Molekularna organizacja komórki

Transkrypt

1 Arkadiusz Kozubek Aleksander F. Sikorski Jan Szopa Molekularna organizacja komórki II. Lipidy, liposomy i błony biologiczne pod redakcją A. Kozubka Wydanie II, poprawione Wrocław 1996 Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego

2 Recenzent Maria Warwas Opracowanie typograficzne Maciej Szłapka Copyright 1993 by Uniwersytet Wrocławski - Wydawnictwo ISBN Łamanie wykonano w Pracowni Składu Komputerowgo ΤΥΡΟ-GRAF Wydrukowano we Wrocławskiej Drukarni Naukowej

3 Spis treści Wstęp 9 1. Lipidy Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych Ekstrakcja lipidów z materiału zwierzęcego 18 l.1.2. Ekstrakcja lipidów rozpuszczalnikami o małej toksyczności Ekstrakcja lipidów z erytrocytów Ekstrakcja lipidów z materiału roślinnego Izolacja i analiza lipidów Frakcjonowanie lipidów metodą chromatografii na CM-celulozie Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) 24 l.2.3. Analiza fosfolipidów w chromatografii cienkowarstwowej 25 l.2.4. Oznaczanie fosforu w rozdzielonych w TLC frakcjach fosfolipidowych Analiza lipidów roślinnych w chromatografii cienkowarstwowej Izolacja i oczyszczanie lecytyny jajecznej 28 l.2.7. Izolacja monogalakto- i dwugalaktodwuglicerydów z całkowitych lipidów roślinnych 30 l.2.8. Izolacja lipidów fenolowych (5-n-alk(en)ylorezorcynoli) z ziaren żyta 31 l.2.9. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów rezorcynolowych Oznaczanie składu nasyconych i nienasyconych homologów lipidów rezorcynolowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej 33 l Oznaczanie składu homologów lipidów rezorcynolowych pod względem długości łańcucha alifatycznego w chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu Oczyszczanie lipidów rezorcynolowych oraz izolacja poszczególnych ich homologów Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach Transestryfikacja lipidów Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej l.3.3. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych w chromatografii gazowej Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie lipidów całkowitych metodą wanilinową... 39

4 Spis treści Oznaczanie cholesterolu całkowitego Oznaczanie glikolipidów metodą fenolową Oznaczanie fosforu w fosfolipidach Oznaczanie fosfolipidów w zawiesinach wodnych (np. w liposomach) 43 l.4.6. Oznaczanie lipidów rezorcynolowych Detekcja lipidów w chromatografii cienkowarstwowej Detekcja nieswoista Detekcja swoista Amfifilowe właściwości lipidów Wyznaczanie krytycznego stężenia micelizacji na przykładzie związku powierzchniowo czynnego 53 l.6.2. Właściwości termotropowe fosfolipidów - wyznaczanie temperatury przejścia fazowego metodą optyczną 54 l.6.3. Samoorganizacja cząsteczek fosfolipidów - powstawanie liposomów Utlenianie lipidów 59 l.7.1. Oznaczanie produktów peroksydacji reagujących z kwasem tiobarbiturowym Wybrane enzymy metabolizmu lipidów 61 l.8. l. Lipaza trójglicerydowa - test dyfuzyjny na wykazywanie aktywności Fosfolipaza A Oznaczanie aktywności fosfolipazy A Fosfolipaza D Izolacja częściowo oczyszczonej fosfolipazy D 64 l.8.6. Hydroliza fosfatydylocholiny przez fosfolipazę D Wykorzystanie fosfolipazy D do konwersji lecytyny do innych fosfolipidów Lipoksygenazy - enzymatyczne utlenianie lipidów Utlenianie kwasu linolowego przez lipoksygenazę soi Błony biologiczne Białka i lipidy błon erytrocytów Porównanie składu lipidowego błon erytrocytów przeżuwaczy i nieprzeżuwaczy Izolacja i analiza ilościowa i jakościowa białek cieni erytrocytów Oznaczanie białka metodą Lowry'ego Oznaczanie cukrów całkowitych Właściwości barierowe błon biologicznych Transport bierny małych nieelektrolitów 76

5 Spis treści Wybiórczość transportu ułatwionego jonów poprzez błonę biologiczną Indukowana przepuszczalność dwuwarstwy fosfolipidowej dla jonów. Jonofory Płynność błony biologicznej Ocena płynności błon pęcherzyków lipidowych sporządzonych z mieszaniny fosfatydylocholiny i cholesterolu (9:1) metodą depolaryzacji fluorescencji z użyciem difenyloheksatrienu Liposomy jako modele w badaniach procesu fuzji błon biologicznych l. Badanie fuzji liposomów poprzez śledzenie mieszania zawartości ich przestrzeni wodnych Elementy technologii liposomowej Techniki preparacji liposomów Efekt stosowanej techniki preparacyjnej na pojemność liposomów Duże jednowarstwowe liposomy obciążone" sacharozą, metodą solubilizacji detergentem niejonowym i dializy Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach Wpływ składu lipidowego na objętość zamkniętą Określanie trwałości i stabilności liposomów Uwalnianie karboksyfluoresceiny jako miernik stabilności liposomów Badanie wpływu surowicy na trwałość liposomów Dodatek Temperatury i entalpie głównego przejścia fazowego fosfolipidów (Tabela 4) Temperatury przejścia dwuwarstwa-h II fosfatydyloetanolamin (Tabela 5) Orientacyjne masy cząsteczkowe niektórych lipidów (Tabela 6) Struktura i niektóre właściwości wybranych związków powierzchniowo czynnych (Tabela 7) 107

6 Wstęp Lipidy (od greckiego słowa lipos - tłuszcz) są drobnocząsteczkowymi związkami organicznymi występującymi w komórkach zwierząt, roślin i mikroorganizmów lub na ich powierzchni. Lipidy pełnią kluczową rolę jako aktywne składniki błon biologicznych, a także w wielu procesach metabolicznych. Są również formą zapasową paliwa metabolicznego. Pierwszą analizę elementarną lipidów przeprowadził Lavoisier wykazując, że tłuszcze i oleje składają się głównie z węgla i wodoru. Scheele badając lipidy odkrył glicerol i wykazał jego obecność w tłuszczach zwierzęcych i olejach roślinnych. Chevreul w 1811 r. wydzielił z mydeł kwasy tłuszczowe, a w 1812 r. odkrył w kamieniach żółciowych cholesterol. Podzielił on tłuszcze na dwie grupy - tłuszcze zmydlające się i niezmydlające się i wykazał, że tłuszcze zmydlające się są estrami glicerolu i kwasów tłuszczowych. W tym samym czasie niemiecki lekarz Vogel stwierdził występowanie cholesterolu w ścianach naczyń krwionośnych człowieka. W 1877 r. Hoppe-Seiler wydzielił z żółtka jaja oraz z mózgu lipid nazwany lecytyną (z greckiego lekitos - żółtko jaja). W 1884 r. angielski lekarz G. Tudicum w swojej książce dotyczącej budowy mózgu wskazywał biologiczną uniwersalność fosfolipidów. W szczególności napisał, że fosfatydy są chemiczną duszą każdej bioplazmy, zwierzęcej i roślinnej. Mogą pełnić różnorodne funkcje dzięki posiadaniu kontrastowych właściwości. Szczególnie istotna jest ich zdolność do tworzenia roztworów koloidalnych. Bez tych właściwości mózg, jak i każda bioplazma nie mogłyby funkcjonować. Badacz ten wydzielił również z mózgu związki zawierające azot i fosfor, które nazwał kefaliną, sfingomielina i cerebrozydem. Dalsze postępy badań lipidów następowały powoli i dopiero od lat pięćdziesiątych XX w. po opracowaniu nowych metod rozdzielania i analizy tych związków stały się możliwe znaczące postępy. Nowo uzyskiwane dane pozwoliły na zweryfikowanie dotychczas przyjętej opinii o funkcji biologicznej lipidów. Funkcje zapasowe i energetyczne zostały zepchnięte na plan dalszy - głównymi okazały się te, które dotychczas były mało dostrzegane - udział w budowie i funkcji błon biologicznych, procesach biosyntezy i modyfikacji białek w komórce, przemianach energii (fotosynteza), a także w międzykomórkowym przekazywaniu informacji, jak również w wielu istotnych przemianach metabolicznych (np. lipidowe hormony, witaminy, barwniki czy kwasy żółciowe). Jedną z najbardziej intrygujących cech lipidów jest ich nadzwyczajna różnorodność. Powody istnienia takiej różnorodności są niezbyt znane, tym niemniej coraz więcej uwagi poświęca się badaniom jej roli np. w budowie i funkcji błon biologicznych, w których lipidy stanowią średnio 50% składu (od 80% w osłonce mielinowej do 20% w mitochondriach). Nawet pojedyncza błona może zawierać ponad 100 unikalnych typów lipidów. Dlaczego tak wiele i czy każda błona ma unikalny skład lipidowy? Powody tej heterogenności są jeszcze mało znane, chociaż coraz częściej stwierdza się aktywną rolę lipidów w procesach przebiegają-

7 Wstęp 10 cych z udziałem błon biologicznych. W tych badaniach istotne są następujące zagadnienia: - mieszanina lipidów powinna co najmniej tworzyć stabilną strukturę dwuwarstwową, w której białka mogłyby wykazywać swą aktywność, - jedne typy lipidów mogą być wymagane do stabilizacji np. rejonów o silnym zakrzywieniu, połączeń między błonami czy też optymalnej interakcji z określonymi białkami, - inne lipidy są ważnymi czynnikami regulatorowymi. Szczególnie istotne są pochodne fosfatydyloinozytolu występujące w błonach komórek eukariotycznych, - pewne lipidy biorą także udział w szlakach biosyntezy. Na przykład fosfatydyloglicerol u E. coli dostarcza reszt glicerofosforanowych dla biosyntezy periplazmatycznych oligosacharydów, - dla optymalnej aktywności pewnych enzymów mogą być również wymagane pewne swoiste lipidy, - lipidy, a w szczególności gangliozydy, pełnić mogą istotną rolę w regulacji wzrostu komórki, wiązaniu do swoistych receptorów w błonie plazmatycznej, a także w procesie adhezji, - inne składniki lipidowe również mogą pełnić specjalne funkcje. Dotyczy to m.in. dolicholu, ubichinonów, menachinonów, karotenoidów, a także czynnika aktywującego krwinki płytkowe. Opisane w dalszej części tego skryptu ćwiczenia mają na celu zilustrowanie tematyki lipidowej oraz wstępu do problematyki błon biologicznych. Nie pretendują jednak do roli wyczerpującej ilustracji wszystkich zagadnień możliwych do napotkania w czasie studiowania biochemii i biofizyki lipidów i błon biologicznych.