Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji w preparatach kriokonserwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Acta Haematologica Polonica Original Article 2006, 37, Nr 3 str KRZYSZTOF ILNICKI 1, ELŻBIETA URBANOWSKA 2 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji w preparatach kriokonserwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej Occurence of spontaneous aggregation in the preparations of the cryopreserved nuclear cells obtained from the cord blood 1 Z Zakładu Genetyki, Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie, Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Małgorzata Krajewska-Walasek 2 Z Katedry i Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych A.M. w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. n. med. Wiesław Wiktor Jędrzejczak SŁOWA KLUCZOWE: Krew pępowinowa Agregacja komórek jądrowych Kriokonserwacja KEY WORDS: Cord blood Nuclear cells aggregation Cryopreservation STRESZCZENIE: Zjawisko nieswoistej agregacji komórek ( cell clumping ) występuje w kriokonserwowanych preparatach komórek jądrowych uzyskiwanych z krwi pępowinowej, szpiku i krwi obwodowej po ich rozmrożeniu. W celu oceny zjawiska nieswoistej agregacji badano wpływ wzrastającej gęstości zawiesiny wypreparowanych z krwi pępowinowej komórek jądrowych, poddawanych następnie kriokonserwacji. Oceniono również wpływ dwu wybranych metod rozmrażania kriokonserwowanych komórek na nasilenie tego zjawiska. Intensywność agregacji komórek wzrastała wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny: od ok. 15% zagregowanych komórek występujących w stężeniach 5 i 10 mln/ml do ok. 43% w stężeniu 50 mln/ml podczas rozmrażania metodą klasyczną. Zastosowanie do rozcieńczenia komórek płynu zawierającego dekstran (metoda rozmrażania wg Rubinsteina) w znacznym stopniu ograniczyło zjawisko agregacji. Niezależnie od intensywności procesu agregacji i zastosowanej metody rozmrażania, liczba komórek na komórek, które nie uległy agregacji, utrzymywała się na bardzo zbliżonym poziomie tj. ok. 70 % w stosunku do liczby tych komórek przed mrożeniem. Proces nieswoistej agregacji nie ma charakteru wybiórczego i dotyka w równym stopniu wczesne komórki jak i komórki dojrzałe a substancje takie jak dekstran w znacznym stopniu hamują nieswoistą agregację komórek. SUMMARY: The phenomenon of nonspecific cell aggregation (cell clumping) appears after thawing in the nucleated cell preparations obtained from the Bone Marrow, Peripheral Blood and the Umbilical Cord Blood (UCB). To evaluate the cell clumping phenomenon, the influence of an increasing density of the nucleated cell suspension, extracted from the UCB and freezed, was examined. The two selected techniques of thawing were also evaluated for their influence on cell clumping. The intensity of the cell clumping increased simultaneously with the growing density of the cell suspension. It rose from app. 15% in the 5 and 10 mln/ml groups to app. 43% in the 50 mln/ml groups, when thawed accordingly to the classic technique. If the solution containing dextran

2 106 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA (Rubinstein s technique) was applied post thaw to dilute the cell suspension, the clumping phenomenon was markedly inhibited. Regardless of the intensity of the aggregation process, the number of the CFC in the whole pool that remained suspended after thawing (per cells), remained on a quite stable level of app. 70% of the prefreezing value. This phenomenon does not appear to be selective, it affects both the early haematopoietic cells (CFC) and the mature cells, independently of the initial density of the freezed suspension, and the substances like dextran may markedly inhibit the process. WSTĘP Krwiotwórcze komórki macierzyste są wykorzystywane do leczenia wielu śmiertelnych dawniej chorób, w tym nowotworów układu go i odpornościowego. Stosuje się je u chorych poddanych masywnej chemioterapii lub radioterapii mającej na celu zniszczenie komórek nowotworowych. Zniszczeniu ulegają wtedy również zdrowe komórki macierzyste występujące w szpiku. Dla skorygowania tego niedoboru dokonuje się przeszczepienia komórek krwiotwórczych, które po różnicowaniu i proliferacji wytworzą wszystkie elementy morfotyczne krwi funkcjonujące przez pozostały czas życia chorego (7). Komórki tj. komórki macierzyste i ukierunkowane krwi pępowinowej stanowią niejednorodną populację z przewagą mniej dojrzałych komórek, których potencjał proliferacyjny jest znacznie większy niż w szpiku (18). Ta cenna właściwość krwi pępowinowej pozwala na przeszczepienie mniejszej liczby komórek krwiotwórczych niż przy zastosowaniu przeszczepu szpiku lub komórek krwiotwórczych z krwi obwodowej. Komórki te muszą występować w odpowiedniej liczbie i jakości zapewniającej pełną odnowę hematologiczną biorcy przeszczepu (8, 19). W chwili obecnej krew pępowinowa może być stosowana do leczenia, gdy niedostępne są inne źródła tych komórek, tj. szpik kostny i krew obwodowa (19). Podstawową niedogodnością związaną z wykorzystaniem krwi pępowinowej do przeszczepienia u biorców dorosłych jest jej ograniczona i stosunkowo niewielka objętość, w której zawarta jest ograniczona liczba komórek krwiotwórczych nawet wtedy, gdy krew pobierana jest przez fachowy, przeszkolony personel medyczny (6). Liczba komórek krwiotwórczych, która występuje w krwi pępowinowej wystarcza do przeszczepienia u dzieci o masie ciała ok. 30 kg, ale jest niewystarczająca do wykonywania tego typu zabiegów u biorców dorosłych, mimo że zamrażane są tylko wyselekcjonowane jednostki krwi, spełniające kryteria pozyskania określonej liczby komórek krwiotwórczych (16). Stwarza to konieczność zastosowania na tyle wydajnych metod preparatyki, aby odzysk komórek przeznaczonych do przeszczepienia był jak najwyższy (2, 9). Spontaniczna i nieswoista agregacja komórek jądrowych tzw. cell clumping stanowi jedno ze zjawisk ograniczających liczbę izolowanych komórek efektywnie dostępnych do przeszczepienia (8). Występuje ono w przechowywanych przez dłuższy czas w temperaturze 4 C nie poddawanych żadnej preparatyce jednostkach krwi obwodowej, szpiku jak też i krwi pępowinowej. Zachodzi również bardzo intensywnie i czę-

3 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji 107 sto gwałtownie w rozmrożonych preparatach wyizolowanych komórek jądrowych poddawanych uprzednio kriokonserwacji (11). Celem pracy było zbadanie nasilenia zjawiska agregacji komórek jądrowych krwi pępowinowej w zależności od gęstości zawiesiny tych komórek poddawanych zamrażaniu. Ponadto, oceniano wpływ wybranych podłóż hodowlanych na zjawisko agregacji występujące w rozmrażanej próbce. MATERIAŁ I METODY Pracę wykonano na 89 porcjach krwi pępowinowej pobieranej w trakcie porodów rozwiązywanych siłami natury. Metodą grawitacyjną pozyskiwano krew pępowinową do butelki zawierającej podłoże Iscove a (Gibco Ltd) z dodatkiem 1500 IU heparyny (Biochemie GmBH). Wiek rodzących wahał się w przedziale od 18 do 34 lat, były zdrowe, a porody odbywały się bez komplikacji. W każdej pozyskanej jednostce krwi pępowinowej określano jej objętość, bezwzględną liczbę komórek jądrowych (za pomocą analizatora hematologicznego Cell Dyna 1700 firmy Abbott) w populacji, których zawarte są komórki macierzyste i ukierunkowane oraz oceniano ich żywotność metodą wchłaniania błękitu trypanu. W dalszym etapie badań krew pępowinową poddawano separacji na 3% roztworze skrobi hydroksyetylowanej (Fresenius AG) w celu uzyskania frakcji komórek jądrowych. Po procedurze sedymentacji i dalszej preparatyce doprowadzano zawiesinę komórek jądrowych do gęstości wyjściowej wynoszącej 10,9 mln komórek w 1 ml. Z uzyskanej w taki sposób zawiesiny komórek przygotowano próbki przeznaczone do zamrożenia. Zmiany liczby komórek jądrowych po rozmrożeniu próbki i dalszej preparatyce odnoszono do tej wyjściowej wartości. Dla określenia liczby komórek krwiotwórczych i ich zdolności do tworzenia kolonii hematopoetycznych zakładano hodowlę w podłożu z metylcelulozą (17). W wyjściowej liczbie komórek jądrowych wynoszącej 10,9 mln komórek w 1 ml, liczba komórek wynosiła ± 8393 w 1 ml (142 ± 85 na komórek jądrowych). Zmiany liczby komórek po rozmrożeniu próbki i dalszej preparatyce odnoszono do tych wyjściowych wartości. W celu określenia optymalnych warunków mrożenia komórek krwiotwórczych uprzednio wyizolowane komórki jądrowe zawieszano w płodowej surowicy cielęcej. Doprowadzano gęstość komórek do stężenia 50; 20; 10 i 5 mln komórek w 1 ml. Tak przygotowany 1 ml zawiesiny komórek przenoszono do fiolek krioprezerwacyjnych (Nalge Nunc Int.) i dodawano do niej po 0,25 ml podłoża Iscove a z dodatkiem DMSO (końcowe stężenie DMSO wynosiło 7%). Zamrażanie prowadzono według klasycznej procedury kriokonserwacji komórek limfoidalnych. Fiolki przechowywano w temperaturze C. W celu oceny wydajności odzysku kriokonserwowanych komórek krwiotwórczych i wpływu podłoży hodowlanych na występowanie agregacji komórek do rozmrażania próbek zastosowano 2 wybrane metody, tj. metodę klasyczną

4 108 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA oraz opisaną przez Rubinsteina (14). Po 3 miesiącach przechowywania w ciekłym azocie (MESSER System) próbki rozmrażano w łaźni wodnej w temperaturze 37 C nieustannie mieszając. Po całkowitym rozmrożeniu badanej próbki dodawano kroplami podłoże Iscove a z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (metoda klasyczna) lub płyn do rozmrażania komórek zawierający dekstran (metoda Rubinstein a). W rozmrożonej próbce określano liczbę komórek jądrowych oraz ich żywotność metodą wchłaniania błękitu trypanu. Zawiesinę uzupełniano płynem Iscove a lub płynem przygotowanym wg metody Rubinsteina. W celu określenia liczby komórek In vitro zakładano hodowle w metylcelulozie. (Stem Cell Tech) (10). Otrzymane wartości przedstawiano jako średnie ± odchylenie standardowe. Porównania między grupami były przeprowadzane z użyciem testu t Studenta, a wartości p poniżej 0,05 uznawano za statystycznie znamienne. WYNIKI Wpływ stężenia komórek jądrowych przechowywanych w ciekłym azocie na żywotność, wydajność odzysku tych komórek oraz komórek. a. Żywotność komórek jądrowych Po przechowaniu materiału w ciekłym azocie i rozmrożeniu żywotność komórek jądrowych wynosiła 83 %. b. Wydajność odzysku komórek jądrowych. Po rozmrożeniu fiolki z badaną próbką, liczba komórek jądrowych w zawiesinie była mniejsza niż przed zamrożeniem (Ryc. 1). Odzysk komórek rozmrażanych metodą Rubinsteina wynosił ok. 85% we wszystkich badanych grupach. Podobny odsetek odzysku zaobserwowano w grupie zawierającej próbki o niższych stężeniach komórek, tj. 5 i 10 mln w 1 ml zawiesiny rozmrażanych metodą klasyczną. W grupach zawierających komórki występujące w wyższych stężeniach, tj. 20 i 50 mln komórek w 1 ml zawiesiny odzysk komórek jądrowych rozmrażanych metodą klasyczną wyraźnie się zmniejszał osiągając wartość ok. 57%. W tej grupie występowała również duża zmienność, większa niż w grupie materiału rozmrażanego metodą Rubinsteina. Nie stwierdzono istotnej statystycznie różnicy (p < 0.05) pomiędzy wpływem stężenia 5 i 10 mln oraz 10 i 20 mln komórek jądrowych w 1 ml zawiesiny a odsetkiem odzysku tych komórek rozmrażanych metodą klasyczną. Natomiast, występowała statystycznie znamienna różnica (p < 0.05) pomiędzy wpływem stężenia 20 i 50 mln oraz 10 i 50 mln komórek jądrowych w 1ml zawiesiny a odsetkiem odzysku tych komórek rozmrażanych metoda klasyczną. Ponadto, nie występowała znamiennie statystyczna różnica (p<0.05) pomiędzy wpływem stężenia 5, 10, 20 i 50 mln komórek jądrowych rozmrażanych metodą Rubinstein a a odsetkiem odzysku tych komórek po ich rozmrożeniu. Te dane mogą jednak być mylące gdyż nie wszystkie komórki jądrowe były żywe. W związku z powyższym w Tab. 1 zestawiono wartości dokonując korekty w oparciu o dane dotyczące żywotności komórek jądrowych.

5 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji 109

6 110 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA

7 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji 111 c. Wydajność odzysku komórek. Populacje komórek jądrowych pozostających w zawiesinie po rozmrożeniu próbki metodą klasyczną i wg Rubinsteina prezentują zbliżone wartości odsetka odzysku komórek, w przeliczeniu na hodowanych komórek, które nie uległy agregacji, niezależnie od ich stężenia w próbce poddawanej kriokonserwacji. (Ryc. 2). Nie stwierdzono statystycznie znamiennej różnicy (p<0,05) Tabela 1. Zmiany liczby żywych komórek jądrowych po krioprezerwacji i przechowywaniu w temperaturze 196 C materiału zamrożonego w różnych stężeniach oraz rozmrażanego metodą klasyczną lub metodą Rubinsteina Table 1. Changes in the number of living, nucleated cells after cryopreservation and storage of the material in different concentrations in 196º C, and thawing by classic and Rubinstein s methods Gęstość zawiesiny komórek jądrowych podczas przechowywania Względna i bezwzględna liczba odzyskanych komórek jądrowych w zależności od zastosowanej metody rozmrażania Odsetek liczby wyjściowej Metoda Klasyczna Liczba bezwzględna Metoda wg Rubinsteina Odsetek liczby wyjściowej Liczba bezwzględna 5 x 10 6 /ml 67 % 7,3 x ,5 % 7,9 x x 10 6 /ml 69 % 7,5 x ,5 % 7,8 x x 10 6 /ml 61,5 % 6,7 x ,5 % 7,8 x x 10 6 /ml 47 % 5,1 x % 7,5 x 10 6 Tabela 2. Zmiany liczby komórek po krioprezerwacji w temperaturze 196 C i przechowywaniu zamrożonego materiału w różnych stężeniach oraz rozmrażanego metodą klasyczną lub wg Rubinsteina. Table 2. Changes in the number of hematopoietic colony forming cells after cryopreservation and storage of the material in different concentrations in C, and thawing by classic and Rubinstein s methods Gęstość zawiesiny komórek jądrowych Liczba komórek na 10 5 komórek jądrowych Metoda klasyczna Liczba komórek na 1 ml Odsetek odzysku liczby komórek na 1 ml w odniesieniu do liczby wyjściowej Liczba komórek na 10 5 komórek jądrowych Metoda Rubinsteina Liczba komórek na 1 ml. Odsetek odzysku liczby komórek na 1 ml w odniesieniu do liczby wyjściowej 5 x 10 6 /ml 101 ± ± ,1% 100 ± ± ,7% 10 x 10 6 /ml 101 ± ± % 102 ± ± ,0% 20 x 10 6 /ml 95 ± ± ,4% 96 ± ± ,9%

8 112 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA 50 x 10 6 /ml 98 ± ± ,3% 98 ± ± ,9% pomiędzy wpływem stężenia komórek jądrowych w próbkach przechowywanych w ciekłym azocie rozmrażanych metodą klasyczną i Rubinstein a a odzyskiem komórek (na komórek, które pozostały w zawiesinie). W tabeli 2 przedstawiono zmiany liczby komórek z uwzględnieniem spadku żywotności komórek jądrowych i wpływu przechowywania w zamrożeniu różnych gęstości zawiesin tych komórek. Na liczbę komórek, w przeliczeniu na rozmrożonych komórek jądrowych, które nie uległy agregacji, nie ma wpływu ani początkowa liczba tych komórek w zamrażanej próbce ani metoda jej rozmrażania. Całkowita liczba komórek w 1 ml rozmrożonej próbki zmniejszała się wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny komórek. Zmniejszenie liczby tych komórek jest znaczniejsze w przypadku rozmrażania metodą klasyczną (o ok. 66% w stosunku do liczby wyjściowej) niż w przypadku rozmrażania metodą wg Rubinstein a (o ok. 51%). OMÓWIENIE WYNIKÓW Bardzo istotnym zjawiskiem, które występuje podczas procesu zamrażania komórek jądrowych z krwi pępowinowej, szpiku i krwi obwodowej jest nieswoista agregacja ( cell clumping ). Powoduje ono zmniejszenie liczby komórek krwiotwórczych efektywnie dostępnych do przeszczepienia. Jest to o tyle istotne w odniesieniu do krwi pępowinowej, ponieważ zwykle pobiera się jej niewielką objętość i uzyskanie jak największej liczby komórek krwiotwórczych stanowi istotny problem techniczny. Zjawisko nieswoistej agregacji komórek obserwowane jest w przechowywanym przez dłuższy czas materiale świeżym, podczas gdy w materiale poddawanym zamrażaniu jego intensywność jest znacząco wyższa a skutki są widoczne po minutach lub nawet sekundach po rozmrożeniu. Stwarza to niejednokrotnie dramatyczne sytuacje (11) i wymusza stosowanie metody zamrażania materiału transplantacyjnego w niewielkich porcjach tj. w probówkach (czasami ponad 300 porcji na jeden zabieg przeszczepienia), po to by uniknąć ewentualnych strat komórek. Jednakże wykonywanie wielu dodatkowych czynności w zastosowanym w ten sposób tzw. układzie otwartym preparatyki może grozić zakażeniem materiału poddawanego preparatyce. W obecnej pracy zastosowano dwie metody rozmrażania krioprezerwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej. Metoda klasyczna polegała na rozcieńczeniu rozmrożonej zawartości fiolki podłożem hodowlanym z dodatkiem płodowej surowicy cielęcej, natomiast metoda Rubinsteina polegała na rozcieńczeniu zawartości fiolki płynem zawierającym dekstran (10). Zadaniem składników zawartych w tym płynie było zapobieżenie spontanicznej agregacji komórek. Niezależnie od zastosowanej metody rozmrażania, jak i gęstości zawiesiny zamrażanych komórek, liczba komórek (w przeliczeniu na hodowanych komórek jądrowych, które nie uległy agregacji) pozostawała taka sama. Wynika z tego, że proces agregacji komórek pozostających w zawiesinie nie jest procesem wybiórczym i dotyka zarówno komórki ukierunkowane tworzące, jak i już bar-

9 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji 113 dziej dojrzałe komórki, niezależnie od nasilenia w/w procesu, które następuje wraz ze wzrostem gęstości zawiesiny komórek jądrowych w próbce. Prezentowane wyniki zgodne są z wynikami przedstawionymi przez Schlebaka i wsp. (15), Armitage i wsp (12), Alcorna i wsp. (1) oraz Perez-Oteyza i wsp. (13), którzy nie stosowali procedury zapobiegającej agregacji i wykazali, że wartość odzysku komórek jądrowych zamrożonych w stężeniu 70 mln komórek w 1 ml zawiesiny wynosi 54%. Wartość ta jest zbliżona do wartości uzyskanej w niniejszej pracy (57%), gdy zawiesinę o gęstości 50 mln komórek w 1 ml rozmrażano metodą klasyczną. Powstające w wyniku procesu spontanicznej agregacji komórek struktury są trudne do rozbicia i próby wykonania tego wiążą się z obniżeniem żywotności komórek. Beaujean i wsp. (3) donoszą o udanych próbach rozbijania agregatów komórek poprzez ich energiczne wytrząsanie, lecz wyniki przedstawione w obecnej pracy nie potwierdzają tych danych. Wydaje się, że w zjawisku spontanicznej agregacji bierze udział szereg procesów i czynników zachodzących równolegle, lecz nie koniecznie ze sobą powiązanych. Są to między innymi: uwalniająca się w wyniku degradacji granulocytów i płytek krwi tromboplastyna i enzymy proteolityczne, czynnik antyheparynowy, obecny w surowicy C-zależny czynnik powodujący selektywną adhezję granulocytów i monocytów oraz obecność nici DNA ze zdegradowanych komórek. W trakcie procesu obserwowana jest nasilona degradacja granulocytów i płytek krwi. Komórki te są dużo bardziej wrażliwe na proces kriokonserwacji niż limfocyty, a ponadto optymalny dla nich jest inny schemat mrożenia. Podczas zamrażania limfocytów, obecne dodatkowo w zawiesinie, prawie wszystkie granulocyty i płytki krwi ulegają destrukcji. Można założyć, że powstała w wyniku ich destrukcji tromboplastyna uczestniczy w powstawaniu fibrynogenu co prowadzi do zlepiania komórek jądrowych, a wśród nich komórek. Uwolnione enzymy proteolityczne oddziaływują na inne, jeszcze nie zdegradowane komórki powodując dalsze narastanie poziomu tromboplastyny i wzmożoną agregację komórek. Nici DNA pochodzące z już zdegradowanych komórek sprzyjają zlepianiu tych komórek, które jeszcze pozostają w zawiesinie. Z przedstawionych danych wynika, że w trakcie rozmrażania materiału kriokonserwowanego komórki, które tworzą nie uczestniczą czynnie w procesie agregacji. Natomiast właśnie komórki dodatkowe są czynnikiem sprawczym między innymi procesu agregacji, a co za tym idzie strat komórek krwiotwórczych odpowiedzialnych za rekonstytucję hematopoezy u biorcy przeszczepu. Przeciwdziałanie procesowi agregacji prowadzone jest różnymi metodami. Bock i wsp. (5) helatują przy użyciu EDTA jony Ca ++ niezbędne do aktywacji fibrynogenu. Dodawane są także ACD i heparyna do podłoża do mrożenia oraz do podłoża do rozcieńczania rozmrażanych komórek. Li i wsp.(10) inaktywują uwolnione w wyniku degradacji granulocytów enzymy proteolityczne leupeptyną a Beck i wsp.(4) twierdzą, że istnieje możliwość rozbijania już powstałych agregatów za pomocą DNA-zy I. Jednak, Nicol i wsp. (12) negują przydatność DNA-zy. Uzyskane wyniki wskazują, że zastosowanie podłoża z dodatkiem dekstranu i albuminy ludzkiej w znacznym stopniu hamuje zjawisko spontanicznej agregacji.

10 114 K. ILNICKI, E. URBANOWSKA W praktyce klinicznej materiał komórkowy stosowany do przeszczepień krwiotwórczych zwykle nie podlega rozcieńczeniu, dlatego należałoby rozważyć wstępne zawieszenie takiego materiału jeszcze przed mrożeniem, w,,podłożu Rubinsteina z dodatkiem krioprotektora. To z kolei, wymaga przeprowadzenia dodatkowych badań nad zachowaniem komórek w tak odmiennym środowisku, a także reakcji biorcy przeszczepu na to środowisko. PIŚMIENNICTWO 1. Alcorn MJ, Holyoake TL, Richmond LJ, Pearson C, Farrell E, Green R, Dunlop DJ, Franklin IM. CD34+ cells can be selected efficiently from cryopreserved peripheral blood progenitor cells and can retain their proliferative potential. J. Hematotherapy 1997; 6: Armitage S, Fehily D, Dickinson A, Chapman C, Navarrete C, Contreras M. Cord blood banking: volume reduction of cord blood units using a semiautomated closed system. Bone Marrow Transplantation 1999, 23: Beaujean F, Bourhis J-H, Bayle C, Jouault H, Divine M, Rieux C, Janvier M, Le Forestier C, Pico JL. Successful cryopreservation of purified autologous CD34+ cells: influence of freezing parameters on cell recovery and engraftment. Bone Marrow Transplantation 1998; 22: Beck C, Nguyen X.D, Kluter H, Eichler H. Effect of recombinant human deoxyribonyclease on the expression of cell adhesion molecules oof thawed and processed cord blood hematopoietic progenitors. Eur. J. Hæmatol. 2003; 70: Bock GN, Chess L, Mardiney MR. Prevention of clumping of frozen-stored leukocyte populations by EDTA. Cryobiology 1972; 9: Ilnicki K. Efficacy of the umbilical cord blood collection in the conditions of the delivery room s staff routine work. Evaluation using some selected physiological parameters. Acta Haematol. Pol. 1986; 27: Ilnicki K, Jędrzejczak WW. Przeszczepianie komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej u człowieka alternatywą dla przeszczepień szpiku kostnego. Post. Biol. Kom. 994; 21: Jędrzejczak WW. Komórki macierzyste krwiotworzenia. w Ultrastruktura i Funkcja Komórki red J. Kawiak i Z. Osuchowska P W N 1989; 3: Jędrzejczak WW, Urbanowska E. Isolation and cryopreservation of haematopoietic stem and progenitor cells from peripheral blood and cord blood. w Advances in Tissue Banking. World Scientific Publishing 2002; Li ML, Panterne B, Levesque J-P, Hatzfeld A, Hatzfeld J. Cryopreservative effect of leupeptin on early human BM progenitors. In Vitro Cellular and Developemental Biology 1992; 28A: Mandanas RA, Kratochvil A, Garner T, Selby GB. Formation of fibrin clots in cryopreserved stem cell bags during thawing procedure: lack of impact on engraftment in autologous stem cell transplantation. Bone Marrow Transplantation 1999; 23: Nicol A, Nieda M, Donaldson C, Denning-Kendall P. Analysis of cord blood CD34+ cells after cryopreservation. Exp. Hematol. 1995; 23: Perez-Oteyza J, Bornstein R, Corral M, Hermosa V, Alegre A, Torrabadella M, Ramos P, Garcia J., Odriozola J., Navarro J.L. Controlled- versus uncontrolled-rate cryopreservation of peripheral blood progenitor cells: a prospective multicenter study. Haematologica 1998; 83: Rubinstein P, Dobrila L, Rosenfeld RE, Adamson JW, Migliaccio G, Migliaccio AR, Taylor PE, Stevens CE. Processing and cryopreservation of placental/umbilical cord blood for unrelated bone marrow reconstitution. Proc Nat Acad Sci, 1995; 92: Schlebak AA, Marley SB, Roberts IAG, Goldman JM, Gordon MY. Optimal timing for processing and cryopreservation of umbilical cord hematopoietic stem cells for clinical transplantation. Bone Marrow Transplantation 1999; 23:

11 Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji Solves P, Perales A, Mirabet V, Blasco J, Blanquer A, Planelless D, Larrea L, Monleon J, Carbonell-Ubreros F. Angeles Soler M. Optimizing Donor selection in a Cord Blood Bank. Eur. J. Hæmatol. 2004; 72: Sutherland HJ, Eaves AC, Eaves CJ.: Quantitative assays for human hematopoietic progenitor cells. w Bone Marrow Processing and Purging: a Practical Guide. Ed, A.P.Gee CRC Press Inc. Boca Raton PP 1991; Tanavade VM, Malehorn MT, Lumkul R, Gao Z, Wingard J, Garrett ES, Civin CI. Human Stem Progenitor cells from neonatal Cord Blood have greater hematopoietic expansion capacity then those from mobilised adult blood. Exp. Hematol. 2002; 30: Urbanowska E, Jędrzejczak WW. Krew pępowinowa jako źródło komórek krwiotwórczych do przeszczepienia. Acta Haematol. Pol. 2004; 35: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Krzysztof Ilnicki ul. Bukowskiego 7/ Warszawa