Degradacja i kontrola jakości RNA w mitochondriach człowieka

Transkrypt

1 Załącznik nr 2 do wniosku o przeprowadzenie postępowania habilitacyjnego AUTOREFERAT Roman Józef Szczęsny Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Degradacja i kontrola jakości RNA w mitochondriach człowieka Warszawa, 2019 Strona 1 z 20

2 1. Imię i Nazwisko: Roman Szczęsny 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe Grudzień 2009 Wrzesień 2004 obrona rozprawy doktorskiej Badanie funkcji ludzkiej helikazy hsuv3p. Promotor prof. dr hab. Ewa Bartnik. Dyplom z wyróżnieniem. Instytut Biochemii i Biofizyki PAN. Rozprawa została wyróżniona przez Radę Naukową IBB PAN oraz uzyskała Nagrodę im. Witolda Drabikowskiego przyznaną przez Polskie Towarzystwo Biochemiczne i firmę Merck Sp. z o.o. za najlepszą pracę doktorską z biochemii obronioną w obrona pracy magisterskiej Metabolizm RNA w mitochondriach człowieka w warunkach zahamowanej translacji mitochondrialnej lub transkrypcji/replikacji DNA mitochondrialnego. Promotor prof. dr hab. Ewa Bartnik. Dyplom z wyróżnieniem. Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski. Wrzesień 2002 obrona pracy licencjackiej: Biogeneza mitochondriów i białek mitochondrialnych. Promotor prof. dr hab. Ewa Bartnik. Dyplom z wyróżnieniem. Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski. 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych Od 2012 adiunkt, Instytut Biochemii i Biofizyki PAN asystent naukowy, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski 4. Zainteresowania badawcze oraz przebieg kariery naukowej Przedmiotem moich zainteresowań naukowych są mechanizmy kontrolujące jakość, ilość oraz obróbkę RNA powstałego w wyniku transkrypcji genomów występujących w komórkach ludzkich mitochondrialnego i jądrowego. Prowadzone przeze mnie badania mają na celu funkcjonalną charakterystykę białek uczestniczących w metabolizmie RNA jak i identyfikację nowych, nieznanych dotychczas czynników zaangażowanych w ten metabolizm. Ponadto, jestem zainteresowany poznaniem kompleksów białkowych maszynerii degradującej RNA u kręgowców oraz znaczeniem metabolizmu RNA dla utrzymania homeostazy komórkowej. Swoje badania realizuję wykorzystując różnorodne metody biologii molekularnej i komórkowej, w tym posiadam doświadczenie w prowadzeniu badań z użyciem wysokoprzepustowych przeszukań funkcjonalnych (ang. sirna screening). Studia licencjackie, magisterskie oraz pracę doktorską wykonałem pod opieką prof. Ewy Bartnik, przy czym badania, które wykonałem w trakcie rozprawy doktorskiej zostały przeprowadzone pod jednoczesnym kierunkiem prof. Piotra P. Stępnia. Badania, które przeprowadziłem dotyczyły metabolizmu RNA w mitochondriach człowieka. Dzięki modelowi opieki nad młodymi badaczami, który przyjęli prof. Ewa Bartnik i prof. Piotr Stępień, miałem możliwość rozwijania umiejętności formułowania własnych hipotez badawczych oraz opracowywania schematu badań prowadzących do ich weryfikacji. W tym okresie 17 miesięcy spędziłem na trzech stażach naukowych w laboratoriach w Anglii, Francji i Finlandii. Staże te nie tylko pozwoliły mi zapoznać się z nową tematyką badań: śmierć komórkowa i różnicowanie (Francja), transkrypcyjna regulacja ekspresji genów (Anglia), replikacja ludzkiego genomu mitochondrialnego (Finlandia), ale także rozszerzyć mój warsztat badawczy oraz zapoznać się z organizacją pracy naukowej w różnych krajach. Po obronie doktoratu rozpocząłem kilkuletni staż podoktorski pod kierunkiem prof. Andrzeja Dziembowskiego. W trakcie tego stażu miałem możliwość kontynuowania badań nad metabolizmem mitochondrialnego RNA, ale także uczestniczyłem w kilku projektach badawczych dotyczących metabolizmu RNA na terenie jądra i cytoplazmy. Pod opieką prof. Dziembowskiego miałem możliwość dalszego kształtowania swoich umiejętności badawczych, wdrażania nowych metod badawczych do codziennej praktyki laboratoryjnej, rozwoju umiejętności opracowywania manuskryptów, przygotowywania wniosków grantowych, opieki nad członkami zespołu badawczego oraz rozszerzenia doświadczenia w organizacji projektów naukowych. Strona 2 z 20

3 5. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U r. poz. 882 ze zm. w Dz. U. z 2016 r. poz ). 5.1 Tytuł osiągnięcia naukowego Degradacja i kontrola jakości RNA w mitochondriach człowieka 5.2 Publikacje wchodzące w skład osiągnięcia naukowego Osiągnięcie naukowe stanowi zbiór 5 publikacji naukowych: 4 prac eksperymentalnych oraz 1 pracy przeglądowej. Zbiór prac rozpoczyna artykuł przeglądowy Szczesny i wsp. 2012, w którym został podsumowany stan wiedzy na temat degradacji RNA w mitochondriach sprzed ukazania się prac eksperymentalnych wchodzących w skład osiągnięcia naukowego, oraz omówiono nierozstrzygnięte problemy badawcze związane z tą tematyką. W pracy tej podsumowałem m.in. wyniki badań prowadzonych w ramach doktoratu oraz przedstawiłem problemy badawcze, które stanowią przedmiot moich badań, w tym pytania badawcze, na które odpowiedziałem (lub starałem się odpowiedzieć) prowadząc badania opisane w publikacjach eksperymentalnych wchodzących w skład niniejszego osiągnięcia naukowego. 1. Szczesny RJ*, Borowski LS, Malecki M, Wojcik MA, Stepien PP, Golik P. RNA degradation in yeast and human mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms, 2012, PubMed PMID: , (IF 5,456), * - autor korespondencyjny 2. Borowski LS, Dziembowski A, Hejnowicz MS, Stepien PP, Szczesny RJ*. Human mitochondrial RNA decay mediated by PNPase-hSuv3 complex takes place in distinct foci. Nucleic Acids Research, 2013, PubMed PMID: (IF 8,808), * - autor korespondencyjny 3. Szczesny RJ, Hejnowicz MS, Steczkiewicz K, Muszewska A, Borowski LS, Ginalski K, Dziembowski A. Identification of a novel human mitochondrial endo-/exonuclease Ddk1/c20orf72 necessary for maintenance of proper 7S DNA levels. Nucleic Acids Research, 2013a, PubMed PMID: (IF 8,808) 4. Pietras Z, Wojcik MA, Borowski LS, Szewczyk M, Kulinski TM, Cysewski D, Stepien PP, Dziembowski A*, Szczesny RJ*. Dedicated surveillance mechanism controls G-quadruplex forming non-coding RNAs in human mitochondria. Nature Communications, 2018a, PMID: (IF 12,353), * - autorzy korespondencyjni 5. Dhir A*, Dhir S#, Borowski LS#, Jimenez L, Teitell M, Rötig A, Crow YJ, Rice GI, Duffy D, Tamby C, Nojima T, Munnich A, Schiff M, de Almeida CR, Rehwinkel J, Dziembowski A, Szczesny RJ*, Proudfoot NJ*. Mitochondrial doublestranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature, 2018, PMID: (IF 41,577), * - autorzy korespondencyjni, # - autorzy równorzędni Powyższe prace powstały z moim istotnym udziałem, wyrażającym się między innymi 1 : 1) współudziałem w opracowaniu koncepcji badań i manuskryptów, 2) planowaniu eksperymentów, ich wykonaniu lub bezpośredniej opiece/nadzorze nad osobami przeprowadzającymi eksperymenty, 3) analizie, dyskusji wyników i formułowaniu wniosków, 4) koordynowaniu prac osób uczestniczących w badaniach, 5) przygotowaniu wstępnej i końcowej wersji manuskryptów, 5) wysłaniu manuskryptów do czasopism i przygotowaniu odpowiedzi na pytania/krytyczne uwagi ze strony recenzentów. Badania przedstawione w pracach eksperymentalnych były głównie (lub częściowo) finansowane z grantów badawczych, które uzyskałem. W 4 z 5 publikacji jestem autorem korespondencyjnym (w dwóch publikacjach jestem jedynym takim autorem). W pracy, w której nie jestem autorem korespondencyjnym jestem pierwszym autorem. Cztery z przedstawionych prac powstały z udziałem autorów pracujących wyłącznie w polskich placówkach naukowych. Jedna praca powstała we współpracy z kilkoma ośrodkami zagranicznymi (Dhir i wsp. 1 Mój szczegółowy udział w poszczególnych pracach został opisany z Załączniku nr 4 Wykaz opublikowanych prac naukowych.. Oświadczenia pozostałych autorów zamieszczono w Załączniku nr 6 Oświadczenia współautorów. Strona 3 z 20

4 2018). W przypadku tej pracy nawiązałem współpracę z głównym partnerem zagranicznym, a następnie ją koordynowałem. 5.3 Omówienie celu naukowego prac stanowiących osiągnięcie naukowe, uzyskanych wyników oraz ich znaczenia Wprowadzenie do tematyki prowadzonych badań Mitochondria są kluczowymi organellami komórki eukariotycznej. Ich przestrzeń ograniczona jest przez dwie błony białkowo-lipidowe: wewnętrzną i zewnętrzną błonę mitochondrialną. Pomiędzy błonami znajduje się tzw. mitochondrialna przestrzeń międzybłonowa, natomiast teren wyznaczony przez wewnętrzną błonę mitochondrialną to tzw. macierz mitochondrialna. Mitochondria są szczególnymi organellami ponieważ ich biogeneza i funkcjonowanie zależy od informacji genetycznej zawartej w dwóch genomach jądrowym i mitochondrialnym. Podstawową, powszechnie znaną rolą mitochondriów jest synteza nośnika energii użytecznej biologicznie (ATP). Proces ten odbywa się z udziałem łańcucha oddechowego, którego elementy zlokalizowane są w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. Jednakże, funkcja mitochondriów nie ogranicza się tylko i wyłącznie do pełnienia roli centrum energetycznego komórki. Na terenie mitochondriów zachodzą również inne ważne szlaki metaboliczne, takie jak cykl mocznikowy. Co więcej, mitochondria stanowią również istotny element regulujący ważne procesy komórkowe np. apoptozę. Badania ostatnich lat, w tym te przeprowadzone przeze mnie i współpracowników (Dhir i wsp. 2018), rozszerzają repertuar mechanizmów, przez które mitochondria wpływają na funkcjonowanie i losy komórki. Okazuje się bowiem, że mitochondria stanowią ważny czynnik biorący udział w regulacji nieswoistej odpowiedzi immunologicznej. Badania przeprowadzone w ramach omawianego osiągnięcia doprowadziły do stwierdzenia, że ekspresja genomu mitochondrialnego jest źródłem dwuniciowego RNA, który jeśli wydostanie się z mitochondriów do cytoplazmy może uruchomić mechanizmy nieswoistej odpowiedzi immunologicznej (antywirusowej), w warunkach gdy komórka nie została zainfekowana (Dhir i wsp. 2018). Poziom mitochondrialnego dwuniciowego RNA podlega kontroli przez degradosom mitochondrialny, którego skład oraz funkcja zostały w dużym stopniu poznane dzięki badaniom opisanym w publikacjach będących elementami przedstawianego osiągnięcia naukowego (Borowski i wsp. 2013, Pietras i wsp. 2018a) Organizacja ludzkiego genomu mitochondrialnego, jego transkrypcja i obróbka pierwotnych transkryptów Ludzki genom mitochondrialny to dwuniciowa kolista cząsteczka DNA o długości ~16,5 kpz, której poszczególne nici określane są jako nić ciężka (H) (ang. heavy) i lekka (L) (ang. light). Nazwy nici ludzkiego mitochondrialnego DNA (mtdna) odzwierciedlają fakt, że nić ciężka zawiera więcej nukleotydów guanylowych, co powoduje, że można ją oddzielić od nici lekkiej podczas wirowania w gradiencie chlorku cezu. Genom mitochondrialny człowieka koduje tylko 37 genów 2, niemniej każdy z nich jest niezbędny do życia człowieka. Ludzki mtdna koduje 13 białek wchodzących w skład kompleksów łańcucha oddechowego oraz 24 cząsteczki RNA (2 rrna i 22 trna) wchodzące w skład mitochondrialnego aparatu syntezy białek (Anderson i wsp. 1981). Genom mitochondrialny oraz procesy związane z jego utrzymaniem i ekspresją zlokalizowane są w macierzy mitochondrialnej. Większość spośród ~1500 białek zlokalizowanych w mitochondriach kodowana jest w genomie jądrowym, syntetyzowana w cytoplazmie, a następnie importowana do mitochondriów. Wszystkie białka uczestniczące w replikacji, segregacji i ekspresji genomu mitochondrialnego są kodowane w genomie jądrowym. Transkrypcja genomu mitochondrialnego odbywa się z udziałem tylko dwóch 3 promotorów, po jednym dla każdej 2 W omówieniu przyjęto powszechnie zaakceptowaną mapę ludzkiego genomu mitochondrialnego według, której mtdna koduje 37 genów. Istnieją doniesienia wskazujące, że ludzki mtdna koduje dodatkowo funkcjonalne krótkie peptydy humaninę i MOTS-c (Lee i wsp. 2015). 3 Przez wiele lat uważano, że ludzki mtdna transkrybowany jest z udziałem trzech promotorów. Jednakże w ostatnich latach rozpoczęto dyskusję kwestionującą istnienie jednego z trzech wyjściowo zaproponowanych promotorów (Litonin i wsp. 2010, Van Haute i wsp. 2015). Strona 4 z 20

5 z nici mtdna. Proces ten katalizowany jest przez mitochondrialną polimerazę RNA (POLRMT) i obejmuje obie nici mtdna niemal na całej ich długości, co prowadzi do powstania długich policistronowych prekursorowych RNA, które następnie podlegają endonukleolitycznej obróbce. W policistronowych transkryptach sekwencje obu rrna oraz większości mrna sąsiadują po stronie 5 i 3 z sekwencjami trna. Obróbka tych złożonych transkryptów polega na wycięciu z nich trna, co prowadzi do powstawania prekursorów mrna, rrna i trna oraz antysensownego, niekodującego RNA. Proces ten odbywa się z udziałem mitochondrialnej RNazy P oraz RNazy Z (kodowanej przez gen ELAC2), której rola w tym procesie w komórkach człowieka została po raz pierwszy opisana przez nas (Brzezniak i wsp. 2011) i wkrótce potwierdzona przez badania innej grupy badawczej (Sanchez i wsp. 2011). Powstające prekursowe mtrna podlegają posttranskrypcyjnym modyfikacjom (Van Haute i wsp. 2015). Jedną z nich jest poliadenylacja końca 3, która dotyczy głównie mrna, ale została również zaobserwowana w przypadku rrna, trna oraz niekodującego mtrna (Tomecki i wsp. 2004, Szczesny i wsp. 2010). W świetle prowadzonych przeze mnie badań istotną cechą ludzkiego genomu mitochondrialnego jest to, że rozmieszczenie sekwencji kodujących w mtdna oraz przebieg jego transkrypcji predysponuje mitochondrialny system genetyczny do generowania dużej ilości niekodującego mtrna, który jest komplementarny do funkcjonalnych mtrna. Dla większości genów mitochondrialnych nicią kodującą jest nić L, podczas gdy nić H stanowi dla nich nić matrycową. Oznacza to, że większość funkcjonalnych mtrna (rrna, mrna, trna) powstaje w wyniku transkrypcji nici H, podczas gdy transkrypcja nici L poza ekspresją ośmiu trna i jednego mrna (ND6) związana jest z powstawaniem dużej ilości niekodującego, antysensownego mtrna. W normalnych warunkach transkrypty niekodujące (antysensowne) utrzymywane są na bardzo niskim poziomie, co wskazywało, że są one bardzo szybko usuwane poprzez degradację. Badania, które przeprowadziłem wraz ze Współpracownikami pozwoliły opisać maszynerię białkową, która odpowiada za ten proces. Funkcję jednego z enzymów uczestniczących w tym procesie (RNA helikazy SUV3) wykazałem w trakcie badań w ramach rozprawy doktorskiej (Szczesny i wsp. 2010). Rola innych białek (PNPaza, GRSF1) w degradacji i kontroli jakości mtrna została opisana dzięki badaniom wchodzącym w skład osiągnięcia naukowego (Borowski i wsp. 2013, Pietras i wsp. 2018a). Część przedłożonego do oceny osiągnięcie naukowego stanowi również publikacja, w której wykazaliśmy znaczenie degradacji niekodującego mtrna dla utrzymania funkcjonowania komórki i zdrowia człowieka (Dhir i wsp. 2018). Jednocześnie prace mające na celu poznanie białek uczestniczących w degradacji mtrna zaowocowały odkryciem nukleazy DDK1 (MGME1) niezbędnej do prawidłowego utrzymania mitochondrialnego 7S DNA (Szczesny i wsp. 2013a) oraz genomu mitochondrialnego (Kornblum i wsp. 2013, Nicholls i wsp. 2014). Mutacje w genie kodującym nukleazę DDK1/MGME1, odkrytą przez nas (Szczesny i wsp. 2013a) oraz niezależnie przez inną grupę badawczą (Kornblum i wsp. 2013), prowadzą do rozwoju wieloukładowej choroby mitochondrialnej u człowieka (Kornblum i wsp. 2013) Degradacja RNA w mitochondriach Degradacja RNA w dużym stopniu kształtuje mitochondrialny transkryptom. Fakt, że wiele genów podlega transkrypcji z udziałem tego samego promotora, co prowadzi do syntezy policistronowego RNA, powoduje, że regulacja ekspresji genów mitochondrialnych jest znacząco ograniczona na poziomie inicjacji transkrypcji. Poziomy dojrzałych mrna mitochondrialnych są zróżnicowane, pomimo, że geny występujące na danej nici mtdna są transkrybowane z tą samą częstością 4. Wskazuje to, że etapy posttranskrypcyjne, a zwłaszcza degradacja RNA mają duże znaczenie dla regulacji ekspresji mitochondrialnej informacji genetycznej. Zgodnie z tym przypuszczeniem zaobserwowaliśmy zależność poziomu danego ludzkiego mt-mrna od jego czasu półtrwania (stabilności) (Piechota i wsp. 2006a). Nasze badania (Piechota i wsp. 2006b) oraz badania innych badaczy (Seidel-Rogol and Shadel, 2002) wskazują, że obniżenie poziomu mtdna, które może skutkować rozwojem choroby u człowieka (Rusecka i wsp. 2018), może być do pewnego stopnia kompensowane na etapie regulacji poziomu mtrna. Tym samym, poznanie mechanizmów regulujących poziom mtrna jest bardzo ważne. 4 Wyjątek stanowią geny kodujące rrna, których transkrypcja jest częstsza niż pozostałych genów. Jest to możliwe dzięki alternatywnej terminacji transkrypcji, która odbywa się na końcu 3 genów rrna przez co pozostałe sekwencje kodujące nie podlegają transkrypcji. Strona 5 z 20

6 Drugą istotną funkcją jaką odgrywa degradacja RNA w mitochondriach to kontrola jakości mtrna. W ramach tego procesu usuwane są nie tylko uboczne produkty obróbki pierwotnych transkryptów, ale także nieprawidłowo obrobione mtrna i antysensowny mtrna, co w ostateczności nadaje kształt mitochondrialnemu transkryptomowi (Pietras i wsp. 2018b). Degradacja RNA mitochondrialnego początkowo została opisana u drożdży Saccharomyces cerevisiae. Cykl badań genetycznych i biochemicznych, który doprowadził do zidentyfikowania i opisania funkcji kompleksu degradującego drożdżowy RNA mitochondrialny, został podsumowany w pracy Szczesny i wsp Kompleks ten nazywa się degradosomem mitochondrialnym. Składa się on z RNA helikazy Suv3 oraz rybonukleazy Dss1 (Stepien i wsp. 1992, Dmochowska i wsp. 1995, Dziembowski i wsp. 2003). Wykazano, że kompleks Suv3-Dss1 uczestniczy w obrocie (ang. turnover) mt-mrna, ale przede wszystkim jest odpowiedzialny za usuwanie produktów ubocznych składania mitochondrialnego pre-mrna (tj. wyciętych intronów) oraz nieprawidłowych transkryptów mitochondrialnych. Analiza porównawcza sekwencji drożdżowego Suv3 z białkami z innych organizmów wskazała, że homologi SUV3 występują we wszystkich zbadanych Eukaryota (Dmochowska i wsp. 1999). Co ważne, homolog SUV3 zidentyfikowano również u człowieka (Dmochowska i wsp. 1999). Wstępne badania nad ludzkim SUV3 potwierdziły, że białko to jest zlokalizowane w macierzy mitochondrialnej. Co więcej, stwierdzono, że ludzki SUV3 jest aktywną helikazą, przy czym przeprowadzone badania wykazały, że enzym ten w warunkach in vitro posiada dużo wyższą aktywność w stosunku do dupleksów DNA niż do dupleksów RNA (Minczuk i wsp. 2002). Sugerowało to, że funkcja ludzkiego SUV3 może być odmienna od funkcji jego drożdżowego homologa. Ponadto, w genomie człowieka nie zidentyfikowano genu, który byłby homologiem drożdżowego dss1. Obserwacje te wskazywały, że maszyneria degradująca RNA w mitochondriach człowieka może mieć inny skład niż maszyneria odpowiedzialna za ten proces w mitochondriach drożdży. Badania przeprowadzone przeze mnie w ramach rozprawy doktorskiej miały na celu identyfikację funkcji ludzkiego białka SUV3. W pierwszym etapie badań stwierdziłem, że funkcja pełniona przez SUV3 jest niezbędna do życia komórek ludzkich hodowanych in vitro (Szczesny i wsp. 2007). Jednocześnie, stwierdziliśmy, że inaktywacja genu SUV3 u myszy powoduje śmierć na etapie rozwoju zarodkowego, co potwierdziło w układzie in vivo, że funkcja pełniona przez SUV3 u ssaków jest niezbędna do życia (Pereira i wsp. 2007). Badania funkcjonalne pozwoliły mi zaproponować, że ludzka helikaza SUV3 jest niezbędna do degradacji mtrna (Szczesny i wsp. 2010). W przypadku dysfunkcji SUV3 dochodzi do zahamowania degradacji mtrna, co przejawia się zwiększoną stabilnością mitochondrialnego mrna ND3 i dużą akumulacją antysensownych mtrna (Szczesny i wsp. 2010). Ponieważ SUV3 nie posiada aktywności rybonukleolitcznej było oczywiste, że musi on współpracować z innym białkiem w degradacji mtrna, które posiada taką aktywność. Potencjalnym kandydatem, który mógłby pełnić taką funkcję była ludzka fosforylaza polinukleotydowa (PNPaza). Wiadomo było, że u człowieka białko to zlokalizowane jest w mitochondriach (Piwowarski i wsp. 2003). Ponadto, badania in vitro wskazywały, że PNPaza może oddziaływać z SUV3 (Wang i wsp. 2009). Stwierdzono również, że oddziaływanie PNPazy z SUV3 umożliwia degradację dwuniciowych substratów RNA, które bez obecności SUV3 nie były degradowane przez PNPazę (Wang i wsp. 2009). W trakcie swoich badań w ramach rozprawy doktorskiej zaobserwowałem, że PNPaza współoczyszcza się z SUV3 i vice-versa (Szczesny i wsp. 2010). Jednakże, rola PNPazy w degradacji mtrna była mocno kwestionowana. Przede wszystkim postulowano, że PNPaza jest zlokalizowana w przestrzeni międzybłonowej mitochondriów, a nie w macierzy mitochondrialnej (Chen i wsp. 2006), gdzie zachodzą procesy związane z ekspresją mtdna. Ponadto, badania funkcjonalne PNPazy nie wskazywały na zaangażowanie tego białka w degradację mtrna, z wyjątkiem regulacji długości ogonów poli(a) występujących na końcach 3 mt-mrna (Nagaike i wsp. 2005, Slomovic i Schuster, 2008), przy czym sugerowano, że zmiany w długościach ogonów poli(a) są wtórnym efektem zaburzenia funkcji PNPazy (Slomovic i Schuster, 2008). W ostateczności grupa kierowana przez Teitella zaproponowała, że PNPaza uczestniczy w imporcie RNA z cytoplazmy do mitochondriów i jednocześnie zasugerowała, że zaobserwowane przeze mnie współoczyszczanie się PNPazy z SUV3 jest artefaktem wynikającym z oddziaływania tych białek w ekstrakcie białkowym uzyskanym po lizie mitochondriów, ale faktycznie nie mającym miejsca w warunkach in vivo (w macierzy mitochondrialnej) (Wang i wsp. 2010). Tym samym, rybonukleaza odpowiedzialna za degradację mtrna była nieznana, co stało się przedmiotem prac badawczych wchodzących w skład osiągnięcia naukowego (Borowski i wsp. 2013). Strona 6 z 20

7 Helikaza SUV3 działa w kierunku od 3 do 5 RNA, tym samym degradacja RNA zależna od aktywności helikazowej SUV3 przebiega w kierunku 3 5. W trakcie prac nad rolą SUV3 w metabolizmie mtrna stwierdziliśmy obecność mitochondrialnych transkryptów skróconych od końca 5 (Szczesny i wsp. 2010). Sugerowało to istnienie alternatywnej ścieżki degradacji mtrna, w której RNA byłby degradowany w kierunku 5 3. Analiza bioinformatyczna wykazała możliwość istnienia w mitochondriach człowieka białka o potencjalnej aktywności nukleolitycznej, które mogłoby być elementem alternatywnej, SUV3-niezależnej ścieżki degradacji mtrna lub też mogłoby współpracować z SUV3 i jego partnerem rybonukleolitycznym w degradacji mtrna, w celu zwiększenia wydajności tego procesu. Białko to, kodowane przez gen C20ORF72, zostało poddane analizie biochemicznej i funkcjonalnej, których wyniki zostały opisane w jednej z publikacji wchodzących w skład osiągnięcia (Szczesny i wsp. 2013a). Istotnym zagadnieniem dotyczącym degradacji antysensownych mtrna jest wysoka wydajność tego procesu. Analiza transkryptomów różnych tkanek człowieka przeprowadzona za pomocą sekwencjonowania nowej generacji wykazała, że 11 mitochondrialnych mrna 5 stanowi pod względem ilościowym znaczącą część komórkowego mrna od 5 do 30% (Mercer i wsp. 2011). Biorąc pod uwagę fakt, że mt-mrna nie charakteryzują się długim czasem półtrwania 6 ich znacząca ilość w całkowitej puli mrna komórkowego wskazuje, że są one syntetyzowane z dużą częstością. Co więcej, wykazano, że transkrypcja nici L, która jest głównym źródłem mitochondrialnego antysensownego RNA, jest częstsza niż transkrypcja nici H (Attardi i wsp. 1990). Mimo to, w normalnych warunkach mitochondrialne antysensowne transkrypty są utrzymywane na bardzo niskim poziomie, co z kolei wskazuje, że są one usuwane z dużą wydajnością. Skuteczność tego procesu jest tym bardziej interesująca, że ze względu na nierównomierny rozkład nukleotydów guanylowych między nićmi mtdna (ang. GC-skew) antysensowne mtrna są bogate w te nukleotydy, co powoduje, że mogą tworzyć struktury G-kwadrupleksów. Struktury takie charakteryzują się dużą stabilnością, przez co ich obecność w RNA może utrudniać jego degradację. W celu poznania mechanizmów warunkujących wydajne usuwanie antysensownych mtrna przeprowadzono badania, które są elementem niniejszego osiągnięcia naukowego (Szczesny i wsp. 2013a, Pietras i wsp. 2018a). Bardzo niski poziom antysensownych mtrna w warunkach fizjologicznych sugerował, że transkrypty te mogą zaburzać funkcjonowanie kodujących mtrna i/lub odgrywać inną rolę w procesach komórkowych. Sprawne usuwanie antysensownych mtrna miałoby przeciwdziałać ich potencjalnemu negatywnemu wpływowi. Jednym z mechanizmów w jaki antysensowne mtrna mogłyby wpływać na funkcjonowanie mitochondrialnych mrna i trna byłaby hybrydyzacja z tymi transkryptami, co przejawiałoby się tworzeniem w mitochondriach dwuniciowego RNA. Możliwość taka została zweryfikowana eksperymentalnie. Wyniki tych badań zostały opisane w publikacji, która stanowi część przedłożonego do oceny osiągnięcia naukowego (Dhir i wsp. 2018) Cele prac badawczych przedstawionych jako osiągnięcie naukowe Identyfikacja ludzkiej mitochondrialnej rybonukleazy. Ustalenie czy PNPaza jest partnerem helikazy SUV3 w degradacji mitochondrialnego RNA. Poznanie mechanizmów warunkujących wysoką wydajność usuwania antysensownych transkryptów mitochondrialnych. Sprawdzenie czy antysensowne mtrna mogą wpływać na homeostazę komórkową poprzez tworzenia dwuniciowego mitochondrialnego RNA. 5 Dwa mitochondrialne mrna są bicistronowe (kodują po dwa białka). Dlatego liczba mitochondrialnych mrna (11) jest mniejsza od liczby białek (13) kodowanych w genomie mitochondrialnym. 6 Dla większości mt-mrna czas półtrwania wynosi 2-4 godziny (Piechota i wsp. 2006a, Chujo i wsp. 2012). Strona 7 z 20

8 5.3.4 Uzyskane wyniki oraz ich znaczenie Borowski LS, Dziembowski A, Hejnowicz MS, Stepien PP, Szczesny RJ*. Human mitochondrial RNA decay mediated by PNPase-hSuv3 complex takes place in distinct foci. Nucleic Acids Research, 2013, 41: , PMID: , (IF 8,808), * - autor korespondencyjny W momencie prowadzenia badań opisanych w powyższej publikacji rybonukleaza, która degraduje RNA w mitochondriach człowieka była nieznana i stanowiła przedmiot poszukiwań kilku grup badawczych. W pracy tej wykazaliśmy, że PNPaza jest rybonukleazą odpowiedzialną za degradacją RNA w mitochondriach człowieka w warunkach fizjologicznych. Tym samym, uzyskaliśmy odpowiedź na jedno z ówczesnych kluczowych pytań dotyczących metabolizmu mtrna u człowieka. Ponadto, udowodniliśmy, że PNPaza tworzy z helikazą SUV3 kompleks ludzkiego degradosomu mitochondrialnego. Wykazaliśmy m.in., że: 1) istnieje pula PNPazy zlokalizowana w macierzy mitochondrialnej, 2) współoczyszczanie się PNPazy z SUV3 nie jest artefaktem, 3) oba białka oddziałują ze sobą w warunkach in vivo, 4) obniżenie poziomu PNPazy powoduje stabilizację mitochondrialnych mrna i akumulację transkryptów antysensownych, tym samym stwierdziliśmy, że dysfunkcja PNPazy powoduje ten sam rodzaj zaburzeń w metabolizmie mtrna co dysfunkcja SUV3, 5) oddziaływanie PNPaza-SUV3 zachodzi w określonych miejscach mitochondriów, które nazwaliśmy D-foci, 6) oddziaływanie SUV3-PNPaza jest niezbędne do degradacji mtrna. Uzyskane wyniki były bardzo ważnym głosem w dyskusji naukowej czy PNPaza jest poszukiwaną ludzką mitochondrialną rybonukleazą. Co ważne, wyniki przeprowadzonych przez nas badań mają znaczenie, które wykracza poza naukową ciekawość. Stwierdzono, że mutacje w genie kodującym PNPazę prowadzą do chorób u człowieka COXPD13 (ang. combined oxidative phosphorylation deficiency 13; OMIM ) i DFNB70 (ang. deafness, autosomal recessive 70; OMIM ) (Vedrenne i wsp. 2012, von Ameln i wsp. 2012). Jako podłoże molekularne tych chorób w literaturze sugeruje się zaburzenie importu RNA do mitochondriów (Vedrenne i wsp. 2012, von Ameln i wsp. 2012). Jednakże, w świetle wyników badań opisanych przez nas w powyższej publikacji może się okazać, że patogeneza tych chorób jest związane z funkcją PNPazy w degradacji mtrna. Ponadto, bardzo ciekawym odkryciem, którego dokonaliśmy, było ustalenie, że kompleks PNPaza-SUV3 tworzy się w specyficznych strukturach mitochondrialnych, które nazwaliśmy D-foci. Wskazuje to, że procesy degradacji mtrna zależne od degradosomu mitochondrialnego są zorganizowane przestrzennie. Tego typu organizacja procesów związanych z degradację RNA była wcześniej opisana dla transkryptów kodowanych jądrowo, ale nie była opisana dla żadnego mitochondrialnego systemu genetycznego. Wkrótce po ukazaniu się naszej publikacji zostały opublikowane dwie inne prace, w których autorzy również zaobserwowali, że metabolizm mtrna jest zorganizowany przestrzennie (Antonicka i wsp. 2013, Jourdain i wsp. 2013). Badania były współfinansowane z kierowanego przeze mnie projektu: Analiza ludzkiego degradosomu mitochondrialnego oraz nowej, potencjalnej rybonukleazy mitochondrialnej, która może z nim współdziałać. IUVENTUS PLUS, MNiSW. Szczesny RJ, Hejnowicz MS, Steczkiewicz K, Muszewska A, Borowski LS, Ginalski K, Dziembowski A. Identification of a novel human mitochondrial endo-/exonuclease Ddk1/c20orf72 necessary for maintenance of proper 7S DNA levels. Nucleic Acids Research, 2013a, 41: , PMID: , (IF 8,808) RNA może być degradowany przy użyciu różnych ścieżek: przebiegających egzonukleolitycznie w kierunku 5 3 lub 3 5 oraz z udziałem endonukleaz (Houseley i Tollervey, 2009). Analiza sekwencji produktów pośrednich degradacji mtrna akumulających się w warunkach zaburzonej funkcji SUV3 wykazała, że większość z nich była skrócona na końcu 3 (Szczesny i wsp. 2010). Taki wynik wskazywał, że degradacja RNA zależna od helikazy SUV3 przebiega w kierunku 3 5, co jest zgodne z wynikami analiz biochemicznych aktywności podjednostek degradosomu mitochondrialnego. Badania te wykazały, że SUV3 rozplata dwuniciowe substraty od końca 3 do końca 5, podczas gdy PNPaza jest 3 5 egzorybonukleazą (Wang i wsp. 2009, Venø i wsp. 2011). Tym samym, degradosom do rozpoczęcia degradacji RNA wymaga dostępnego końca 3 w transkrypcie. Strona 8 z 20

9 W większości układów biologicznych dany proces może być realizowany przez więcej niż jeden mechanizm, z tym, że wydajność tych mechanizmów może być różna. Wiadomo, że poza nielicznymi wyjątkami, zaburzenie danej ścieżki degradacji RNA jest przynajmniej częściowo kompensowane przez funkcjonowanie innych mechanizmów (Houseley i Tollervey, 2009). Degradacja RNA w mitochondriach drożdży jest zależna przede wszystkim od mitochondrialnego degradosomu i przebiega w kierunku 3 5. Jednakże, badania nad obróbką prekursorowych RNA w tych organellach wskazują, że istnieje w nich również degradacja RNA w kierunku 5 3 (Fekete i wsp. 2008). Naszą uwagę zwrócił fakt, że podczas analizy produktów pośrednich degradacji mtrna akumulujących się w warunkach zaburzonej funkcji ludzkiego SUV3 wykryliśmy transkrypty skrócone na końcu 5 (Szczesny i wsp. 2010). Ponadto, takie transkrypty wykryto również podczas wysokoprzepustowej analizy RNA mitochondrialnego pochodzącego z komórek ssaczych z niezaburzoną degradacją mtrna, przy czym poziom tych transkryptów w normalnych warunkach był bardzo niski (Mercer i wsp. 2011). Dane te sugerowały, że w mitochondriach ludzkich może istnieć alternatywna ścieżka degradacji RNA, której aktywność mogłaby wspierać degradosom w usuwaniu dużej ilości antysensownego mtrna. Kompleksowa analiza bioinformatyczna białek ludzkich przeprowadzona przez zespół dr. Krzysztofa Ginalskiego (Uniwersytet Warszawski) ujawniła wiele przypuszczalnych nukleaz należących do rodziny PD-(D/E)XK (Steczkiewicz i wsp. 2012). Rodzina ta obejmuje enzymy o zróżnicowanej aktywności nukleolitycznej zarówno DNazy jak i RNazy. Wstępne przewidywanie lokalizacji wewnątrzkomórkowej jednej z nowozidentyfikowanych potencjalnych nukleaz PD-(D/E)XK sugerowało, że białko kodowane przez gen C20ORF72 może być białkiem mitochondrialnym. Wydawało się, że białko to może być zaangażowane w przypuszczalną ścieżkę degradacji mtrna rozpoczynającą się od końca 5. Ponadto, ponieważ wiadomo było, że niektórzy przedstawiciele rodziny PD-(D/E)XK posiadają aktywność endorybonukleolityczną istniała możliwość, że białko C20ORF72 zwiększa wydajność degradacji antysensownych mtrna poprzez ich podzielenie na krótsze fragmenty i generowanie dodatkowych końców 3 od których degradację mógłby rozpocząć degradosom. W ten sposób wyjściowy transkrypt byłby degradowany przez wiele cząsteczek degradosomu, a nie tylko przez jedną. Aby sprawdzić czy domniemana nukleaza kodowana przez gen C20ORF72 uczestniczy w degradacji mtrna przeprowadziliśmy jej analizę biochemiczną i funkcjonalną (Szczesny i wsp. 2013a). Wykazaliśmy, że produkt białkowy genu C20ORF72, który nazwaliśmy DDK1, to mitochondrialnie zlokalizowana, zależna od jonów metali DNaza pozbawiona wykrywalnej aktywności rybonukleazy. Eksperymenty in vivo wykazały, że białko to jest niezbędne do utrzymania prawidłowego poziomu jednoniciowego mitochondrialnego 7S DNA. DDK1 to pierwsze zidentyfikowane białko o aktywności nukleolitycznej, które uczestniczy w metabolizmie 7S DNA. Jego rola w metabolizmie jednoniciowego 7S DNA ustalona na podstawie eksperymentów in vivo była zgodna z analizą biochemiczną, która wykazała, że DDK1 degraduje ssdna, ale nie substraty dsdna. Co ciekawe, wykazaliśmy, że DDK1 jest endodeoksyrybonukleazą, która wymaga wolnych końców dla swojej aktywności, a zatem nie degraduje kolistych substratów, a liniowe. Co ważniejsze, stwierdziliśmy, że w przypadku chimerycznych substratów RNA-DNA-RNA białko DDK1 może przemieszczać się wzdłuż fragmentu RNA, a następnie przecinać substrat w obrębie DNA. To odkrycie ma duże znaczenie dla bieżących badań nad rolą DDK1 prowadzonych przez innych badaczy, którzy sugerują, że DDK1 uczestniczy w usuwaniu starterów replikacji z nowozsyntetyzowanym mtdna (Uhler i wsp. 2016). Jest to zgodne z wynikami badań grupy kierowanej przez dr. Michała Mińczuka (MRC Mitochondrial Biology Unit, Cambridge, UK), która niezależnie od nas zidentyfikowała C20ORF72 jako enzym niezbędny do utrzymania prawidłowego poziomu genomu mitochondrialnego (Kornblum i wsp. 2013). Co więcej stwierdzono, że mutacje w genie C20ORF72 prowadzą do wieloukładowej choroby mitochondrialnej u człowieka (Kornblum i wsp. 2013). Badania nad DDK1 stanowiły integralną część badań, których celem było poznanie mechanizmów degradacji mtrna. Rezultatem badań nad DDK1 jest opis białka, które uważane jest za ważny czynnik niezbędny do utrzymania prawidłowego poziomu mtdna. W dalszych badaniach we współpracy z zespołem dr. Mińczuka wykazaliśmy, że DDK1 oddziałuje z podjednostką katalityczną mitochondrialnej polimerazy DNA (Nicholls i wsp. 2014). Ponadto, stwierdziliśmy, że niedobór aktywności DDK1 (oficjalny symbol MGME1) powoduje rearanżacje w mtdna i akumulację jego liniowych fragmentów (Nicholls i wsp. 2014), co dodatkowo potwierdza ważną rolę DDK1 w funkcjonowaniu mitochondrialnego systemu genetycznego. Strona 9 z 20

10 Badania były głównie finansowane z kierowanego przeze mnie projektu: Analiza ludzkiego degradosomu mitochondrialnego oraz nowej, potencjalnej rybonukleazy mitochondrialnej, która może z nim współdziałać. IUVENTUS PLUS, MNiSW. Pietras Z, Wojcik MA, Borowski LS, Szewczyk M, Kulinski TM, Cysewski D, Stepien PP, Dziembowski A*, Szczesny RJ*. Dedicated surveillance mechanism controls G-quadruplex forming non-coding RNAs in human mitochondria. Nature Communications, 2018a, 9(1):2558, PMID: , (IF 12,353), * - autorzy korespondencyjni Zastosowanie strategii poszukiwawczej z użyciem analiz bioinformatycznych nie pozwoliło na identyfikację białka, które współdziałałoby z degradosomem w degradacji mtrna. Dlatego też, zastosowaliśmy alternatywną strategię badawczą, w której poszukiwaliśmy białek współoczyszczających się zarówno z PNPazą jak i SUV3. W wyniku przeprowadzonej analizy zidentyfikowaliśmy białko GRSF1 (ang. G-Rich RNA Sequence Binding Factor 1) jako potencjalnie współpracujące z kompleksem PNPaza-SUV3. Identyfikacja tego białka wśród białek współoczyszczających się z degradosomem była dla nas szczególnie interesująca ponieważ z wcześniejszych badań wiadomo było, że GRSF1 jest białkiem zlokalizowanym w mitochondriach. Co więcej, stwierdzono, że GRSF1 jest białkiem wiążącym RNA (należy do grupy białek quasi-rrm) i preferencyjnie wiąże RNA bogaty w nukleotydy guanylowe. Ponieważ, antysensowne mtrna są bogate w nukleotydy guanylowe wydawało się wysoce prawdopodobne, że GRSF1 współpracuje z degradosomem w degradacji tej grupy transkryptów. W wyniku przeprowadzonych badań wykazaliśmy, że GRSF1 faktycznie współpracuje z degradosomem w degradacji antysensownych mtrna zwiększając wydajność degradacji tych transkryptów przez kompleks PNPaza- SUV3. Stwierdziliśmy, że rolą GRSF1 jest destabilizacja G-kwadrupleksów (G4) występujących w mtrna, co ułatwia jego degradację przez degradosom mitochondrialny. Przeprowadzając badania z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej wykazaliśmy, że GRSF1 występuje w D-foci tj. mitochondrialnych ciałkach zawierających degradosom. Za pomocą kompleksowej analizy RNA-seq transkryptomu mitochondrialnego zidentyfikowaliśmy substraty degradosomu oraz GRSF1 i odkryliśmy, że niekodujące mtrna, które są podatne na tworzenie G-kwadrupleksów, akumulują się w warunkach dysfunkcji degradosomu lub obniżenia poziomu GRSF1. Wśród tych niekodujących mtrna stanowiących in vivo substrat degradosomu i GRSF1 odkryliśmy krótki mtrna (nazwaliśmy go trna-like), który podlega dojrzewaniu posttranskrypcyjnemu. Analizy biochemiczne i biofizyczne wykazały, że odkryty trna-like oraz inne substraty GRSF1/degradosomu rzeczywiście tworzą G-kwadrupleksy. Wykazaliśmy, że wiązanie GRSF1 do RNA zawierającego G-kwadrupleksy rozplata i/lub zapobiega tworzeniu tych struktur, co wzmacnia degradację danego RNA przez degradosom. Dodatkowo, w badaniach tych stwierdziliśmy, że rolą SUV3 w degradacji mtrna jest nie tylko rozplatanie dupleksów RNA, ale także oddysocjowanie białek (GRSF1) związanych z mtrna, co umożliwia degradację RNA przez PNPazę. Ostatecznie zaproponowaliśmy mechanizm molekularny współpracy między GRSF1 i degradosomem w degradacji mitochondrialnych RNA zawierających G-kwadrupleksy. Zgodnie z naszą wiedzą jest to pierwszy udokumentowany przykład mechanizmu molekularnego obejmującego współpracę między białkiem destabilizującym G4 (GRSF1) i maszynerią degradującą RNA (PNPaza-SUV3). Opierając się na wynikach analiz własnych oraz przeprowadzonych przez innych badaczy stwierdziliśmy, że struktury G-kwadrupleksów są charakterystyczne dla antysensownych, niekodujących mtrna. Zaobserwowaliśmy, że struktury te najprawdopodobniej nie występują w kodujących mtrna. Tym samym, wyniki naszych badań nie tylko przyczyniły się do poznania jednego z mechanizmów, który decyduje o wydajnej degradacji antysensownych mtrna, ale także sugerują, że G4 mogą być jednym z markerów niekodującego mtrna. Umożliwiałoby to odróżnienie tej klasy mtrna od kodującego mtrna i naznaczało antysensowne transkrypty do degradacji przez degradosom. Nasze badania biochemiczne i funkcjonalne uzupełniliśmy o analizę filogenetyczną GRSF1 oraz analizę genomów mitochondrialnych z różnych grup organizmów pod względem ich sekwencji, składu nukleotydowego oraz rozkładu nukleotydów guanylowych między nićmi mtdna (ang. GC-skew). Na podstawie uzyskanych wyników zaproponowaliśmy, że ludzkie białko GRSF1 oraz jego homologi z innych organizmów stanowią odrębną grupę w obrębie białek quasi-rrm. Co ciekawe, stwierdziliśmy, że białka GRSF1 występują jedynie u kręgowców. Strona 10 z 20

11 Ostatecznie, na podstawie przeprowadzonych analiz zaproponowaliśmy, że pojawienie się GRSF1 w mitochondriach jest ewolucyjną adaptacją, która nastąpiła, gdy genomy mitochondrialne przeszły zmianę od takich, które kodują niewielką liczbę G4 do genomów bogatych w G4. Sądzimy, że pojawienie się GRSF1 w mitochondriach umożliwiło kontrolę poziomu mitochondrialnych transkryptów zawierających G-kwadrupleksy. Wyniki naszych badań wspierają ciekawą hipotezę postawioną przez Guo i Bartel, którzy zaproponowali, że u Eukaryota doszło do wykształcenia maszynerii białkowej, która przeciwdziała tworzeniu G-kwadrupleksów w RNA (Guo i Bartel, 2016). Wyniki badań opisanych w Pietras i wsp. 2018a wzbudziły duże zainteresowanie innych badaczy, co przejawiło się między innymi: 1) zaproszeniem przez uznanych naukowców (Lorenzo Galluzzi i Guido Kroemer, University Paris Descartes, Paris, FR) do napisania komentarza, który ukazał się w Molecular and Cellular Oncology (Pietras i wsp. 2018b), 2) zaproszeniem do wygłoszenia referatu na temat przeprowadzonych badań podczas The 9th World Congress on Targeting Mitochondria ( , Berlin, Niemcy) organizowanego przez World Mitochondria Society. Badania były głównie finansowane z grantu realizowanego przez konsorcjum 4 zespołów badawczych, w którym jestem kierownikiem jednego z zespołów: Multidyscyplinarne kompleksowe badania degradacji i kontroli jakości mitochondrialnego RNA. SYMFONIA, Narodowe Centrum Nauki. Dhir A*, Dhir S#, Borowski LS#, Jimenez L, Teitell M, Rötig A, Crow YJ, Rice GI, Duffy D, Tamby C, Nojima T, Munnich A, Schiff M, de Almeida CR, Rehwinkel J, Dziembowski A, Szczesny RJ*, Proudfoot NJ*. Mitochondrial doublestranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature, 2018, PMID: , (IF 41,577), * - autorzy korespondencyjni, # - autorzy równorzędni Mitochondrialne transkrypty antysensowne podlegają ścisłej kontroli przez degradosom. W trakcie moich badań byłem zainteresowany czy transkrypty takie mogą wpływać na funkcjonowanie mitochondriów i/lub homeostazę komórkową. Ponieważ niekodujące transkrypty mitochondrialne są komplementarne do funkcjonalnych mtrna wydawało się bardzo prawdopodobne, że mogą one tworzyć dwuniciowy RNA (dsrna). Hipoteza taka została zweryfikowana eksperymentalnie (Dhir i wsp. 2018). W wyniku przeprowadzonych badań wykazaliśmy, że ekspresja genomu mitochondrialnego może być głównym źródłem komórkowego dsrna u ludzi. Następnie zidentyfikowaliśmy degradosom mitochondrialny jako bardzo ważny czynnik, który chroni komórkę przed ekspozycją na mt-dsrna. Okazało się bowiem, że wyciszenie ekspresji SUV3 lub PNPazy prowadzi do akumulacji mt-dsrna. We współpracy z zespołem prof. Nicholasa Proudfoota (Oxford University, Wielka Brytania) oraz innymi grupami badawczymi wykazaliśmy, że w przypadku dysfunkcji PNPazy mitochondrialny dsrna nie tylko gromadzi się w macierzy mitochondrialnej, ale jest również uwalniany z mitochondriów do cytoplazmy. Na terenie cytoplazmy mt-dsrna jest omyłkowo rozpoznawany jako materiał pochodzenia wirusowego, co prowadzi do aktywacji jednego z mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej (tj. indukcji szlaku odpowiedzi interferonowej) w warunkach gdy infekcja wirusowa nie miała miejsca. Opisane przez nas badania wskazują, że mt-dsrna, którego tworzeniu przeciwdziała degradosom mitochondrialny, stanowi poważne zagrożenie dla homeostazy komórki. Co ważne, nasi współpracownicy, którzy mieli dostęp do odpowiedniego materiału badawczego, wykazali nagromadzenie mt-dsrna w pierwotnych fibroblastach skóry pochodzących od pacjentów posiadających hipomorficzne mutacje w genie PNPT1 (gen kodujący PNPazę). Zaobserwowany wzrost mt-dsrna w fibroblastach był skorelowany ze wzrostem ekspresji genów regulowanych przez interferon β w materiale uzyskanym z krwi obwodowej pacjentów z mutacjami w PNPT1. Tego typu zmiany w ekspresji genów są jednym z symptomów grupy chorób nazywanych interferonopatiami typu I. Uzyskane przez nas wyniki prowadzą do trzech ważnych wniosków: 1) obecność antysensownego mtrna prowadzi do tworzenia mitochondrialnego dsrna, który może wpływać na homeostazę komórki, 2) mitochondria mogą uczestniczyć w regulacji procesów komórkowych jako źródło dsrna, co rozszerza repertuar mechanizmów dzięki którym organella te wpływają na funkcjonowanie i los komórki, 3) niekontrolowany mt-dsrna może indukować niepożądaną, permanentną aktywację szlaku odpowiedzi interferonowej, co w konsekwencji może stanowić podłoże interferonopatii u człowieka. Tym samym, nasze badania rozszerzają pulę mechanizmów, które mogą prowadzić do wspomnianej grupy chorób i wskazują, że w przypadku pacjentów cierpiących na interferonopatie o nieustalonej Strona 11 z 20

12 etiologii powinno rozważyć się sprawdzenie poziomu mt-dsrna oraz analizę sekwencji genów zaangażowanych w regulację jego poziomu i/lub wypływu z mitochondriów do cytoplazmy. Badania, które przeprowadziłem wraz z zespołem w ramach kierowanego przeze mnie projektu SONATA (NCN) pozwoliły na zidentyfikowanie kilku genów, których obniżenie ekspresji powoduje wzrost poziomu mt-dsrna w komórkach ludzkich (dane niepublikowane), podobnie jak ma to miejsce w przypadku komórek z obniżonym poziomem SUV3 lub PNPazy. Geny te zostały zidentyfikowane poprzez wysokoprzepustowe przeszukania z użyciem biblioteki sirna zawierającej sirna dla prawie wszystkich genów kodujących białka u człowieka (ang. genome-wide sirna screening). Metodologia te została wprowadzona przeze mnie do Pracowni Biologii RNA i Genomiki Funkcjonalnej IBB PAN. Nowozidentyfikowane czynniki regulujące poziom mt-dsrna są obecnie przedmiotem szczegółowych badań w ramach kierowanego przeze mnie grantu przyznanego przez Fundację na rzecz Nauki Polskiej (program First TEAM). Badania przeprowadzone w Polsce były finansowane z grantu, którego jestem kierownikiem: Identyfikacja nowych elementów i ścieżek degradacji ludzkiego RNA mitochondrialnego za pomocą wysokoprzepustowych przeszukiwań biblioteką sirna pokrywającą cały genom. SONATA, Narodowe Centrum Nauki. 5.4 Literatura von Ameln, S., Wang, G., Boulouiz, R., Rutherford, M.A., Smith, G.M., Li, Y., Pogoda, H.-M., Nürnberg, G., Stiller, B., Volk, A.E., et al. (2012). A mutation in PNPT1, encoding mitochondrial-rna-import protein PNPase, causes hereditary hearing loss. Am. J. Hum. Genet. 91, Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn, M.H., Coulson, A.R., Drouin, J., Eperon, I.C., Nierlich, D.P., Roe, B.A., Sanger, F., et al. (1981). Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290, Antonicka, H., Sasarman, F., Nishimura, T., Paupe, V., and Shoubridge, E.A. (2013). The Mitochondrial RNA-Binding Protein GRSF1 Localizes to RNA Granules and Is Required for Posttranscriptional Mitochondrial Gene Expression. Cell Metabolism 17, Attardi, G., Chomyn, A., King, M.P., Kruse, B., Polosa, P.L., and Murdter, N.N. (1990). Regulation of mitochondrial gene expression in mammalian cells. Biochem. Soc. Trans. 18, Borowski, L.S., Dziembowski, A., Hejnowicz, M.S., Stepien, P.P., and Szczesny, R.J. (2013). Human mitochondrial RNA decay mediated by PNPase-hSuv3 complex takes place in distinct foci. Nucleic Acids Res. 41, Brzezniak, L.K., Bijata, M., Szczesny, R.J., and Stepien, P.P. (2011). Involvement of human ELAC2 gene product in 3 end processing of mitochondrial trnas. RNA Biol 8, Chen, H.-W., Rainey, R.N., Balatoni, C.E., Dawson, D.W., Troke, J.J., Wasiak, S., Hong, J.S., McBride, H.M., Koehler, C.M., Teitell, M.A., et al. (2006). Mammalian Polynucleotide Phosphorylase Is an Intermembrane Space RNase That Maintains Mitochondrial Homeostasis. Mol. Cell. Biol. 26, Chujo, T., Ohira, T., Sakaguchi, Y., Goshima, N., Nomura, N., Nagao, A., and Suzuki, T. (2012). LRPPRC/SLIRP suppresses PNPasemediated mrna decay and promotes polyadenylation in human mitochondria. Nucleic Acids Res. 40, Dhir, A., Dhir, S., Borowski, L.S., Jimenez, L., Teitell, M., Rötig, A., Crow, Y.J., Rice, G.I., Duffy, D., Tamby, C., et al. (2018). Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature 560, Dmochowska, A., Golik, P., and Stepien, P.P. (1995). The novel nuclear gene DSS-1 of Saccharomyces cerevisiae is necessary for mitochondrial biogenesis. Curr. Genet. 28, Dmochowska, A., Kalita, K., Krawczyk, M., Golik, P., Mroczek, K., Lazowska, J., Stepień, P.P., and Bartnik, E. (1999). A human putative Suv3-like RNA helicase is conserved between Rhodobacter and all eukaryotes. Acta Biochim. Pol. 46, Dziembowski, A., Piwowarski, J., Hoser, R., Minczuk, M., Dmochowska, A., Siep, M., van der Spek, H., Grivell, L., and Stepien, P.P. (2003). The yeast mitochondrial degradosome. Its composition, interplay between RNA helicase and RNase activities and the role in mitochondrial RNA metabolism. J. Biol. Chem. 278, Fekete, Z., Ellis, T.P., Schonauer, M.S., and Dieckmann, C.L. (2008). Pet127 governs a 5 -> 3 -exonuclease important in maturation of apocytochrome b mrna in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 283, Guo, J.U., and Bartel, D.P. (2016). RNA G-quadruplexes are globally unfolded in eukaryotic cells and depleted in bacteria. Science 353. Houseley, J., and Tollervey, D. (2009). The many pathways of RNA degradation. Cell 136, Jourdain, A.A., Koppen, M., Wydro, M., Rodley, C.D., Lightowlers, R.N., Chrzanowska-Lightowlers, Z.M., and Martinou, J.-C. (2013). GRSF1 regulates RNA processing in mitochondrial RNA granules. Cell Metab. 17, Strona 12 z 20

13 Kornblum, C., Nicholls, T.J., Haack, T.B., Schöler, S., Peeva, V., Danhauser, K., Hallmann, K., Zsurka, G., Rorbach, J., Iuso, A., et al. (2013). Loss-of-function mutations in MGME1 impair mtdna replication and cause multisystemic mitochondrial disease. Nat. Genet. 45, Lee, C., Zeng, J., Drew, B.G., Sallam, T., Martin-Montalvo, A., Wan, J., Kim, S.-J., Mehta, H., Hevener, A.L., de Cabo, R., et al. (2015). The mitochondrial-derived peptide MOTS-c promotes metabolic homeostasis and reduces obesity and insulin resistance. Cell Metab. 21, Litonin, D., Sologub, M., Shi, Y., Savkina, M., Anikin, M., Falkenberg, M., Gustafsson, C.M., and Temiakov, D. (2010). Human Mitochondrial Transcription Revisited ONLY TFAM AND TFB2M ARE REQUIRED FOR TRANSCRIPTION OF THE MITOCHONDRIAL GENES IN VITRO. J. Biol. Chem. 285, Mercer, T.R., Neph, S., Dinger, M.E., Crawford, J., Smith, M.A., Shearwood, A.-M.J., Haugen, E., Bracken, C.P., Rackham, O., Stamatoyannopoulos, J.A., et al. (2011). The Human Mitochondrial Transcriptome. Cell 146, Minczuk, M., Piwowarski, J., Papworth, M.A., Awiszus, K., Schalinski, S., Dziembowski, A., Dmochowska, A., Bartnik, E., Tokatlidis, K., Stepien, P.P., et al. (2002). Localisation of the human hsuv3p helicase in the mitochondrial matrix and its preferential unwinding of dsdna. Nucleic Acids Res. 30, Nagaike, T., Suzuki, T., Katoh, T., and Ueda, T. (2005). Human mitochondrial mrnas are stabilized with polyadenylation regulated by mitochondria-specific poly(a) polymerase and polynucleotide phosphorylase. J. Biol. Chem. 280, Nicholls, T.J., Zsurka, G., Peeva, V., Schöler, S., Szczesny, R.J., Cysewski, D., Reyes, A., Kornblum, C., Sciacco, M., Moggio, M., et al. (2014). Linear mtdna fragments and unusual mtdna rearrangements associated with pathological deficiency of MGME1 exonuclease. Hum. Mol. Genet. 23, Pereira, M., Mason, P., Szczesny, R.J., Maddukuri, L., Dziwura, S., Jedrzejczak, R., Paul, E., Wojcik, A., Dybczynska, L., Tudek, B., et al. (2007). Interaction of human SUV3 RNA/DNA helicase with BLM helicase; loss of the SUV3 gene results in mouse embryonic lethality. Mech. Ageing Dev. 128, Piechota, J., Tomecki, R., Gewartowski, K., Szczesny, R., Dmochowska, A., Kudła, M., Dybczyńska, L., Stepien, P.P., and Bartnik, E. (2006a). Differential stability of mitochondrial mrna in HeLa cells. Acta Biochim. Pol. 53, Piechota, J., Szczesny, R., Wolanin, K., Chlebowski, A., and Bartnik, E. (2006b). Nuclear and mitochondrial genome responses in HeLa cells treated with inhibitors of mitochondrial DNA expression. Acta Biochim. Pol. 53, Pietras, Z., Wojcik, M.A., Borowski, L.S., Szewczyk, M., Kulinski, T.M., Cysewski, D., Stepien, P.P., Dziembowski, A., and Szczesny, R.J. (2018a). Dedicated surveillance mechanism controls G-quadruplex forming non-coding RNAs in human mitochondria. Nat Commun 9, Pietras, Z., Wojcik, M.A., Borowski, L.S., Szewczyk, M., Kulinski, T.M., Cysewski, D., Stepien, P.P., Dziembowski, A., and Szczesny, R.J. (2018b). Controlling the mitochondrial antisense - role of the SUV3-PNPase complex and its co-factor GRSF1 in mitochondrial RNA surveillance. Mol Cell Oncol 5, e Piwowarski, J., Grzechnik, P., Dziembowski, A., Dmochowska, A., Minczuk, M., and Stepien, P.P. (2003). Human polynucleotide phosphorylase, hpnpase, is localized in mitochondria. J. Mol. Biol. 329, Rusecka, J., Kaliszewska, M., Bartnik, E., and Tońska, K. (2018). Nuclear genes involved in mitochondrial diseases caused by instability of mitochondrial DNA. J. Appl. Genet. Sanchez, M.I.G.L., Mercer, T.R., Davies, S.M.K., Shearwood, A.-M.J., Nygård, K.K.A., Richman, T.R., Mattick, J.S., Rackham, O., and Filipovska, A. (2011). RNA processing in human mitochondria. Cell Cycle 10, Seidel-Rogol, B.L., and Shadel, G.S. (2002). Modulation of mitochondrial transcription in response to mtdna depletion and repletion in HeLa cells. Nucl. Acids Res. 30, Slomovic, S., and Schuster, G. (2008). Stable PNPase RNAi silencing: its effect on the processing and adenylation of human mitochondrial RNA. RNA 14, Steczkiewicz, K., Muszewska, A., Knizewski, L., Rychlewski, L., and Ginalski, K. (2012). Sequence, structure and functional diversity of PD-(D/E)XK phosphodiesterase superfamily. Nucleic Acids Res. 40, Stepien, P.P., Margossian, S.P., Landsman, D., and Butow, R.A. (1992). The yeast nuclear gene suv3 affecting mitochondrial posttranscriptional processes encodes a putative ATP-dependent RNA helicase. PNAS 89, Szczesny, R.J., Obriot, H., Paczkowska, A., Jedrzejczak, R., Dmochowska, A., Bartnik, E., Formstecher, P., Polakowska, R., and Stepien, P.P. (2007). Down-regulation of human RNA/DNA helicase SUV3 induces apoptosis by a caspase- and AIF-dependent pathway. Biol. Cell 99, Szczesny, R.J., Borowski, L.S., Brzezniak, L.K., Dmochowska, A., Gewartowski, K., Bartnik, E., and Stepien, P.P. (2010). Human mitochondrial RNA turnover caught in flagranti: involvement of hsuv3p helicase in RNA surveillance. Nucl. Acids Res. 38, Szczesny, R.J., Borowski, L.S., Malecki, M., Wojcik, M.A., Stepien, P.P., and Golik, P. (2012). RNA degradation in yeast and human mitochondria. Biochim. Biophys. Acta 1819, Strona 13 z 20