PEŁNOMOCNIK REKTORA ds. specjalizacji dla diagnostów laboratoryjnych Prof. dr hab.med. Andrzej Szutowicz

Transkrypt

1 PEŁNOMOCNIK REKTORA ds. specjalizacji dla diagnostów laboratoryjnych Adres do korespondencji: Katedra Biochemii Klinicznej Zakład Medycyny Laboratoryjnej Gdański Uniwersytet Medyczny ul. Dębinki 7, Gdańsk tel , strona Prof. dr hab.med. Andrzej Szutowicz Ocena pracy doktorskiej mgr Anny Jaworskiej pt. Investigation of cellular processes involved in Alzheimer s disease: gamma-secretase activity and calcium homeostasis maintenance Ocenę przeprowadzono na podstawie uchwały Rady Naukowej Instytutu Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk z dnia 7 grudnia 2016r., pismo RN / SPD /2016. Rozprawa doktorska mgr Anny Jaworskiej została wykonana w Laboratory of Neurodegeneration at International Institute of Molecular and Cell Biology w Warszawie pod kierunkiem profesora Jacka Kuźnickiego. Stanowi ona kolejny etap szeroko zakrojonych, wieloletnich badań nad mechanizmami homeostazy wapnia w warunkach fizjologicznych i patologicznych, prowadzonych pod kierunkiem jej Promotora. Sygnał wapniowy jest uznawany za najbardziej pierwotny/podstawowy element utrzymania homeostazy wewnątrzkomórkowej w warunkach fizjologicznych, a jednocześnie za wielokierunkowo działający sygnał patogenny. Na początku dysertacji brak jest informacji, że część danych została już opublikowana w dwóch pracach: Jaworska i wsp. BBA 2013 i Brendel, Jaworska i wsp Fakt ten zwiększa wartość rozprawy dowodząc, że część wyników została już poddana wcześniejszej weryfikacji. Przedstawiona praca stanowi próbę połączenia limfocytarnego modelu zaburzeń homeostazy wapnia u ludzi z chorobą Alzheimera (AD) z badaniami amyloidozy i struktury mózgu AD transgenicznych myszy traktowanych związkami hamującymi amyloidogenezę. W przedstawionym kształcie dysertacja stanowi raczej luźne połączenie dwóch odległych modeli doświadczalnych, w których badane były różne aspekty patomechanizmów tej choroby. Badania na jednolitych modelach doświadczalnych wykazują, że amyloid beta powoduje zarówno ostre jak i przewlekłe zaburzenia transportu i dystrybucji Ca. Wiadomo również, że pierwotna dysfunkcja homeostazy wapnia wywołuje zmiany w procesach amyloidogenezy. Dlatego próba połączenia wspólnym mechanizmem zmian w limfocytach w przebiegu, sporadycznej AD, gdzie patologia amyloidowa 1

2 nie jest obecna na obwodzie, ze zmianami w mózgach zwierząt z genetyczną uogólnioną postacią tej choroby trudno uznać za trafione. W konsekwencji oba podejścia doświadczalne należałoby traktować, jako dotyczące dwóch oddzielnych postaci tej choroby genetycznie uwarunkowanej i sporadycznej. Ta rozdzielność zawarta jest w tytule, jak również można ją zauważyć w różnych miejscach dysertacji. Jest to jednak sprzeczne z deklarowanymi dążeniami autorki do połączenia, za wszelka cenę, wspólnym patomechanizmem obu modeli doświadczalnych. We wstępie można wyraźnie wyodrębnić trzy części. Pierwsza z nich to jasno opisane, dobrze znane fakty dotyczące cech klinicznych, epidemiologicznych i diagnostyczno-biochemicznych AD. Druga prezentuje w sposób zwięzły dwie hipotezy AD: amyloidową i wapniową oraz zmiany strukturalne elementów neuronów mózgu wiązane przyczynowo z tymi sygnałami neurodegeneracyjnymi, które również są skorelowane z ubytkami funkcji poznawczych. Hipoteza wapniowa AD jest opisana dość ogólnie tak, że trudno jest na tej podstawie znaleźć racjonalne uzasadnienie samej chęci powtórzenia i weryfikacji istniejących wyników (In my work, I wanted to reproduce and verify.). Należałoby sprecyzować, jakie elementy poprzednich badań są niejasne/kontrowersyjne i wymagają ponownego przetestowania. A takich jest wiele. W podrozdziale 7 został opisany w sposób ogólny stan wiedzy dotyczący doświadczalnych terapii z zastosowaniem inhibitorów amyloidogenezy. Wyodrębnienie tego zagadnienia jest jak najbardziej uzasadnione w związku z tematem wiodącym dysertacji. Jednak tutaj zabrakło, do pełnego obrazu state of art, danych dotyczący licznych badań przedklinicznych różnych inhibitorów beta i gamma sekretaz. Stwarza to problem z wyartykułowaniem odpowiedniego jasnego celu pracy mającej wykazać, jak się wydaje, unikalne właściwości badanych inhibitorów. Podrozdział 8 w sposób zwięzły, lecz wyczerpujący przestawia problematykę kolców dendrytycznych w AD, i jednocześnie uzasadnia ich badanie, jako wskaźnika skuteczności antyamyloidowej RO i FRM Pewne zaskoczenie wzbudza trzecia część wstępu zawarta w podrozdziale 9. Dotyczy ona historycznych i technicznych aspektów oraz cech użytkowych mikroskopii fluorescencyjnej oraz dwufotonowej mikroskopii in vivo. Jest to opis narzędzi badawczych, a nie problemów naukowych związanych z zaburzeniami białkowo-wapniowymi w AD. W żadnym stopniu nie przybliża to czytelnika do racjonalnego wyjaśnienia celu pracy. Jest on więc niepotrzebny. Mógłby natomiast być umieszczony w materiałach lub metodach czy też w dyskusji przy interpretacji jakości i zawartości obrazów mikroskopowych. Taki układ wstępu powoduje, że autorka nie podaje w pełni racjonalnego zunifikowanego celu badań oraz podjętych w związku tym prac doświadczalnych. Materiały i metody. Część zawierająca opis doświadczeń na zwierzętach transgenicznych może być uznana za wzorcową ze względu na przejrzysty układ, zwięzłość oraz informatywność opisów 2

3 metod badawczych. W podrozdziałach 11.2, 11.3, 11.4 zwracają uwagę końcowe zdania: All experiments were done in Forum Pharmaceuticals. Czy oznacza to, że badania te wykonali pracownicy tej firmy czy, że zostały one wykonane przez doktorantkę na terenie w/w? Natomiast w części 21 opisującej doświadczenia na limfocytach ludzkich za niewystarczające należy uznać dane dotyczące probantów. W opisach poszczególnych pacjentów w Tabeli 1 brakuje informacji o lekach powszechnie stosowanych u ludzi w wieku bardzo dojrzałym takich jak: beta blokery, moczopędne, niesterydowe leki przeciwzapalne, przeciwzakrzepowe, a u chorych z AD dodatkowo inhibitory acetylocholinesterazy, antagoniści receptorów NMDA, które w różny sposób mogą modyfikować dystrybucję Ca w przedziałach komórkowych organizmu. I tak np. antagoniści receptorów NMDA hamują transport Ca 2+ w limfocytach B (Simma i wsp. 2014, Cell Commun Signal) itp. Oczywiście, 24 godz. hodowla w RPMI mogła spowodować usunięcie części leków, lecz niekoniecznie spowodowanych przez nie modyfikacji adaptacyjnych tych komórek. Należałoby przedyskutować ten problem przy interpretacji wyników, lub przynajmniej podać w Tabeli 1 jakie leki przyjmowali pacjenci. Opisy izolacji limfocytów B, ich hodowli oraz pomiarów parametrów wapniowych związanych z SOCE i receptorem IP 3, i ich opracowania, są w pełni zadowalające. Pojawiają się sporadycznie błędy literowe np. str. 54, l. 17 methylene zamiast ethylene itp. W rozdziale Aims of Work dwa cele badawcze pracy wydają się oczywiste. Jednakże uzasadnienie dla ich podjęcia w kontekście znanych bogatych danych literaturowych na te tematy, nie zostało we wstępie podane. Można się domyślać, że element nowości stanowią dwa nowo wynalezione związki przeciw-amyloidowe. Po raz pierwszy spotkałem się z celem pracy umieszczonym po Metodach. To tylko uwaga redakcyjna, nie mająca wpływu na treści merytoryczne dysertacji. W rozdziale Wyniki kandydatka w sposób przejrzysty zaprezentowała dwa oddzielne zestawy danych doświadczalnych. W podrozdziale 29 przedstawiła ona własne, już opublikowane, dane dotyczące biodostępności RO , u myszy Tg, zalecając zapoznanie się ze szczegółami w publikacji [72] (Brendel, Jaworska i wsp. 2013). Wykazano, że podawanie 30mg/kg RO przez 6 miesięcy wyraźnie obniża poziom amyloidu beta 1-42 w mózgach myszy Tg mierzonego % powierzchni i liczbą płytek amyloidowych. Związek zwiększał gęstość kolców postsynaptycznych (PSD-95), lecz nie presynaptycznych (synapsyna) w korze wzrokowej, ruchowej i hipokampie zarówno zwierząt Tg jak i WT. Dane te wskazują na potencjalną aktywność anty-amyloidogenną RO przy podawaniu droga doustną. Publikacja stanowiąca podstawę większości danych zamieszczonych w dysertacji ma 15 współautorów. Należałoby podać udział kandydatki, jako drugiego autora, w powstaniu tych danych. 3

4 Badania biodostępności FRM18588 zostały wykonane w ramach dysertacji. Przedstawiają one szybkość wchłaniania i eliminacji z mózgu jednej wybranej dawki związku. Jednakże brak jest badań zależności od dawki, która jest równie ważnym elementem w badaniu biodostępności i toksyczności nowych związków o potencjale terapeutycznym. Dlatego należałoby wyjaśnić, dlaczego wybrano dawkę 80 mg/kg? Brak jest również jakiejkolwiek wzmianki czy były to myszy Tg czy WT? Z ryc. 19B można wnioskować, że były to jednak myszy Tg. Czy informacja w legendzie tej ryciny: Data obtained by Forum Pharmaceuticals oznacza, że były one wykonane przez pracowników firmy i przekazane doktorantce? W tytule podrozdziału podano, że FRM18588 nie zmienia gęstości kolców dendrytycznych. W tekście (str 71/72), że badano to zarówno u zwierząt Tg jak i WT. Jednakże w dalszej części tekstu jak również na Ryc. 21, 23 występuje tylko jedna grupa zwierząt podzielona na podgrupy otrzymujące i nieutrzymujące FRM. Jakie to są zwierzęta Tg czy WT, a może połączone w jedną grupę? Należy zgodzić się z wnioskiem, że związek nie wywiera działania neurotoksycznego, przynajmniej w zakresie liczby i plastyczności kloców dendrytycznych w trzech regionach kory mózgowej. Ale nie wiadomo, czy dotyczy to zwierząt Tg. W związku tym wniosek końcowy na str. 72: This study show that GSM (chodzi chyba o FRM-18588) does not alter the spine density while reducing Aβ level significantly nie jest uprawniony. Autorka nie mierzyła poziomu amyloidu w tych doświadczeniach. Doświadczenie na ryc. 19 nie może być brane pod uwagę, bo dotyczy kilkugodzinnej obserwacji na myszach Tg podczas gdy eksperymenty na Ryc. 21, 23 prowadzono w wielotygodniowym przedziale czasowym prawdopodobnie na myszach WT. Taka rozbieżność powinna być ewentualnie przedyskutowana, czego nie uczyniono. Druga część wyników, już opublikowana (Biochim Biophys Acta, (2013) 1833, ), poza wymienionymi wyżej zastrzeżeniami dotyczącymi informacji o probantach (Materiały i Metody), jest zaprezentowana bardzo dobrze. Istnieje bardzo mało doniesień dotyczących zaburzeń transportu i kompartmentacji Ca w limfocytach w starzeniu, a jeszcze mniej (około 10) w chorobie Alzheimera. Stąd doświadczenia te dostarczają oryginalnych/nowatorskich danych na temat obwodowego elementu patomechanizmu tej choroby. Oprócz tego, wyjaśnia zarówno sposób pomiarów fukcjonalnych puli wewnątrz limfocytarnego Ca 2+ jak i ich matematycznej interpretacji. Przedstawienie wyników za pomocą scattergramów dla poszczególnych grup probantów NDS, MCI i SAD charakteryzuje je zarówno pod względem ilościowym jak i jakościowym, indywidualnie oraz jako grupę. Wykazują one, że limfocyty B osób bez upośledzenia funkcji poznawczych zawierały większą niż SAD frakcję komórek wykazujących oscylacje spontaniczne Ca 2+, lecz mniejszą frakcję komórek odpowiadających influksem Ca 2+ zewnątrzkomórkowego na stymulację IgM, w środowisku wysoko-wapniowym. Oryginalną obserwacją jest wykazanie jednakowej/prawidłowej sekwestracji Ca w reticulum endoplazmatycznym we wszystkich grupach, 4

5 demonstrowanej jego uwalnianiem przez tapsigarginę. Natomiast trudnym do wytłumaczenia, bez dodatkowych doświadczeń, jest izolowany wzrost bazowego poziomu Ca i SOCE w limfocytach B pacjentów z MCI. W Tabeli 2 wartość w rubryce Fold change w pierwszej linijce powinna wynosić 0.7, ponieważ wartość SAD jest mniejsza od NDS. Układ dyskusji wyraźnie odzwierciedla dwa dość odległe zagadnienia będące przedmiotem dysertacji. Dużym utrudnieniem jest brak odnośników do rycin i tabel będących przedmiotem interpretacji. Duża część tekstu dyskusji powinna znaleźć się we wstępie. I tak cała str. 85 bardzo dobrze uzasadnia cel pracy, lecz nie ma nic wspólnego z interpretacją uzyskanych wyników. Podobne fragmenty przynależne do wstępu można znaleźć w dalszych podrozdziałach dyskusji. Nie można również zgodzić się z tezą, że decyzja połączenia dwóch oddzielnych projektów wynika ze wspólnego punktu uchwytu, jakim jest amyloid-beta. Owszem pierwszy projekt nowatorski, dotyczy modyfikacji genetycznie uwarunkowanej amyloido-genezy przez 1 nowy inhibitor gammasekretazy - RO Przedstawia również wstępne dane dla drugiego wskazując na jego nietoksyczność u myszy WT przy długotrwałym stosowaniu, lecz bez udokumentowanej przewlekłej aktywności anty-amyloidowej. Ani w dyskusji ani we wstępie autorka nie ustosunkowała się do bardzo konkretnych danych dotyczących istniejących już i badanych przedklinicznie i klinicznie związków takich jak: inhibitory BACE 1 : LY , LY , MK-8931 lub inhibitory gamma-sekretazy: LY , BMS , czy też PT (IC 50 =1.2 nm) i szereg innych. Bez takiego porównania trudno zorientować się w zaletach czy też wadach nowych związków w stosunku do już zbadanych. Z kolei porównywanie siły działania dwóch własnych związków (str. 90) wydaje się mało uzasadnione w świetle przedstawianych wyników. Stosowano różne dawki związków (30 mg/kg dla RO i 80 mg/kg dla FRM), mierzono poziom amyloidu różnymi metodami dającymi słabo porównywalne wyniki (histochemia i ELISA), oraz model przewlekły z modelem ostrym. Druga część, chociaż bardziej oryginalna w ogóle tej kwestii nie porusza. Bada ona bowiem zaburzenia homeostazy Ca 2+ w limfocytach B u osób ze sporadyczną chorobą Alzheimera. Nie są one w tych przypadkach spowodowane przez amyloid-beta, którego poziom, w obwodowych przedziałach organizmu (w tym w osoczu i komórkach krwi) pacjentów SAD nie ulega zmianie. Zmiany amyloidowe są obecne jedynie w mózgach SAD. Obserwuje się tam akumulację amyloidubeta w przedziałach wewnątrzkomórkowych i jego obniżenie w przedziale zewnątrzkomórkowym (co jest laboratoryjnym markerem diagnostycznym). Tak więc zaburzenia metabolizmu Ca w leukocytach SAD mogą wynikać raczej z patologii zewnątrzmózgowych, które ją inicjują i utrzymują neurodegenerację (epizody niedotlenienia, stany zapalne, hipoglikemie, niedobory pirofosforanu tiaminy itp.). Co więcej, grupy kontrolnej nie stanowili healthy volunteers, o 5

6 których bardzo trudno w tej grupie wiekowej, lecz chorzy z chorobami układu sercowo- 6