Otrzymywanie obwodowych komórek krwiotwórczych oraz badanie ich żywotności w produkcie aferezy przed i po krioprezerwacji

Transkrypt

1 diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics Diagn Lab 2014; 50(3): Praca poglądowa Review Article Otrzymywanie obwodowych komórek krwiotwórczych oraz badanie ich żywotności w produkcie aferezy przed i po krioprezerwacji The obtaining of peripheral blood stem cells and evaluation of its viability in the apheresis product before ad after cryopreservation Hanna Borowska, Piotr Klimek, Maria Cioch Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie Streszczenie Krew obwodowa jest głównym źródłem macierzystych komórek krwiotwórczych. Komórki te po mobilizacji i aferezie podlegają mrożeniu. Znanym efektem występującym po rozmrożeniu jest osłabienie ich żywotności. Różne metody badania żywotności komórek CD34 + mogą być użyteczne przy ocenie jakości preparatu przeszczepowego. Summary The peripheral blood is a major source of haematopoietic stem cells (PBSCs). These cells are cryopreserved after mobilization and apheresis. The known effect of this procedure is post-thaw reduced viability of PBSCs. Different methods of measuring CD34 + viability may be useful in quality graft evaluation. Słowa kluczowe: komórki krwiotwórcze, mobilizacja, transplantacja, CD34 +, żywotność Keywords: haematopoietic stem cells, mobilisation, transplantation, CD34 +, viability Pozyskiwanie obwodowych komórek krwiotwórczych Jednym z największych osiągnięć medycyny XX wieku było opracowanie, a następnie upowszechnienie metody transplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych (HSCT; Haematopoietic Stem Cell Transplantation). Ten rodzaj terapii radykalnie poprawił rokowanie w wielu, zwłaszcza nowotworowych chorobach układu krwiotwórczego i nadal w niektórych jednostkach chorobowych jest jedyną drogą do całkowitego wyleczenia. Wyróżniamy 2 główne metody pozyskiwania HSCT w zależności od rodzaju dawcy: metodę allogeniczną, kiedy to komórki krwiotwórcze, zgodne w układzie HLA pochodzą od innej osoby (ktoś spośród rodzeństwa, bądź osoba niespokrewniona) i autologiczną, kiedy sam biorca dostarcza dla siebie komórek krwiotwórczych [1]. Przez długi czas jedynym źródłem HSCs był szpik, ale opracowanie i wprowadzenie rekombinowanego czynnika wzrostu kolonii granulocytarnych (G-CSF; Granulocyte Colony Stimulating Factor) przyczyniło się do opracowania nowego sposobu pozyskiwania HSCs, polegającego na ich mobilizacji do krwi, a następnie zebraniu drogą aferezy przy użyciu separatora. Przeszczepianie tzw. obwodowych komórek krwiotwórczych (PBSCs; Peripheral Blood Stem Cells) jest w tej chwili zdecydowanie dominującą formą transplantacji, głównie autologicznych, ale także allogenicznych. Ocenia się, że w przypadku przeszczepień allogenicznych w 74%, a w przypadku transplantacji autologicznych aż w 98% zabiegów wykorzystuje się PBSCs [2, 3]. Wśród głównych zalet stosowania obwodowych komórek krwiotwórczych (PBSCT; Peripheral Blood Stem Cell Transplantation) wymienia się: mniej obciążający sposób ich pozyskiwania (niebolesny i niewymagający znieczulenia ogólnego), szybszą rekonstrukcję układu krwiotwórczego i mniejsze ryzyko zanieczyszczenia komórkami nowotworowymi, choć w przypadku transplantacji allogenicznych można się liczyć z częstszym występowaniem choroby przeszczepowej przeciwko gospodarzowi (GvHD; Graft versus Host Disease) [2]. U zdrowych dawców w mobilizacji stosuje się wyłącznie G-CSF, natomiast w przypadku transplantacji autologicznych u chorych na nowotwory układu krwiotwórczego podanie G-CSF poprzedzone jest zastosowaniem wysokodozowanej chemioterapii. Najczęściej stosowane schematy cytostatyczne podawane w celu mobilizacji zawierają w swoim składzie duże dawki cyklofosfamidu, etopozydu lub cytarabiny [4]. Kinetyka mobilizacji komórek szpiku po wszystkich schematach jest podobna, a największy ich wyrzut ma miejsce po upływie około 5 do 10 dni od rozpoczęcia podawania G-CSF. Mobilizacja dotyczy wielu typów komórek, nie tylko prymitywnych komórek hematopoetycznych, ale także progenitorów megakariocytów, erytrocytów i granulocytów oraz form dojrzałych, w tym neutrofili. 249

2 Podstawowym parametrem określającym jakość preparatu przeszczepowego jest zawartość w nim komórek wykazujących ekspresję antygenu CD34 +. U blisko 99% stymulowanych zdrowych dawców i 95% chorych można uzyskać w trakcie jednej leukaferezy więcej niż 2x10 6 komórek CD34 + na kilogram masy ciała biorcy [5]. Wśród chorych, u których stosujemy procedurę mobilizacyjną przed planowaną autologiczną transplantacją komórek krwiotwórczych wyróżnia się tzw.: źle mobilizujących się (poor mobilizers), u których nie można osiągnąć minimalnego poziomu komórek CD34 + wynoszącego 2x10 6 /kg masy ciała biorcy, nawet w wyniku kilku następujących po sobie leukaferez, średnio mobilizujących się, którzy osiągają minimalną liczbę, lecz nie 5x10 6 komórek CD34 + /kg oraz dobrze mobilizujących się (good mobilizers), u których podczas aferezy uzyskuje się co najmniej 5x10 6 komórek CD34 + /kg. Do czynników osłabiających odpowiedź na protokoły mobilizacji zaliczamy wiek powyżej 60 lat, liczbę i rodzaj cykli chemioterapii oraz radioterapię [5, 6, 7, 8, 9]. Do leków szczególnie upośledzających mobilizację należą leki alkilujące, zwłaszcza melfalan, a także stosowany od stosunkowo niedawna w chorych na szpiczaka plazmocytowego lenalidomid [10]. Szansę na zwiększenie efektywności mobilizacji, zwłaszcza w grupie źle mobilizujących się daje pleryksafor nowy lek, będący inhibitorem cząstki adhezyjnej CXCR4 [7, 11]. Separator komórkowy, zbierający PBSCs działa w oparciu o różnice w szybkości sedymentacji między komórkami i osoczem. Afereza polega na pobieraniu krwi pacjenta/zdrowego dawcy przez urządzenie z układem drenów do wirówki, w której zachodzi proces rozdziału. Gdy system optyczny separatora wykryje kożuszek, system pomp perystaltycznych pozwala na zassanie frakcji kożuszka leukocytarnego, w której znajdują się komórki jednojądrzaste, w tym komórki macierzyste, a także leukocyty i płytki krwi do pojemnika odbiorczego. W tym samym czasie następuje przekazanie dawcy pozostałych składników, tj. erytrocytów, trombocytów i osocza. Procedurę leukaferezy zwykle wykonuje się w separatorach takich jak: Com.Tec (Fresenius), Amicus (Fenwal), COBE Spectra, Spectra Optia (Carridian). Ostateczna efektywność separacji zależy od wyjściowej liczby komórek CD34 + we krwi dawcy oraz ustawień separatora. Należy dążyć do tego, aby w trakcie separacji strata erytrocytów i tromocytów była jak najmniejsza przy jak największym odzysku komórek CD34 + [8]. Afereza trwa zwykle od 2 do 4 godzin i w jej trakcie objętość krwi przetwarzana jest dwu lub pięciokrotnie [9]. Objętość uzyskanego preparatu wynosi ml. W większości przypadków z uwagi na zbyt długą odległość w czasie do transplantacji preparat komórek krwiotwórczych jest zamrażany. Po uzyskaniu satysfakcjonującej liczby komórek przygotowuje się i zamraża kilka porcji PBSCs, co jest przydatne w przypadku planowych transplantacji tandemowych lub kolejnych transplantacji przeprowadzanych z powodu nawrotu. Minimalna liczba HSCs, gwarantująca ich skuteczne wszczepienie wynosi 2x10 6 /kg masy ciała biorcy. W przypadku liczby mniejszej u 80% pacjentów obserwuje się późniejszą regenerację układu płytkotwórczego, co wiąże się z ryzykiem poważnych powikłań krwotocznych. Ustalono, że idealna dawka HSCs wynosi powyżej 5x10 6 /kg i przeszczepienie jej uruchamia produkcję trombocytów w ciągu 14 dni od transplantacji u 85% pacjentów. Przy odpowiedniej liczbie przeszczepionych komórek krwiotwórczych uruchomienie produkcji neutrofili następuje zwykle już w 9-10 dniu [2]. Czynniki wpływające na osłabienie żywotności obwodowych komórek krwiotwórczych Obecnie podstawowym parametrem charakteryzującym jakość preparatu przeszczepowego jest liczba komórek CD34 +, określana za pomocą metody cytometrycznej [12, 13]. Jeszcze przed wykonaniem zabiegu aferezy ocenia się liczbę komórek CD34 + we krwi pacjenta/zdrowego dawcy, aby dokładnie ustalić moment, w którym procedura będzie najbardziej efektywna. Podstawy ilościowej oceny ekspresji CD34 + opisane zostały przez International Society of Hematotherapy and Graft Engineering (protokół ISHAGE), obecnie International Society for Cellular Therapy (ISCT) [14, 15]. Ostatnio, coraz więcej publikacji wskazuje na fakt, że nie tylko liczba komórek CD34 + ma wpływ na jakość przeszczepu, ale także ich żywotność. Jedną z przyczyn utraty żywotności komórek CD34 + jest już sama procedura aferezy, ponieważ separator sprawia, że komórki znajdują się w krążeniu poza łożyskiem naczyniowym, a więc w nietypowym i niekorzystnym dla siebie środowisku [8, 16]. Kolejnym czynnikiem niekorzystnie wpływającym na żywotność jest chemioterapia i podawanie czynników wzrostu w procedurze mobilizacji, jakkolwiek pojawiły się też doniesienia o ochronnym działaniu G-CSF. Większość produktów aferezy jest przechowywana przed wszczepieniem w niskiej temperaturze mającej za zadanie zablokować drogi enzymatyczne i metabolizm komórek. Wykazano, że krioprezerwacja oraz późniejsze rozmrażanie preparatu mają negatywny wpływ na żywotność komórek CD34 + i powodzenie transplantacji [17]. Ma to szczególnie duże znaczenie w sytuacji, gdy zachodzi konieczność powtórnego wykonania transplantacji z powodu nawrotu choroby i wykorzystania preparatu PBSCs przechowywanego w stanie zamrożenia przez wiele lat. Świeże preparaty komórek krwiotwórczych prezentują żywotność na poziomie 95-99% przez 72 godziny przechowywania. Autologiczne lub allogeniczne preparaty mogą być przechowywane do 48 godzin w temperaturze +4 C, jednak najczęściej są w tym czasie zamrażane i przechowywane przez krótki okres w temperaturze -86 C i następnie docelowo w parach ciekłego azotu w temperaturze -160 C [8, 9]. Wykazano, że przechowywanie komórek krwiotwórczych w zamrażarce niskotemperaturowej w temperaturze -80 C powoduje utratę integralności błony komórkowej i zdolności do proliferacji już po 3 miesiącach [18]. W procedurze opracowania produktu aferezy materiał dzieli się na porcje, każda z liczbą komórek CD34 + powyżej 2x10 8 /ml (według niektórych źródeł 1-4 x 10 8 /ml) przez dodanie autologicznego osocza lub albuminy 5%. Albuminę dodaje się zwłaszcza w przypadku pacjentów ze szpiczakiem plazmocytowym, aby uniknąć żelowania się produktu podczas przechowywania lub preparatyki [9]. Zamrażanie komórek wstrzymuje ich szlaki metaboliczne, ale może też spowodować uszkodzenie błony komórkowej przez wzrost ciśnienienia osmotycznego oraz powstawanie kryształów z wody zawartej w cytoplazmie. Oba te zjawiska mogą prowadzić do lizy komórki i organelli wewnątrzkomórkowych. Jako krioprezerwant stosuje się najczęściej 10% DMSO (Dimethlyl Sulfoxide 250

3 Diagn Lab 2014; 50(3): dwumetylosulfotlenek), który cechuje się zdolnością przenikania przez membranę komórki i wiąże wodę wewnątrz oraz zewnątrz komórki. W konsekwencji wzrost kryształów zostaje spowolniony, a wzrost ciśnienia osmotycznego ograniczony [9, 18]. Poza DMSO mieszanina mrożąca zawiera także HES (Hydroxyethyl Starch hydroksymetyloskrobia), który formuje osłonkę wokół komórki i zapobiega jej odwodnieniu. Opisywane są różne mieszaniny mrożące zawierające np. 5% DMSO i 5% HES, 10% DMSO, lub 5% DMSO wraz z 6% HES. W zasadzie efektywność mieszaniny krioochronnej zwiększa się wraz ze stężeniem składników, jednak zbyt duże stężenie może mieć także toksyczny wpływ na komórkę. Ważne jest także stężenie białka w mieszaninie, które zmienia lepkość mieszaniny i ochrania komórki. Źródłem białka jest osocze lub albuminy. Mieszanina krioochronna jest dodawana do preparatu PBSCs, dzielona na porcje, zamrażana w sposób kontrolowany a następnie przechowywana w oparach ciepłego azotu w temperaturze -160 C. Niektóre źródła wskazują, że zadowalające wyniki można uzyskać zamrażając komórki najpierw w temperaturze -80 C, a następnie w docelowej temperaturze -160 C, co pozwala na uniknięcie kosztów związanych z zakupem i obsługą urządzenia do kontrolowanego procesu zamrażania [18]. Kolejnym krytycznym momentem dla komórek krwiotwórczych jest etap rozmrażania. Rozmrażanie odbywa się najczęściej przy łóżku pacjenta. Najlepszą i powszechnie stosowaną procedurą jest natychmiastowe umieszczenie pojemnika wyjętego z ciekłego azotu (lub zamrażarki) w łaźni wodnej lub urządzeniu do suchego rozmrażania komórek macierzystych ustawionego na 37 C, z delikatnym mieszaniem. Procedura ta powinna być wykonana szybko, aby uniknąć sklejania się komórek oraz zminimalizować czas przez jaki komórki są narażone na DMSO w wyższej temperaturze ze względu na toksyczność. Przechowywanie rozmrożonego preparatu przez 5 godzin zmniejsza żywotność komórek do 64% (z 90% żywych odzyskanych po rozmrożeniu) [18]. Wielu autorów uważa, że podstawowe znaczenie dla utraty żywotności PBSCs ma ich zamrażanie i rozmrażanie, które mogą przyczyniać się do śmierci komórek, wczesnej apoptozy oraz zmniejszeniu potencjału klonogenicznego [19]. Zależność między początkową liczbą komórek CD34 + w preparacie, a liczbą żywych komórek po rozmrożeniu ma istotne znaczenie, ponieważ tylko żywe komórki decydują o odbudowie układu krwiotwórczego [9, 18]. Co więcej, przy utracie żywotności komórek powstaje duża liczba komórek apoptotycznych lub nekrotycznych, które po przetoczeniu mogą u biorcy wywołać wiele objawów niekorzystnych, ze wstrząsem włącznie [18]. Badanie żywotności obwodowych komórek krwiotwórczych Zestawienie najczęściej stosowanych obecnie metod badania żywotności komórek krwiotwórczych przedstawiono w tabeli I. Najbardziej rozpowszechnione metody wykorzystują zjawisko zwiększonej przepuszczalności błony komórkowej martwych komórek krwiotwórczych, wskutek czego wnikające do wnętrza substancje barwią cytoplazmę, organelle komórkowe (lizosomy) i jądro. Żywe komórki nie ulegają barwieniu, co łatwo można wykazać w badaniu mikroskopowym. Najczęściej stosowanymi barwnikami są: błękit trypanu, jodek propidyny, czerwień obojętna i oranż akrydyny [19]. Metody mikroskopowe mają jednak wiele ograniczeń, ponieważ umożliwiają zbadanie niewielkiej liczby komórek, a interpretacja wyniku zależy od obserwatora. Poza tym metody oparte na wyżej wymienionych związkach nie barwią komórek, w których apoptoza znajduje się na wczesnym etapie. Metodą oferującą większą dokładność i powtarzalność okazała się cytometria przepływowa [20]. Główne wady i zalety metod cytometrycznych w stosunku do metod mikroskopowych zebrano w tabeli II. Badania cytometryczne pozwalają na analizę samych komórek lub populacji komórkowych oznaczonych markerami, przez co można ilościowo określić, czy komórki w danym preparacie znajdują się w stanie nekrozy czy też apoptozy, a nawet w jakim są jej stadium [21]. Apoptoza zaczyna się od kurczenia się komórki, widocznego w cytometrze jako zmiany w rozproszeniu wiązki lasera. Początkowo integralność błony komórkowej pozostaje niezmieniona. Aktywacja kaspaz prowadzi do zmian potencjału błony mitochondrialnej, czemu towarzyszą wewnątrzkomórkowe zmiany Ca 2+ oraz ph. Po utracie potencjału błony mitochondrialnej, błony lizosomów także tracą swoją funkcję. Aktywacja endonukleaz ma swoje odzwierciedlenie w redystrybucji fosfatydyloseryny w błonie komórkowej i jej wyeksponowaniem, podczas gdy integralność błony zostaje niezmieniona. Translokacja fosfatydyloseryny zachodzi tuż przed kondensacją chromatyny i degradacją jądra komórkowego. Dopiero w końcowym etapie, komórka rozpada się na ciała apoptotyczne [21, 22]. Metodami cytomertii przepływowej można określić zmiany potencjału membran mitochondrialnych, aktywację kaspaz, ekspozycję i wydzielanie protein mitochondrialnych, Metody mikroskopowe Metody cytometryczne Wady 1. W dużym stopniu ocena subiektywna, zależna koszt 1. Stosunkowo duży od badacza Zalety 1. Mały koszt 1. Krótki czas badania METODY MIKROSKOPOWE METODY CYTOMETRYCZNE Błękit trypanu Aneksyna V Czerwień obojętna 7-AAD Jodek propidyny Barwniki SYTO (Syto-16) Oranż akrydyny Oranż akrydyny Rodamina 123 DiOC6 Badanie aktywności kaspaz Tabela I. Zestawienie metod badania żywotności komórek krwiotwórczych. 2. Krótki czas badania 2. Możliwość precyzyjnego ustalenia żywotności komórek CD34+ lub wykazujących ekspresję kilku innych markerów komórek krwiotwórczych 3. Ocena obiektywna Tabela II. Główne wady i zalety metod mikroskopowych i cytometrycznych w badaniu żywotności komórek krwiotwórczych. 251

4 ekspozycję fosfatydyloseryny, czy zmiany morfologiczne, a więc określić zarówno początkowe etapy, takie jak kurczenie się komórki, a także końcowe czyli pojawienie się ciał apoptotycznych. Nowoczesne metody cytometryczne pozwalają na równoczesną ocenę na powierzchni badanych komórek typowych dla nich antygenów oraz markerów nekrozy i apoptozy. Charakterystyczna dla komórek krwiotwórczych jest ekspresja takich antygenów, jak: CD34, CD71, CD90, CD117, CD123 oraz brak ekspresji: CD38, CD71 i antygenów liniowych [23]. Dla precyzyjnego określenia żywotności komórek krwiotwórczych można równocześnie oceniać ekspresję wielu antygenów, ale ze względów finansowych bada się zazwyczaj tylko CD34 w połączeniu z wybranym markerem apoptozy. Zastosowanie markerów komórkowych oraz barwników pozwala na ilościową analizę żywych komórek, apoptotycznych czy nekrotycznych przez prędkość z jaką barwniki przenikają do komórek i czas na jaki są w nich zatrzymywane. Nienaruszalność błony komórkowej jest charakterystyczna dla większości czasu trwania procesu apoptozy. Integralność błony komórkowej obejmuje zarówno zachowanie jej podstawowej funkcji jaką jest bariera dla jonów i struktur makromolekularnych jak i obecność pomp komórkowych. Analiza ta może być przeprowadzona za pomocą mikroskopu fluoroscencyjnego lub cytometrii przepływowej [21]. Odkrycie, że utrata asymetryczności błony komórkowej i ekspozycja fosfatydyloseryny (PS) są charakterystyczne dla procesu apoptozy w komórkach wszystkich typów pozwoliło na opracowanie metody oznaczania PS w błonie komórkowej za pomocą aneksyny V, która wiąże się z PS w obecności jonów wapnia. Aneksyna V umożliwia rozróżnianie komórek żywych od apoptotycznych. Używając mieszaniny aneksyny V i jodku propidyny (PI), można rozróżnić komórki żywe, apoptotyczne oraz nekrotyczne, ponieważ PI przenika do komórek nekrotycznych, gdzie wiąże się z DNA, podczas gdy aktywna błona komórek apoptotycznych sprawia, że komórki te pozostają niezabarwione. Żywe komórki nie barwią się więc ani za pomocą aneksyny V ani PI. Komórki apoptotyczne, w których błona komórkowa nie straciła integralności, ale już zaszła translokacja PS, barwią się aneksyną. Dopiero komórki nekrotyczne są wybarwiane oboma barwnikami [21]. W metodzie cytometrycznej mogą także być wykorzystane typowe barwniki fluorescencyjne: 7-amino-aktynomycyna D (7-AAD), barwniki SYTO i oranż akrydyny. 7-AAD wiąże się pomiędzy guaniną i cytozyną w podwójnej nici DNA w komórkach nekrotycznych oraz będących w zaawansowanych stadium apoptozy, które już utraciły integralność błony komórkowej [8]. Aneksyna V może być użyta razem z barwnikami wiążącymi się z DNA do określenia komórek nekrotycznych lub będących w późnej apoptozie, w których została zachwiana integralność błony komórkowej. Wprowadzenie 7-AAD do protokołu ISHAGE pozwoliło na eliminację komórek nekrotycznych z analizy [14]. Inną metodą określającą żywotność komórek jest zastosowanie barwników SYTO, które stają się fluorescencyjne po związaniu z kwasami nukleinowymi. Barwniki SYTO są czułe na zmiany struktury chromatyny, co jest jednym z objawów apoptozy. Zastosowanie Syto-16 pozwala na wykrycie funkcjonalnie nieaktywnych komórek CD34 +, niewykrywalnych poprzednimi metodami [17]. Barwienie Syto-16 jest bardziej dokładną metodą wykluczania komórek apoptotycznych niż aneksyna V, ponieważ wraz z postępem apoptozy fluorescencja SYTO zanika. Metodami cytometrycznymi można także określać funkcje mitochondriów, które prawdopodobnie decydują o tym, kiedy zachodzi śmierć komórki. Kluczowym procesem dla roli mitochondriów jest formowanie się megakanałów w ich zewnętrznej membranie, które powodują przechodzenie protein mitochondrialnych do cytoplazmy. Otwarcie tych kanałów wpływa na zachwianie asymetrii w rozłożeniu protonów po obu stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej, co powoduje zmiany jej potencjału. Zmiany te charakteryzują wczesną fazę apoptozy i mogą być oznaczone za pomocą liofilicznych kationowych fluorochromów, które przechodzą przez błonę komórkową takich jak rodamina 123 (Rh123) lub 3,3 -diheksylocarbocjanek jodku (DiOC6). Kombinacja DiOC6 oraz PI pozwala na rozróżnienie między żywymi komórkami, które barwią się na zielono, komórkami we wczesnym stadium apoptozy, których fluorescencja jest zmniejszona oraz komórkami nekrotycznymi wybarwionymi przez PI na czerwono. Rh123 w kombinacji z PI pozwala na rozróżnienie żywych komórek, które barwią się Rh123 i nekrotycznych barwionych PI [21]. Bardzo ważnym barwnikiem wykorzystywanym do badania żywotności PBSCs, zarówno w mikrokopie fluoroscencyjnym, jak i w cytometrze przepływowym jest oranż akrydyny (AO), przenikający przez błonę komórkową i akumulowany w lizosomach, które ze względu na działanie pompy protonowej mają niskie ph. Gdy AO znajdzie się w lizosomach jest protonowany i w nich uwięziony. Barwienie komórek AO odzwierciedla działanie pompy protonowej w lizosomach. Zdolność lizosomów do akumulowania AO pozostaje niezmienna we wczesnych stadiach apoptozy i nagle tracona w czasie nekrozy, co pozwala na rozróżnienie procesu śmierci w jakim znajdują się komórki. Monomeryczne wiązanie AO do DNA skutkuje zieloną fluorescencją, natomiast polimeryczne wiązanie w lizosomach, czerwoną. W czasie apoptozy czerwona fluorescencja pozostaje niezmieniona dzięki zachowaniu funkcjonalności błony lizosomów, natomiast zielona fluorescencja zanika w wyniku degradacji DNA. Czerwony sygnał nasila się w komórkach apoptotycznych i maleje w nekrotycznych, podczas gdy zielony jest stabilny w trakcie początkowej fazy apoptozy. W czasie apoptozy enzymy hydrolityczne degradują struktury makromolekularne, takie jak DNA czy cytoszkielet. Enzymy te, zwane kaspazami odgrywają istotną rolę związaną ze zmianami morfologicznymi zachodzącymi w trakcie apoptozy. W żywej komórce kaspazy są obecne w cytoplazmie jako prekursory enzymów, ale w czasie apoptozy ulegają aktywacji. Metodą pomiaru aktywności kaspaz jest zastosowanie substratów peptydowych które nie są fluorescencyjne, ale pod wpływem działania kaspaz dają świecące produkty [21]. Podsumowanie Jeden z podstawowych wykładników powodzenia transplantacji komórek krwiotwórczych wyrażany jest głównie przez czas potrzebny do odbudowania populacji trombocytów i neutrofili. W przypadku, gdy hematopoeza nie zostanie odbudowana w trak- 252

5 Diagn Lab 2014; 50(3): cie pierwszego miesiąca po przeszczepieniu, życie pacjenta może być zagrożone. Istotne staje się więc określenie liczby żywych komórek krwiotwórczych w preparacie przeszczepowym po rozmrożeniu, ponieważ nawet jeśli ich liczba, pochodząca z aferezy będzie odpowiednia, może ona ulec dramatycznemu obniżeniu w wyniku krioprezerwacji oraz procedury rozmrażania. Idealna metoda badania żywotności komórek przed transplantacją powinna dokładnie określać liczbę żywych, nieapoptotycznych komórek za pomocą możliwie małej ilości reagentów i w jak najkrótszym czasie, tak aby ocena była możliwa tuż po rozmrożeniu, najlepiej w ciągu 1 godziny. Zalety takie mają opisane wyżej metody cytometryczne. Piśmiennictwo: 1. Gratwohl A, Baldomero H, Sureda A. Indications for and current practice of allogeneic and autologous HSCT. In: Haematopoietic stem cell transplantation. The EBMT handbook, Paris, European School of Haematology. 2012; Larghero J, Garcia J, Gluckman E. Sources and procurement of stem cells. In: Haematopoietic stem cell transplantation. The EBMT handbook, Paris, European School of Hamatology. 2008; Moog R. Mobilization and harvesting of peripheral blood stem cells. Curr Stem Cell Res 2006; 1: Cashian J, Shea T. Mobilization of autologous peripheral blood hematopoietic cells for support of high-dose cancer therapy. In: Thomas Hematopoietic Cell Transplantation. 3th ed. Malden, Blackwell Publishing Ltd 2004; Fu S, Liesveld J. Mobilization of hematopoietic stem cells. Blood Reviews 2000; 14: Lemoli R. New strategies for stem mobilization. Mediterr J Hematol Infect Dis 2012; 4: e Lanza F, Lemoli RM, Olivieri A, et al. Factors affecting successful mobilization with plerixafor: an Italian prospective survey in 215 patients with multiple myeloma and lymphoma. Transfusion 2014; 54: Bakanay SM, Dalva K, Arat M, et al. Does continuous flow apheresis influence viability in allogenic hematopoietic stem cell harvest? Transf Apher Sci 2006; 34: Schlenke P, Mertens A, Ahlke C. How do I collect and process stem cells? ISBT Sci Ser 2010; 5: Cioch M, Wach M, Jawniak D, Mańko J, Legieć W, Walter-Croneck A et al. The different peripheral blood stem cell mobilization methods in patients with multiple myeloma. Bone Marrow Transplantation 2010; 45: 578 (abstr). 11. DiPersio JF, Stadtmauer EA, Nademanee A, et al. Plerixafor and G-CSF versus placebo and G-CSF to mobilize hematopoietic stem cells for autologous stem cell transplantation in patients with multiple myeloma. Blood 2009; 113: Barnett D, Janossy G, Lubenko, et al. Guideline for the flow cytometric enumeration of CD34 + hematopoietic stem cells. Clin Lab Haem 1999; 21: Jędrzejczak WW. Transplantacja komórek krwiotwórczych jako metoda leczenia chorób rozrostowych układu krwiotwórczego. Wielka Interna Hematologia pod red. Dmoszyńskiej A. Medical Tribune, Warszawa 2011: Keeney M, Gratama JW, Sutherland DR. Critical role of flow cytometry in evaluating peripheral blood hematopoietic stem cell grafts. Cytometry Part A 2004; 58A: Brocklebank AM, Sparrow RL. Enumeration of CD34 + cells in cord blood: A variation on a single-platform flow cytometric method based on the ISHAGE gating strategy. Cytometry 2001;46: Bozdag SC, Bay M, Ayyildiz E, et al. Impact of age and diagnosis on viability during centrifugation and cryopreservation of peripheral blood stem cell products. Transf Apher Sci 2012; 47: de Boer, Dräger AM, Pinedo HM, et al. Extensive early apoptosis in frozen-thawed CD34-positive stem cells decreases threshold doses for hematological recovery after autologius peripheral blood progenitor cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2002; 29: Bakken AM. Cryopreserving human peripheral blood progenitor cells. Current Stem Cell Res& Ther 2006; 1: Solomon M, Wofford J, Johnson C, et al. Factors influencing cord blood viability assessment before cryopreservation. Transfusion 2010; 50: Humpe A, Beck C, Schoch R, et al. Establishment and optimization of a flow cytometric method for evaluation of viability of CD34 + cells after cryopreservation and comparison with trypan blue exclusion staining. Transfusion 2005; 45: Vermes I, Haanen C, Reutelingsperger C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Meth 2000; 243: Darzynkiewicz Z, Juan G, Li X, et al. Cytometry in cell necrobiology: analysis of apoptosis and occidental cell death (necrosis). Cytometry 1997; 27: Cioch M, Gromek T, Dmoszyńska A. Znaczenie powierzchniowych markerów komórek macierzystych w przeszczepianiu szpiku. A Haemat Pol 2006; 37: Adres do korespondencji: dr Maria Cioch Klinika Hematoonkologii i Transplantacji Szpiku Uniwersytetu Medycznego w Lublinie Lublin, ul. Staszica 11 Tel mariacioch@wp.pl Zaakceptowano do publikacji:

6 254