Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Kultury tkankowe i komórkowe roślin i zwierząt Porównanie ilości i jakości DNA wyizolowanego z komórki roślinnej i zwierzęcej METODY BADANIA KWASÓW NUKLEINOWYCH: 1. TECHNIKI MIKROSKOPOWE A. MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA Mikroskop elektronowy jest urządzeniem, którego zakres rozdzielczości wynosi 0,2-20 nm, co umoŝliwia oglądanie organelli komórkowych, wirusów i makrocząsteczek biologicznych (np. DNA), niemniej jednak ograniczeniem mikroskopu elektronowego jest brak moŝliwość oglądania próbek materii Ŝywej. Najbardziej popularną techniką uwidaczniania DNA jest metoda Klein-Schmidta. W tej technice kroplę roztworu DNA w octanie amonu zawierającym cytochrom c, nanosi się na powierzchnię octanu amonu. Po dotknięciu przez kroplę powierzchni, tworzy się na niej cienki film zdenturowanego cytochromu c. Film ten zawiera pewną ilość cząsteczek DNA, do której przyłącza się cienka warstwa cytochromu. JeŜeli do tego filmu zostanie przyłoŝony mały obiekt kulisty, to dołączy się do niego kropla zawierająca część filmu. Usunięcie fazy wodnej np. poprzez zanurzenie w alkoholu, spowoduje stabilne przyleganie warstwy do filmu pokrywającego kulisty obiekt. Technika ta zawiera wstępne barwienie pozytywne, np. octanem uranu. Metoda ta jest stosowana do określania długości i formy DNA. Zmodyfikowana metoda Klein-Schmidta pozwala natomiast zlokalizować specyficzne obszary w DNA m.in. określić pozycje końców liniowego DNA w formie kolistej, identyfikować bardzo długie cząsteczki izolowane z E.coli zainfekowanych fagiem λ oraz określić kierunek replikacji DNA faga λ. B. SKANINGOWA MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na badanie cech strukturalnych obiektów biologicznych o wymiarach 3-20 nm w buforach czy w warunkach zbliŝonych do fizjologicznych. Znalazła ona zastosowanie w badaniach nad zginaniem DNA na skutek róŝnych oddziaływań z białkami, oddziaływaniem przeciwciał z róŝnymi formami DNA, w analizie relacji stechiometrycznych kompleksów białek z kwasami nukleinowymi i badaniach struktury chromatyny. C. MIKROSKOPIA SKANINGOWO-TUNELOWA Mikroskopia skaningowo-tunelowa jest precyzyjną techniką charakteryzującą się wysoką rozdzielczością - co najmniej 0,02 0,3 nm, pozwalająca uzyskiwać obraz trójwymiarowy. Za pomocą mikroskopu skaningowo-tunelowego bada się m.in. kompleksy białek z kwasami nukleinowymi oraz topografię DNA. 2. ELEKTROFOREZA Elektroforeza jest obecnie jedna z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania kwasów nukleinowych. W wersji podstawowej jest to prosta i szybka technika uŝywana do rozdzielania 1

2 cząsteczek DNA, które nie mogą być rozdzielone innymi technikami np. przez wirowanie w gradiencie gęstości. Do fizycznego opisu elektroforezy słuŝą takie parametry jak: wielkość molekularna DNA - N D, średnia wielkość porów w Ŝelu - α, natęŝenie pola elektrycznego - ε; N D M M D a a QaEa ; α ; ε bd 2kBT gdzie M a jest wielkością fragmentów DNA, które pasują do typowej wielkości porów Ŝelu a, Q a = M a l D λ D ładunek cząsteczki o wielkości scharakteryzowanej przez M a. A. ELEKTROFOREZA W śelu AGAROZOWYM Agaroza to frakcja agaru oczyszczona z krasnorostów. Jest to polisacharyd zbudowany z około 800 liniowo połączonych reszt heksozy (inaczej 400 reszt agarobioza). Agarobioza jest dwucukrem zbudowanym z D-galaktozy i 3,6-anhydro-L-galaktozy. Powstawanie Ŝelu agarozowego jest reakcją odwracalną, w wyniku której pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową, które rozgałęziają się tworząc sieć. Wielkość porów Ŝelu agarozowego zaleŝy od stęŝenia agarozy i określa zakres cięŝaru makrocząsteczek np. DNA, RNA, które moŝna w niej elektroforetycznie rozdzielać. śel agarozowy stosuję się do rozdzielania DNA o szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Wadą elektroforezy w Ŝelu agarozowym jest słaba rozdzielczość frakcji DNA róŝniącego się poniŝej 5% wielkości. StęŜenie agarozy [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z] 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2, ,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2 Elektroforeza w Ŝelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo, a rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE 1 (90 mm Tris-base, 90 mm kwas borowy, 2 mm EDTA, ph 8) lub TAE 1 (40 mm Tris-base, 40 mm lodowy kwas octowy, 1 mm EDTA, ph 8). Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w kierunku anody. DNA o tych samych masach cząsteczkowych, ale róŝnych konformacjach charakteryzuje róŝna ruchliwość elektroforetyczna. Im dłuŝsza jest cząsteczka DNA lub RNA tym dłuŝej odnajduje ona drogę poprzez pory Ŝelu. JeŜeli umieścimy DNA w Ŝelu agarozowym i przyłoŝymy niskie napięcie to prędkość migracji DNA o róŝnych cięŝarach cząsteczkowych jest proporcjonalna do napięcia. Aby otrzymać optymalny rozdział DNA o wielkości większej niŝ 2 kp.z, elektroforeza prowadzona jest w polu elektrycznym o natęŝeniu nie większym niŝ 5V/cm. PowyŜej tego napięcia fragmenty DNA przemieszczają się z prędkością odwrotnie proporcjonalną do logarytmu ich cięŝaru cząsteczkowego. Elektroforetyczne zachowanie DNA w Ŝelu agarozowym nie zaleŝy od składu zasad azotowych i słabo zaleŝy od temperatury. Jednak jeŝeli stosuje się Ŝele agarozowe o stęŝeniu mniejszym niŝ 0,5% naleŝy elektroforezę prowadzić w temperaturze około 4 C. Do uwidocznienia DNA po lub w trakcie elektroforezy stosowany jest rutynowo bromek etydyny (EtBr), który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). NaleŜy pamiętać, Ŝe obecność związku interaklującego do DNA w Ŝelu agarozowym zmniejsza ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym 2

3 barwnikiem DNA jest np. SYBR Green, którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niŝ EtBr. B. ELEKTROFOREZA W śelu POLIAKRYLAMIDOWYM (PAGE) Elektroforeza w Ŝelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych fragmentów DNA lub białek. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niŝ 1000 par zasad. W Ŝelach tych moŝna efektywnie rozdzielać takŝe jednoniciowe fragmenty DNA i RNA. śel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji N,N -metylenobisakrylamidu z monomerami akryloamidu w obecności wolnych rodników dostarczonych przesz nadsiarczan amonu i stabilizowanych przez TEMED (N,N,N,N -tetrametylenodiamina). Stopień usieciowana Ŝelu (udział procentowy N,N -metylenobisakrylamidu) stanowi czynnik wpływający na rozdzielenie fragmentów jednoniciowego DNA. Elektroforezę w Ŝelach poliakrylamidowych prowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a więc migracja cząsteczek DNA jest zgodna z kierunkiem siły ciąŝenia, gdzie jednoniciowe DNA charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracja w Ŝelu. Rozdział elektroforetyczny prowadzony jest w buforze TBE 1. DNA w Ŝelu poliakrylamidowym moŝna wybarwiać za pomocą np. EtBr lub Sybr Gold. StęŜenie poliakrylamidu [%] Zakres długości rozdzielanego liniowego DNA [kp.z] 3,5 5,0 8,0 12,0 15,0 20, śele poliakrylamidowe mają przewagę nad Ŝelami agarozowymi z kilku przyczyn: - zdolność rozdzielcza Ŝeli poliakrylamidowych jest tak duŝa, Ŝe moŝna rozdzielać cząsteczki DNA róŝniące się o 1 p.z. - studzienkę Ŝelu poliakrylamidowego moŝna załadować znacznie większą ilością DNA niŝ w Ŝelu agarozowym - DNA odzyskany z Ŝelu poliakrylamidowego jest czysty (nie wymaga dodatkowego czyszczenia przy stosowaniu w biologii molekularnej) C. ELEKTROFOREZA W POLU PULSYJĄCYM (PFGE) Elektroforeza w polu pulsującym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o bardzo duŝej masie cząsteczkowej, np. DNA chromosomalnego wyŝszych eukariota, którego długość wynosi powyŝej 7000 p.z. W metodzie tej zastosowano zmienne, pulsujące, wzajemnie prostopadłe pole elektryczne. Cząsteczki DNA znajdujące się w Ŝelu, do którego zostanie przyłoŝone takie pole, potrzebuje czasu aby zmienić swoje ułoŝenie na zgodne z orientacją pola. Czas ten jest tym dłuŝszy im większa jest masa cząsteczki, a DNA będzie rozdzielana według masy, poniewaŝ czas trwania impulsu elektrycznego jest krótszy niŝ czas potrzebny na reorientacje cząsteczki DNA w Ŝelu. Granica rozdzielczości elektroforezy w pulsującym polu elektrycznym zaleŝy m.in. od stopnia jednorodności stosowanych pól elektrycznych, długości trwania impulsu, względnych wartości natęŝenia obydwu pól. D. ELEKTROFOREZA W POLU INWERSYJNYM (FIGE) Elektroforeza w polu inwersyjnym jest stosowana do rozdzielania fragmentów DNA o długości p.z., przy czym rozdzielczość tej metody jest około 100-krotnie wyŝsza niŝ w przypadku zwykłej elektroforezy agarozowej. Zastosowano tu elektryczne pole inwersyjnym którego wektor natęŝenia pola zmienia zwrot na przeciwny w określonych momentach. Stosunek czasu trwania impulsu dodatniego do ujemnego wynosi 3:1, a wartości bezwzględne natęŝenia pola obydwu impulsów są 3

4 równe. Podczas elektroforezy w polu inwersyjnym łańcuchy DNA ulegają cyklicznym, synchronicznym zmianom konformacyjnym, które trwają do chwili zmiany zwrotu wektora natęŝenia pola elektrycznego na przeciwny. E. ELEKTROFOREZA KAPILARNA (CE) Elektroforeza kapilarna jest stosowana do analizy krótkich, jednoniciowych oligonukleotydów oraz sekwencjonowania DNA. W elektroforezie kapilarnej stosuje się kolumny (kapilary), których wewnętrzna średnica wynosi najczęściej µm, natęŝenie prądu µa, a natęŝenie pola elektrycznego w Ŝelu około 300 V/cm przy zastosowaniu buforu o niskiej przewodności. W tej elektroforezie wykorzystano efekt elektrosomozy. Kapilary wykonane są ze stopionej krzemionki, która zawiera wolne grupy silanolowe ulegające jonizacji pod wpływem działania elektrolitu o ph<2, na skutek czego wewnętrzna powierzchnia kapilar zostaje naładowana ujemnie, a gęstość jej ładunku zaleŝy od ph. Przylegająca warstwa jonów dodatnich z roztworu znajdującego się w kapilarze po przyłoŝeniu pola elektrycznego porusza się, powodując przepływ cieczy z zewnętrznego zbiornika przez kapilary. Detekcja odbywa się najczęściej przez monitorowanie absorbancji UV na kolumnie. Objętość próbki jest rzędu nanolitrów, co pozwala analizować składniki pojedynczych komórek. F. ELEKTROFOREZA W śelach DENATURUJĄCYCH (CGGE) Elektroforeza w Ŝelach denaturujących jest głównie wykorzystywana do wykrywania i analizy mutacji. Wykorzystuje się tu fakt, Ŝe temperatura topnienia wiązań wodorowych między zasadami azotowymi DNA zaleŝy od składu zasad komplementarnych nici. Stosuje się tu czynnik denaturujący, głównie mocznika lub formamidu. Elektroforeza prowadzona jest w temperaturze bliskiej temperaturze topnienia danego DNA, zazwyczaj w C. Temperatura topnienia DNA zaleŝy od składu ilościowo puryn i pirymidyn w DNA (temperatura topnienia dla G i C jest wyŝsza niŝ dla A i T). 3. SPEKTROSKOPIA ABSORPCYJNA W pomiarach spektroskopowych zasadnicze znaczenie ma znajomość stęŝeń molowych kwasów nukleinowych. StęŜenie moŝna otrzymać z pomiaru absorpcji przy długości fali λ = 260 nm (maksymalna absorpcja promieniowania nadfioletowego przez DNA), jeŝeli znamy molowy współczynnik ekstynkcji ε: A260 C = ε l gdzie l to długość drogi optycznej w kuwecie. Przyjmuje się, ze wartości współczynnika ekstynkcji wynosi 6600 M -1 cm -1. Widmo absorpcji moŝe być wykorzystane do określenia stęŝenia i czystości próbki DNA. Pomiar stęŝenia DNA w roztworze oznacza się poprze pomiar absorpcji przy długości fali λ = 260 nm, określanej często jako OD gęstość optyczna. Idealny roztwór do pomiarów spektrofotometrycznych DNA to bufor o niskim stęŝeniu jonów, np. bufor TE. JeŜeli A 260 równa się 1 to stęŝenie dwuniciowego DNA (dsdna) wynosi około 50 µg/ml, jednoniciowego DNA (ssdna) 36 µg/ml, RNA - 40 µg/ml, a oligonukleotydów 30 µg/ml. NaleŜy jednak pamiętać, Ŝe jest to wartość przybliŝona, poniewaŝ wartość współczynnika ekstynkcji zaleŝy od składu zasad azotowych w DNA. Stosunek A 260 /A 280 jest natomiast często stosowna miarą czystości roztworu DNA, a ściślej miarą zanieczyszczenia DNA białkami (maksimum absorpcji UV dla białek wynosi 280 nm). Ogólnie preparat DNA uznaje się za czysty jeŝeli A 260 /A 280 wynosi 1,8-2,0. JeŜeli próbka DNA zanieczyszczona jest RNA to wartość A 260 /A 280 jest bliŝsza 2,0, natomiast jeŝeli próbka zanieczyszczona jest białkami to wartość A 260 /A 280 jest niŝsza niŝ 1,8. Absorpcja mierzona przy długości fali 230 odzwierciedla zanieczyszczenia pochodzące od węglowodorów, białek lub fenolu. W przypadku czystych próbek wartość A 260 /A 230 powinna wynosić 2,2. Absorpcja mierzona przy długości fali 325 nm moŝe być wyznacznikiem wytrąceń w roztworze lub zanieczyszczeń samej kuwety. 4

5 4. MAGNETYCZNY REZONANS JĄDROWY Magnetyczny rezonans jądrowy ma zastosowanie w badaniach struktury Z-DNA, obszarów przejść B Z-DNA oraz dynamiki tych przejść. NMR stosowany jest takŝe w badaniach nad oddziaływaniem DNA z róŝnymi ligandami np. w badaniach nad oddziaływaniem m.in. leków przeciwnowotworowych z DNA. 5. SPEKTROSKOPIA PROMIENIOWANIA RENTGENOWSKIEGO Spektroskopia promieniowania rentgenowskiego stosowana jest w badaniach krystalograficznych struktury DNA, w szczegółową charakterystykę w tym błędnie tworzone pary zasad czy zasady pozahelikalne. Za pomocą tej metody moŝna takŝe badać kompleksy DNA z róŝnymi związkami jak substancje przeciwnowotworowe i antybiotyki. 6. SPEKTROSOKOPIA RAMANA Spektroskopia Ramana opisuje rotacyjne i oscylacyjne widma cząsteczek. Pozwala ona na poznanie struktury pojedynczych grup atomów w układach biologicznych, a takŝe pozwala na uzyskanie informacji o szybkich zmianach strukturalnych zachodzących w cząsteczkach biologicznych. W klasycznej metodzie Ramana do wzbudzenia stosowany jest laser argonowy, gdzie DNA moŝna badać w roztworze, w formie odwodnionego włókna lub postaci krystalicznej. 7. SPEKTROSKOPIA W PODCZERWIENI Spektroskopia w podczerwieni była jednym z klasycznych narzędzi w badaniach nad strukturą i oddziaływaniem małych cząsteczek takich jak jony metali czy leki łączące się z DNA poprzez interkalację. 8. SPEKTROSKOPIA FLUORESCENCYJNA DNA nie wykazuje mierzalnej fluorescencji wewnętrznej z wyjątkiem niskich temperatur. Z DNA wiąŝą się natomiast znaczniki intekalatorowe jak EtBr czy barwniki akrydynowe, które fluorescencję wykazują. Jednak mają one tę wadę, Ŝe wiąŝą się z DNA niespecyficznie wzdłuŝ całej długości helisy. W przeciwieństwie do DNA fluorescencję wykazują białka, których fluorescencja w wielu przypadkach nie zmienia się po związaniu z DNA. 9. DICHROIZM KOŁOWY (CD) Dichroizm kołowy jest zjawiskiem polegającym na zróŝnicowanym oddziaływaniu cząsteczek (chiralnych) ze światłem o róŝnej polaryzacji kołowej. Kwasy nukleinowe ze względu na strukturę helikalną i określoną skręcalność, bardzo dobrze nadają się do badań metodą CD. Metoda ta pozwala róŝnicować struktury zawierające pętle oraz wykazujące róŝną skręcalność. Widmo CD zaleŝy od siły jonowej i rodzaju roztworu, w którym się znajduje. Zmiany konformacyjne w kwasach nukleinowych moŝna badać jako funkcje temperatury, ph, rozpuszczalnika. Technika ta jest szeroko stosowana w badaniu przejść konformacyjnych DNA takich jak denaturacja i zmiana form B A oraz B A czy rozróŝnienie DNA dwuniciowego od trójniciowego. Spektroskopia znajduje takŝe szerokie zastosowanie w badaniu oddziaływań kwasów nukleinowych z substancjami małocząsteczkowymi jak chromofory czy leki. Technika ta znalazła takŝe zastosowanie w badaniu oddziaływań typu: białko-białko czy białko-dna. 5

6 WYKONANIE ĆWICZENIA Materiały i sprzęt 1. Roztwór TE (10 mm Tris-base, 1mM EDTA, ph 8) 2. 1% roztwór agarozy 3. Roztwór bromku etydyny (50 mg/ml) 4. Roztwór buforu elektroforetycznego TBE 1 (90 mm Tris-base, 90 mm kwas borowy, 2 mm EDTA, ph 8) 5. Roztwór obciąŝający LB (50% glicerol, 0,25% błękit bromofenylowy, 1 mm EDTA) 6. Kolba Erlenmeyer'a 25 ml 7. Cylinder miarowy 8. Aparat do elektroforezy 9. Pipety automatyczne: 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml 10. Probówki eppendorf 11. Spektrofotometr UV-Vis 12. Kuwety kwarcowe a. Charakterystyka wyizolowanego DNA widmo absorpcji UV Rozcieńczyć 1:10 roztwór DNA przy pomocy buforu TE; w razie potrzeby przygotować rozcieńczenie 1:100. Zmierzyć z uŝyciem kuwet kwarcowych absorpcje roztworu DNA przy długości fali 230, 260 i 280 nm, stosując bufor TE jako odnośnik. Wyznaczyć stęŝenie DNA. b. Elektroforeza w Ŝelu agarozowym NawaŜkę 0,3 g agarozy rozpuścić w 30 ml buforu elektroforetycznego TBE 1 poprzez jej zagotowanie w kuchence mikrofalowej, tak aby agaroza nie tworzyła widocznych agregatów. Ostudzić tak przygotowany roztwór do około 50 C i dodać 1 µl bromku etydyny. Wlać roztwór agarozy do uprzednio przygotowanej formy (stolik elektroforetyczny) z umocowanym grzebieniem formującym studzienki do nanoszeni próbek. Po zastygnięciu agarozy zalać Ŝel buforem elektroforetycznym TBE 1. Powierzchnia buforu powinna znajdować się około 1 mm ponad górną powierzchnią Ŝelu. Powoli wyjąć grzebień, tak aby nie uszkodzić studzienek Ŝelu. Wymieszać w probówce eppendorfa 10 µl wcześniej przygotowanego roztworu DNA i 5 µl roztworu obciąŝającego LB. Dokładnie rozpipetować. Całość umieść w jednej studzience Ŝelu. Podłączyć elektrody aparatu elektroforetycznego do zasilacza. Elektroforezę prowadzić przez min przy napięciu 90 V. Obejrzeć Ŝel umieszczony na transiluminatorze emitującej światło nadfioletowe λ = nm. Opracowanie wyników 1) Obliczyć stosunek absorpcji roztworu DNA przy 230, 260 i 280 nm (A 260 /A 280, A 260 /A 230 ). Skomentować róŝnicę pomiędzy otrzymaną wartością a wielkością charakterystyczną dla wysoce oczyszczonego DNA. 2) Obliczyć stęŝenie DNA (mg/ml) w roztworze TE i na tej podstawie całkowitą ilość otrzymanego DNA i wydajność oczyszczania dla ludzkich komórek nowotworowych (A 260 = 1 to C dsdna = 50 µg/ml; 1 mln komórek 6 µg DNA) 3) Porównać wydajność i czystość DNA izolowanego z komórek roślinnych i zwierzęcych. 6

7 Literatura 1. Bryszewska M., Leyko W.: Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów, Warszawa: PWN 2000; 2. Techniki analizy i detekcji kwasów nukleinowych i białek, kurs zorganizowany przez Katedrę Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Akademii Rolniczej w Poznaniu, Techniki elektroforetyczne oraz produkcja i oczyszczanie białek rekombinowanych, kurs organizowany przez DNA-Gdańsk,