Ekspresja molekuł adhezyjnych na komórkach blastycznych a zjawisko oporności wielolekowej w ostrych białaczkach

Transkrypt

1 PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 4, str MAGDALENA MAŁEK, DARIUSZ JAWNIAK, ANETA GORĄCY, ANNA DMOSZYŃSKA Ekspresja molekuł adhezyjnych na komórkach blastycznych a zjawisko oporności wielolekowej w ostrych białaczkach Expression of adhesion molecules on blast cells in relation to multidrug resistance in acute leukemia Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytet Medyczny w Lublinie Kierownik: Prof. dr hab. Anna Dmoszyńska STRESZCZENIE Oporność wielolekowa związana z ekspresją białka P-gp (MDR-1) oraz oporność za pośrednictwem molekuł adhezyjnych (CAM-DR) związana z ekspresją integryn oparte są na dwu róŝnych mechanizmach. CAM-DR moŝe indukować ekspresję białka P-gp, które jest jednym z najwaŝniejszych czynników złego rokowania w ostrych białaczkach. Celem pracy było zbadanie wzajemnej zaleŝności między ekspresją róŝnych molekuł adhezyjnych a obecnością białka P-gp na komórkach blastycznych ostrych białaczek, w aspekcie oceny znaczenia prognostycznego cząsteczek adhezyjnych. U 28 chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) i 17 chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (OBL) oceniano ekspresję następujących molekuł adhezyjnych: selektyny L, β1-integryn: VLA-2, VLA-4, VLA-5, VLA-6, β2-integryn: LFA-1, Mac-1, CD11c/18, nadrodziny immunoglobulin:vcam-1, ICAM-1, PECAM i NCAM oraz cząsteczek CD44 i CD34, a takŝe ekspresję białka P-gp oporności wielolekowej. Na podstawie naszych badań wykazaliśmy, Ŝe w OBS obecność β2-integryny CD11b/18 i VCAM (CD106) na blastach, zaś w OBL obecność selektyny L (CD62L) na blastach ma istotny związek z ekspresją białka P-gp oporności wielolekowej (MDR). Jednocześnie, dodatnia ekspresja tych cząsteczek adhezyjnych na blastach łączyła się ze znacznie gorszą odpowiedzią na leczenie. Wydaje się zatem, Ŝe cząsteczki CD11b/18 i CD106 w OBS, zaś CD62L w OBL mogą odgrywać rolę czynników niekorzystnych prognostycznie. Zarówno w OBS jak i w OBL brak odpowiedzi na chemioterapię indukującą wiązała się istotnie z wyŝszą ekspresją β2-integryny CD11b na blastach. Z kolei jedynie w OBS (nie w OBL) wykazano dodatnią korelację między ekspresją MDR-1 i CD11b, co moŝe sugerować, Ŝe oporność na leczenie w OBS wynika ze współdziałania mechanizmu MDR i CAM-DR, związanego z β2-integrynami, zaś w OBL mechanizm CAM-DR pozostaje być moŝe niezaleŝny. PowyŜsze wnioski wymagają potwierdzenia na większych grupach chorych. SŁOWA KLUCZOWE: Molekuły adhezyjne Oporność wielolekowa Ostra białaczka SUMMARY Multi-drug resistance associated with the expression of P-gp protein (MDR-1) and cell-adhesion mediated drug resistance (CAM-DR) connected with the expression of integrins are based on two different mechanisms. CAM-DR might induce expression of P-gp protein, which is one of the major poor prognostic factors in acute leukemias. In this study we evaluated the relation between

2 800 M. MAŁEK i wsp. expression of various adhesion molecules and P-gp protein on blast cells of acute leukemia patients considering complete remission (CR) rate after first line induction therapy, in order to assess the prognostic role of the studied molecules. In 45 newly diagnosed acute leukemia patients including: 28 acute myeloid leukemia (AML) patients and 17 acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients, we analysed the expression of the following adhesion molecules: L selectin, β1- integrins: VLA-2, VLA-4, VLA-5, VLA-6, β2-integrins: LFA-1, Mac-1, CD11c/18, immunoglobulins: VCAM-1, ICAM-1, PECAM, NCAM and CD44, CD34 antigens, as well as the expression of P-gp protein. In this study we have documented that: the presence of β2-integrin CD11b/18 and VCAM (CD106) on blast cells in AML and the presence of selectin L (CD62L) on blast cells in ALL correlates with the expression of P-gp protein (MDR-1). At the same time, positive expression of the above mentioned adhesion molecules was connected with considerably worse response to the treatment. Therefore it seems, that CD11b/18 and CD106 in AML, as well as CD62L in ALL may serve as poor prognostic factors. In both AML and ALL therapy resistance correlated with higher expression of β2-integrin CD11b on blast cells. Moreover, only in AML (not in ALL) we observed positive correlation between MDR and CD11b expression, what suggests, that therapy resistance in AML may result from cooperation of MDR and CAM-DR mechanisms, while in ALL CAM-DR mechanism connected with β2-integrins is probably independent. Our conclusions need to be confirmed in larger groups of patients. KEY WORDS: Adhesion molecules Multi-drug resistance Acute leukemia WSTĘP Ostra białaczka charakteryzuje się nieprawidłowością interakcji pomiędzy komórkami blastycznymi a otaczającym je mikrośrodowiskiem szpiku. W oddziaływaniach tych pośredniczą molekuły (cząsteczki) adhezyjne, które umoŝliwiają nie tylko wzajemne przyleganie (adhezję) między komórkami i składnikami macierzy pozakomórkowej, ale takŝe wyzwalają szereg wewnątrzkomórkowych procesów takich jak: przekaz sygnału oraz ekspresja genów regulujących wzrost i apoptozę komórki. Aberracje ekspresji molekuł adhezyjnych są przyczyną nieprawidłowego przylegania i lokalizacji komórek białaczkowych w podścielisku szpiku, co w konsekwencji prowadzi do zahamowania apoptozy, indukcji proliferacji blastów, zaburzeń interakcji z komórkami cytotoksycznymi oraz migracji blastów [1]. Oporność wielolekowa (multidrug resistance MDR) polegająca na utracie aktywności przeciwnowotworowej cytostatyków stanowi jeden z podstawowych problemów w chemioterapii ostrych białaczek. Mechanizm tego zjawiska jest złoŝony i biorą w nim udział m.in. błonowe białka transportowe i zaburzenia procesu apoptozy. Najwcześniej poznanym białkiem pełniącym rolę aktywnego transportera cytostatyków na zewnątrz komórki jest, kodowana przez gen MDR-1, P-glikoproteina (białko P-gp), której wysoka ekspresja w komórkach białaczkowych powoduje oporność na: antracykliny, alkaloidy vinca, taksany i epipodofilotoksyny. W literaturze sugeruje się wpływ P-gp na proces apoptozy, gdyŝ zaobserwowano związek wysokiej ekspresji P-gp i genu BclXL [2]. Wiele badań klinicznych udowodniło, Ŝe wysoka ekspresja P-gp jest niezaleŝnym negatywnym czynnikiem rokowniczym w ostrej białaczce szpikowej (OBS) tj. wiąŝe się istotnie z niŝszym odsetkiem całkowitych remisji (CR) oraz krótszym czasem przeŝycia (OS) [3, 4], nawet u chorych z prawidłowym kariotypem [5].

3 Ekspresja molekuł adhezyjnych 801 W przypadku ostrej białaczki limfoblastycznej (OBL), znaczenie prognostyczne P-gp nie jest jednoznacznie określone. Niektórzy autorzy stwierdzają, Ŝe jest to czynnik niekorzystny rokowniczo [6], zaś inni nie znajdują korelacji z odpowiedzią na leczenie i całkowitym przeŝyciem [7]. W niektórych publikacjach podkreśla się rolę wysokiej aktywności białka P-gp jako czynnika rokowniczego jedynie w OBL T-komórkowej [8]. Zjawisko oporności na chemioterapię za pośrednictwem cząstek adhezyjnych (cell adhesion mediated drug resistance- CAM-DR), opisane pierwotnie w szpiczaku plazmocytowym (9), polega na zahamowaniu, wywołanej róŝnymi cytostatykami, apoptozy komórek nowotworowych, na skutek ich adhezji do podścieliska szpiku (głównie fibronektyny) za pośrednictwem β1-integryn. Badania in vitro potwierdziły występowanie tego zjawiska takŝe w ostrych białaczkach [10, 11]. CAM-DR, w przeciwieństwie do innych znanych rodzajów oporności wielolekowej, dotyczy nie tylko cytostatyków, ale takŝe inhibitorów kinazy tyrozynowej jak imatinib [12]. Udowodniono, Ŝe CAM-DR pojawia się de novo w sposób odwracalny [13] oraz niezaleŝnie od ekspozycji komórek białaczkowych na cytostatyki, a takŝe moŝe stymulować rozwój innych form wielolekowej oporności [14]. Mechanizm CAM-DR nie jest dokładnie znany, jednak na podstawie dotychczasowych badań na komórkach szpiczakowych wykluczono aktywny transport leków oraz wzrost ekspresji białek z rodziny BCL [15]. Natomiast w najnowszych doniesieniach dotyczących ostrych białaczek stwierdzono w komórkach blastycznych wzrost poziomu białka XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis) hamującego apoptozę oraz obniŝenie poziomu pro-apoptotycznego białka Bim z rodziny BCL-2, na skutek adhezji blastów do fibronektyny [13, 16]. Ostatnio Wu i wsp. [17] opisali w białaczkach nowy rodzaj oporności na cytostatyki, którą nazwali,,natychmiastową opornością (sudden drug resistance- SDR). Według tych autorów jest ona związana z ekspresją β2-integryn oraz indukowaną przez te cząsteczki homotypową agregacją komórek białaczkowych. W literaturze istnieją jedynie pojedyncze doniesienia na temat wzajemnej korelacji ekspresji P-gp i cząsteczek adhezyjnych, zaś znaczenie kliniczne takiej koekspresji nie jest znane. W związku z tym podjęliśmy badania mające na celu ocenę wzajemnej zaleŝności między ekspresją róŝnych molekuł adhezyjnych a obecnością glikoproteiny P na komórkach blastycznych ostrych białaczek, w aspekcie wpływu na uzyskanie remisji choroby po leczeniu pierwszoliniowym oraz oceny znaczenia prognostycznego cząsteczek adhezyjnych. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań było 45 chorych, u których rozpoznano ostrą białaczkę de novo, w tym: 28 chorych na ostrą białaczkę szpikową (OBS) i 17 chorych na ostrą białaczkę limfoblastyczną (OBL). Analizowano oddzielnie grupę chorych na OBS i OBL. Charakterystyka chorych na OBS pod względem typu białaczki według klasyfikacji FAB, przedstawiała się następująco: MLA-M0 (1 chory), MLA-M1 (1 chory), MLA-M2 (5 chorych), MLA-M3 (4 chorych), MLA-M4 (13 chorych), MLA-M5 (4

4 802 M. MAŁEK i wsp. chorych). OBL B-komórkową stwierdzono u 14 chorych, natomiast OBL T-komórkową u 2 chorych, rozpoznano równieŝ 1 przypadek białaczki bifenotypowej B i T komórkowej. Chorzy pozostawali pod obserwacją kliniczną przez okres od 1 do 3,5 roku od momentu rozpoznania choroby. Charakterystykę kliniczną badanych grup chorych przedstawia Tabela 1. Tabela 1. Charakterystyka kliniczna chorych na OBS i OBL Table1. Clinical characteristics of AML and ALL patients Badany parametr Chorzy na OBS Chorzy na OBL (n=28) (n=17) Średnia (± SD) Mediana (zakres) Średnia (± SD) Mediana (zakres) Wiek 52 (±15) 58 (22 70) 33 (±15) 26 (17 60) Leukocyty (G/l) 21,8 (±29,6) 13,7 (1,2 126,0) 68,7 (±81,7) 32,0 (2,0 329,0) Blasty szpiku (%) 68,0 (±21,2) 66,5 (21,0 100) 87,1 (±10,7) 89,0 (67,0 100) DFS (mies.) 9,8 (±12,3) 3,0 (0 36) 8,9 (±9,7) 5,0 (0 31) OS (mies.) 12,7 (±13,4) 6,5 (0 40) 14,8 (±10,1) 12,0 (1 32) CR po leczeniu pierwszoliniowym (% chorych) 46,4 88,2 Materiałem badań był szpik pobrany w czasie diagnozowania choroby, przed leczeniem. W cytometrze przepływowym (Cytoron Absolute firmy Ortho Diagnostic Systems, przy uŝyciu programów: IMMUNOCOUNT II i WinMDI) oceniano ekspresję następujących molekuł adhezyjnych: selektyny L (CD62L), β1-integryn: VLA-2 (CD49b/29), VLA-4 (CD49d/29), VLA-5 (CD49e/29), VLA-6 (CD49f /29), β2- integryn: LFA-1 (CD11a/18), Mac-1 (CD11b/18), CD11c/18, nadrodziny immunoglobulin:vcam-1 (CD106), ICAM-1 (CD54), PECAM ( CD31) i NCAM (CD56) oraz cząsteczek CD44 i CD34, a takŝe ekspresję białka P-gp oporności wielolekowej. Próbki świeŝo pobranego, pełnego szpiku przygotowywano do analizy w cytometrze przepływowym wg. opisanej w literaturze, standardowo stosowanej metody inkubacji z przeciwciałami monoklonalnymi (18). W wyodrębnionej, na podstawie analizy komórek w prezentacji FW-SC (forward scatter) vs RT-SC (right scatter) oraz CD45 vs RT-SC, bramce komórek blastycznych oceniano koekspresję antygenów adhezyjnych z markerem, który wykazywał największą ekspresję w danym przypadku białaczki tj. np.cd33 w przypadku OBS oraz np. CD19 w przypadku OBL. Za dodatnią ekspresję przyjęto obecność badanego antygenu na >30% komórek, z wyjątkiem białka P- gp, którego obecność na >10% komórek, według danych z literatury [7], uznawano za dodatnią ekspresję. Analizę statystyczną przeprowadzono przy uŝyciu testu korelacji Spearmana oraz testu U Manna-Whitney`a dla zmiennych niezaleŝnych.

5 Ekspresja molekuł adhezyjnych 803 WYNIKI Ostra białaczka szpikowa (OBS) W OBS ekspresja MDR-1 wynosiła średnio 19,14% (mediana 12,4%) i wahała się od 1,3 do 65,4%. Dodatnią ekspresję MDR-1 stwierdzono u 54,16% chorych. Porównano ekspresję MDR-1 w grupach chorych na OBS z obecnością lub brakiem badanych cząsteczek adhezyjnych na blastach. Stwierdzono, Ŝe chorzy o fenotypie CD106(+) mają istotnie większą ekspresję MDR-1 (mediana 31,5%), w porównaniu do chorych o fenotypie CD106( ) (mediana 9,1%) (p=0,04). Co więcej, wszyscy chorzy o fenotypie CD106(+) mieli dodatnią ekspresję MDR-1, czemu towarzyszył brak odpowiedzi na leczenie indukujące. Podobne róŝnice (jednak bez istotności statystycznej), dotyczące ekspresji MDR-1 i efektów leczenia zanotowano takŝe pomiędzy grupami chorych o fenotypie CD11b(+) i CD11b( ) (Tabela 2). W grupach chorych z obecnością lub brakiem pozostałych badanych cząsteczek adhezyjnych na blastach, ekspresja MDR-1 była zbliŝona. Tabela 2. Ekspresja MDR-1 i efekty leczenia chorych na OBS, zaleŝnie od obecności wybranych cząsteczek adhezyjnych na blastach Table 2. MDR-1 expression and therapy results in AML patients according to the presence of selected adhesion molecules on blast cells Cząsteczka adhezyjna MDR-1* (%) mediana (zakres) CD11b 9,5 (1,3 32,7) CD106 9,1 (1,3 64,0) Chorzy z brakiem ( ) cząsteczki adhezyjnej na blastach % DFS** (mies.) CR mediana (zakres) 75 11,5 (0 36) 52 3,0 (0 36) Chorzy z obecną (+) cząsteczką adhezyjną na blastach MDR-1* (%) mediana (zakres) 20,4 (1,8 65,4) 31,5 (11,6 47,9) * róŝnica pomiędzy ekspresją MDR-1 dla CD106 (p=0,04), dla CD11b (p > 0,05) ** róŝnica pomiędzy DFS dla CD106 i CD11b - bez istotności statystycznej % DFS** (mies.) CR mediana (zakres) 25 0 (0 33) 0 0 (0 18) Analizowano równieŝ dwie grupy chorych na OBS o fenotypie: MDR-1(+) (n=13) i MDR-1( ) (n=11), pod kątem róŝnic w ekspresji molekuł adhezyjnych. Wykazano, Ŝe grupa chorych MDR-1(+) charakteryzowała się istotnie większym odsetkiem blastów CD18+ (mediana 74,34% vs 55,03%, zakres 23,21 100% vs 7,73 95,52%) (p=0,04) oraz blastów CD11b+ (mediana 44,25% vs 39,41%, zakres 13,31 99,9% vs 2,61-71,13% (p=0,03), a takŝe wyraŝnie większym (róŝnica zbliŝona do istotności) odsetkiem blastów CD11a+ (mediana 78,32% vs 42,59%, zakres 6,4 100% vs 8,69 96,78%) (p=0,07), w stosunku do grupy chorych z ujemną ekspresją MDR-1 (Rycina 1). W grupach chorych MDR(+) i MDR( ) nie zanotowano róŝnic w ekspresji pozostałych badanych antygenów adhezyjnych.

6 804 M. MAŁEK i wsp. EKSPRESJA CZĄSTECZKI ADHEZYJNEJ (%) ADHESION MOLECULE EXPRESSION (%) Min.-max. CD11a mediana, median CD11b mediana, median CD18 mediana, median CHORZY MDR(-) MDR(-) PATIENTS CHORZY MDR(+) MDR(+) PATIENTS Ryc.1. Ekspresja wybranych cząsteczek adhezyjnych w OBS u chorych o fenotypie MDR( ) i MDR(+) Fig. 1. Expression of selected adhesion molecules in MDR( ) and MDR(+) AML patients Chorych na OBS podzielono równieŝ na grupy: z remisją całkowitą CR(+) (n=13) i bez remisji całkowitej CR( ) (n=15) po leczeniu indukującym, u których porównywano ekspresję cząsteczek adhezyjnych. Zaobserwowano istotne róŝnice w ekspresji dwóch cząsteczek adhezyjnych (Rycina 2). W grupie chorych CR(+) stwierdzono znamiennie niŝszą ekspresję CD11b (mediana 22,1% vs 47,32%, zakres 2,61 76,11% vs 13,5 99,92%) (p=0,01) oraz niŝszą ekspresję CD106 (mediana 4,09% vs 21,19%, zakres 1,33 25,68% vs 0,58 53,72%), w porównaniu do grupy chorych CR( ). Ekspresja CD11b istotnie (p=0,03) ujemnie korelowała z czasem trwania remisji w teście Spearmana. Ostra białaczka limfoblastyczna (OBL) W OBL ekspresja MDR-1 była znacznie mniejsza niŝ w OBS i wynosiła średnio 7,0% (mediana 3,4%), z zakresem wartości od 0,5 do 30,9%. Dodatnią ekspresję MDR-1 stwierdzono zaledwie u 20% chorych. W OBL ekspresja MDR-1 wykazywała istotną statystycznie dodatnią korelację tylko z jedną cząsteczką adhezyjną tj. CD62L (p=0,02). Oceniając ekspresję MDR-1 u chorych na OBL, zaleŝnie od obecności lub braku poszczególnych cząsteczek adhezyjnych na blastach, nie zanotowano istotnych róŝnic. Stwierdzono natomiast znacznie wyŝszy odsetek CR u chorych o fenotypie CD62L( ) (91% CR) oraz chorych o fenotypie CD11b( ) (92% CR), w porównaniu do pacjentów CD62L(+) (75% CR) lub CD11b(+) (50% CR).

7 Ekspresja molekuł adhezyjnych 805 EKSPRESJA CZĄSTECZKI ADHEZYJNEJ (%) ADHESION MOLECULE EXPRESSION (%) Min.-max. CD11b mediana, median CD106 mediana, median CHORZY BEZ REMISJI NON-RESPONDERS CHORZY Z REMISJĄ RESPONDERS Ryc. 2. Ekspresja wybranych cząsteczek adhezyjnych u chorych na OBS zaleŝnie od odpowiedzi na chemioterapię Fig. 2. Expression of selected adhesion molecules in AML patients according to chemotherapy response EKSPRESJA CD62L (%) CD62L EXPRESSION (%) Min.-Maks. 25% - 75% Mediana, median CHORZY MDR(-) MDR(-) PATIENTS CHORZY MDR(+) MDR(+) PATIENTS Ryc. 3. Ekspresja CD62L w OBL u chorych o fenotypie MDR( ) i MDR(+) Fig. 3. Expression of CD62L in MDR( ) and MDR(+) ALL patients

8 806 M. MAŁEK i wsp. Porównywano takŝe ekspresję badanych antygenów adhezyjnych w grupach chorych na OBL o fenotypie MDR-1(+) (n=3) i MDR-1( ) (n=12). U chorych MDR-1(+) wykazano istotnie (p=0,03) większą ekspresję CD62L (mediana 50,98%, zakres 24,81 59,69%) w porównaniu do chorych MDR( ) (mediana 11,71%, zakres 1,94 47,93%) (Rycina 3). Wynik ten jest zgodny ze stwierdzoną wcześniej w teście Spearmana dodatnią korelacją między MDR-1 i CD62L. Ekspresja innych cząsteczek adhezyjnych, w tym β2-integryn nie wykazywała istotnych róŝnic pomiędzy grupami chorych MDR-1(+) i MDR-1( ). W grupie chorych na OBL z obecnością CR wykazano istotnie (p=0,04) niŝszą ekspresję jednej molekuły adhezyjnej tj. CD11b (mediana 5,51%, zakres 3,0 50,98%), w porównaniu do chorych, którzy nie osiągnęli CR (mediana 25,55%, zakres 11,83 39,27%) (Rycina 4). 50 EKSPRESJA CD11B (%) CD11b EXPRESSION (%) Min.-Maks. 25% - 75% Mediana, median CHORZY BEZ REMISJI NON-RESPONDERS CHORZY Z REMISJĄ RESPONDERS Ryc. 4. Ekspresja CD11b u chorych na OBL zaleŝnie od odpowiedzi na chemioterapię Fig. 4. Expression of CD11b in ALL patients according to chemotherapy response OMÓWIENIE WYNIKÓW Oporność wielolekowa związana z ekspresją białka P-gp (MDR-1) oraz oporność za pośrednictwem molekuł adhezyjnych (CAM-DR), związana z ekspresją integryn oparte są na dwu róŝnych mechanizmach. RóŜni autorzy [10, 14] sugerują, Ŝe w białaczkach CAM-DR moŝe ułatwiać pojawienie się innych form oporności wielolekowej, m.in. indukować glikoproteinę P. W większości badań dowiedziono, Ŝe wysoka ekspresja białka P-gp na blastach ma niekorzystne znaczenie prognostyczne w ostrych białaczkach [4, 6]. Niewiele publikacji dotyczy wzajemnej zaleŝności między ekspre-

9 Ekspresja molekuł adhezyjnych 807 sją MDR-1 i cząsteczek adhezyjnych oraz wynikających z tego implikacji klinicznych, co było tematem naszych badań. W OBS stwierdziliśmy dodatnią ekspresję P-gp u 54,16% chorych, co jest wartością nieco wyŝszą niŝ dane z literatury, gdzie opisuje się ok % przypadków OBS P-gp(+) [3, 19]. Być moŝe wynika to z duŝego udziału chorych >60rŜ. w badanej grupie. Średnia ekspresja P-gp na blastach OBS wynosiła 19,1%, podobnie jak w piśmiennictwie 20 40% [4]. W OBS, na podstawie przeprowadzonych badań, wykazaliśmy, Ŝe obecność P-gp na blastach istotnie koreluje z większą ekspresją β2-integryny Mac-1 (CD11b/18), podobną tendencję stwierdzono takŝe w przypadku innej β2-integryny LFA- 1(CD11a/18). Chorzy na OBS z dodatnią ekspresją CD11b mieli istotnie gorsze efekty leczenia i przebieg kliniczny choroby. Uzyskane wyniki przemawiają za tym, Ŝe w OBS CD11b odgrywa rolę niekorzystną prognostycznie, zaś przyczyną stwierdzonej w badaniach własnych oporności na leczenie indukujące u chorych CD11b(+), moŝe być współdziałanie dwóch mechanizmów: MDR i CAM-DR, związanej z β2-integrynami. W OBS β2-integryny wspólnie z β1-integrynami pośredniczą zarówno w adhezji komórek białaczkowych do podścieliska szpiku, jak równieŝ w ich migracji. Antygen CD11b, naleŝący do β2-integryn, uznawany jest w literaturze [20, 21] za niezaleŝny czynnik złego rokowania w OBS, poniewaŝ jego wysoka ekspresja CD11b jest istotnie związana z niekorzystnymi zmianami genetycznymi oraz niskim odsetkiem CR, krótkim czasem trwania CR i krótkim OS, co jest zgodne z naszymi obserwacjami. Paietta i wsp. [20] proponują nawet wyodrębnienie OBS z dodatnią (>32%) ekspresją CD11b jako oddzielnej jednostki chorobowej o złym rokowaniu, niezaleŝnie od obecności innych czynników ryzyka, takich jak P-gp czy zmiany genetyczne. Autorzy ci uwaŝają, Ŝe unikalność tej białaczki polega na jednoczesnej obecności cech morfologicznej niedojrzałości komórek blastycznych oraz ekspresji antygenu CD11b, charakteryzującego w warunkach prawidłowych dojrzałe monocyty i granulocyty. Do ciekawych wniosków w OBL u dzieci doszli Rhein i wsp. [22], którzy stwierdzili, Ŝe wysoka ekspresja CD11b cechuje blasty o większej dojrzałości i mniejszej aktywności proliferacyjnej oporne na chemioterapię, dlatego moŝe ona być markerem choroby resztkowej. Obserwacja ta moŝe stanowić pośrednie wyjaśnienie stwierdzonej przez nas ujemnej korelacji między ekspresją CD11b i czasem trwania remisji w OBS. W literaturze znaleziono jedyną publikację dotyczącą relacji między cząsteczką Mac-1 i MDR [23], w której dowiedziono, Ŝe niekorzystny wpływ ekspresji CD11b na przebieg kliniczny OBS wynika z istotnego związku tego antygenu z obecnością białka P-gp oporności wielolekowej, co równieŝ wykazano w naszych badaniach. W OBS zaobserwowano takŝe istotną zaleŝność między obecnością innej cząsteczki adhezyjnej tj. VCAM na blastach a wyŝszą ekspresją MDR-1, co łączyło się z brakiem odpowiedzi na leczenie i niekorzystnym przebiegiem klinicznym choroby u chorych z dodatnią ekspresją CD106. W literaturze większość badań dotyczących VCAM w ostrych białaczkach koncentruje się na roli, jaką cząsteczka ta pełni na komórkach podścieliska szpiku jako ligand dla β1-integryny VLA-4 obecnej na blastach, dowodząc znaczenia interakcji VLA-4/VCAM zarówno w procesie adhezji jak i migracji

10 808 M. MAŁEK i wsp. komórek białaczkowych. W pojedynczych doniesieniach wykazano, Ŝe ekspresja VCAM na blastach jest markerem infiltracji białaczkowej [24]. Nie znaleziono natomiast informacji na temat związku ekspresji VCAM-1 na blastach z ekspresją MDR-1 oraz przebiegiem klinicznym OBS. W zespołach mielodysplastycznych (MDS) stwierdzono, Ŝe wzrost stęŝenia rozpuszczalnej formy VCAM (svcam) we krwi wiąŝe się ze złym rokowaniem [25], co odpowiada naszym obserwacjom dotyczącym ekspresji VCAM na blastach OBS. Pewnym pośrednim wyjaśnieniem uzyskanych wyników własnych mogą być takŝe badania in vitro Mudry`ego i wsp. w OBL [11], które dowiodły, Ŝe interakcja komórek blastycznych VLA-4(+) z cząsteczką VCAM, obecną na komórkach podścieliska szpiku, pełni rolę protekcyjną podczas ekspozycji komórek białaczkowych na cytostatyki. Biorąc pod uwagę, opisywany w piśmiennictwie, mechanizm dwukierunkowego przekazywania sygnałów między komórkami blastycznymi i komórkami podścieliska szpiku [26], moŝna przypuszczać, Ŝe w OBS efekt indukowania oporności na chemioterapię wywiera takŝe interakcja VCAM obecnego na blastach z VLA-4 na komórkach podścieliska szpiku. W OBL w badanej przez nas grupie chorych dodatnią ekspresję P-gp stwierdzono u 20% chorych, co mieści się w granicach podanych w literaturze tj. 4 60% przypadków OBL P-gp(+) [6, 7], przy czym duŝa rozbieŝność danych moŝe wynikać z róŝnych metod uŝytych do badania ekspresji MDR. W OBL wykazano istotną dodatnią korelację między ekspresją P-gp, a ekspresją selektyny L (CD62L), przy czym w grupie chorych CD62L+ odsetek CR był niŝszy w porównaniu do chorych CD62L( ). Selektyna L bierze udział w dystrybucji komórek progenitorowych ich migracji do krwi i zasiedlaniu szpiku. UwaŜa się, Ŝe obniŝenie jej ekspresji na tych komórkach sprzyja ich mobilizacji, zaś związanie selektyny L z jej ligandem stymuluje proliferację komórek progenitorowych [27]. W OBS i MDS stwierdzono obniŝenie ekspresji selektyny L na blastach, zaś wzrost stęŝenia jej postaci,,złuszczonej (scd62l) we krwi, w porównaniu do osób zdrowych [28, 29]. W literaturze nie znaleziono publikacji dotyczących związku ekspresji CD62L z białkiem P-gp w ostrych białaczkach, natomiast dane dotyczące prognostycznego znaczenia selektyny L są kontrowersyjne. W przypadku selektyny L obecnej na blastach OBL, Mengarelli i wsp. [30] nie stwierdzili związku jej ekspresji z przebiegiem klinicznym choroby, natomiast w OBS Graf i wsp. [27] zanotowali wysoką ekspresję CD62L u chorych z korzystnym rokowniczo kariotypem, co łączyło się z wyŝszym odsetkiem CR i dłuŝszym DFS. Extermann i wsp. [31] wykazali, Ŝe wysoki poziom rozpuszczalnej formy selektyny L (scd62l) jest negatywnym czynnikiem rokowniczym w OBS, związanym z krótszym EFS (event free survival) oraz OS. Autorzy ci sugerują, Ŝe scd62l moŝe wpływać na proces apoptozy oraz interakcji blastów z komórkami cytotoksycznymi powodując bardziej agresywny przebieg OBS. W innym badaniu [29] natomiast nie stwierdzono związku stęŝenia scd62l z uzyskaniem CR w OBS i OBL. Uzyskane przez nas wyniki przemawiające za niekorzystnym prognostycznie wpływem powierzchniowej ekspresji selektyny L w OBL, co nie znalazło odzwierciedlenia w literaturze, wymagają zatem potwierdzenia na większej grupie chorych.

11 Ekspresja molekuł adhezyjnych 809 W dostępnej literaturze, w jedynej publikacji dotyczącej relacji molekuł adhezyjnych z MDR-1 w OBL (32), zanotowano jedynie dodatnią korelację między ekspresją łańcucha β2-integryn (CD18) a białka P-gp, czego nie obserwowaliśmy w naszych badaniach. Na podstawie naszych badań wykazaliśmy, Ŝe w OBS obecność β2-integryny CD11b/18 lub VCAM (CD106) na blastach, zaś w OBL obecność selektyny L (CD62L) na blastach ma istotny związek z ekspresją białka P-gp oporności wielolekowej (MDR), przy czym jednocześnie łączy się ze znacznie gorszą odpowiedzią na leczenie. Wydaje się zatem, Ŝe cząsteczki CD11b/18 i CD106 w OBS, zaś CD62L w OBL mogą odgrywać rolę czynników niekorzystnych prognostycznie. Zarówno w OBS jak i w OBL brak odpowiedzi na chemioterapię indukującą wiązała się istotnie z wyŝszą ekspresją β2-integryny CD11b na blastach. Z kolei jedynie w OBS (nie w OB- L) wykazano korelację między ekspresją MDR-1 i CD11b, co moŝe sugerować, Ŝe oporność na leczenie w OBS wynika ze współdziałania mechanizmu MDR i CAM- DR, związanego z β2-integrynami, zaś w OBL mechanizm CAM-DR pozostaje być moŝe niezaleŝny. PowyŜsze wnioski wymagają potwierdzenia na większych grupach chorych. PIŚMIENNICTWO 1. Bradstock K, Gottlieb DJ. Interaction of acute leukemia cells with bone marrow microenvironment: implications for control of minimal residual disease. Leuk Lymphoma. 1995; 18(1-2): Ross DD. Novel mechanisms of drug resistance in leukemia. Leukemia. 2000; 14: Michieli M, Damiani D, Ermacora A. i wsp. P-glycoprotein, lung resistance-related protein and multidrug resistance associated protein in de novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implications. Br J Haematol. 1999; 104(2): Motoji T, Motomura S, Wang YH. Multidrug resistance of acute leukemia and strategy to overcome it. Int J Hematol. 2000; 72(4): Damiani D, Tribelli M, Raspadori D. i wsp. The role of MDR-related proteins in the prognosis of adult acute myeloid leukaemia (AML) with normal karyotype. Hematol. Oncol. 2007; 25(1): Tafuri A, Gregorj C, Petrucci MT, i wsp. GIMEMA Group: MDR1 protein expression is an independent predictor of complete remission in newly diagnosed adult acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2002; 100(3): Wattel E, Lepelley P, Merlat A. i wsp. Expression of the multidrug resistance P glycoprotein in newly diagnosed adult acute lymphoblastic leukemia: absence of correlation with response to treatment. Leukemia. 1995; 9: Plasschaert SL, Vellenga E, de Bont ES. i wsp. High functional P-glycoprotein activity is more often present in T-cell acute lymphoblastic leukaemic cells in adults than in children. Leuk. Lymphoma. 2003; 44(1): Hazlehurst LA, Damiano JS, Buyuksal I, Pledger WJ, Dalton WS. Adhesion to fibronectin via β1 integrins regulates p27 kip1 levels and contributes to cell adhesion mediated drug resistance (CAM- DR). Oncogene. 2000; 19: Garrido S, Appelbaum F, Willman C, Banker D. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug-induced apoptosis by direct contact with human bone marow stromal cell line (HS-5). Exp Hematol. 2001; 29:

12 810 M. MAŁEK i wsp. 11. Mudry R, Fortney J, York T, Hall B, Gibson L. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood. 2000; 96(5): Damiano JS. Integrins as novel drug targets for overcoming innate drug resistance. Curr Cancer Drug Targets. 2002; 2(1): Wang X, Wang C, Qin YW, Yan SK, Gao YR. The association of up-regulation of X-linked inhibitor of apoptosis protein with cell adhesion-mediated drug resistance in U937 cells. Hematol. Oncol. 2008; 26(1): Yanamandra N, Colaco NM, Parquet NA. i wsp. Tipifarnib and bortezomib are synergistic and overcome cell adhesion-mediated drug resistance in multiple myeloma and acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res. 2006; 12(2): Damiano J, Cress A, Hazlehurst L, Shtil A, Dalton W. Cell adhesion mediated drug resistance (CAM- DR): role of integrins and resistance to apoptosis in human myeloma cell lines. Blood. 1999; 93(5): Hazlehurst LA, Argilagos RF, Dalton WS. Beta1 integrin mediated adhesion increases Bim protein degradation and contributes to drug resistance in leukaemia cells. Br J Haematol. 2007; 136(2): Wu RC, Wang Z, Liu MJ, Chen DF, Yue XS. Beta2-integrins mediate a novel form of chemoresistance in cycloheximide-induced U937 apoptosis. Cell Mol Life Sci. 2004; 61(16): Schwonzen M, Diehl V, Dellanna M, Staib P. Immunophenotyping of surface antigens in acute myeloid leukemia by flow cytometry after red blood cell lysis. Leuk Res. 2007; 31(1): Seedhouse CH, Grundy M, White P. i wsp. Sequential influences of leukemia-specific and genetic factors on p-glycoprotein expression in blasts from 817 patients entered into the National Cancer Research Network acute myeloid leukemia 14 and 15 trials. Clin Cancer Res. 2007; 13(23): Paietta E, Andersen J, Yunis J. i wsp. Acute myeloid leukemia expressing the leucocyte integrin CD11b - a new leukaemic syndrome with poor prognosis: result of an ECOG database analysis. Eastern Cooperative Oncology Group. Br J Haematol. 1998; 100(2): Graf M, Reif S, Kröll T, Hecht K, Nuessler V, Schmetzer H. Expression of MAC-1 (CD11b) in acute myeloid leukemia (AML) is associated with an unfavourable prognosis. Am J Hematol. 2006; 81(4): Rhein P, Scheid S, Ratei R. i wsp. Gene expression shift towards normal B cells, decreased proliferative capacity and distinct surface receptors characterize leukemic blasts persisting during induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2007; 21(5): Del Poeta G, Venditti A, Stasi R. i wsp. P-glycoprotein and terminal transferase expression identify prognostic subsets within cytogenetic risk classes in acute myeloid leukemia. Leuk Res. 1999; 23(5): Han K, Kahng J, Kim M. i wsp. Expression of functional markers in acute nonlymphoblastic leukemia. Acta Haematol. 2000; 104(4): Passam FH, Tsirakis G, Boula A. i wsp. Levels of soluble forms of ICAM and VCAM in patients with myelodysplastic syndromes and their prognostic significance. Clin Lab Haematol. 2004; 26(6): Jiang H, Sugimoto K, Sawada H. i wsp. Mutual education between hematopoietic cells and bone marrow stromal cells through direct cell-to-cell contact: factors that determine the growth of bone marrow stroma-dependent leukemic (HB-1) cells. Blood. 1998; 92: Graf M, Reif S, Hecht K. i wsp. Low L-selectin (CD62L) expression in acute myeloid leukemia correlates with bad cytogenetic risk. Eur J Haematol. 2003; 71(5): Buccisano F, Maurillo L, Tamburini A. i wsp. Evaluation of the prognostic relevance of L-selectin and ICAM expression in myelodysplastic syndromes. Eur J Haematol. 2008; 80(2): Kapelko-Słowik K, JaŜwiec B, Mirosław S. i wsp.: Plasma concentration of the shed form of L- selectin (sl-selectin) in patients with acute myeloblastic leukemia (AML) and acute lymphoblastic leukemia (ALL) and its relation to the clinical course. Pol Arch Med Wewn. 2004; 112(5):

13 Ekspresja molekuł adhezyjnych Mengarelli A, Zarcone D, Caruso R. i wsp. Adhesion molecule expression, clinical features and therapy outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 2001; 40(5-6): Extermann M, Bacchi M, Monai N. i wsp. Relationship between cleaved L-selectin levels and the outcome of acute myeloid leukemia. Blood. 1998; 92(9): Oh EJ, Kahng J, Kim Y. i wsp. Expression of functional markers in acute lymphoblastic leukemia. Leuk Res. 2003; 27(10): Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres do korespondencji: Dr n. med. Magdalena Małek Katedra i Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie ul. Staszica Lublin tel. (081)