Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Określanie liczby chromosomów w komórkach eukariotycznych

Transkrypt

1 WSTĘP Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki Określanie liczby chromosomów w komórkach eukariotycznych Opracowali 21 kwietnia 2016: mgr inż. Majus Misiak, dr hab. Ewa Augustin i prof. dr hab. inż. Andrzej Składanowski Uporządkowanie materiału genetycznego w komórkach eukariotycznych odbywa się na wielu poziomach: od nici DNA nawiniętej wokół kompleksu białek histonowych do chromosomów umiejscowionych w dyskretnych domenach w jądrze komórkowym. Ze względu na strukturę chromatyny, obserwacje chromosomów mogą być prowadzone w systematyczny sposób jedynie podczas mitozy. Stopniowa kondensacja chromatyny w trakcie mitozy (a także mejozy) prowadzi do wyodrębnienia chromosomów jako oddzielnych tworów morfologicznych. W chromosomie mitotycznym można wyróżnić poszczególne regiony (ryc. 1): ramię p (krótkie), q (długie), centromer oraz telomery. Ze względu na położenie centromeru, chromosomy można podzielić na: metacentryczne (centromer w środku chromosomu), submetacentryczne (w pobliżu środka), akrocentryczne (w pobliżu jednego z końców), telocentryczne (na końcu chromosomu) oraz holocentryczne (takie w których wiele centromerów rozciąga się na całej długości chromosomu). U człowieka występują wyłącznie pierwsze trzy typy chromosomów. Chromosomy telocentryczne posiada m.in. mysz domowa, a najrzadziej występujące chromosomy holocentryczne są obserwowane w ważnym organizmie modelowym w badaniach biologicznych - nicieniu C. elegans. Klasyczne techniki cytogenetyczne pozwalają nie tylko na rozróżnienie chromosomów na podstawie rozmiaru i położenia centromeru, ale też na wybarwienie na chromosomach ściśle zdefiniowanych rejonów, tzw. prążków. Każdy prążek na chromosomie stanowi odzwierciedlenie funkcjonalnych i strukturalnych cech, które są zachowane na odcinku na tyle długim, by mogły być zaobserwowane przy pomocy mikroskopu. Najczęściej stosowane metody uwidaczniania prążków opierają się na zależnych od sekwencji DNA różnicach w wiązaniu barwników w poszczególnych rejonach chromosomów: G najważniejsza metoda prążkowania chromosomów, oparta na częściowym nadtrawieniu enzymami proteolitycznymi (np. trypsyną), a następnie wyznakowaniu barwnikiem Giemsy (mieszanina błękitu metylenowego, eozyny i azuru B), wiążącym się zarówno z DNA, jak i białkami. Rejony bogate w pary AT silnie wiążą barwnik, tworząc ciemne pasma, w przeciwieństwie do par bogatych w pary GC oraz niektórych par mieszanych. R odwrócone barwienie Giemsy (ang. reverse), polegające na denaturacji DNA poprzez ogrzewanie w kwaśnym roztworze, a następnie barwienie odczynnikiem Giemsy. W tych warunkach preferowana jest denaturacja sekwencji AT, pozwalająca na dobarwienie sekwencji GC. Prążki R stanowią zatem odwrotność prążków G. Zastosowanie ostrzejszych warunków denaturacji może być zastosowane do wybarwienia rejonów najbogatszych w pary GC (prążków T), z których około połowy znajduje się w rejonach telomerowych. 1

2 Rycina 1. Schemat przedstawiający wyidealizowany obraz kariotypu człowieka (ideogram) z zaznaczonymi prążkami G-ciemnymi i G-jasnymi (rozdzielczość 850 prążków). Przykładowe chromosomy meta-, submeta- i akrocentryczne zostały opisane, wraz z wyszczególnionymi elementami strukturalnymi. Źródło: Alberts B. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2014, zmodyfikowane. Q barwienie z wykorzystaniem fluorescencyjnej pochodnej akrydyny - chinakryny (ang. quinacrine). Związek ten interkaluje do DNA, przy czym fluorescencja po związaniu w rejonach bogatych w pary AT jest silniejsza, niż w przypadku rejonów bogatych w pary GC. Z tego względu prążki Q są uważane za równoważne prążkom G. Inne barwniki fluorescencyjne preferujące pary AT (np. DAPI) zachowują się analogicznie, jednak są mniej czułe na różnice sekwencji od chinakryny. Fluorochromy wiążące się preferencyjnie do rejonów GC DNA (7-AAD, 7- aminoaktynomycyna D) dają wzór zbliżony do prążków R. Wybarwienie prążków G, R i Q może być przeprowadzone dla większości ssaków oraz ptaków, jednak w przypadku innych eukariontów nie zawsze jest możliwe. U człowieka pasma G-ciemne (często po prostu: pasma G) są ściślej upakowane, zawierają geny późno replikowane oraz długie sekwencje rozproszone (LINE ang. long interspersed nuclear elements). Pasma G-jasne (albo pasma R) zawierają geny wcześnie replikowane (typu housekeeping), sekwencje Alu bogate w pary GC oraz wyspy CpG rejony chromosomów znajdujące się w pobliżu rejonów promotorowych ok. 40% wszystkich genów. Obecność wysp CpG w pasmach G-jasnych jest zatem ściśle powiązane z występowaniem genów w tych rejonach. Przykładowo, chromosom 22 bogaty w pasma R charakteryzuje się większą gęstością genów od chromosomów 13, 18 i 21 bogatych w pasma G. Obserwacje chromosomów prowadzone są w celu określenia ich liczby w komórce (tzw. ploidalności) oraz ich morfologii. Identyfikacja, za pomocą technik cytogenetycznych, abnormalnej liczby chromosomów, delecji, inwersji, amplifikacji czy też translokacji fragmentów DNA z jednego chromosomu do drugiego stanowi podstawę w diagnostyce chorób genetycznych. Występowanie trzech kopii jednego chromosomu (trisomia), zwykle na skutek nondysjunkcji chromosomów w trakcie mejozy, jest przyczyną licznych schorzeń, z których do najczęściej występujących należą zespół Downa oraz zespół Edwardsa (tab. 1). Kariotyp pacjenta stanowi ważne kryterium diagnostyczne w chorobach nowotworowych, w szczególności w ostrej białaczce szpikowej (AML, ang. acute myeloid leukemia) i ostrej białaczce limfoblastycznej (ALL ang. acute lymphoblastic leukemia). Występowanie powtarzających się translokacji bądź 2

3 Tabela 1. Przykłady anomalii chromosomalnych u człowieka Anomalia Charakterystyka genetyczna Objawy kliniczne Zespół Turnera 45,X Niski wzrost, szczątkowe jajniki i słabo rozwinięte sutki, dziecięcy narząd rodny Zespół Klinefeltera 47,XXY Ginekomastia, małe jądra Trisomia X 47,XXX Dwa ciałka Barra, prawie normalny fenotyp żeński ze słabo wykształconymi drugorzędowymi cechami płciowymi Zespół Downa Zespół Edwardsa Zespół Pradera-Williego Zespół Patau (trisomia D) 47,XX,+21 47,XY,+21 47,XX,+18 47,XY,+18 Częściowa delecja ramienia q chr ,XX,+13 47,XY,+13 Translokacyjny zespół Downa Translokacje między chr. 15, 22 a chr. 21 Zespół Filadelfia Zespół Cri du Chat ("koci krzyk") t(9;22)(q34:q11) (Translokacja fragmentu ramienia q chr. 9 do chr. 22) Częściowa delecja ramienia p chr. 5 Fałd mongolski (epicantus), wysunięty język, hipotonia (stan zmniejszonego napięcia mięśniowego), upośledzenie umysłowe Liczne wady wrodzone, upośledzenie umysłowe Niedorozwój umysłowy, hipotonia, hipogonadyzm, otyłość Niedorozwój umysłowy, wady ośrodkowego układu nerwowego i narządu wzroku Objawy kliniczne podobne do trisomii chr. 21 Większość przypadków przewlekłej białaczki szpikowej (CML ang. chronic myeloid leukemia), występuje w ostrych białaczkach limfoblastycznych Niedorozwój umysłowy, nieprawidłowości budowy twarzy utraty części chromosomu pozwalają na prognozę przebiegu choroby oraz wybór terapii. przeciwnowotworowej. W diagnozie anemii Fanconiego wykorzystywana jest niestabilność genetyczna pochodzących od pacjenta komórek i ich nadwrażliwość na związki uszkadzające materiał genetyczny. Skutkuje to powstawaniem skomplikowanych aberracji w chromosomach metafazowych (ryc. 2c). Z kolei zespół Blooma cechuje zwiększona wymiana fragmentów DNA między siostrzanymi chromatydami. Badanie powstających aberracji chromosomalnych jest przydatne w określaniu mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych. Wiele takich leków powoduje zatrzymanie progresji cyklu komórkowego w późnych fazach, głównie między końcem fazy S i wejściem do mitozy, ze względu na uszkodzenia DNA. Za pomocą inhibitorów kinaz białkowych (staurosporyna, kofeina) lub inhibitor fosfataz (kwas okadaikowy) komórki zablokowane w np. fazie G 2 można zmusić do wejścia w fazę podziału przez wywołanie tzw. przedwczesnej kondensacji chromatyny. Badania efektu przedwczesnej kondensacji chromatyny służą celom poznawczym (poznanie regulacji przejścia między fazami G 2 i M). 3

4 Rycina 2. Po lewej: chromosom wyizolowany w stadium metafazy, zdjęcie wykonane przy pomocy skaningowej mikroskopii elektronowej. W środku: chromosomy metafazowe pochodzące z komórek ostrej białaczki szpikowej HL-60, wybarwionych Giemsą i sfotografowanych w świetle widzialnym (góra), wybarwionych fluorescencyjnie DAPI i sfotografowanych przy wzbudzeniu UV (dół). Zarówno liczba, jak i morfologia chromosomów w ludzkich komórkach nowotworowych często znacznie odbiega od prawidłowej. Preparaty zostały wykonane przez studentów. Po prawej: Aberracje chromosomalne obserwowane w komórkach pochodzących od pacjentów z anemią Fanconiego, które były traktowane związkiem sieciującym DNA (np. mitomycyną C). (A) przerwy; (B) pęknięcia; (C) utrata fragmentu chromosomu; (D i E) chromosomy radialne; (F) złożone figury; (G) chromosom dicentryczny. Źródła: Alberts B. Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 2014; Wreszcie, porównanie wzorów prążków między różnymi gatunkami jest użyteczne w wykrywaniu pokrewieństwa ewolucyjnego, oraz zmian które spowodowały rozdzielenie się gatunków. Przykładowo, wzór ten u człowieka i szympansa jest niemal identyczny, za wyjątkiem chromosomu 2 u człowieka, który powstał w wyniku fuzji dwóch chromosomów małpich (tab. 2). W celu przeprowadzenia badań cytogenetycznych niezbędne jest wyizolowanie komórek w trakcie mitozy, kiedy chromosomy są możliwe do wyodrębnienia. Ze względów praktycznych zazwyczaj wykorzystywane są limfocyty wyizolowane z krwi obwodowej, a następnie stymulowane do proliferacji. Częstość występowania mitoz w populacji komórek rosnących niesynchronicznie jest stosunkowo niewielka, ze względu na krótki czas trwania mitozy w porównaniu do pozostałych faz cyklu komórkowego. Liczba mitoz zależy od rodzaju komórek oraz warunków eksperymentalnych, jednak nawet dla szybko dzielących się nowotworów w hodowli komórkowej rzadko wykracza ponad 3%. Z tego względu przy wykonywaniu preparatów chromosomowych stosuje się wzbogacenie populacji w komórki mitotyczne jedną z dwóch metod: 1. Synchronizacja komórek w fazie G 1 cyklu komórkowego, a następnie stymulacja do wejścia w fazę S i G 2 cyklu. Preparaty są wykonywane po kilku godzinach od rozpoczęcia cyklu, kiedy większość komórek znajdzie się w profazie / prometafazie. 2. Zatrzymanie komórek w metafazie za pomocą związków chemicznych hamujących polimeryzację tubuliny (tzw. antymitotyków) i poprzez to blokujących tworzenie wrzeciona mitotycznego. Najczęściej stosowane są: nokodazol, kolcemid lub alkaloidy Vinca (w tym stosowany klinicznie lek przeciwnowotworowy - winkrystyna). 4

5 Tabela 2. Liczba chromosomów u wybranych gatunków organizmów. Gatunek Liczba chromosomów (2N) Mundżak indyjski (Muntiacus muntjak) 6 (samica), 7 (samiec) Muszka owocówka (Drosophila melanogaster) 8 Rzodkiewnik pospolity (Arabidopsis thaliana) 10 Nicień (Caenorhabditis elegans) 11 (samiec), 12 (hermafrodyta) Ogórek (Cucumis sativus) 14 Drożdże piekarnicze (Saccharomyces cerevisiae) 16 Chomik chiński (Cricetulus griseus) 22 Kot domowy (Felis catus) 38 Mysz (Mus musculus) 40 Szczur (Rattus norvegicus) 42 Mundżak chiński (Muntiacus reevesi) 46 Tytoń (Nicotiana tabacum) 48 Koń (Equus ferus caballus) 64 Pies domowy (Canis familiaris) 78 Rak szlachetny (Astacus astacus) 176; różne doniesienia Rezus (Macacca mulatta) 42 Człowiek (Homo sapiens) 46 Szympans (Pan troglodytes) 48 Orangutan (Pongo pygmaeus) 48 Metoda oparta o zatrzymanie cyklu komórkowego w metafazie jest, ze względu na prostotę wykonania, powszechnie stosowana w określaniu liczby i typu chromosomów oraz aberracji powstających pod wpływem związków uszkadzających DNA. Szybko postępująca kondensacja chromosomów w trakcie mitozy (patrz ryc. 3) sprawia, że metoda ta daje jednak mniejszą rozdzielczość. Zbyt długa ekspozycja na czynnik antymitotyczny prowadzi do nadmiernego skrócania chromosomów i łączenia się sąsiadujących prążków; w przypadku niektórych typów komórek może też doprowadzić do ukończenia mitozy. Wysokorozdzielcze metody cytogenetyczne oparte na analizie chromosomów wyizolowanych w trakcie profazy pozwalają na rozróżnienie 850 (i więcej) prążków G w haploidalnym kariotypie i tym samym na wykrycie mikrodelecji, pęknięć i niewielkich przearanżowań w strukturze chromosomu. W praktyce technika ta umożliwia wykrycie delecji rzędu 5-10 Mpz (milionów par zasad). Diagnostyka mniejszych zmian wymaga zastosowania innych technik, np. fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (ang. FISH, fluorescence in situ hybridization). 5

6 Rycina 3. Stopniowe skracanie i kondensacja chromosomów w kolejnych etapach mitozy na przykładzie chromosomu 7. Prążki zostały uwidocznione przy zastosowaniu barwnika Giemsy.Źródło: Bangs C.D., Donlon Timothy A. Metaphase Chromosome Preparation from Cultured Peripheral Blood Cells. Current Protocols in Human Genetics (2005), Na typową procedurę przygotowania tzw. wymazów chromosomalnych (ang. chromosome spreads) składają się: 1. Spęcznienie komórek w roztworze hipotonicznym (zwykle 75 mm KCl). 2. Utrwalenie i dehydratacja chromatyny oraz rozerwanie błon lipidowych przy pomocy np. roztworu Carnoy'a. 3. Przygotowanie rozmazu na szkiełku mikroskopowym. 4. Wizualizacja chromosomów po ich wybarwieniu barwnikami fluorescencyjnymi (chinakryna, DAPI, 7-AAD) lub za pomocą barwnika Giemsa LITERATURA Bangs, C.D., i wsp. Metaphase Chromosome Preparation from Cultured Peripheral Blood Cells. Current Protocols in Human Genetics (2005), Bickmore, W.A. Karyotype Analysis and Chromosome Banding. Encyclopedia of Life Sciences (2001). Melters, D.P. i wsp. Holocentric chromosomes: convergent evolution, meiotic adaptations, and genomic analysis. Chromosome Research (2012), 20(5):

7 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Roztwory: 75 mm KCl w wodzie destylowanej Utrwalacz Carnoy'a: świeżo sporządzona mieszanina 1:3 obj. (v/v) lodowatego kwasu octowego i metanolu Barwnik Giemsa, rozcieńczony 1:20 w wodzie destylowanej Roztwór soli fizjologicznej PBS (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 8 mm Na 2 HPO 4,1.5 mm KH 2 PO 4, ph 7.4) Sprzęt: Wykonanie: Probówki wirówkowe Pipety automatyczne 200 l, 1000 l i 5 ml Szkiełka mikroskopowe Mikroskop świetlny 1. Przygotować zawiesinę komórek (ok. 1 mln. komórek na próbkę). 2. Do osadu komórek dodać 5 ml PBS 3. Delikatnie rozpipetować do uzyskania jednolitej zawiesiny 4. Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.) 5. Delikatnie wylać nadsącz znad komórek 6. Rozpipetować osad komórek w pozostałości nadsączu 7. Dodać 4 ml 75 mmkcl i pozostawić na 10 min. w temperaturze pokojowej 8. Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.) 9. Zawiesić komórki w pozostałości nadsączu 10. Dodawać po kropli 4 ml utrwalacza Carnoy'a powoli mieszając zawiesinę na wytrząsarce, odstawić na 15 min. w temperaturze pokojowej. 11. Odwirować przez 5 min (1000 obr./min.) 12. Powtórzyć kroki 8-10 dwukrotnie 13. Po ostatnim wirowaniu zawiesić komórki w pozostałości utrwalacza (ok l). 14. Nakropić zawiesinę komórek (1-2 krople na szkiełko) na szkiełko mikroskopowe z wysokości ok cm za pomocą pipety automatycznej. 15. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu (~10 minut) 16. Zalać preparat roztworem barwnika Giemsa (1:20) na 5-7 min. 17. Przepłukać wodą destylowaną, na kilka sekund w 90% etanolu. 18. Wysuszyć na powietrzu i obserwować pod powiększeniem x. Przygotować dodatkowo jeden preparat chromosomalny na każdą grupę i nie barwić. Opisać preparat (z numerem grupy i datą ćwiczenia) i oddać prowadzącemu ćwiczenie. Określić liczbę chromosomów w badanych komórkach. Zaobserwować różnicę w kształcie i wielkości chromosomów. 7

8 SPRAWOZDANIE Podać wyznaczoną średnią ilość chromosomów w otrzymanych do badania komórkach (zliczonych z minimum trzech różnych metafaz). Na podstawie załączonych zdjęć preparatów wykonanych przy pomocy prowadzącego, opisać wygląd wyizolowanych chromosomów. Określić, na podstawie liczby chromosomów oraz ich morfologii, z jakich komórek (mysich czy ludzkich) pochodzą te chromosomy. Odnaleźć w literaturze komórki, z których został wykonany preparat, posługując się odpowiednimi wyszukiwarkami (ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, google.scholar.com), lub katalogiem linii komórkowych (atcc.org). Porównać otrzymane wyniki z literaturowymi i omówić ewentualne rozbieżności. 8