Diagnostyka molekularna i terapia genowa

Transkrypt

1 Diagnostyka molekularna i terapia genowa Dr hab. Józef Dulak Zakład Biochemii Komórki Wydział Biotechnologii UJ Ul. Gronostajowa Kraków jdulak@mol.uj.edu.pl

2 Odkrywanie przeznaczenia

3

4 Kariotyp Kariotyp ludzki zestaw wszystkich chromosomów składa się z z 22 par chromosomów autosomalnych i chromosomów płci (XX u kobiety, XY u mężczyzny). Ryc. 1. Barwienie barwnikami specyficznymi dla poszczególnych par chromosomów. Aberracje chromosomowe Utrata, powielenie lub pęknięcie chromosomów powoduje określone objawy kliniczne. Ryc.2. Kariotyp komórek nowotworowych płuc. (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

5 Choroby genetyczne Stanowią różnorodną grupę zaburzeń spowodowanych przez mutacje punktowe, duże mutacje i nieprawidłowości chromosomowe 1. Defekty pojedynczych genów (zaburzenia mendlowskie) wywołane przez mutacje, których rezultatem jest synteza uszkodzonych białek lub zaprzestanie syntezy. Mutacje mogą być dziedziczone lub powstawać de novo w rodzicielskich komórkach rozrodczych. 2. Zaburzenia chromosomowe polegają na utracie lub zyskaniu chromosomów, albo na zmianach w ich strukturze. Większość zaburzeń chromosomowych powstaje de novo w rodzicielskich komórkach rozrodczych. Nieprawidłowości związane z liczbą chromosomów dotyczą obecności wielokrotności kopii całego aparatu chromosomów (poliploidy) albo polegają na utracie lub powieleniu pojedynczego chromosomu (aneuploidy) Nieprawidłowości strukturalne chromosomów wynikają z pęknięcia chromosomu i obejmują delecje, duplikacje czy rearanżacje chromosomu 3. Zaburzenia wieloczynnikowe spowodowane są przez zespół genów i czynników środowiskowych. Obejmują wiele powszechnych chorób (osteoporoza, choroba wieńcowa) (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

6 Tempo identyfikacji genów sprzężonych z chorobami genetycznymi (1981 do 2000). Do roku 2000 zidentyfikowano 1112 genów, warunkujących choroby. Te dane nie obejmują 94 chorób warunkowanych fuzją genów, będąca wynikiem translokacji. Liczby w nawiasach wskazują gen-kandydat podejrzany o sprzężenie z chorobą.

7 Mutacje DNA Zmiany sekwencji DNA organizmu spowodowane działaniem czynników chemicznych, fizycznych lub błędami w replikacji DNA. Mutacje punktowe zmiana pojedynczej zasady: Zmiany sensu Nonsensowne Fazy odczytu Miejsc składania Duże mutacje zmiana więcej niż jednej zasady: Delecje Insercje Inwersje (rearanżacje) Mutacje dynamiczne Zaburzenia struktury i liczby chromosomów Delecje Insercje Rearanżacje Translokacje Aneuploidy i poliploidy

8 Origin of chronic myelogenous leukemia

9 Origin of chronic myelogenous leukemia

10 Origin of chronic myelogenous leukemia

11

12

13 CCT GAG GAG CCT GTG GAG From Anthony Cerami and Charles M. Peterson, "Cyanate and Sickle-Cell Disease." Copyright 1975 by Scientific American, Inc. All rights reserved.)

14 Wykrywanie mutacji w genie β-globiny anemia sierpowata

15 Kopiarka inżyniera genetyka ILLUSTRATION: TERRY SMITH Molecular Biology of the Cell

16 Przyspieszony kurs wiedzy nt. replikacji DNA CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3 3 -GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5 Denaturacja 5 -CACGTGTGC TTCTGGATT CATT CAGGGACC TTGC ACA-3 GGAAGGTGT-5 replikacja DNA replikacja DNA 5 -CGTGT GC TT 3 -GTGCACACG AAGACCTAAGTAAGT CCCT GGAACGTGT-5

17 Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR

18 Reakcja łańcuchowa polimerazy - PCR

19 Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (1) 1. Izolacja kwasu nukleinowego (nawet z b. małej ilości materiału) 2. Umieszczenie w probówce DNA, nukleotydów, starterów, polimerazy DNA (wszystko w odpowiednim buforze K +, Mg 2+ ) 3. Umieszczenie probówek w termocyklerze

20 Etapy reakcji łańcuchowej polimerazy (2) 1. Wstępna denaturacja 94 o C 5 minut 2. Denaturacja 94 o C 40 sekund 3. Przyłączenie starterów 58 o C 40 sekund 4. Replikacja 72 o C 40 sekund Etapy 2-4 powtarzane są razy...

21 Tu mieszka Thermus thermophilus

22 Analysing of DNA- gel electrophoresis

23 Mutacje przyczyny chorób Człowiek zdrowy Człowiek chory na mukowiscydozę -zazwyczaj umiera do 20 roku życia

24 DIAGNOSTYKA PRENATALNA PCR 10 eksonu genu warunkującego mukowiscydozę (CF) w rodzinie, w której rodzice są nosicielami mutacji F508 Tor 1 marker wielkości; tor 2 kontr. neg; tor 3-homozygota F508; tor 4-prawidłowy DNA; tor ojciec nosiciel zmutowanego allelu; tor matka, nosicielka zmutowanego allelu, tor- płód -? (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

25 Diagnostyka molekularna Wykrywanie wirusa HIV-1 Wykrywanie wirusów jest jednym z najtrudniejszych zadań diagnostycznych (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

26 Diagnostyka molekularna Wykrywanie mutacji w genie BRCA1 Mutacje genu BRCA1 ATM p53 Częstość wyst. defektu u kobiet 1:500 do 1:2000 1:80 do 1:200 1: %nowotworów piersi w populacji 8%<40lat 1%>50lat do 8% 1%<35 lat 2430T>C 3232A>G 3667A>G 4427T>C HRAS1 1:10 do 1:20 do 8% Molecular Medicine Trent RJ (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

27 Sekwencja DNA W Projekcie Sekwencjonowania Genomu Człowieka zastosowano metodę opisaną w 1977 roku przez Freda Sangera. W styczniu 2001 roku przedstawiono par zasad genomu człowieka z czego około z dokładnością 99.99%. (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

28 Mutacje w genie DMD Substytucja C>T w eksonie Kontrola Biochimie 79, 1997; Zakład Genetyki Człowieka PAN, Poznań (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

29 Mikromacierze

30 Mikromacierze DNA/Czujniki DNA/Czipy DNA/Genetyczne mikroprocesory

31 Mikromacierze w badaniu ekspresji genów

32 Mikromacierze w badaniu ekspresji genów Fig. 3. Genes distinguishing acute lymphoid leukaemia (ALL) from acute myeloid leukaemia (AML). The figure shows the 50 genes with the greatest distinction between ALL and AML, the top panel showing genes more highly expressed in ALL and the bottom panel showing genes more highly expressed in AML. Each row corresponds to a gene, with the columns corresponding to expression levels of these genes in different patient samples. Expression levels greater than the mean are red, and those below the mean are blue. The scale indicates standard deviations above or below the mean. (Adapted with permission from Golub et al5)

33 DIAGNOSTYKA PRENATALNA AMNIOCENTEZA - aspiracja płynu owodniowego za pomocą specjalnej, cienkiej igły i założeniu hodowli komórek owodniowych (diagnostyka molekularna) oraz analizie w kierunku stężenia markerów płodowych, takich jak α-fetoproteina (AFP). (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę) Amniocentezę wykonuje się zwykle w tyg. ciąży (są próby w tyg.). Wyniki z hodowli uzyskuje się po 2-4 tyg., w zależności od techniki hodowli Powikłania: - niezaaspirowanie płynu pod wpływem skurczu macicy - powikłania matczyne polegające na plamieniu i przecieku płynu owodniowego - poronienia - ryzyko 0,5% - uraz płodu igłą aspiracyjną ultrasonograf minimalizuje ryzyko

34 Genetyczna diagnostyka pre-implantacyjna

35 Źródła materiału do badań Krew Nasienie Ślina Mocz Włos Ząb Kość Tkanka (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

36

37

38 DNA satelitarny DNA satelitarny sekwencje DNA składające się z krótkich powtarzających się motywów (zwykle od bp), charakterystyczne dla eukariontów. DNA minisatelitarny to powtórzenia krótszych, kilkunukleotydowych jednostek, a DNA mikrosatelitarny to powtórzenia sekwencji najwyżej cztero- a często dwu-nukleotydowych nukleotydowych: Np. -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA- -CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT- Wiele mikrosatelitów jest polimorficznych, różniąc się u poszczególnych osób liczbą powtórzeń, gdyż podczas replikacji DNA gubią się lub (rzadziej) dodają kolejne pary. Pozwala to ustalenie tzw. profilu genetycznego, ego, co wykorzystuje się między innymi w kryminalistyce.

39 Krótkie tandemowe powtórzenia (STR) AATG 7 powtórzeń 8 powtórzeń Region powtórzeń jest zmienny natomiast sekwencje DNA rozpoznawane przez startery są stałe Homozygota = obydwa allele tej samej długości Heterozygota = allele różnej długości (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

40 Analiza DNA mikrosatelitarnego pozwala na ustalanie ojcostwa?

41 OKREŚLANIE POKREWIEŃSTWA DNA fingerprinting DNA trawiono enzymem HinfI,, a następnie rozdzielono w żelu agarozowym i hybrydyzowano z sondą molekularną (CAC)5. Tor 1, matka; tor 2, dziecko I; tor 3, dziecko II; tor 4, domniemany ojciec, którego ojcostwo badanie wykluczyło. Dzieci są bliźniętami dizygotycznymi Laboratorium Genetyki Molekularnej, Poznań (udostępnione przez dr hab. Jolantę Jurę)

42 Frank Lee Smith F.L. Smith został skazany za gwałt i morderstwo ośmioletniej dziewczynki. Został skazany na dożywocie zmarł po 14 latach w więzieniu w Teksasie Analiza mikrosatelitarnego niewinny. DNA wykazała, że był 1. osoba 2. osoba Jedna z metod: Namnaża się fragmenty DNA mikro-satelitarnego. Analizuje długość otrzymanych fragmentów. Im więcej namnażanych fragmentów, tym większa czułość testu.

43 Do kogo jesteśmy podobni?...

44 Dziedziczenie cech psychicznych Minnesota Twin Studies Współczynniki korelacji występowania tych samych cech U bliźniąt jedno- i dwujajowych wychowywanych oddzielnie Cecha Bliźnięta Bliźnięta jednojajowe dwujajowe Cechy osobowości łącznie 0,45 0,26 Depresja 0,48 <0,05 Wrogość 0,4 0,05 Fobie 0,55 0,32 Religijność 0,61-0,12

45 Każda cecha ma podłoże genetyczne...

46 Zdumiewiająca hipoteza F. Crick Czyli nauka o pochodzeniu duszy

47 Zmienianie przeznaczenia

48 Terapia genowa wykorzystanie kwasów nukleinowych w charakterze leków Gen terapeutyczny Wektor Pacjent Ekspresja genu terapeutycznego Efekt leczniczy Białko lecznicze

49 Jakie choroby można leczyć za pomocą terapii genowej? Czy terapia genowa jest potrzebna?

50 Narodziny terapii genowej Komórki HPRT -/- pożywka HAT Prof.Wacław Szybalski Gen HPRT Pożywka HAT McArdle Laboratory for Cancer Research, Wisconsin, Madison, USA Komórki HPRT +/+

51 Konsekwencje braku funkcjonalnego genu HPRT HPRT Choroba Lescha-Nyhana

52 Genetyczne strzykawki Wektory retrowirusowe Wektory adenowirusowe Wektory AAV (wirusy towarzyszące adenowirusom) plazmidowy DNA

53 Wektory retrowirusowe ITR gag pol env ITR retrowirus Wbudowują transgen do genomu biorcy zapewniają długotrwałą ekspresję genu ITR transgen ITR Wektor retrowirusowy wbudowują się w przypadkowe miejsce chromosomu mogą powodować mutagenezę insercyjną