym całość przesącza się, a następnie pozostawia się w temperaturze pokojowej do powolnego odparowania, a po 1 do 2 dni zbiera się kryształy. W innej odmianie sposobu otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina o wzorze 3 w stalowym naczyniu młyna kulowego mieli się mirycetynę o wzorze 1 i kofeinę o wzorze 2 w ilości stechiometrycznej 1:1, po czym dodaje się polarny, aprotyczny rozpuszczalnik w ilości 50 μl na każde 50 mg mirycetyny, a następnie mieszaninę poddaje się mieleniu przez czas od 5 do 45 minut, przy częstości drgań Hz, i tak otrzymany materiał mikrokrystaliczny suszy się w temperaturze pokojowej przez czas od 12 do 24 godzin i poddaje analizie na dyfraktometrze proszkowym. Wynalazek został bliżej przedstawiony na rysunkach, na których Fig. 1 przedstawia część niezależną komórki elementarnej kokryształu mirycetyna kofeina, wraz z numeracją atomów i wiązaniami wodorowymi, Fig. 2 przedstawia upakowanie cząsteczek w sieci krystalicznej, ukazujące (a) tworzenie taśm molekularnych oraz (b) tworzenie dwuwymiarowej sieci, Fig. 3 przedstawia porównanie dyfraktogramu teoretycznego kokryształu mirycetyna kofeina (MIRCAF calc) z eksperymentalnym dyfraktogramem proszkowym (MIRCAF SE EtOH), Fig. 4 przedstawia porównanie dyfraktogramu teoretycznego kokryształu mirycetyna kofeina (MIRCAF calc) z dyfraktogramem produktu syntezy metodą mielenia z dodatkiem octanu etylu (MIRCAF LAG EtOAc), Fig. 5 przedstawia porównanie dyfraktogramu teoretycznego kokryształu mirycetyna kofeina 1:1 (MIRCAF calc) z dyfraktogramem produktu syntezy metodą mielenia z dodatkiem tetrachlorometanu (MIRCAF LAG CC14), Fig. 6 przedstawia dyfraktogram eksperymentalny mirycetyny, Fig. 7 przedstawia dyfraktogram eksperymentalny kofeiny, Fig. 8 przedstawia dyfraktogram proszkowy mieszaniny mirycetyny i kofeiny (MIR + CAF PM), w porównaniu do dyfraktogramu teoretycznego kokryształu mirycetyna kofeina, wraz z zaznaczonymi refleksami diagnostycznymi i w przykładach jego wykonania. P r z y k ł a d 1 Mirycetynę (25 mg, mmol) oraz kofeinę (15.2 mg, mmol) rozpuszczono w 7 ml metanolu za pomocą mieszania. Roztwór przesączono do zlewki, którą szczelnie zaklejono parafilmem i wykonano kilka niewielkich otworów umożliwiających powolne parowanie roztworu. Następnie pozostawiono zlewkę w temperaturze pokojowej (23 C). Po dwóch dobach zebrano żółte igłowate kryształy na dnie zlewki. Spośród otrzymanych kryształów wybrano monokryształ do analizy rentgenostrukturalnej. Wykonanie dyfraktogramu proszkowego całości otrzymanych kryształów wyklucza obecność innych produktów oprócz zamierzonego kokryształu mirycetyny i kofeiny. P r z y k ł a d 2 Mirycetynę (50 mg, mmoi) oraz kofeinę (30.4 mg, mmol) rozpuszczono w 10 ml etanolu za pomocą mieszania. Roztwór przesączono do zlewki, którą szczelnie zaklejono parafilmem i wykonano kilka niewielkich otworów umożliwiających powolne parowanie roztworu. Następnie pozostawiono zlewkę w temperaturze pokojowej (23 C). Po trzech dobach zebrano żółte igłowate kryształy na dnie zlewki. Wykonanie dyfraktogramu proszkowego całości otrzymanych kryształów wyklucza obecność innych produktów oprócz zamierzonego kokryształu mirycetyny i kofeiny. P r z y k ł a d 3 Mirycetynę (100 mg, mmol) oraz kofeinę (61 mg, mmol) umieszono w stalowym naczyniu o pojemności 10 ml, zawierającym dwie stalowe kulki o średnicy 7 mm. Do mieszaniny dodano 100 μl (około dwie krople) octanu etylu. Naczynie zamocowano w młynku kulowym Narva Vibra-

4 4 PL B1 tor Mill i poddano mieleniu przez 30 minut, przy częstotliwości drgań 50 Hz. Otrzymany materiał mikrokrystaliczny wysuszono w warunkach pokojowych przez okres 12 godzin i poddano analizie na dyfraktometrze proszkowym. Porównanie otrzymanego dyfraktogramu z dyfraktogramem teoretycznym dla kokryształu mirycetyna kofeina 1:1 pozwala na stwierdzenie 100% konwersji (Rysunek 5). P r z y k ł a d 4 Mirycetynę (50 mg, mmol) oraz kofeinę (30.5 mg, mmol) umieszono w stalowym naczyniu o pojemności 10 ml, zawierającym dwie stalowe kulki o średnicy 7 mm. Do mieszaniny dodano 50 μl (około jedną kroplę) tetrachlorometanu. Naczynie zamocowano w młynku kulowym Narva Vibrator Mill i poddano mieleniu przez 30 minut, przy częstotliwości drgań 50 Hz. Otrzymany materiał mikrokrystaliczny wysuszono w warunkach pokojowych przez okres 12 godzin i poddano analizie na dyfraktometrze proszkowym. Porównanie otrzymanego dyfraktogramu z dyfraktogramem teoretycznym dla kokryształu mirycetyna kofeina pozwala na stwierdzenie 100% konwersji. P r z y k ł a d 5 Analizę rentgenograficzną wykonano w temperaturze 23 C, na czterokołowym aparacie Oxford Diffraction Xcalibur PX o geometrii kappa, z kamerą CCD Ruby, wykorzystując promieniowanie MoK ( = Å). Rejestrację, redukcję i analizę danych wykonano z wykorzystaniem programów CrysAlisCCD i CrysAlisRED. Strukturę rozwiązano metodami bezpośrednimi wykorzystując program SHELXS-97 i udokładniono z wykorzystaniem programu SHELXL-97. Dyfraktogramy proszkowe wykonano w temperaturze pokojowej, na aparacie Bruker D8 Advance wykorzystując promieniowanie Cu-K ( = Å) przy 30 kv i 40 ma i detektor VÅNTEC-1. Każdą próbkę analizowano w zakresie kątów 2Θ 3 a 40, z krokiem i łącznym czasem pomiaru 40 minut. Kokryształ mirycetyna kofeina 1:1 krystalizuje w grupie przestrzennej P2 1/n układu jednoskośnego. Wybrane dane krystalograficzne znajdują się w tabeli 1. T a b e l a 1 Wybrane dane krystalograficzne kokryształu mirycetyna kofeina Dane krystalograficzne C 15H 10O 8 C 8H 10N 4O 2 V = (5) Å 3 Mr = Z = 4 Układ jednoskośny, P2 1/n a = (3) Å T = 296 (2) K b = 4.443(6) Â R[F 2 > 2σ(F 2 )] = c = (3) Å ß = 97.87(2) Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina o wzorze 3, znamienny tym, że mirycetynę o wzorze 1 w ilości od 25 do 50 mg oraz kofeinę o wzorze 2 w ilości od 15 do 30,5 mg miesza się z od 5 do 10 ml metanolu lub etanolu (99.8%), po czym całość przesącza się, a następnie pozostawia się w temperaturze pokojowej do powolnego odparowania, a po 1 do 2 dni zbiera się kryształy. 2. Sposób otrzymywania kokryształu mirycetyna kofeina o wzorze 3, znamienny tym, że w stalowym naczyniu młyna kulowego mieli się mirycetynę o wzorze 1 i kofeinę o wzorze 2 w ilości stechiometrycznej 1:1, po czym dodaje się polarny, aprotyczny rozpuszczalnik w ilości 50 μl na każde 50 mg mirycetyny, a następnie mieszaninę poddaje się mieleniu przez czas od 5 do 45 minut, przy częstości drgań Hz, i tak otrzymany materiał mikrokrystaliczny suszy się w temperaturze pokojowej przez czas od 12 do 24 godzin i poddaje analizie na dyfraktometrze proszkowym.

5 PL B1 5 Rysunki

6 6 PL B1

7 PL B1 7

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)