Badanie wpływu rożnych stężeń olejku eterycznego i naparu z szałwii lekarskiej Salvia officinalis

Transkrypt

1 Badanie wpływu rożnych stężeń olejku eterycznego i naparu z szałwii lekarskiej Salvia officinalis L. na tempo wzrostu hodowli płynnej bakterii Escherichia coli szczepów MC4100 i MC4100ΔClpB Autor: Olga Kałużna Klasa: III Opiekun: p. Hanna Szarafińska Szkoła: III Liceum Ogólnokształcące im. Bohaterów Westerplatte w Gdańsku Streszczenie Podczas badań sprawdzałam wpływ olejku eterycznego oraz naparu z szałwii lekarskiej Salvia officinalis w różnych stężeniach na tempo wzrostu hodowli płynnej bakterii Escherichia coli szczepów MC4100 i MC4100ΔClpB. Badanie wykazało bakteriobójcze i bakteriostatyczne działanie olejku szałwiowego w stężeniu 1:100 na bakterie obu szczepów. Również olejek w stężeniu 1:1000 początkowo wpływał hamująco na tempo wzrostu hodowli, ale bakterie były w stanie przezwyciężyć jego działanie. Olejek w stężeniu 1:10000 oraz napar w dowolnym stężeniu nie miały znaczącego wpływu na tempo wzrostu hodowli żadnego ze szczepów. Nie udało mi się ustalić bezpośredniego związku między obecnością białka opiekuńczego ClpB w komórkach bakteryjnych a ich odpornością na zastosowany czynnik stresotwórczy. Sugeruje to, że działanie olejku z szałwii lekarskiej nie wpływa na proces agregacji białek. Wstęp Szałwia lekarska Salvia officinalis, podobnie jak pozyskiwany z niej olejek eteryczny, jest znana od starożytności i wykorzystywana w wielu dziedzinach, między innymi jako środek leczniczy, w kosmetyce, w gastronomii. Napar z szałwii jest szeroko stosowany do płukania gardła w przypadku infekcji i przy bakteryjnych zapaleniach jamy ustnej ze względu na powszechne przekonanie o właściwościach bakteriobójczych i ściągających. Olejek eteryczny z szałwii, pozyskiwany metodą destylacji parą wodną, używany jest np. w aromaterapii i zewnętrznie jako środek przeciwzapalny. W mojej pracy badawczej postanowiłam sprawdzić jaki wpływ ma olejek szałwiowy kupiony w sklepie zielarskim oraz napar z suszonej szałwii lekarskiej na dwa szczepy bakterii Escherichia coli. Pierwszy ze szczepów - MC to standardowy szczep wykorzystywany do badań laboratoryjnych, natomiast w drugim - MC4100ΔClpB - zahamowana jest ekspresja genu kodującego jedno z białek opiekuńczych, co uniemożliwia mu efektywne przeciwdziałanie skutkom agregacji białek. Mój eksperyment miał na celu zbadanie jaki wpływ wywiera wydestylowany olejek eteryczny na tempo wzrostu bakterii E. coli oraz czy efekt ten różni się w wypadku tych dwóch szczepów. Materiał i metody Moją pracę badawczą przeprowadzałam w Katedrze Biochemii Wydziału Biologii Uniwersytetu Gdańskiego pod opieką p. mgr. Przemysława Glazy. Szczepy bakterii Escherichia coli: MC4100 i MC4100ΔClpB otrzymałam dzięki uprzejmości p. prof. Krzysztofa Liberka. Gatunek Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) to prokarionty należące do domeny Eubacteria (bakterie właściwe), do grupy enterobakterii [8]. Na podstawie składu ściany komórkowej klasyfikowane są jako bakterie gramujemne [8]. Szczep Escherichia coli MC4100 jest szczepem laboratoryjnym, nie występującym w środowisku naturalnym. Stanowi organizm modelowy wykorzystywany powszechnie w eksperymentach. Szczep ten jest niepatogenny względem ludzi i zwierząt. W dalszej części pracy nazywany będzie szczepem standardowym.

2 Szczep MC4100ΔClpB różni się od szczepu standardowego blokadą ekspresji genu kodującego białko ClpB (jedno z białek opiekuńczych, chroniących komórkę bakteryjną przed negatywnym wpływem czynników środowiskowych zmieniających prawidłową konformację białek). Dalej nazywany jest szczepem zmutowanym. Zaszczepiłam hodowle nocne bakterii dodając jedną kolonię bakterii odpowiedniego szczepu pobraną z płytki z pożywką do 50 ml pożywki LB i pozostawiając na noc w wytrząsarce Julabo SW23 w temperaturze 37ºC. Odmłodziłam hodowle dodając 2 ml hodowli nocnej do 50 ml pożywki LB. Kolby z nowymi hodowlami wstawiłam do wytrząsarki (temperatura łaźni wodnej 37ºC, tempo obrotów 200 rpm) i odmładzałam do momentu uzyskania gęstości optycznej (OD) w przedziale 0,250-0,400 przy długości fali 600 nm. Użyłam spektrofotometru NOVASPEC II firmy PHARMACIA. W przypadku szczepu standardowego odmładzanie trwało 60 min., a zmutowanego 120 min. z powodu mniejszego tempa wzrostu bakterii szczepu zmutowanego w pierwszej fazie rozwoju kolonii. Do badań użyłam olejku szałwiowego firmy Semifarm, który zakupiłam w sklepie zielarskim. Jest to czysty olejek, pozyskiwany metodą destylacji parą wodną, co oznacza, że jego stężenie wynosi 100%. Napar z szałwii lekarskiej przygotowałam przy użyciu suszonej szałwii w saszetkach firmy Herbapol według instrukcji na opakowaniu. 2 saszetki (każda po 1,2 g suszonej szałwii) zalałam 100 ml wody o temperaturze 95ºC. Pozostawiłam mieszankę do zaparzenia przez 15 min. Następnie ostudziłam do temperatury pokojowej. Stężenie olejku eterycznego w naparze było niemożliwe do oszacowania, natomiast prawdopodobnie wielokrotnie niższe niż w czystym olejku ze względu na niewielką jego zawartość w pędach szałwii oraz rozcieńczenie wodą podczas parzenia. W skład olejku szałwiowego wchodzą między innymi związki takie jak: α-tujon (31,7%), kamfora (16,7%), α-pinen, kamfen, β-pinen, β-mircen, p-cymen, limonen, 1,8-cineol, β-tujon, borneol, β-kariofilen i α-humulen, które należą do głównie do grup terpenów i monoterpenów. Przed użyciem odczynników do doświadczenia przefiltrowałam je używając jałowej strzykawki i filtra Syringe Driven Filter Unit Millipore Millex-GS 0,22 μm w celu pozbycia się ewentualnych biologicznych zanieczyszczeń, które mogłyby zafałszować wyniki doświadczenia. Aby uzyskać roztwory o różnych stężeniach, do kolb stożkowych o pojemności 100 ml odmierzyłam po 9 ml odmłodzonych hodowli E. coli, oznaczyłam kolby, a następnie dodałam odpowiednie objętości wody destylowanej i odczynników, aby uzyskać pożądane proporcje. Podczas przeprowadzania próby kontrolnej zamiast odczynników dodałam 1 ml wody destylowanej. Rodzaj odczynnika Stężenie odczynnika Objętość odczynnika (μl) Olejek szałwiowy Napar z szałwii Objętość wody destylowanej (μl) 1: : : : : Tabela 1. Proporcje odczynników i wody w poszczególnych stężeniach dodawanych do płynnej hodowli bakteryjnej. Podczas eksperymentu przeprowadziłam 6 serii pomiarów - po 3 próby dla każdego ze szczepów w celu uzyskania powtarzalności wyników. W każdej serii było po 6 kolb. Jedna seria obejmowała 9 pomiarów OD: pierwszy tuż po dodaniu odczynnika do kolby, a następne co 15 min. przez 2 godziny. Gęstość optyczna hodowli świadczy o jej liczebności. W czasie pomiędzy pomiarami kolby przebywały w wytrząsarce w warunkach optimum fizjologicznego E. coli (temperatura 37ºC), przy tempie obrotów 200 rpm. Do opracowania wyników użyłam arkusza kalkulacyjnego programu OpenOffice.org Calc, dzięki któremu przeprowadziłam standaryzację wyników, obliczyłam średnią arytmetyczną uzyskanych wyników oraz odchylenie standardowe prób, a także stworzyłam wykresy przedstawione w tej pracy. Wykresy zawierają dane po standaryzacji.

3 Wyniki 0,9 gęstość optyczna 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, czas od rozpoczęcia pomiarów (min.) Wykres 1. Wpływ olejku w stężeniu 1:10000 oraz naparu z szałwii lekarskiej na bakterie pałeczki okrężnicy (szczep standardowy i Olejek 1:10000 (szczep Napar 1:10 (szczep Napar 1:100 (szczep Olejek 1:10000 (szczep Napar 1:10 (szczep Napar 1:100 (szczep Olejek szałwiowy w stężeniu 1:10000 oraz napar w dowolnym stężeniu nie wpływają znacząco na rozwój hodowli standardowego szczepu. Jak potwierdziły kolejne próby, zarówno względem tego szczepu, jak i mutanta, takie stężenie olejków eterycznych nie spowodowało spadku tempa wzrostu kolonii bakteryjnych. Słupki standardowego odchylenia nie zostały uwidocznione na Wykresie 1, ponieważ się pokrywają, co pokazuje, że różnice pomiędzy uzyskanymi wartościami są nieistotne statystycznie. gęstość optyczna 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0-0,1-0, czas od rozpoczęcia pomiarów (min.) Wykres 2. Wpływ olejku z szałwii lekarskiej w stężeniu 1:100 na bakterie pałeczki okrężnicy (szczep standardowy i Próba kontrolna (szczep Olejek 1:100 (szczep Próba kontrolna (szczep Olejek 1:100 (szczep Dopiero wyższe stężenie olejku (1:100, 1:1000) spowodowało zmiany w tempie rozwoju kolonii, zarówno w przypadku szczepu standardowego, jak i mutanta. Po dodaniu olejku w stężeniu 1:100 do hodowli bakterii szczepu standardowego widać działanie bakteriobójcze na początku wykonywania pomiarów (po 30 min.), a następnie stale bakteriostatyczne.

4 W przypadku działania tego samego stężenia olejku na szczep zmutowany, zaobserwowałam bardzo ciekawy i trudny do wytłumaczenia efekt. Przez pierwsze 15 min. po dodaniu odczynnika, OD hodowli wzrastało równomiernie, podobnie jak próby kontrolnej, a dopiero w kolejnym pomiarze, tj. po 30 min. od wprowadzenia olejku, gęstość optyczna hodowli spadła do poziomu z początku doświadczenia. Podczas dalszych pomiarów utrzymywało się podobne OD. Zjawisko to zaobserwowałam we wszystkich trzech powtórzeniach. gęstość optyczna 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1-0,1-0,2 Po dodaniu olejku w stężeniu 1:1000 do szczepu standardowego w pierwszym pomiarze po 15 min. zaobserwowałam wzrost zbieżny z próbą kontrolną. Następnie został on zahamowany przez bakteriostatyczne działanie olejku, które jednak nie utrzymywało się długo (już w pomiarze po 45 min. od rozpoczęcia doświadczenia widoczny był dalszy wzrost hodowli w tym samym tempie co próba kontrolna). Hodowla szczepu zmutowanego reagowała odmiennie niż standardowego. Natychmiast nastąpiło bakteriostatyczne działanie olejku stężeniu 1:1000, w przeciwieństwie do stężenia 1:100, w którym to przypadku w pierwszym pomiarze widoczny jest wyraźny wzrost OD. Działanie bakteriobójcze widoczne było przez ok. 1h, po tym czasie (począwszy od pomiaru po 75 min. od rozpoczęcia eksperymentu) zauważyłam stopniowy wzrost liczebności hodowli. Dyskusja czas od rozpoczęcia pomiarów (min.) Wykres 3. Wpływ olejku z szałwii lekarskiej w stężeniu 1:1000 na bakterie pałeczki okrężnicy (szczep standardowy i Olejek 1:1000 (szczep Olejek 1:1000 (szczep W pracy badałam, czy brak białka opiekuńczego ClpB u bakterii szczepu zmutowanego ma wpływ na tempo wzrostu ich hodowli w obliczu działania czynnika stresotwórczego - olejku eterycznego z szałwii lekarskiej. Białko ClpB służy do rozwijania nierozpuszczalnych w wodzie agregatów białkowych [2], powstających w wyniku działania czynników stresowych (np. temperatury, utleniaczy, promieni UV, związków toksycznych) rozprostowujących naturalną konformację białek, które następnie fałdują się w sposób niekontrolowany i zupełnie przypadkowy, nie mogąc dłużej spełniać swojej funkcji w komórce. Następuje wówczas wytrącenie zlepionych z wielu zdenaturowanych cząsteczek białka agregatów, które upośledzają pracę komórki bakteryjnej, powodując w efekcie jej obumarcie [6]. W przypadku braku ekspresji genu odpowiadającego za dezagregację (w wypadku zastosowanego szczepu mutanta jest to gen kodujący białko ClpB), komórka ma dużo mniejszą odporność na stres środowiskowy, a co za tym idzie - jest dużo wrażliwsza na zachodzące w otoczeniu zmiany. Prawidłowy kształt cząsteczek białka jest najważniejszym czynnikiem umożliwiającym im pełnienie określonej funkcji. Zwijanie białek do prawidłowej konformacji in vitro jest procesem bardzo mało efektywnym, podczas którego tylko niewielka ilość białek jest w stanie uzyskać prawidłowy kształt, natomiast w komórkach te procesy zachodzą bardzo często, z dużą prędkością i efektywnością

5 [5, 8]. Najprawdopodobniej jest to związane z obecnością tzw. chaperone proteins - białek opiekuńczych, które umożliwiają zwijanie białek do odpowiedniego kształtu przy zużyciu dużo mniejszych nakładów energii [5]. Chaperony nie decydują o typie konformacji, a jedynie usprawniają przebieg fałdowania i zapobiegają tworzeniu nierozpuszczalnych agregatów z częściowo sfałdowanych cząsteczek [8]. Inne białka opiekuńcze, między innymi ClpB u prokariontów, zajmują się rozwijaniem nieprawidłowo sfałdowanych cząsteczek białka (tworzących agregaty), dzięki czemu mogą one w dalszym ciągu pełnić swoją rolę w komórce [2]. Związki organiczne zawarte w olejku eterycznym z Saliva officinalis, m.in.: α-tujon (31,7%) i kamfora (16,7%), według niektórych naukowców mają działanie bakteriostatyczne względem bakterii E. coli [7]. Olejek szałwiowy w stężeniu 1:100 wykazuje na tyle silne działanie bakteriostatyczne względem obu badanych szczepów, że nie są one w stanie go przezwyciężyć, a niska liczebność hodowli utrzymuje się przez cały czas prowadzenia pomiarów [Wykres 2]. Wzrost OD na początku pomiarów hodowli zmutowanego szczepu E. coli z olejkiem w stężeniu 1:100 przypuszczalnie wiąże się z nagłym wzrostem ilości nierozpuszczalnych agregatów, które powodują zmętnienie hodowli, jeszcze przed obumarciem bakterii. W kolejnym pomiarze następuje gwałtowny spadek gęstości optycznej, prawdopodobnie wskutek nagłej śmierci komórek. Ponieważ nie występuje białko ClpB, nie może następować dezagregacja uszkodzonych białek. Ich funkcja nie może być przywrócona przez brak białka opiekuńczego, co sprawia, że zostają zdegradowane proteolitycznie [5]. Możliwe jest również, że bakterie są w stanie przystosować się do czynnika stresowego oraz przezwyciężyć jego działanie (jak w przypadku działania olejku w stężeniu 1:1000 na szczep standardowy, gdy po ok. 45 min. liczebność bakterii zaczyna rosnąć w takim samym tempie jak bakterie z próby kontrolnej). Mechanizm pozwalający na przystosowanie się bakterii do zmieniających się warunków środowiska opisany jest w przypadku regulacji ekspresji genów operonu laktozowego [8]. Być może po dodaniu do hodowli bakteryjnej olejku eterycznego bakterie są w stanie aktywować ekspresję genów kodujących takie białka, które pozwalają przezwyciężyć szkodliwe działanie czynnika stresotwórczego. Podobny efekt wzrostu zaobserwowałam w wypadku szczepu zmutowanego, ale wyższa liczebność zaczyna być widoczna dopiero ok. 75. minuty. Mimo że tempo wzrostu jest znacznie mniejsze niż przy szczepie standardowym, wyraźnie jest widoczny jego stały przebieg po 75. minucie. Można spekulować na temat przyczyny tego procesu, jednak moim zdaniem taki przebieg doświadczenia sugeruje, że olejek z szałwii nie wpływa bezpośrednio na powstawanie agregatów białkowych, dlatego brak ekspresji białka ClpB nie ma wpływu na odporność tych bakterii. Szczególnie silne działanie przeciwdrobnoustrojowe przypisuje się olejkom eterycznym ze względu na ich właściwości lipofilowe [9, 1], które powoduje niszczenie ściany i błony komórkowej mikroorganizmów oraz hamowanie syntezy niezbędnych do życia związków, między innymi białek strukturalnych i enzymatycznych [1]. Badania dotyczące właściwości antybakteryjnych olejku eterycznego z szałwii lekarskiej wyraźnie stwierdzają większą aktywność olejków względem bakterii gramdodatnich niż gramujemnych [7, 3]. Ze względu na budowę ściany komórkowej bakterii gramujemnych, których błona zewnętrzna zbudowana jest głównie z lipidów i lipoprotein [8] olejki eteryczne muszą pokonać barierę dwóch błon. W przypadku bakterii gramdodatnich, których błona komórkowa jest pokryta grubą warstwą peptydoglikanu [8], można spekulować, że jest on przepuszczalny dla substancji zawartych w olejku i dlatego są one mniej odporne od bakterii gramujemnych. Być może olejek reaguje z fosfolipidami zawartymi w błonie komórkowej wskutek swojej lipofilności [9, 1] i to powoduje obumieranie bakterii. Należy zaznaczyć, że wyniki doświadczenia na szczepie zmutowanym z użyciem olejku w stężeniu 1:1000 są niejednoznaczne, ale w każdej z trzech prób odnotowałam znaczący statystycznie wzrost OD hodowli z olejkiem 1:1000 względem hodowli z olejkiem 1:100 w ostatnim pomiarze, mimo sporych odchyleń standardowych. Może to wskazywać na fakt, że w tym konkretnym stężeniu olejku tempo wzrostu mutanta zależy także od innych czynników lub jest losowe. Być może wykonanie większej liczby powtórzeń dla tego stężenia rozwiałoby pojawiające się wątpliwości oraz zmniejszyło odchylenie standardowe. Niemniej, nie udało mi się wykazać bezpośredniego powiązania między obecnością białka

6 dezagregującego ClpB w komórkach bakterii E. coli a jej odpornością na olejek z szałwii lekarskiej. Można zatem wysnuć wniosek, że olejek z Salvia officinalis prawdopodobnie nie zmienia konformacji białek oraz nie powoduje ich agregacji. Bakteriobójcza funkcja olejków eterycznych może mieć praktyczne znaczenie dla rośliny, np. zapobieganie infekcji w okolicach uszkodzeń rośliny powstałych wskutek działań mechanicznych [9]. Zdecydowałam się na pominięcie słupków standardowego odchylenia na Wykresie 1 ze względu na to, że zaburzały przejrzystość wyników, a odchylenia były statystycznie nieistotne. W pozostałych przypadkach postanowiłam pozostawić SD mimo przeprowadzenia tylko trzech prób (co może być uznane za niewystarczającą liczbę do obliczenia standardowego odchylenia), ponieważ obrazuje ono różnice w uzyskanych wynikach i pozwala wyodrębnić dane, które z całą pewnością są istotne dla przeprowadzonego przeze mnie eksperymentu. Bibliografia [1] E. Czerwińska, W, Piotrowski, Czystość mikrobiologiczna przypraw i ich aktywność bakteriostatyczna, VII Ogólnopolska Konferencja Naukowa [2] S.M. Doyle, S. Wickner, Hsp104 and ClpB: protein disaggregating machines. Trends Biochem Sci Jan;34(1):40-8. Epub 2008 Nov 12 [3] E. Hać-Szymańczuk, E. Lipińska, S. Błażejak, K. Bieniak, Ocena aktywności przeciwbakteryjnej szałwii lekarskiej (Salvia officinalis L.), Katedra Biotechnologii, Mikrobiologii i Oceny Żywności Wydział Nauk o Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego [4] M. Kelen, B. Tepe, Chemical composition, antioxidant and antimicrobial properties of the essentials oils of three Salvia species from Turkish flora. Bioresource Technol., 2008; 99 [5] H. Lodish, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, and J. Darnell, Molecular Cell Biology, 4th edition. New York: W. H. Freeman; ISBN-10: [6] M. Simon, M. Waszyk-Nowaczyk, K. Książek, Starzenie się organizmów prokariotycznych, Postepy Hig Med Dosw (online), 2011; 65: [7] Marina Soković, Jasmina Glamočlija, Petar D. Marin, Dejan Brkić and Leo J. L. D. van Griensven, Antibacterial Effects of the Essential Oils of Commonly Consumed Medicinal Herbs Using an In Vitro Model, Published: 27 October 2010 [8] E. P. Solomon, L.R. Berg, D. W. Martin, Biologia, wg VII wydania amerykańskiego, MULTICO Oficyna Wydawnicza, Warszawa 2007; ISBN [9] K. P. Svoboda and J. B. Hampson, Bioactivity of essential oils of selected temperate aromatic plants: antibacterial, antioxidant, antiinflammatory and other related pharmacological activities. Plant Biology Department, SAC Auchincruive, Ayr, Scotland, UK., KA6 5HW