Praca oryginalna Original Article

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics 2012 Volume 48 Number Praca oryginalna Original Article Laboratoryjna ocena materiału komórek krwiotwórczych przeznaczonych do transplantacji w aspekcie zastosowania różnych preparatów dimetylosulfotlenku (DMSO) Laboratory evaluation of hematopoietic cells intended for transplantation with regards to the use of various dimethyl sulphoxide preparations Maria Kozłowska-Skrzypczak, Paula Matuszak, Ewa Bembnista, Anna Mierzwa, Jolanta Kiernicka-Parulska, Mieczysław Komarnicki Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu Streszczenie Celem pracy było porównanie krioprotektanta, dimetylosulfotlenku dwóch różnych producentów wykorzystanego w celu zamrożenia komórek krwiotwórczych. Oceniano komórki zawarte w materiale transplantacyjnym pod względem ich liczby i żywotności oraz zawartości ukierunkowanych prekursorów układu granulocytarno-monocytowego (CFU-GM). Stosowano spektralnie czysty dimetylosulfotlenek (DMSO) firmy Merck ( M DMSO) oraz jałowy, apirogenny DMSO firmy WAK Chemie GmbH ( C DMSO). Ocenie poddano 70 prób zawierających hematopoetyczne komórki z krwi uzyskane metodą leukaferezy. Żywotność komórek jądrowych oceniano testem wchłaniania błękitu trypanu, natomiast żywotność komórek CD34+ oznaczano metodą cytometrii przepływowej za pomocą 7-aminoaktynomycyny D. Liczbę kolonii utworzonych przez CFU-GM określano stosując technikę hodowli in vitro. Żywotność komórek jądrowych oraz CD34+ w materiale poddanym zamrażaniu przy użyciu M DMSO i C DMSO nie różniła się istotnie (p>0,05). Mediana liczby kolonii utworzona przez CFU-GM była większa w materiale poddanym zamrożeniu przy użyciu C DMSO, jednakże różnice nie były istotne statystycznie (p>0,05). Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że zastosowanie C DMSO jest tak samo skuteczne jak wykorzystanie M DMSO w zakresie badanych parametrów. Jednocześnie za klinicznym wykorzystaniem C DMSO przemawia fakt, że jest apirogenny, wolny od endotoksyn i mykoplazm. Summary The aim of the thesis was to compare cryoprotectants used in freezing hematopoietic cells which are included in transplant material in terms of the number and the viability of these cells as well as the content of the granulocyte-macrophage precursors (CFU-GM). Spectrally pure dimethyl sulphoxide (DMSO) from Merck producer ( M DMSO) and sterile, pyrogen free DMSO from WAK Chemie GmbH producer ( C DMSO) were used. 70 samples containing hematopoietic cells recovered by means of leukapheresis were assessed. Cell viability was estimated by trypan blue incubation test while CD34+ cells viability was determined by means of flow cytometry using 7-amino-actinomycin D. The number of colonies formed by CFU-GM was determined using in vitro culture. No significant differences (p>0.05) were found in the number of nuclear and CD34+ cells included in the material subjected to cryopreservation by means of M DMSO and C DMSO. The median number of the CFU-GM - formed colonies was higher in the material subjected to freezing by means of C DMSO, however, these differences were not statistically significant (p>0.05). Based on the conducted research, it was found that applying C DMSO was as effective as the M DMSO. At the same time, another argument for the clinical use of C DMSO is that it proves apyrogenic as well as free of endotoxin and mycoplasma. Słowa kluczowe: Dimetylosulfotlenek; komórki krwiotwórcze; transplantacja Key words: Dimethyl sulphoxide; hematopoietic cells; transplantation 387

2 Laboratoryjna ocena materiału komórek krwiotwórczych przeznaczonych do transplantacji w aspekcie zastosowania... Wstęp Transplantacja krwiotwórczych komórek macierzystych stanowi uznaną metodę leczenia wielu chorób nowotworowych oraz nienowotworowych. W przypadku przeszczepień własnych komórek konieczne jest przechowywanie materiału do czasu transplantacji. W tym celu standardowo stosuje się metodę zamrażania. Technika ta znalazła zastosowanie w przypadku wszystkich transplantacji komórek autologicznych, pozyskiwanych z krwi obwodowej oraz szpiku [1]. Zamrażanie krwiotwórczych komórek macierzystych niesie ze sobą ryzyko uszkodzenia komórek spowodowane bezpośrednim wpływem niskiej temperatury sięgającej C. Dlatego niezbędne jest użycie środków krioprotekcyjnych, które znacznie zmniejszają proces tworzenia zewnątrzi wewnątrzkomórkowych kryształów lodu oraz dehydratację komórek [2, 3, 4]. Jednym z nich jest dimetylosulfotlenek (DMSO) stosowany w różnym stężeniu, najczęściej 10% [5]. DMSO posiada zdolność przenikania przez błonę komórkową. Należy do krioprotektantów penetrujących. Po wniknięciu do komórki DMSO doprowadza do wyrównania gradientu osmotycznego, a także utrzymuje stabilne wewnątrzkomórkowe stężenie soli i ph [6]. Osmolalność 10% roztworu DMSO wynosi 1,4 osmoli, preparaty krwiotwórczych komórek macierzystych mają miliosmoli, dlatego po dodaniu DMSO komórki ulegają gwałtownemu odwodnieniu. To działanie ma na celu wyrównanie różnicy osmolalności między środowiskiem wewnątrz- i zewnątrzkomórkowym [7]. Ze względu na dużą wrażliwość komórek po rozmrożeniu, DMSO może doprowadzić do ich lizy. Redukcji w ten sposób ulega liczba komórek oraz w dużym stopniu powoduje to istotne zmniejszenie żywotności komórek mniej i bardziej dojrzałych. Poza działaniem krioochronnym DMSO wpływa toksycznie na komórki. Ścisłe przestrzeganie procedury przygotowania i rozmrażania preparatów przeznaczonych do przeszczepienia ogranicza niekorzystne skutki działania DMSO [8]. Toksyczność DMSO rośnie wraz ze wzrostem temperatury, dlatego ważne jest, aby preparat po rozmrożeniu był jak najszybciej oceniony pod względem liczby i żywotności komórek. Wartość tych parametrów jest podstawą do dopuszczenia materiału do transplantacji. Obecnie na rynku medycznym znajduje się wiele rodzajów DMSO. Wśród nich wymienić można spektralnie czysty, niejałowy dimetylosulfotlenek, konfekcjonowany w dużych pojemnikach. Jego zastosowanie łączy się z ryzykiem zanieczyszczenia materiału drobnoustrojami. Niedawno wprowadzono na rynek medyczny kilka krioprotektantów, które cechuje sterylność oraz apirogenność. Są wolne od endotoksyn i mykoplazm oraz produkowane w ampułkach lub ampułkostrzykawkach, gotowych do użycia, co zmniejsza ryzyko zakażenia. Jednym z elementów analizy materiału transplantacyjnego jest oznaczenie liczby komórek CD34+. Wcześniej ocenie poddawano zawartość prekursorów układu granulocytarnomonocytowego (colony forming unit-granulocyte, monocyte; CFU-GM) w hodowli in vitro oraz liczbę komórek jądrowych. Na podstawie licznych badań stwierdzono, że istnieje liniowa zależność pomiędzy liczbą komórek jednojądrowych, CD34+, CFU-GM, a czasem odnowy układu krwiotwórczego po przeszczepieniu [9, 10]. Obecnie nadal prowadzonych jest wiele badań zmierzających do ustalenia optymalnych warunków przechowywania oraz zamrażania materiału przeszczepowego. Modyfikacjom podlega zarówno skład mieszaniny krioprotekcyjnej jak i szybkość, sposób zamrażania oraz przechowywania komórek. Nieustannie trwają prace nad zminimalizowaniem szkodliwych efektów ubocznych związanych z zamrażaniem [5, 11, 12]. W niniejszej pracy porównano preparaty DMSO dwóch różnych producentów, firmy Merck ( M DMSO) oraz DMSO firmy WAK GmBH Chemie ( C DMSO) pod względem wpływu na jakość materiału przeznaczonego do transplantacji. Materiał i metody Do badań użyto 70 prób zawierających komórki hematopoetyczne z krwi uzyskane metodą leukaferezy przy użyciu separatora komórkowego (Cobe Spectra). Materiał pochodził od pacjentów z rozpoznaniem chorób krwi i pobierany był zawsze w celach leczniczych oraz w celu przeprowadzenia poszerzonej oceny preparatu pod kątem jego przydatności do transplantacji. Każdorazowo pacjent był informowany o celu pobrania i uzyskiwano zgodę na te czynności. Na badania uzyskano zgodę uczelnianej komisji bioetycznej. Próby zawierające materiał komórek krwiotwórczych po aferezie były zamrażane w sposób programowany z użyciem krioprogramatora firmy Cryoson. Przygotowaną zawiesinę poddawano zamrażaniu początkowo z szybkością 1 o C/min. oraz 5 o C/min. po przekroczeniu temperatury -40 o C/min. Dla porównania, jednocześnie zamrażano próby od jednego pacjenta z zastosowaniem spektralnie czystego dimetylosulfotlenku (DMSO) firmy Merck (oznaczony w pracy jako M DMSO) oraz jałowego, wolnego od endotoksyn i mykoplazm, apirogennego DMSO firmy WAK Chemie GmBH (oznaczony w pracy jako C DMSO). Każdorazowo przed użyciem M DMSO był filtrowany przez jałowe membrany o wielkości porów 0,4 μm. Rozmrażanie materiału przeprowadzano w temperaturze 37 C. Próby po rozmrożeniu oceniane były pod względem liczby komórek oraz ich żywotności. Ocena żywotności komórek a) Określanie żywotności komórek testem wchłaniania błękitu trypanu (BT) Po rozmrożeniu, do zawiesiny komórek (100 µl) dodawano 0,4% roztwór BT (100 µl), inkubowano w temperaturze 20 C przez 1 minutę. Ocenę prowadzono pod mikroskopem świetlnym zgodnie z przyjętymi zasadami, uznając jako komórki martwe ciemno wybarwione. Wynik przedstawiano jako odsetek komórek żywych. b) Oznaczanie odsetka żywych komórek CD34+ przy użyciu metody cytometrii przepływowej z 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD) 388

3 Do badania żywotności komórek używano zestawu Stem- KitTM Reagents (Beckman Coulter). Dla każdej próbki oznaczano trzy probówki (1): CD45 FITC/CD34 PE/7-AAD, (2): CD45 FITC/CD34 PE/7-AAD, (3): CD45 FITC/CTRL/7-AAD. Do probówek nr 1 i 2 dodawano 20 µl odczynnika CD45 FITC/CD34 PE, do probówki 3 dodawano odczynnika CD45 FITC/ Control PE. Do wszystkich probówek dodawano 20 µl odczynnika 7-AAD i 100 µl badanego materiału. Następnie dodawano 2 ml roztworu lizującego mieszano na mieszadle i umieszczano w ciemni na 10 minut. Tak przygotowane próbki analizowano w cytometrze przepływowym (FASC Calibur, FASC Canto II). Znalezioną populację komórek CD34+/low SSC poddano analizie na cytogramie CD34/7-AAD. Wynik w pracy podawano jako odsetek komórek żywych. Ocenę cytometryczną przykładowej próby przedstawiono na rycinie 1. wiesinę komórek (10 5 komórek/100 µl) dodawano do 900 µl półpłynnego medium hodowlanego MethoCult H4534 (Stem Cell, Kanada) Materiał rozmieszczano w jałowej płytce hodowlanej (Nunc, Dania). Za każdym razem wykonywano 5-6 jednoczasowych hodowli. Po 7-10 dniowej inkubacji w inkubatorze Cellstar (wilgotność 100%, 5% CO 2, 37 C) oceniano liczbę kolonii wytworzonych przez CFU-GM. Za kolonię uznawano skupisko składające się z ponad 50 komórek (rycina 2). Rycina 2. Kolonie utworzone przez prekursory układu granulocytarno-monocytowego po 7 dniach hodowli in vitro (zdjęcie własne). Ocena statystyczna Dla wszystkich ocenianych parametrów określono średnią, medianę, minimum, maksimum oraz odchylenie standardowe. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta dla zmiennych niepowiązanych oraz testu Manna- Whitney`a, przyjmując za istotne p<0,05. Rycina 1. Cytometryczna ocena żywotności komórek CD34+ (LL-93,67%) w materiale separacyjnym (przykładowy obraz cytometryczny). Ocena liczby prekursorów układu granulocytarno-monocytowego (CFU-GM) Materiał po rozmrożeniu (2 ml) rozcieńczano dodając 8 ml schłodzonego podłoża RPMI 1640 (Biomed, Lublin). Komórki jednojądrowe uzyskiwano z interfazy po wirowaniu (400xg, 18 o C, 15 min) na gradiencie Gradisolu L (Aqua- Medica, Łódź). Komórki płukano dwukrotnie (200xg, 18 o C, 15 min) przy użyciu RPMI 1640 i oceniano ilościowo. Za- Wyniki Uzyskane wyniki analizy statystycznej, medianę, odchylenie standardowe, minimum i maksimum dotyczące żywotności komórek jądrowych oraz komórek CD34+ i zawartości ukierunkowanych prekursorów układu granulocytarno-monocytowego w materiale zamrażanym z użyciem M DMSO oraz C DMSO przedstawiono w tabelach, natomiast na rycinach zaznaczono wyniki uzyskane w poszczególnych próbach. Średnia zawartość komórek o fenotypie CD34+ w materiale poddanym zamrażaniu z użyciem M DMSO wynosiła 2,36 (0,1-11,74)%, natomiast przy użyciu C DMSO 2,53 (0,1-13)%. 1. Żywotność komórek jądrowych oceniana przy użyciu błękitu trypanu Porównanie prób poddanych zamrażaniu przy użyciu M DMSO oraz C DMSO pod względem żywotności komórek Tabela I. Porównanie żywotności komórek określanej przy użyciu błękitu trypanu w materiale zamrożonym przy użyciu M DMSO i C DMSO. mediana odchylenie standardowe minimum maksimum p M DMSO* 87,00 11, ,00 98,00 C DMSO* 82,00 9, ,00 97,00 * M DMSO dimetylosulfotlenek spektralnie czysty * C DMSO dimetylosulfotlenek apirogenny, wolny od endotoksyn i mykoplazm 0,

4 Laboratoryjna ocena materiału komórek krwiotwórczych przeznaczonych do transplantacji w aspekcie zastosowania... Rycina 3. Żywotność komórek jądrowych w kolejnych próbach oceniana z użyciem błękitu trypanu w materiale zamrożonym z M DMSO i C DMSO (kolejne próby). Rycina 4. Żywotność komórek CD34+ w kolejnych próbach oceniana metodą cytometrii przepływowej przy użyciu 7-AAD w materiale zamrożonym z M DMSO i C DMSO. jądrowych przedstawia tabela I oraz rycina 3. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w żywotności ocenianej za pomocą BT pomiędzy materiałem zamrożonym przy użyciu M DMSO, a C DMSO (p>0,05). Uzyskane minimalne i maksymalne wartości w obu badanych grupach utrzymywały się na zbliżonym poziomie. 2. Żywotność komórek CD34+ oceniana metodą cytometrii przepływowej przy użyciu 7-AAD. Uzyskane wyniki przedstawiono w tabeli II oraz na rycinie 4. Wyższą żywotność zaobserwowano w materiale poddanym zamrażaniu z użyciem M DMSO, jednak różnice te nie były statystycznie istotne (p>0,05). Rozpiętość zakresu wartości minimalnych w badaniu żywotności komórek CD34+ była większa niż w przypadku oceny żywotności komórek jądrowych po inkubacji z BT. Rozpiętość wartości maksymalnych była na podobnym poziomie. Rycina 5. Liczba kolonii utworzonych przez prekursory układu granulocytarnomonocytowego w kolejnych próbach w materiale zamrożonym przy użyciu M DMSO oraz C DMSO. 3. Porównanie liczby prekursorów granulocytarno-monocytowych CFU-GM w materiale zamrażanym z zastosowaniem M DMSO oraz C DMSO. W tabeli III oraz na rycinie 5 przedstawiono porównanie liczby kolonii utworzonych przez prekursory CFU-GM. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w porównywanych próbach zamrażanych z użyciem M DMSO i C DMSO (p>0,05). Analiza statystyczna wskazuje na wyższą medianę liczby kolonii w materiale zamrażanym z zastosowaniem C DMSO oraz duży zakres uzyskanych wartości zarówno w grupie badań z użyciem C DMSO jak i M DMSO. Tabela II. Porównanie żywotności komórek ocenianej metodą cytometrii przepływowej przy użyciu 7-aminoaktynomycyny D w materiale zamrożonym po zastosowaniu M DMSO oraz C DMSO. mediana odchylenie standardowe minimum maksimum p M DMSO* 91,13 21, ,14 97,43 C DMSO* 89,50 20, ,79 97,10 * M DMSO dimetylosulfotlenek spektralnie czysty * C DMSO dimetylosulfotlenek apirogenny, wolny od endotoksyn i mykoplazm 0,9327 Tabela III. Porównanie liczby kolonii utworzonych przez prekursory układu granulocytarno-monocytowego w materiale zamrożonym z zastosowaniem M DMSO oraz C DMSO. mediana odchylenie standardowe minimum maksimum p M DMSO* 82 93, C DMSO* , * M DMSO dimetylosulfotlenek spektralnie czysty * C DMSO dimetylosulfotlenek apirogenny, wolny od endotoksyn i mykoplazm 0,

5 Dyskusja W badaniach własnych podsumowano wyniki oceny liczby i żywotności komórek hematopoetycznych krwi zawartych w materiale z leukaferezy. Badania te stanowiły istotny element pozwalający na wdrożenie nowego apirogennego i sterylnego preparatu dimetylosulfotlenku. Jak powszechnie wiadomo, powodzenie terapii za pomocą transplantacji komórek krwiotwórczych uzależnione jest od jakości materiału przeszczepowego, w tym liczby komórek zdolnych do samoodnowy i różnicowania oraz żywotności wszystkich komórek charakteryzujących się różnym poziomem dojrzałości. Ich źródłem może być szpik kostny lub krew. W celu uzyskania preparatu z krwi obwodowej niezbędne jest przeprowadzenie mobilizacji doprowadzającej do krótkotrwałego przemieszczenia komórek hematopoetycznych ze szpiku [1, 13]. Preparaty z krwi, obecnie najczęściej stosowane, uzyskiwane są na drodze aferezy za pomocą separatorów komórkowych. Autologiczne krwiotwórcze komórki macierzyste do chwili transplantacji zawsze poddawane są zamrożeniu. Środkiem krioochronnym jest najczęściej DMSO stosowany samodzielnie lub w połączeniu z innymi substancjami jak np. hydroksyetylowaną skrobią. W badaniach własnych oznaczenia wykonywano w materiale poddanym zamrożeniu w parach ciekłego azotu w sposób programowany. Krioprotektantem był każdorazowo 10% dimetylosulfotlenek. Komórki przechowywano do czasu wykonania badania w temperaturze minus156 o C. Niezwłocznie po rozmrożeniu przeprowadzano oznaczenia obejmujące liczbę i żywotność komórek jądrowych oraz zawierających antygen CD34+. Z piśmiennictwa wynika, że zastosowanie metody kontrolowanego zamrażania oraz zminimalizowanie czasu od rozmrożenia preparatu przeszczepowego do oceny pozwala na obniżenie strat i wiarygodną ocenę rzeczywistej liczby komórek i ich żywotności [14]. W badaniach własnych oceniono żywotność komórek w materiale zamrażanym przy użyciu C DMSO i M DMSO za pomocą błękitu trypanu oraz metodą cytometrii przepływowej z użyciem 7-AAD. Jak wiadomo, im większa żywotność komórek, tym lepsza jakość materiału przeznaczonego do transplantacji. W badaniach własnych żywotność komórek po rozmrożeniu była porównywalna z wynikami innych autorów [12, 14, 15]. Ocena żywotności komórek z użyciem błękitu trypanu w badaniach własnych obejmowała wszystkie komórki jądrowe. Polegała na analizie obrazu mikroskopowego i zliczaniu komórek żywych, niechłonących barwnika i martwych, wchłaniających barwnik. Martwe komórki mają uszkodzoną błonę komórkową, dzięki czemu barwnik może wniknąć do ich wnętrza. Problemem występującym przy stosowaniu tej metody jest fakt, iż komórka z uszkodzoną błoną może ulegać regeneracji i dalej prawidłowo funkcjonować, mimo, że w tej metodzie zostanie uznana za martwą. Pod względem żywotności komórek ocenianej przy użyciu błękitu trypanu nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między M DMSO oraz C DMSO. Jednakże zwraca uwagę nieco większa żywotność, gdy stosowano M DMSO. Kolejnym ocenianym parametrem w badaniach własnych była żywotność komórek badana metodą cytometrii przepływowej z użyciem 7-AAD. Ta analiza pozwala na ocenę odsetka procentowego żywych komórek CD34+ w obrębie puli leukocytów CD45+ znajdujących się w materiale przeznaczonym do transplantacji. Na podstawie otrzymanych wyników można zauważyć, iż żywotność komórek zamrażanych z użyciem M DMSO jest nieistotnie większa niż próbek poddanych zamrożeniu z użyciem C DMSO. W badaniach własnych oceniono liczbę prekursorów CFU -GM w hodowli in vitro. Dzięki tej metodzie możliwa jest ocena potencjału proliferacyjnego komórek w materiale przeznaczonym do transplantacji. Dane z piśmiennictwa wskazują, że liczba CFU-GM jest skorelowana z liczbą hematopoetycznych komórek CD34+ oraz czasem rekonstytucji hematopoezy [10, 16]. Na podstawie przeprowadzonych badań własnych stwierdzono nieistotnie statystycznie większą liczbę kolonii CFU-GM w materiale zamrażanym z użyciem C DMSO niż M DMSO. Uzyskane wyniki wskazują na wyższą medianę liczby kolonii w materiale zamrożonym z zastosowaniem C DMSO oraz duży zakres uzyskanych wartości zarówno w grupie badań z użyciem C DMSO jak i M DMSO. Duża rozpiętość wyników hodowli prekursorów układu granulocytarno-monocytowego obserwowana była wcześniej przez licznych autorów [10]. Na podstawie przedstawionych wyników można stwierdzić, że zarówno M DMSO jak i C DMSO jest tak samo skutecznym środkiem krioochronnym stosowanym do zamrażania i przechowywania w stanie zamrożenia komórek krwiotwórczych. Użycie M DMSO skutkuje nieistotną statystycznie, większą żywotnością komórek. Natomiast użycie C DMSO pozwala uzyskać większą liczbę kolonii; różnica jednak nie jest istotna statystycznie. Analiza wyników może nasuwać przypuszczenie, iż C DMSO w większym stopniu zachowuje potencjał proliferacyjny komórek. Badania zostały przeprowadzone na 70-ciu próbach i być może, gdyby grupa badawcza była większa, różnice byłyby inne, może bardziej znamienne. Należy podkreślić, że badania własne mają charakter jedynie laboratoryjny, a nie kliniczny stąd trudno określić wpływ liczby przeszczepionych komórek jądrowych, CD34+ oraz prekursorów układu granulocytarnomonocytowego na wynik transplantacji. Nie można również stwierdzić, czy rodzaj zastosowanego dimetylosulfotlenku jako krioprotektanta ma wpływ na ograniczenie działań niepożądanych u chorych. Piśmiennictwo 1. Czyż A, Kozłowska-Skrzypczak M, Komarnicki M. Hematopoeza. w: Dyszkiewicz W, Jemielity M, Wiktorowicz K, rozdz. w: Transplantologia w zarysie. Wydawnictwo Naukowe UM im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań, 2009: Berz D, Mc Cormack M, Winer ES, et al. Cryopreservation of hematopoietic stem cells. Am J Hematol 2007; 82: Windrum P, Morris TCM, Drake MB, et al. Variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT 391

6 Laboratoryjna ocena materiału komórek krwiotwórczych przeznaczonych do transplantacji w aspekcie zastosowania... centres. Bone Marrow Transplantation 2005; 36: Valeri RC, Ragno G. Cryopreservation of human blood products. Transfusion and Apheresis Science 2006; 34: Abrahamsen JF, Rustin L, Bakken AM, et al. Better preservation of early hematopoietic progenitor cells when human peripheral blood progenitor cells are cryopreserved with 5 percent dimethylsulfoxide instead of 10 percent dimethylsulfoxide. Transfusion 2004; 44: Bakken AM. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells. Current Stem Cell Research & Therapy 2006; 1: Fleming KK, Hubel A. Cryopreservation of hematopoietic stem cells: emerging science Technology and Issues. Transfus Med Hemother 2007; 34: Cigdem A Akkök, Mette R Holte, Tangen JM, et al. Hematopoietic engraftment of dimethyl sulfoxide-depleted autologous peripheral blood progenitor cells. Transfusion 2009; 49: Kozłowska-Skrzypczak M, Komarnicki M Transplantacja hematopoetycznych komórek w chorobach krwi - znaczenie liczby przeszczepianych komórek. Diagn Lab 2008; 44: Yang H, Acker JP, Cabuhat M, et al. Association of post-thaw viable CD34+ cells and CFU-GM with time to hematopoietic engraftment. Bone Marrow Transplantation 2005; 35: Huang YZ, Shen JL, Yang PD, et al. Comparison of different cryopreservation systems for peripheral blood stem cells. Zhonggouo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi 2008; 24: Liseth K, Abrahamsen JF, Bjorsvik S, et al. The viability of cryopreserved PBPC depends on the DMSO concentration and the concentration and the concentration of nucleated cells in the graft. Cytotherapy 2005; 7: Devine H, Tierney DK, Schmitt-Pokorny K, et al. Mobilization of hematopoietic stem cells for use in autologous transplantation. Clin J Oncol Nurs 2010; 14: Kudo Y, Minegishi M, Itoh T, et al. Evaluation of hematological reconstitution potential of autologous peripheral blood progenitor cells cryopreserved by a simple controlled-rate freezing method. J Exp Med 2005; 205: Lee S, Kim S, Baek EJ, et al. Post-thaw viable CD34+ cell count is a valuable predictor of hematopoietic stem cell engraftment in autologous peripheral blood stem cell transplantation. Vox Sanguinis 2008; 94: Isaikina Y, Martinevsky I, Minakovskaya NV, et al. Importance of CFU-GM number for prediction of hematological reconstitution after low CD34+ cell dose autotransplantation in children. Cellular Therapy and Transplantation 2009; 2: Adres do korespondencji: Dr hab. n. med. Maria Kozłowska-Skrzypczak Katedra i Klinika Hematologii i Chorób Rozrostowych Układu Krwiotwórczego Poznań, ul. Szamarzewskiego 84 mks@icpnet.pl Zaakceptowano do publikacji: