PL B1. POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL UNIWERSYTET WROCŁAWSKI, Wrocław, PL BUP 10/14

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. C07D 311/30 ( ) C07D 473/12 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Kokryształ fizetyna-kofeina oraz sposób otrzymywania kokryształu fizetyna-kofeina (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 10/14 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 09/16 (73) Uprawniony z patentu: POLITECHNIKA WROCŁAWSKA, Wrocław, PL UNIWERSYTET WROCŁAWSKI, Wrocław, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MICHAŁ SOWA, Wrocław, PL EWA MATCZAK-JON, Wrocław, PL KATARZYNA ŚLEPOKURA, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Katarzyna Paprzycka

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest kokryształ fizetyna-kofeina znajdujący zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym lub kosmetycznym oraz sposób jego wytwarzania metodą roztworową oraz zawiesinową. Fizetyna (3,7,3',4'-tetrahydroksyflawon, wzór 1) jest naturalnym związkiem pochodzenia roślinnego, należącym do grupy flawonoidów i podgrupy flawonoli. Zgodnie z publikacją Arai, Y., Watanabe, S., Kimira, M., Shimoi, K., Mochizuki, R. & Kinae, N. (2000), J. Nutr. 130, 2243; Kimira, M., Arai, Y., Shimoi, K. & Watanabe, S. (1998), J. Epidemiol. 8, 168 fizetyna występuje głównie w truskawkach oraz innych owocach i warzywach (jabłka, kiwi, brzoskwinie, ogórek, cebula, pomidory), winie i orzechach. Zgodnie z publikacją Ragelle, H., Crauste-Manciet, S., Seguin, J., Brossard, D., Scherman, D., Arnaud, P. & Chabot, G. G. (2012), International Journal of Pharmaceutics, 247, 452 fizetyna jest związkiem słabo rozpuszczalnym w wodzie. Z kolei w publikacji Funakoshi-Tago, M., Nakamura, K., Tago, K., Mashino, T. & Kasahara, T. (2011), Int. Immunopharmacol. 11, 1150 stwierdzono, iż fizetyna wykazuje charakterystyczne dla flawonoidów właściwości przeciwutleniające oraz stosownie do publikacji Geraets, L., Haegens, A., Brauers, K., Haydock, J. A., Vemooy, J. FL, Wouters, E. F., Bast, A. & Hageman, G. J. (2009), Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 568; Park, H. H., Lee, S., Oh., J. M., Lee, M. S., Yoon, K. H., Park, B. H., Kim, J. W., Song, H. & Kim, S.H. (2007). Pharmacol. Res., 55, 31 właściwości przeciwnowotworowe oraz przeciwzapalne. Ponadto, zgodnie z publikacją Khan, N., Afaq, F., Syed, D. N. & Mukhtar, H. (2008), Carcinogenesis, 29, 1049 fizetyna powoduje apoptozę i wstrzymanie cyklu komórkowego w komórkach raka prostaty, okrężnicy - publikacja Lu, X., Jung, J., Cho, H. J., Lim, D. Y., Lee, H. S., Chun, H. S., Kwon, D Y. & Park, J. H. (2005), J. Nutr. 135, 2884 oraz piersi - publikacja Yang, P. M., Tseng, H. H., Peng, C. W., Chen, W. S. & Chiu, S. J. (2012), Int. J. Oncol. 40, 469. Stosownie do publikacji Maher, P. (2009), Genes. Nutr. 4, 297 fizetyna posiada wielokierunkowy wpływ na procesy starzenia neuronów. Z kolei pozytywny wpływ na długotrwałą pamięć myszy został wykazany w publikacji Maher, P., Akaishi, T. & Abe, K. (2006), PNAS. 103, Fizetyna oraz rezweratol chronią zdrowe komórki przed chorobą Huntingtona, co ujawniono w publikacji Maher, P., Dargusch, R., Bodai, L., Gerard, P., Purcell, J. & Marsh, L. J. (2011), Hum. Mol. Genet. 20, 261. Zgodnie z publikacją Zhen, L., Zhu, J., Zhao, X., Huang, W., An, Y., Li, S., Du, X., Lin, M., Wang, Q., Xu, Y. & Pan, J. (2012), Behav. Brain Res. 228, 359 fizetyna posiada również właściwości leku antydepresyjnego i zwiększa zawartość głównego wewnątrzkomórkowego przeciwutleniacza, glutationu, w komórkach, co przedstawiono w publikacji Burdo, L, Schubert, D. & Maher, P. (2008), Brain Res. 1189, 12. W publikacji Rostagno, M. A., Manchon, N., D Arrigo, M., Guillamon, E., Villares, A., Garcia- Lafuente, A., et al. (2011), Analytica Chimica Acta, 685, 204 opisano, że kofeina (1,3,7-trimetyloksantyna, wzór 2) jest naturalnym alkaloidem roślinnym, występującym m. in. w kawie, herbacie i nasionach kakaowca (i produktach z nich wytwarzanych, jak czekolada). Jako związek biologicznie czynny, znana jest ze stymulacji ośrodkowego układu nerwowego oraz przyspieszania metabolizmu. Kofeina jest związkiem farmaceutycznie akceptowalnym i może być stosowana jako składnik preparatów farmaceutycznych i suplementów diety. Kokrystalizacja od kilku lat jest jedną z obiecujących metod modyfikowania niekorzystnych parametrów fizykochemicznych substancji farmaceutycznie czynnych. W roku 2011 opublikowano pierwszą publikację dotyczącą kokrystalizacji flawonoidów w aspekcie farmaceutycznym. Otrzymany kokryształ kwercetyny i kofeiny charakteryzuje się 14-krotnie zwiększoną rozpuszczalnością i 10-krotnie zwiększoną biodostępnością w porównaniu z kwercetyną. Termin kokryształ nie posiada jednoznacznej definicji i jest przedmiotem rozległej debaty - publikacja Aitipamula, S., et. al. (2012), Cryst. Growth Des. 12, Jedna z definicji zakłada, że kokryształ jest strukturalnie homogenicznym ciałem stałym, zawierającym dwa (lub więcej) składników w określonej stechiometrii, które pozostają w obojętnej elektrycznie formie, a w warunkach pokojowych są ciałami stałymi. Głównym składnikiem kokryształu farmaceutycznego jest substancja farmaceutycznie czynna (ang. API), pozostałe zwane są koformerami.

3 PL B1 3 Niewystarczająca biodostępność fizetyny stoi na przeszkodzie ku opracowywaniu skutecznych leków, preparatów farmaceutycznych oraz suplementów diety i jest związana z niewielką rozpuszczalnością w środowiskach wodnych (< 1 mg/g). Próby modyfikacji rozpuszczalności fizetyny podejmowane były poprzez kompleksowanie cyklodekstrynami - publikacja Guzzo, M. R., Uemi, M., Donate, P. M., Nikolaou, S., Machado, A. E. H. & Okano, L. T. (2006), J. Phys. Chem. A. 110, 10545, wytwarzanie nanoemulsji lub formulacji liposomalnych - publikacja Mignet, N., Seguin, J., Ramos Romano, M., Brullé, L., Touil, Y. S., Scherman, D., Bessodes, M. & Chabot, G. G. (2012), Int. J. Pharm. 423, 69. W publikacji Smith, A. J., Kavuru, P., Wojtas, Ł., Zaworotko, M. J. & Shytle, R. D. (2011), Mol. Pharm. 8, 1867 opisano kokryształy farmaceutyczne kwercetyny. W następnej publikacji Kavuru, P. (2008), MSc Thesis, University of South Florida, USA opisano kokokryształy hesperytyny. W jeszcze innej publikacji Sowa, M., Slepokura, K. & Matczak-Jon, E. (2012), Acta Cryst. C68, o262 ujawniono kokryształ bajkaleiny. Przykłady niektórych znanych kokryształów flawonoidów ujawniono w amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr US Zwiększenie rozpuszczalności fizetyny na drodze kokrystalizacji nie było dotychczas przedmiotem badań. Kokryształy fizetyny z nikotynamidem i izonikotynamidem zostały ujawnione w publikacji Sowa, M., Ślepokura, K. & Matczak-Jon, E. (2013), Cryst. Eng. Comm., 15, Istotą wynalazku jest kokryształ fizetyna-kofeina o wzorze 3. Wynalazek dotyczy również sposobu otrzymywania kokryształu fizetyna-kofeina o wzorze 3, który polega na tym, że fizetynę o wzorze 1 w ilości od 25 do 50 mg i kofeinę o wzorze 2 w ilości od 34 do 68 mg w stosunku stechiometrycznym 1:2 rozpuszcza się w od 5 do 10 ml etanolu lub metanolu, po czym całość miesza się, przesącza, a następnie pozostawia się do powolnego odparowania w temperaturze pokojowej, po czym po 4 do 14 dniach zbiera się kryształy. W odmianie sposobu otrzymywania kokryształu fizetyna-kofeina o wzorze 3, fizetynę o wzorze 1 i kofeinę o wzorze 2 w ilości stechiometrycznej 1:2 zawiesza się w octanie etylu w ilości 2 ml na każde 50 mg fizetyny, a następnie całość miesza przez 24 h w temperaturze pokojowej, po czym otrzymany materiał mikrokrystaliczny przesącza się i suszy w temperaturze pokojowej przez okres 12 do 24 godzin, a następnie poddaje analizie na dyfraktometrze proszkowym. Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach jego wykonania oraz na rysunkach gdzie: rys. 1 przedstawia część niezależną komórki elementarnej kokryształu fizetyna-kofeina, wraz z numeracją atomów i wiązaniami wodorowymi (przerywane linie), rys. 2 przedstawia upakowanie cząsteczek w sieci krystalicznej, ukazujące tworzenie warstwy molekularnej na drodze wiązań wodorowych (przerywane linie), rys. 3 przedstawia porównanie dyfraktogramu teoretycznego kokryształu fizetyna-kofeina (FisCaf calc) z eksperymentalnym dyfraktogramem proszkowym wykonanym dla próbki otrzymanej przez odparowanie roztworu etanolowego (FisCaf SE MeOH). Różnice w wartościach kąta 2θ wynikają z kontrakcji kryształu, zachodzącej podczas jego chłodzenia w trakcie pomiaru dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego, rys. 4 przedstawia porównanie dyfraktogramu proszkowego wykonanego dla próbki kokryształu fizetyna-kofeina, otrzymanej przez odparowanie roztworu etanolowego (FisCaf SE MeOH) z dyfraktogramem wykonanym dla próbki kokryształu fizetynakofeina, otrzymanej metodą zawiesinową (FisCaf slurry EtOAc), rys. 5 przedstawia widmo FT-Raman kokryształu fizetyna-kofeina, rys. 6 przedstawia widmo FT-IR kokryształu fizetyna-kofeina, rys. 7 przedstawia krzywą TG-DTA kokryształu fizetyna-kofeina. P r z y k ł a d 1 Fizetynę (50 mg, 0,175 mmol) oraz kofeinę (68 mg, 0,350 mmol) rozpuszczono w 9 ml metanolu za pomocą mieszania. Roztwór przesączono do zlewki, którą szczelnie zaklejono parafilmem i wykonano kilka niewielkich otworów umożliwiających powolne parowanie roztworu. Następnie, pozostawiono zlewkę w temperaturze pokojowej. Po 4 dniach zebrano jasnożółte kryształy na dnie zlewki. Spośród otrzymanych kryształów wybrano monokryształ do analizy rentgenostrukturalnej. P r z y k ł a d 2 Fizetynę (25 mg, 0,087 mmol) oraz kofeinę (34 mg, 0,175 mmol) rozpuszczono w 9 ml etanolu (96%) za pomocą mieszania. Roztwór przesączono do zlewki, którą szczelnie zaklejono parafilmem i wykonano kilka niewielkich otworów umożliwiających powolne parowanie roztworu. Następnie, pozostawiono zlewkę w temperaturze pokojowej. Po 14 dniach zebrano jasnożółte kryształy na dnie zlewki.

4 4 PL B1 P r z y k ł a d 3 Fizetynę (100,0 mg, 0,350 mmol) oraz kofeinę (135,8 mg, mmol) umieszczono w zlewce i dodano 4ml octanu etylu. Otrzymaną zawiesinę mieszano z wykorzystaniem mieszadła magnetycznego, w temperaturze pokojowej, przez okres 24 godzin. Otrzymany materiał odsączono i wysuszono w warunkach pokojowych przez okres 12 godzin, a następnie poddano analizie na dyfraktometrze proszkowym. Porównanie otrzymanego dyfraktogramu z dyfraktogramem kokryształu otrzymanego metodą roztworową pozwala na potwierdzenie struktury oraz stwierdzenie 100% konwersji (rys. 4). P r z y k ł a d 4 Analizę rentgenograficzną wykonano w temperaturze -173 C, na czterokołowym dyfraktometrze Kuma KM-4-CCD o geometrii kappa, z kamerą CCD Sapphire 2, wykorzystując promieniowanie Moκα (κ = 0,71073 Å). Rejestrację, redukcję i analizę danych wykonano z wykorzystaniem programów CRYSALISCCD i CRYSALISRED. Strukturę rozwiązano metodami bezpośrednimi wykorzystując program SHELXS-2013 i udokładniono z wykorzystaniem programu SHELXL P r z y k ł a d 5 Dyfraktogramy proszkowe wykonano w temperaturze pokojowej, na aparacie Bruker D8 Advance wykorzystując promieniowanie Cu-κα (κ = 1,5418 Å) przy 30 kv i 40 ma i detektor VANTEC-1. Każdą próbkę analizowano pomiędzy kątami 2θ 3 a 40, z krokiem 0,01608 i łącznym czasem pomiaru 40 minut. P r z y k ł a d 6 Widmo Ramana wykonano z wykorzystaniem fourierowskiego spektrometru ramanowskiego (FT-Raman, Bruker Multi-Ram) ze wzbudzeniem laserem Nd:YAG (1064 nm) i detektorem germanowym. Próbkę skanowano w zakresie cm -1, z rozdzielczością 2 cm -1. P r z y k ł a d 7 Widmo IR wykonano z wykorzystaniem próżniowego, fourierowskiego spektrometru podczerwieni (FT-IR, Bruker Vertex 70v) w technice osłabionego całkowitego odbicia, przy wykorzystaniu jednoodbiciowej przystawki ATR z kryształem diamentowym. Próbkę skanowano w zakresie cm -1, z rozdzielczością 2 cm -1. P r z y k ł a d 8 Analizę termograwimetryczną wykonano w atmosferze azotu, na aparacie Setaram SETSYS 16/18, z prędkością ogrzewania 5 C/min i w zakresie C. Kokryształ fizetyna-kofeina krystalizuje w grupie przestrzennej P1 układu trójskośnego. Wybrane dane krystalograficzne znajdują się w tabeli 1. T a b e l a 1 Wybrane dane krystalograficzne kokryształu fizetyna-kofeina C 15 H 10 O 6 2C 8 H 10 N 4 O 2 α = 66,25(4) R[F 2 > 2σ(F 2 )] = 0,066 M r = 674,63 β = 79,39(3) wr(f 2 ) = 0,122 Układ trójskośny, P1 γ = 81,05(3) GoF = S = 1,00 α = 7,553(2) Å V= 1460,6(9) Â3 Refleksów zmierzonych = b = 14,247(5) Å Z = 2 Refleksów niezależnych = 7142 c = 15,149(5) Å T = 100(2) K Refleksów obserwowanych = 3262 R int = 0,064 Część niezależna komórki elementarnej kokryształu fizetyna-kofeina (rys. 1) zawiera jedną cząsteczkę fizetyny oraz dwie cząsteczki kofeiny, w formach obojętnych elektrycznie. Analiza upakowania w sieci krystalicznej pokazuje tworzenie warstw molekularnych na drodze wiązań wodorowych zilustrowanych na rys. 2. Otrzymane widma FT-Raman i FT-IR (rys. 4 i 5) są charakterystyczne dla kokryształu fizetynakofeina i pozwalają na jego jednoznaczną identyfikację. Analiza termograwimetryczna wskazuje na stabilność kokryształu fizetyna-kofeina do temperatury ok. 220 C, w której rozpoczyna się jego rozkład. Brak utraty masy do momentu rozkładu potwierdza niesolwatowany charakter kokryształu (rys. 6). Rozkład kokryształu związany jest w pierwszej kolejności z utratą dwóch cząsteczek kofeiny (ubytek masy obliczony 57,6%, zmierzony 56,6%).

5 PL B1 5 Zastrzeżenia patentowe 1. Kokryształ fizetyna-kofeina o wzorze Sposób otrzymywania kokryształu fizetyna-kofeina o wzorze 3, znamienny tym, że fizetynę o wzorze 1 w ilości od 25 do 50 mg i kofeinę o wzorze 2 w ilości od 34 do 68 mg w stosunku stechiometrycznym 1:2 rozpuszcza się w od 5 do 10 ml etanolu lub metanolu, po czym całość miesza się, przesącza, a następnie pozostawia się do powolnego odparowania w temperaturze pokojowej, po czym po 4 do 14 dniach zbiera się kryształy. 3. Sposób otrzymywania kokryształu fizetyna-kofeina o wzorze 3, znamienny tym, że fizetynę o wzorze 1 i kofeinę o wzorze 2 w ilości stechiometrycznej 1:2 zawiesza się w octanie etylu w ilości 2 ml na każde 50 mg fizetyny, a następnie całość miesza przez 24 h w temperaturze pokojowej, po czym otrzymany materiał mikrokrystaliczny przesącza się i suszy w temperaturze pokojowej przez okres 12 do 24 godzin, a następnie poddaje analizie na dyfraktometrze proszkowym. Rysunki

6 6 PL B1

7 PL B1 7

8 8 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)