Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 4, str

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 4, str ANITA ZABOROWSKA 1, BARBARA CEBULA-OBRZUT 2, IDA FRANIAK- PIETRYGA 1,3, JERZY Z. BŁOŃSKI 1, PIOTR SMOLEWSKI 2, TADEUSZ ROBAK 1, ANNA KORYCKA-WOŁOWIEC 1 Wpływ bendamustyny zastosowanej pojedynczo lub w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych na przeŝywalność oraz apoptozę komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro The influence of bendamustine used either alone or in combination with purine nucleoside analogues on the viability and apoptosis of chronic lymphocytic leukemia cells in culture in vitro 1 Z Kliniki Hematologii Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. Tadeusz Robak 2 Z Zakładu Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. Piotr Smolewski 3 Z Zakładu Biochemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Kierownik: Prof. dr hab. Marek Mirowski STRESZCZENIE Bendamustyna () jest lekiem cytotoksycznym łączącym cechy leku alkilującego i antymetabolitu i wykazującym skuteczność terapeutyczną w nieziarniczych chłoniakach złośliwych, w tym takŝe w przewlekłej białaczce limfocytowe (PBL). W mechanizmie jej działania istotną rolę odgrywa zarówno indukcja apoptozy, jak równieŝ katastrofa mitotyczna prowadząca do śmierci komórki na drodze martwicy. Celem naszych badań była ocena wpływu zastosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych (ANP: 2-CdA i FA) na apoptozę i przeŝywalność komórek PBL w hodowli in vitro oraz ocena typu interakcji zachodzących pomiędzy badanymi lekami. Wykazaliśmy, Ŝe zastosowana pojedynczo w stęŝeniu 20 i 40 µg/ml najsilniej indukuje apoptozę komórek PBL. Ponadto, łączne zastosowanie z ANP znamiennie silniej hamuje przeŝycie komórek niŝ leki zastosowane pojedynczo. Synergistyczny/ addycyjny efekt działania zastosowanej łącznie z ANP sugeruje celowość podjęcia dalszych badań nad jej skojarzeniem z innymi lekami cytotoksycznymi, zwłaszcza z przeciwciałami monoklonalnymi. SŁOWA KLUCZOWE: Bendamustyna 2-chlorodeoksyadenozyna Fludarabina Przewlekła białaczka limfocytowa Apoptoza Interakcje SUMMARY Bendamustine () is a cytotoxic drug combining alkylating and antimetabolite properties and showing therapeutical activity in non-hodgkin s lymphomas including chronic lymphocytic leukemia (CLL). In the mechanism of its action the important role is played either by apoptosis or mitotic catastrophe which leads to necrotic cell death. The aim of our studies was to evaluate

2 888 A. ZABOROWSKA i wsp. the influence of used alone or in combination with purine nucleoside anlogues (PNA: 2- CdA and FA) on apoptosis and viability of CLL cells in culture in vitro as well as the estimation the type of interaction between the studied drugs. We have demonstrated that at the concentrations of 20 and 40 µg/ml induces apoptosis of CLL cells in the higher degree. Additionally, used jointly with PNA more strongly inhibited the viability of cells then the drugs used alone. Synergistic/additive effect of used together with PNA suggests that the further studies concerning the combined treatment of with other cytotoxic drugs especially with monoclonal antibodies are worth. KEY WORDS: Bendamustine 2-chlorodeoxyadenosine Fludarabine Chronic lymphocytic leukemia Apoptosis Interactions WSTĘP Od dawna prowadzone są intensywne badania mające na celu poszukiwanie nowych leków skutecznych w leczeniu chorób nowotworowych układu krwiotwórczego. Przez wiele lat leczenie przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL) opierało się na stosowaniu leków alkilujących takich jak iperyt azotowy, cyklofosfamid czy chlorambucyl (Chl) [1, 2]. W latach 80. ubiegłego wieku zsyntetyzowano pierwsze związki nale- Ŝące do grupy tzw. analogów nukleozydów purynowych (ANP). Dwa z nich: kladrybina (2-chlorodeoksyadenozyna; 2-CdA) oraz fludarabina (FA) są rutynowo stosowane w terapii PBL, białaczki włochatokomórkowej oraz nieziarniczych chłoniaków zlośliwych (ChNZ) [3, 4]. Leki te zastosowane in vitro zarówno pojedynczo, jak i w skojarzeniu z innymi lekami przeciwbiałaczkowymi są równieŝ od wielu lat badane w Klinice Hematologii w Łodzi pod kątem ich wpływu na ukierunkowane komórki prekursorowe układu granulocytaro-makrofagowego, jak równieŝ na limfocyty B uzyskane od chorych na PBL [5, 6]. Obecnie coraz więcej uwagi poświęca się bendamustynie () lekowi zsyntetyzowanemu w latach 60. ubiegłego wieku w ówczesnej Niemieckiej Republice Demokratycznej i przez wiele lat niedocenianemu [7, 8]. Cytotoksyczną aktywność zawdzięcza unikalnej strukturze chemicznej, łączącej cechy leku alkilującego i antymetabolitu. W budowie chemicznej leku wyróŝnia się bowiem alkaliczną grupę bis(2-chloroetylo)aminową, pierścień benzoimidazolowy oraz łańcuch kwasu masłowego [9 11]. Współczesne badania in vitro, badania przedkliniczne i kliniczne dotyczące mechanizmu działania, farmakokinetyki, profilu bezpieczeństwa oraz wskazań do klinicznego zastosowania wskazują, Ŝe wykazuje skuteczność terapeutyczną w chorobach limfoproliferacyjnych, a takŝe w pierwotnych i nawrotowych guzach litych [12 15]. W roku 2008 lek został zaakceptowany przez Food and Drug Administration (FDA) do pierwszej linii leczenia chorych na PBL oraz chorych na indolentne ChNZ, oporne na wcześniejsze leczenie schematem zawierającym rituksymab (RIT) [12]. nie wykazuje oporności krzyŝowej z innymi lekami cytotoksycznymi i moŝe być stosowana u chorych na indolentne ChNZ, u których wystąpiła oporność na standardowe leczenie preparatami alkilującymi, takimi jak cyklofosfamid, doksorubicyna, czy etopozyd [16]. Ponadto wykazano, Ŝe ze względu na unikalny mechanizm działa-

3 Wpływ bendamustyny 889 nia lek zachowuje aktywność terapeutyczną u chorych na PBL, u których wykryto delecję chromosomu 17p i/lub inaktywację genu p53 [17]. Dotychczas opublikowane badania kliniczne wskazują, iŝ większą skuteczność zwiększa się po jej zastosowaniu w połączeniu z innymi cytostatykami. Szczególnie podkreśla się skuteczność skojarzonego stosowania z RIT lub RIT i mitoksantronem (MIT) [18, 19]. Ponadto, w badaniach przeprowadzonych in vitro wykazano synergizm działania z FA lub gemcytabiną [13, 17]. Nie opublikowano jednak dotąd badań dotyczących interakcji z innymi ANP, w szczególności z 2-CdA. Celem naszych badań była ocena wpływu zastosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z 2-CdA lub FA na apoptozę oraz przeŝywalność limfocytów białaczkowych uzyskiwanych od chorych na PBL w hodowli in vitro. Dokonaliśmy równieŝ oceny typu interakcji zachodzących pomiędzy badanymi lekami. MATERIAŁY I METODY Charakterystyka chorych Materiał do badań stanowiła krew obwodowa uzyskana od 30 uprzednio nie leczonych chorych na PBL (16 K i 14 M ), w wieku lat (średnia 66,2; mediana 63,5), będących pod opieką Poradni Hematologicznej i Kliniki Hematologii UM w Łodzi w roku Badanie uzyskało akceptację Komisji Bioetycznej przy UM w Łodzi, a wszyscy chorzy wyrazili zgodę na udział w badaniu. Badane leki została udostępniona do badań przez firmę Mundipharma (GmbH, Niemcy) w postaci krystalicznego proszku. Po rozpuszczeniu w medium hodowlanym RPMI-1640 lek był przechowywany w temperaturze 20 C w stęŝeniu 400 µg/ml (1mM). Do badań oceniających cytotoksyczność oraz wpływ na apoptozę komórek PBL stosowano następujące stęŝenia leku: 1, 2, 5, 10, 20, 40i 80 µg/ml. Do oceny skojarzonego działania leku z ANP wybrano stęŝenia : 20 i 40 µg/ml. W wyborze stęŝeń wykorzystano wyniki wcześniejszych badań [13]. Kladrybina (2-CdA Biodrybina; Bioton, Polska) oraz (Fludara; Bayer, Niemcy) są lekami dostępnymi komercyjnie. Kladrybina jest dostępna w fiolkach zawierających 1 mg/ml 2-CdA, natomiast Fludara w fiolkach zawierających 50 mg monofosforanu fludarabiny (FAMP), co odpowiada 39,05 mg aktywnej fludarabiny (FA). 2-CdA stosowano w stęŝeniach: 25, 50 i 100 nm, natomiast FA w stęŝeniach 0,8, 1,6 i 3,2 µm. W celu oceny skojarzonego działania leków, 2-CdA stosowano w stęŝeniach 25 i 50 nm, natomiast FA w stęŝeniach 0,8 i 1,6 µm. StęŜenia ANP wybrano na podstawie wcześniejszych badań własnych [6].

4 890 A. ZABOROWSKA i wsp. Izolacja i hodowla komórek jednojądrowych in vitro Komórki jednojądrowe (Mononuclear cells; MNCs) izolowano z heparynizowanej krwi obwodowej poprzez jej nawarstwienie na Histopaque 1077 (Sigma, St Louis, USA) i wirowanie w gradiencie gęstości przez 20 min., z przyspieszeniem 200 g. Uzyskany na granicy faz pierścień MNCs izolowano i płukano dwukrotnie w płynie Hanksa. Następnie uzyskane MNCs zawieszano w podłoŝu hodowlanym RPMI-1640 w stę- Ŝeniu komórek/ml, dodawano 20% inaktywowanej płodowej surowicy cielęcej, antybiotyki (streptomycyna, gentamycyna, Sigma, ST. Louise, USA) oraz badane leki. Hodowle inkubowano przez 24 lub 48 godzin w cieplarce biologicznej z dopływem 5% CO 2, w temperaturze 37 C, w warunkach 98% wilgotności. Hodowle wykonywane bez dodania leków stanowiły kontrolę. W pierwszym etapie badań leki dodawano do hodowli pojedynczo, w stęŝeniach przedstawionych powyŝej, natomiast w drugim etapie stosowano następujące kombinacje ich stęŝeń: 20 µg/ml + 25 nm 2-CdA 20 µg/ml + 0,8 µm FA 40 µg/ml + 50 nm 2-CdA 40 µg/ml + 1,6 µm FA. Ocena apoptozy i cytotoksyczności Przed rozpoczęciem hodowli oraz po 24 i 48 godzinach inkubacji obliczano całkowitą liczbę komórek w hodowli. Po zakończeniu inkubacji, MNCs płukano dwukrotnie w schłodzonym, zbuforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej (PBS), a następnie komórki zawieszano w buforze wiąŝącym zawierającym 5 µl FITC sprzęŝonym z anneksyną-v (AnnV) oraz 10 µg/ml jodku propydyny (JP). Następnie próbki inkubowano przez 15 min., w ciemności, w temp. pokojowej i niezwłocznie oceniano fluorescencję przy uŝyciu cytometru przepływowego (Facs Calibur, Becton Dickinson) przy długości fali FL1 490" ± 20 nm i dla FL3 530" ± 20 nm [20, 21]. W celu obliczenia indeksu apoptotycznego (apoptotic index; AI) oceniano komórki wybarwiające się anneksyną V (AnnV+/JP oraz AnnV+/JP+). Skompensowany indeks apoptotyczny (compensating apoptotic index; CAI) obliczano jako róŝnicę pomiędzy apoptozą indukowana lekami, a apoptozą spontaniczną, obserwowaną w hodowlach kontrolnych. Cytotoksyczność leków oceniano badając Ŝywotność komórek za pomocą barwienia JP. Analiza statystyczna i ocena interakcji Analizę statystyczną wykonano przy uŝyciu programu STATISTICA v 5.0, USA. RóŜnice statystyczne istotne pomiędzy wynikami uzyskanymi w hodowlach, do któ-

5 Wpływ bendamustyny 891 rych dodano leki oraz w hodowlach kontrolnych oceniano stosując test par Wilcoxona i przyjmując za statystycznie istotne p < 0,05. IC 50 definiowano jako stęŝenie powodujące cytotoksyczność 50% komórek. CI (combination index, index interakcji), pozwalający na określenie typu interakcji obliczano wg poniŝszego wzoru: [A] [B] A, B IC 50 leków zastosowanych w skojarzeniu; [A i ] [B i ] A i, B i IC 50 leków zastosowanych pojedynczo CI < 0,8 definiowano jako synergizm, CI w zakresie 0,8 1,2 definiowano jako addycję, natomiast CI > 1,2 definiowano jako subaddycję (antagonizm) [22]. WYNIKI Odsetek komórek ulegających apoptozie indukowanej zastosowaną we wszystkich stęŝeniach powyŝej 1 ug/ml, zarówno po 48, jak i po 24 godz., był znamiennie wyŝszy, niŝ komórek ulegających apoptozie spontanicznej (p<0.01) (Tabela 1). Analizę cytometryczną komórek PBL ulegających apoptozie przedstawiono na Ryc. 1. NajwyŜszą wartość skompensowanego indeksu apoptotycznego (CAI) uzyskano po 48 godz. inkubacji MNCs z zastosowaną w stęŝeniach 20 lub 40 µg/ml. Dla powyŝszych stęŝeń CAI wynosił odpowiednio 10,2% i 10,9% (Tabela 1). Zastosowanie w stęŝeniu 5 µg/ml lub wyŝszym powodowało ponadto znamienne zmniejszenie przeŝycia komórek PBL, w porównaniu z hodowlami kontrolnymi (p<0.01) (Tabela 2). Cytotoksyczny wpływ zarówno, jak i ANP zastosowanych pojedynczo na komórki PBL był znamiennie większy, niŝ obserwowany w hodowlach kontrolnych (p<0.001) (Tabela 3). w stęŝeniu 40 µg/ml, zastosowana łącznie z 2-CdA w stęŝeniu 50 nm lub z FA w stęŝeniu 1,6 µm, silniej hamowała przeŝycie komórek, niŝ badane leki zastosowane pojedynczo (p<0.02) (Tabela 4). IC 50 dla zastosowanej pojedynczo wynosiło 72,4 µg/ml, natomiast dla 2-Cda i FA wynosiło odpowiednio 70,9 nm i 1,3 µm. (Tabela 3). W przypadku leków zastosowanych w skojarzeniu wartość IC 50 wynosiła 23,4 µg/ml i 29,3 nm odpowiednio dla i 2-CdA, natomiast dla i FA odpowiednio 23,8µg/ml i 0,95 µm (Tabela 4). w skojarzeniu z 2-CdA wykazywała działanie synergistycznie (CI=0,73), natomiast z FA działała addycyjne (CI=1,06) (Tabela 4).

6 Tabela 1. Wpływ bendamustyny () na apoptozę komórek PBL w hodowli in vitro Table 1. The influence of bendamustine () on the apoptosis of CLL cells in culture in vitro Lek 1 µg/ml 2 µg/ml 5 µg/ml 10 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml Kontrola 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h n X 13,5 18,9 14,7 18,1 15,1 22,9 17,4 27,6 16,5 28,9 18,1 27,7 21,9 30,5 SD 12,5 13,2 15,7 14,4 13,9 17,2 17,2 18,6 15,9 21,2 17,4 17,2 18,5 19,1 Zakres 1,7 53,4 0,7 50,7 3,9 65,4 4,1 63,5 3,3 59,6 3,2 72,5 5,1 72,2 Mediana 10,2 16,3 10,8 14,6 10,6 20,5 10,8 20,2 11,5 23,6 13,4 26,5 16,7 27,2 CAI (%) 0,6 0 0,4% 4,2% 0,6% 3,9% 1,3% 7,3% 3,2% 10,2% 6,5% 10,9% 3,9 65,7 3,8 66,4 2,3 77,2 4,1 66,6 2,4 60,7 4,9 73,7 2,6 66,3 Analiza statystyczna P 1v5=0,003; 1v7=0,001; 1v9=0,001; 1v11=0,003; 1v13=0,0006; 2v6=0,01 2v8=0,003; 2v10=0,002; 2v12=0,001, 2v14=0,006 n liczba próbek, X średni procent komórek ulegających apoptozie (Ann-V + ), SD odchylenie standardowe, CAI skompensowany indeks apoptotyczny, P analiza statystyczna Tabela 2. Wpływ bendamustyny () na przeŝywalność komórek PBL w hodowli in vitro Table 2. The influence of bendamustine () on the viability of CLL cells in culture in vitro Lek 1 µg/ml 2 µg/ml 5 µg/ml 10 µg/ml 20 µg/ml 40 µg/ml Kontrola 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h 48h n X 16,2 32,4 17,4 32,3 21,7 36,4 24,1 36,1 22,4 37,4 17,4 38,0 19,8 42,9 50,4 SD 7,4 13,9 9,1 16,4 15,2 19,9 18,4 18,4 17,2 18,8 3,6 11,7 7,6 15,6 16,1 Zakres 6,0 34,9 11,5 64,8 8,5 36,7 18,1 63,5 9,3 59,6 17,4 72,5 10,1 72,2 Mediana 15,3 31,9 14,9 25,4 16,7 24,6 18,5 27,3 16,3 28,9 19,1 37,2 19,3 44,9 51,2 20, ,6 66, ,9 13,2 19,8 17,5 54,6 10,3 31,5 15,6 71,2 80 µg/ml 21,9 77,4 Analiza statystyczna P 2v8=0,01; 2v10=0,004; 2v12=-,004; 2v14=0,0001; 2v15=0,0009; 2v16=0,0006 N liczba próbek; średni odsetek komórek JP + ; SD odchylenie standardowe; mediana- mediana komórek JP + ; IC50 stęŝenie, które powoduje toksyczność 50% komórek; 2-CdA 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); bendamustyna, P analiza statystyczna

7 Tabela 3. Cytotoksyczny wpływ bendamustyny () i analogów nukleozydów purynowych (2-CdA, FA) zastosowanych pojedynczo na komórki przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro, po 48 godzinach inkubacji Table 3. The cytotoxic effect of bendamustine () or purine nucleoside analogues (20CdA, FA) used alone on the CLL cells in culture in vitro after 48 hours incubation Lek Kontrola 2-CdA Fludarabina 20 µg/ml 40 µg/ml 80 µg/ml 25 nm 50 nm 100 nm 0.8 µm 1.6 µm 3.2µM n=52 n=18 n=34 n=20 n=22 n=23 n=16 n=30 n=26 n=21 X 32,4 38, , ,4 57, ,5 53,2 SD 13, ,6 16, ,1 16, , Zakres 11,5 64, , , , , ,9 18,7 75, Mediana 31,9 37,2 44,9 51,2 39,9 40,7 62, ,1 59,7 IC µg/ml 70.9nM 1.3µM Analiza statystyczna P< v3; 1v4; 1v5; 1v6; 1v7; 1v9; 1v10 N liczba próbek; średni odsetek komórek JP + ; SD odchylenie standardowe; mediana- mediana komórek JP + ; IC50 stęŝenie, które powoduje toksyczność 50% komórek; 2-CdA 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); bendamustyna Tabela 4. Cytotoksyczny wpływ bendamustyny zastosowanej w skojarzeniu z analogami nukleozydów purynowych na komórki przewlekłej białaczki limfocytowej w hodowli in vitro, po 48 godzinach inkubacji Table 4. The cytotoxic effect of bendamustine () used in combination with purine nucleoside analogues on CLL cells in culture in vitro, after 48 hours incubation Lek Kontrola 20 µg/ml + 2-CdA 25 nm 40 µg/ml + 2-CdA 50 nm 20 µg/ml + FA 0,8µM 40 µg/ml + FA 1,6 µm Analiza statystyczna P<0, n=52 n=12 n=12 n=10 n=12 X 32,4 45,9 61,3 50,5 62,7 SD 13,8 9,2 13,8 12,6 13,4 zakres 11,5 64,8 31,5 72,8 38,9 89,9 38,1 66,3 47,2 87,3 Median 31,9 48, ,6 60,4 IC50 dla leków zastosowanych pojedynczo 23,4 µg/ml 2-CdA 29,3 nm 23,8 µg/ml FA 0,95 µm CI 0, Typ interakcji Synergizm Addycja 1v3 = 0,02 1v5 = 0,02 N liczba próbek; średni odsetek komórek JP + ; SD odchylenie standardowe; mediana mediana komórek JP + ; IC50 stęŝenie, które powoduje toksyczność 50% komórek; CI indeks kombinacji; 2-CdA 2-chlorodeokyadenozyna (kladrybina); bendamustyna

8 894 A. ZABOROWSKA i wsp. Ryc. 1. Analiza cytometryczna komórek PBL ulegajacych apoptozie Fig. 1. The cytometric analysis of apoptotic CLL cells DYSKUSJA W ostatnim czasie, w badaniach nad optymalizacją leczenia PBL zwrócono uwagę na. Jest to lek o unikalnej strukturze chemicznej i złoŝonym mechanizmie działania, polegającym z jednej strony na aktywacji apoptozy w następstwie uruchomienia szlaku odpowiedzi na stres wywołany uszkodzeniem DNA, z drugiej natomiast związanym ze zniesieniem mitotycznych punktów kontrolnych i w wyniku katastrofy mitotycznej prowadzącym do martwicy (nekrozy) [11]. Opublikowane wyniki badań I i II fazy z zastosowaniem tak w monoterapii, jak i w skojarzeniu z mitoksantronem oraz rituksymabem, wykazały jego względnie dobrą tolerancję oraz wysoką skuteczność zarówno w leczeniu I linii, jak i w przypadkach opornych i nawrotowych [15,23 25]. Bardzo interesująca z punktu widzenia klinicznego jest obserwacja, iŝ aktywność w warunkach in vitro nie zaleŝy od stanu zmutowania genu p53 [17]. Unikalność mechanizmu działania w stosunku do innych leków stosowanych w PBL nasuwa pytanie o moŝliwości kojarzenia jej nie tylko z lekami alkilującymi i przeciwciałami monoklonalnymi, ale takŝe z ANP.

9 Wpływ bendamustyny 895 Nieliczne opublikowane wyniki badań in vitro wykazały synergizm pomiędzy i FA, natomiast interakcje pomiędzy omawianym lekiem, a 2-CdA nie były jak dotychczas przedmiotem doniesień [13, 17]. Dlatego teŝ celem przedstawionych wyŝej badań była ocena wpływu stosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu z FA i 2-CdA na Ŝywotność i apoptozę limfocytów PBL w krótkoterminowej (24 i 48 godzin) hodowli in vitro. Odsetek komórek ulegających apoptozie oceniano uwidoczniając zjawisko eksternalizacji fosfatydyloseryny za pomocą anneksyny V, natomiast komórki obumarłe wykrywano poprzez inkorporację jodku propidyny. Zgodnie z oczekiwaniami, odsetek komórek zarówno ulegających apoptozie, jak i martwiczych był wyŝszy w hodowlach zawierających w stosunku do hodowli kontrolnych, tzn. bez obecności jakiegokolwiek leku cytostatycznego. Ponadto efekt ten wykazywał zaleŝność od zastosowanego stęŝenia leku. Zastosowana przez nas metoda badawcza nie pozwala ustalić, w jakim stopniu zachodząca pod wpływem śmierć komórek była końcowym etapem zaleŝnej od leku apoptozy, a w jakim katastrofy mitotycznej. Warto jednak zwrócić uwagę na wyraźniejszy przyrost odsetka komórek martwiczych w stosunku do apoptotycznych w miarę zwiększania stęŝenia leku w hodowli. Jest to zgodne z wiedzą na temat dualistycznego (proapoptotycznego i pronekrotycznego) mechanizmu działania i mogłoby sugerować, Ŝe eskalacja stęŝeń wzmacnia przede wszystkim jego indukujący wpływ na katastrofę mitotyczną. W badaniach naszych IC 50 dla zastosowanej samodzielnie wynosiło średnio 72,4 µg/ml (188 µm), podczas gdy w badaniach Roue i wsp. [17] podobny efekt uzyskano przy wartości poniŝej 100 µm. Badając interakcje z analogami puryn nie wykazaliśmy opisywanego przez innych autorów jej synergizmu z FA [13, 17]. Obliczony CI pozwala bowiem jedynie na stwierdzenie interakcji o charakterze addycji. Porównując tę obserwację z doniesieniem Roué i wsp. [17] naleŝy jednak zwrócić uwagę, Ŝe autorzy ci prowadzili badania nad komórkami uprzednio zamroŝonymi w środowisku DMSO. Być moŝe więc, taki sposób przechowywania limfocytów PBL, a przede wszystkim ich zamraŝanie i rozmraŝanie, stworzyły warunki do łatwiejszej indukcji apoptozy przez badane leki, niŝ to miało miejsce w limfocytach opracowywanych ex vivo w naszych doświadczeniach. Za taką moŝliwością mogłoby przemawiać takŝe fakt, Ŝe porównywalny stopień utraty Ŝywotności komórek został przez cytowanych autorów osiągnięty za pomocą niŝszych stęŝeń (2 100 µm), niŝ zastosowane w naszych doświadczeniach, (1 80 µg/ml, co odpowiada 2,6 208 µm). NaleŜy takŝe zauwaŝyć, Ŝe określając typ interakcji pomiędzy i FA Roué i wsp. [17] oparli się na definicji zaproponowanej przez Chow i wsp. [26], w której za działanie synergistyczne przyjmuje się CI<1. Zastosowana przez nas definicja Kristensen i wsp. [22] jest bardziej rygorystyczna i synergizmem określa CI<0,8. Przyjmując załoŝenia Chow i wsp., uzyskany przez nas wynik dla interakcji z FA znajduje się na granicy addycji i synergizmu (CI=1,06). Schwanen i wsp. [13] wykonywali hodowle komórek PBL w warunkach porównywalnych z naszymi i z zastosowaniem analogicznych stęŝeń badanych leków. Uzyskany przez nich odsetek komórek ulegających spontanicznej apoptozie po 24 godzi-

10 896 A. ZABOROWSKA i wsp. nach inkubacji wynosił 5,6%, natomiast apoptozie indukowanej zastosowaną w stęŝeniu 10 µg/ml po 48 godzinach hodowli wynosił 24,1%. W naszych badaniach odsetek ten wynosił odpowiednio 10,2% i 23,6%. RóŜnice pomiędzy uzyskanymi wynikami mogą być spowodowane faktem, iŝ do oceny apoptozy autorzy ci stosowali 7-amino-aktynomycynę D, pozwalająca wykryć jedynie komórki martwe, podczas gdy stosowany przez nas test z uŝyciem anneksyny V i jodku propidyny, uwzględnia zarówno komórki apoptotyczne, jak i martwicze. MoŜe to wyjaśniać dlaczego obserwowana przez nas apoptoza spontaniczna jest wyŝsza, niŝ stwierdzona przez Schanena i wsp. [13] przy porównywalnej apoptozie indukowanej lekiem. Oryginalną poczynioną przez nas obserwacją był synergizm pomiędzy, a 2-CdA. PoniewaŜ obliczone przez nas IC 50 dla zastosowanej w skojarzeniu z 2-CdA i FA było porównywalne i wynosiło odpowiednio 23,4 i 23,8 µg/ml (61 i 62 µm), więc róŝnica w obserwowanym typie interakcji moŝe wynikać z odrębności mechanizmów działania obu ANP. Trójfosforan 2-CdA (2-CdA-TP) ulega bowiem szybszej akumulacji w mitochondriach niŝ trójfosforan FA (FA-TP), gdyŝ w cząsteczce 2-CdA w pozycji 2 pierścienia adeninowego atom wodoru został podstawiony atomem chloru, a to z kolei umoŝliwia bezpośrednie oddziaływanie 2-CdA na mitochondria i być moŝe potęguje proapoptotyczne działanie. MoŜe to równieŝ wyjaśniać dlaczego 2-CdA działa toksycznie na komórki PBL w stęŝeniu kilkunastokrotnie niŝszym niŝ FA [27]. Warto tu takŝe wspomnieć, Ŝe Robak i wsp. [28] opublikowali obserwacje, iŝ 2-CdA, podobnie jak, a w odróŝnieniu od FA, moŝe być skuteczna w przypadkach PBL z nieaktywnym genem p53. Podsumowując, przedstawione przez nas wyniki badań nie tylko potwierdziły wpływ na apoptozę i Ŝywotność limfocytów PBL w warunkach in vitro, ale równieŝ wykazały synergizm tego leku z ANP, przede wszystkim z 2-CdA. Wskazuje to na celowość dalszych badań nad charakterem i mechanizmem interakcji tych dwóch leków w celu oceny moŝliwości ich skojarzonego zastosowania w tej chorobie, szczególnie w postaciach opornych na leki alkilujące i FA, jak równieŝ sugeruje celowość podjęcia dalszych badań nad łącznym zastosowaniem z innymi lekami cytotoksycznymi. Praca finansowana z grantu Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr PIŚMIENNICTWO 1. Hallek M., Cheson B.D., Catovsky D. i wsp. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop of Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 Guidelines. Blood 2008; 111: Robak T, Moissev S, Dmoszyńska A, et al. Rituximab, fludarabine and cyclophosphamide (R-FC) prolongs progression free survival in relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) compared with FC alone: Final results from the international phase III REACH trial. Blood 2008;112: Abstract

11 Wpływ bendamustyny Keating MJ, O Brien S, Lerner S i wsp.. Long-term follow-up of patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) receiving fludarabine regimens as initial therapy. Blood, 1998, 92: Robak T, Blonski JZ, Kasznicki M,. Cladribine with prednisone versus chlorambucil with prednisone as first-line therapy in chronic lymphocytic leukemia: report of a prospective, randomized, multicenter trail. Blood 2000, 96: Korycka A, Robak T. The influence of imatinib mesylate (STI571) used alone or in combination with purine analogues on the normal and chronic myelogenous leukemia progenitor cells in vitro. Leuk. Lymph. 2003; 44: Korycka A, Smolewski P, Robak T. The influence of farnesyl protein transferase inhibitor R (Zarnestra) alone and in combination with purine nucleoside analogues on acute myeloid leukemia progenitors in vitro. Eur J Haematol. 2004; 73: OŜegowski W, Krebs D. IMET3393 (-[1methyl-5-bis-(β-chloroethyl)-aminobenz-imidazalyl-(2)]- butyric acid hydrochloride, a new cytotoxic agent from among the series of benzimidazole mustard compounds [in German]. Zbl. Pharm 1971; 110: Herold M, Keinert K, Anger G. i wsp. Risk-adapted combined radiotherapy and chemotherapy for Hodgkin s disease- results of a pilot study. Oncology 1992; 15: Knauf W. Bendamustine in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Export Rev Anticancer Ther. 2009; 9: Cheson BD, Rummel MJ. Bendamustine: Rebirth of an Old Drug. J Clin Oncol. 2009; 27: No 9, str Leoni LM, Baliey B, Reifert J i wsp. Bendamustine (Treanda) displays a distinct pattern of cytotoxicity and unique mechanism features compared with other alkalating agent. Clin Cancer Res. 2008; 14: Blumel S, Goodrich A, Martin Ch, Dang NH. Bendamustine: A novel cytotoxic agent for hematologic malignancies. Clin J Oncol Nurs. 2008; 12: Schwanen C, Hecker T, Hubinger i wsp. In vitro evaluation of bendamustine induced apoptosis in B- chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2002; 16: Bergmann MA, Goebeler ME, Herold M i wsp. Efficacy of bendamustine in patients with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia: Results of a phase I/II study of the German CLL Study Group. Haematologica. 2005; 90: Knauf W. Bendamustibe in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. Export Rev Anticancer Ther. 2009; 9: Friedenberg JW, Cohen P, Chen L i wsp. Bendamustine in patients with rituximab-refractory and alkylator refractory, indolent, and transformed non-hodgkins lymphoma: Results of a phase II multicenter single-agent study. J Clin Oncol. 2008; 26: Roue G, Lopez-Guerra M, Milpied P i wsp. Bendamustine is effective in p53-deficient B-cell neoplasms and requires oxidative stress and caspase-independent signaling. Clin Cancer Res. 2008; 14: Rummel MJ, Al-Batran SE, Kim S.Z. i wsp. Bendamustine plus rituximab is effective and has a favorable toxicity profile in the treatment of mantle cell and low-grade non-hodgkin s lymphoma. J Clin Oncol. 2005; 23: Weide R, Hess G, Koppler H. i wsp. High anti-lymphoma activity of bendamustine/mitoxantrone/rituximab in rituximab pretreated relapsed or refractory indolent lymphomas and mantle cell lymphomas: A multicenter phase II study of the German Low Grade Lymphoma Study Group (GLSG). Leuk. Lymph. 2007; 48: Darzynkiewicz Z, Bedner E, Smolewski P. In situ detection of DNA stand break in analysis of apoptosis by glow-and laser-scaning cytomery. Methods in Molecular Biology 2002; 203: Smolewski P, Szmigielska-Kapłon A, Cebula B. i wsp. Proapoptotic activity of alemtuzumab alone and In combination with rituximab or purine nucleoside analogues in chronic lymphocyric leukemia. Leuk Lymphoma 2005; 46:

12 898 A. ZABOROWSKA i wsp. 22. Kristensen J, Nygren P, Lilienmark J i wsp. Interaction between cladribine (2-chlorodeoxyadenosine) and standard antileukemic drugs in primary cultures of human tumor cells from patients with acute myelocytic leukemia. Leukemia 1994; 8: Knauf WU, Lissitchkov T, Aldaoud A. i wsp. Bendamustine versus chlorambucil as first line treatment in B-cell chronic lymphocytic leukemia: An Update analysis from an International Phase III, Blood 2008; 111: abstr Niederle N, Balleisen L, Heit W i wsp. Bendamustine vs fludarabine as second line treatment for patients with chronic lymphocytic leukemia first interim results of a randomized study. Ann Oncol. 2008; suppl. 4, abstr Weide R, Pandorf A, Heymanns J, Koppler H. Bendamustine/mitoxantrone/rituximab (BMR): a very effective, well tolerated outpatients chemoimmunotherapy for relapsed and refractory CD20-positive indolent malignancies. Final results of a pilot study. Leuk Lymphoma, 2004; 45: Chow TC Talalay p. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effect of multiple drugs and enzyme inhibititors. Adv Enzyme Regul. 1984; 22: Genini D, Adachi S, Chao Q i wsp. Deoxyadenosine analogs induce programmed cell death in chronic lymphocytic leukemia cells by damaging the DNA and by directly affecting the mitochondria. Blood. 2000; 96: Robak T, Błoński JZ, Wawrzyniak E, i wsp. Activity of cladribine combined with cyclophosphamide in frontline therapy for chronic lymphocytic leukemia with 17p13.1/TP53 deletion: report from the Polish Adult Leukemia Group. Cancer. 2009; 115: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autorów: Klinika Hematologii UM w Łodzi ul. Ciołkowskiego Łódź