tęczowych, obrazy chromosomów osobników obu płci porównywano w poszukiwaniu charakterystycznych cech kariotypów samic i samców.

Transkrypt

1 Wprowadzenie Produkcja pstrągów oparta jest na technologiach intensywnego chowu. Jednym z krytycznych elementów jest uzyskanie narybku charakteryzującego się szybkim tempem wzrostu. Z wielu obserwacji wynika, że osobniki należące do jednopłciowych stad rosną w podobnym tempie, a liczba zachowań agresywnych w takich warunkach maleje. Nic więc dziwnego, że od kilku lat obserwujemy rosnące zainteresowanie metodami uzyskiwania jednopłciowych stad wśród hodowców ryb. Wybór płci ryb przeznaczonych do hodowli zależy od wielu czynników. Opiera się zwykle na obserwacjach tempa wzrostu, czasu dojrzewania płciowego oraz jakości mięsa samic i samców. W przypadku pstrągów najkorzystniejszy dla hodowcy wydaje się być chów narybku samiczego, ponieważ samice później niż samce dojrzewają i w związku z tym ich okres wzrostu jest dłuższy. Komponenty pasz są wykorzystywane przez organizmy ryb głównie do przyrostu masy mięśniowej, nie zaś do wzrostu i rozwoju układu rozrodczego ponadto mięso samic charakteryzuje się lepszymi parametrami konsumpcyjnymi. Użycie jednopłciowego, samiczego narybku do hodowli pstrąga tęczowego jest już szeroko stosowane w krajach zachodnich. Fenotypowa zmiana płci samiczej w samczą przy pomocy środków farmakologicznych stosowana jest w celu uzyskania tzw. neosamców czyli osobników o genotypie płci XX posiadających funkcjonalne gonady zdolne do produkcji męskich komórek płciowych. Zapłodnienie komórek jajowych plemnikami wyprodukowanymi przez neosamce pozwala uzyskać tylko samicze zarodki. Innym sposobem uzyskania tylko samic tego gatunku jest zastosowanie tzw. gynogenezy czyli sztucznie indukowanej partenogenezy, podczas której potomstwo dziedziczy tylko matczyny materiał genetyczny. Obie metody należą do biotechnologicznych metod rozrodu ryb. Skuteczność zabiegów biotechnologicznych mających na celu wytworzenie jednopłciowych stad ryb musi podlegać weryfikacji. Dlatego potrzebne są metody pozwalające szybko i bezbłędnie określić płeć ryb. W trakcie badań dotyczących genetycznych podstaw determinacji płci ryb łososiowatych wykazano, ze u pstrąga tęczowego, podobnie jak u ssaków, płeć samicza jest homogametyczna, czyli samice rozwijają się z zarodków posiadających dwa chromosomy X, zaś samce z zarodków heterogametycznych, posiadających chromosomy X i Y. Niestety u tego gatunku identyfikacja genetycznej płci na podstawie obrazu chromosomów jest utrudnione z powodu występowania dużej zmienności jeżeli chodzi o morfologiczne zróżnicowanie chromosomów

2 X i Y. Jedynie ryby z nielicznych populacji posiadają wyróżnialne chromosomy płci. W takim przypadku, samice mają dwa identyczne chromosomy płci (XX), natomiast w komórkach samców jeden z chromosomów płci jest krótszy (XY). Materiał Badania przeprowadzono na dwóch populacjach pstrągów tęczowych o znanym pochodzeniu: linia Maliszewski (ryby o żółto-pomarańczowym ubarwieniu, osobniki albinotyczne), linia Rutki (ryby o dzikim ubarwieniu). Barwny marker ryb albinotycznych może zostać wykorzystane podczas gynogenezy jako pierwszy test skuteczności zabiegu. Analiza koloru skóry ryb gynogenetycznych powstałych w wyniku zapłodnienia oocytów pochodzących od dziko ubarwionych samic inaktywowanym promieniowaniem UV nasieniem od kolorowych samców pozwoli stwierdzić skuteczność tych zabiegów. Metody Zbadano 27 ryb z linii Maliszewski (11 samic, 15 samców, 1 osobnik o niezidentyfikowanej płci fenotypowej) oraz 51 ryb z linii Rutki (26 samic i 25 samców). Wszystkie badane ryby były w wieku 0+. Ryby były iniekowane roztworem kolchicyny (0,1%, 1ml/100 g masy ryby). Po dwóch godzinach ryby były uśmiercane przy pomocy roztworu anestetyku propiscin. Od ryb pobierano gonady w celu identyfikacji fenotypowej płci badanych ryb oraz fragmenty nerki głowowej w celu uzyskania komórek do badań cytogenetycznych. Gonady ryb były umieszczane w płynie fizjologicznym, następnie fragment tkanki wycinano i przygotowywano z niego preparat mikroskopowy. Preparaty te były analizowane pod mikroskopom i objektywem 10X. Fragmenty nerki głowowej zostały poddane homogenizacji a następnie hypotonizacji w 0, 075M roztworze KCl (40 minut). Do zawiesiny komórek w roztworze hypotonicznym dodano utrwalacz (metanol kwas octowy w stosunku 3-1). Zawiesiny w probówkach poddano wirowaniu (1000 obr/min przez 10 minut), płyn znad osadu został usunięty, probówki uzupełniono świeżym utrwalaczem. Probówki z zawieszonymi w utrwalaczu komórki nerki głowowej inkubowano przez 30 minut w temperatuzre 20 o C. Czynność tę

3 powtarzano czterokrotnie. Po ostatnim wirowaniu i usunięciu płynu znad osadu, zawiesinę przeniesiono do probówek Eppendorf i dodano 200 μl utrwalacza. 20 μl zawiesiny komórek umieszczano na szkiełku mikroskopowym. Preparat był oglądany pod mikroskopem, a pozycje chromosomów w stadium metafazy zapisywane. Chromosomowy DNA świeżo przygotowanych preparatów metafazowych denaturowano stosując inkubację preparatów na płycie grzejnej w temperaturze 97 o C przez 4 minuty. Po upływie pierwszej minuty na preparat nakładano mieszaninę hybrydyzacyjną, składającą się z: 16 μl jałowej wody, 3 μl buforu reakcyjnego PRINS, 3 μl mieszaniny nukleotydów (500 μm d ATP, 500 μm d GTP, 500 μm d CTP, 50 μm d TTP, 10 μm rhodamin-d UTP), 0,5 μl polimerazy DNA Taq (5U/μl). Stosowano pary starterów 5S rdna 5S rdna A (5 -TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 ) 1,5 μl (100 pmol/μl), 5S r DNA B (5 -CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3 ) 1,5 μl (100 pmol/μl), Całość przykrywano szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 24 x 32 mm. Po upływie trzech kolejnych minut preparaty przenoszono do wilgotnej komory i inkubowano przez 35 minut w temperaturze 64 o C w celu amplifikowania fragmentu DNA ograniczonego starterami. Po inkubacji usuwano szkiełka nakrywkowe, a preparaty płukano w buforze zatrzymującym reakcję elongacji w temperaturze 60 o C przez 5 minut. Bufor składał się z 50 mm NaCl i 50 mm EDTA o ph = 8 w proporcji 1:1. Następnie preparaty płukano trzykrotnie w temperaturze pokojowej w roztworze Tween 20 (ICN) w 4 X SSC po 5 minut. Roztwór 4 X SSC składał się z 34,8 g chlorku sodowego i 16,48 g cytrynianu sodowego w 1000 ml roztworu. Z kolei preparaty umieszczano na 1 minutę w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej nie zawierającym jonów wapnia i magnezu, po czym pozostawiano je do wyschnięcia w zaciemnionym miejscu. W celu wybarwienia chromosomów na preparaty nakładano roztwór fluorochromu DAPI o stężeniu 15 μg na 1 ml Vectashield substancji zwiększającej trwałość sygnału fluorescencyjnego po czym całość przykrywano szkiełkiem nakrywkowym. Tak przygotowane preparaty były analizowane przy pomocy mikroskopu świetlnego w świetle UV z zastosowaniem filtrów UV-2A i potrójnego filtru FITC/DAPI/rhodamina. Obraz chromosomów barwionych fluorochromem DAPI oraz poddanych procesowi wizualizacji miejsca występowania genów 5S rdna (metoda PRINS) pobierano przy pomocy aparatu cyfrowego i analizowano w programie Photoshop. W przypadku obu linii pstrągów

4 tęczowych, obrazy chromosomów osobników obu płci porównywano w poszukiwaniu charakterystycznych cech kariotypów samic i samców. Wyniki Różnice pomiędzy kariotypami samic i samców badanych pstrągów tęczowych były widoczne w przypadku wszystkich analizowanych ryb o żółto-pomarańczowym fenotypie. Chromosomy X miały morfologię chromosomów subtelocentrycznych (zredukowane acz widoczne ramię krótkie p) podczas gdy chromosom Y miał budowę chromosomu jednoramiennego (akrocentrycznego). Ponadto, stwierdzono występowanie genów 5S rrna na krótkim ramieniu chromosomu X i parze chromosomów metacentrycznych. Sekwencje 5S rdna nie występowały na chromosomie Y. Jeden osobnik posiadający gonady męskie okazał się być osobnikiem triploidalnym o genotypie płci XXY. W przypadku jednego osobnika, nie rozpoznano płci fenotypowej jednak analiza cytogenetyczna wykazała, że ryba ta była samicą (Tabela 1). Podobne różnice pomiędzy kariotypami samic i samców zostały zidentyfikowane u pstrągów tęczowych z linii Rutki. U wszystkich fenotypowych samic, stwierdzono występowanie chromosomów płci typu XX. Wśród 25 fenotypowych samców, 23 osobniki posiadały kombinację chromosomów płci X i Y. U trzech pozostałych samców, chromosomy płci były podobne do tych obserwowanych u samic (Tabela 2).

5 Table 1. Podsumowanie wyników histologicznej i cytogenetycznej analizy pstrągów tęczowych z linii Maliszewski. Numer osobnika Płeć fenotypowa Chromosomowy genotyp płci M17 samiec XY M18 samica XX M19 samiec XY M20 samica XX M22 samica XX M23 samica XX M24 samiec XY M26 samiec XY M27 samiec XY M28 samica XX M29 samica XX M30 samiec XY M31 samiec XXY M32 samica XX M33 samiec XY M34 samica XX M36 samiec XY M37 samiec XY M38 samiec XY M39 samiec XY M40 samiec XY M42 samica XX M43 samica XX M45? XY M46 samiec XY M47 samica XX M48 samiec XY

6 Tabela 2. Podsumowanie wyników histologicznej i cytogenetycznej analizy pstrągów tęczowych z linii Rutki. Płeć fenotypowa Chromosomowy genotyp płci Płeć fenotypowa Chromosomowy genotyp płci Samica 1 XX Samiec 1 XY Samica 2 XX Samiec 2 XY Samica 3 XX Samiec 3 XY Samica 4 XX Samiec 4 XY Samica 5 XX Samiec 5 XY Samica 6 XX Samiec 6 XY Samica 7 XX Samiec 7 XY Samica 8 XX Samiec 8 XY Samica 9 XX Samiec 9 XY Samica 10 XX Samiec 10 XX Samica 11 XX Samiec 11 XY Samica 12 XX Samiec 12 XY Samica 13 XX Samiec 13 XY Samica 14 XX Samiec 14 XY Samica 15 XX Samiec 15 XY Samica 16 XX Samiec 16 XY Samica 17 XX Samiec 17 XX Samica 18 XX Samiec 18 XX Samica 19 XX Samiec 19 XY Samica 20 XX Samiec 20 XY Samica 21 XX Samiec 21 XY Samica 22 XX Samiec 22 XY Samica 23 XX Samiec 23 XY Samica 24 XX Samiec 24 XY Samica 25 XX Samiec 25 XY Samica 26 XY

7 Konkluzje: Fenotypowe odwracanie płci pstrągów tęczowych przy pomocy środków farmakologicznych jest stosowane w celu uzyskania tak zwanych neosamców czyli ryb o genotypie XX ale samczym fenotypie. Potomstwo powstałe po zapłodnieniu oocytów nasieniem neosamców powinno być potomstwem w 100% samiczym. Diagnozowanie płci genetycznej neosamców pozwoli uniknąć niemiłych niespodzianek, np. pojawienia się w potomstwie ryb o genotypie płci XY. Identyfikacja genetycznej płci potomstwa gynogenetycznego i potomstwa powstałego w wyniku zapłodnienia oocytów plemnikami od neosamców pozwoli sprawdzić skuteczność procesów uzyskiwania materiału zarybieniowego o pożądanym genotypie i fenotypie płci. Żółty kolor skóry pstrągów tęczowych może być doskonałym markerem podczas szacowania skuteczności zabiegów gynogenezy. Inaktywowane plemniki dziko ubarwionych samców służą do zapłodnienia oocytów pochodzących od kolorowych samic. Jeżeli zarodek rozwija się tylko z genomu matki (co oznacza, że genom ojca został efektywnie inaktywowany) nie powinien wykazywać cech genomu ojca na przykład dzikiego ubarwienia. Całe potomstwo gynogenetyczne powinno mieć chromosomy płci typu XX. Cytogenetyczna identyfikacja markerów płci u osobników z badanych linii pstrągów tęczowych pozwala zaprojektować badania nad tworzeniem łatwiejszych testów diagnozujących genetyczną płeć ryb tego gatunku. Wiedza na temat zróżnicowania chromosomów płci u ryb z badanych linii pozwala sprawdzać skuteczność programów hodowlanych mających na celu produkcję materiału zarybieniowego tylko jednej płci. Badane linie wydają się być pożyteczne pod kątem takich programów.