EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH

Transkrypt

1 EKOFIZJOLOGIA MIKROORGANIZMÓW WODNYCH II. AKTYWNOŚĆ METABOLICZNA PLANKTONU JEZIORNEGO I PARAMETRY FIZYKOCHEMICZNE WODY Prowadzący ćwiczenia: Dr Waldemar Siuda Mgr Aleksandra Bukowska 1

2 Aktywność mikroorganizmów wodnych Uwagi ogólne Aktywność mikroorganizmów wodnych można określić na podstawie pomiarów dynamiki wielu procesów metabolicznych. Najczęściej używane metody to: pomiar tempa produkcji pierwotnej i wtórnej, określanie tempa respiracji oraz badanie aktywności enzymatycznej fito- i bakterioplanktonu. Miarą aktywności (A) jest przyrost badanego parametru (P) w czasie (t) A = f P(t). Aktywność może, lecz nie musi być funkcją biomasy mikro-organizmów. Jest ona zwykle wypadkową wielu czynników ekologicznych takich jak temperatura, ph, stężenie tlenu, ilość i skład widmowy światła, dostępność biogenów (substratów), biomasa i skład gatunkowy zespołów fito- i bakterioplanktonu itp. A = f (biomasy, fizjologii, warunków środowiska). Dla zrozumienia mechanizmów funkcjonowania środowisk wodnych niezbędnym jest rozróżnienie aktywności potencjalnej i aktywności rzeczywistej. W wyniku pomiarów określamy zwykle aktywność potencjalną tzn. aktywność ujawniającą się w konkretnych, zdefiniowanych warunkach pomiaru. Jeżeli warunki te są optymalne dla przebiegu badanego procesu mówimy, jak np. w przypadku aktywności ektonzymów, o maksymalnej aktywności potencjalnej (V max ). Aktywność rzeczywista to aktywność ujawniana in situ. Jest ona zwykle znacznie niższa niż aktywność potencjalna. Może ona przewyższać aktywność potencjalną tylko wyjątkowo np. w przypadku produkcji pierwotnej, gdy warunki świetlne w miejscu pomiaru są bardziej korzystne niż w środowisku. 2

3 Produkcja pierwotna fitoplanktonu (metoda tlenowa) Produkcja pierwotna - uwagi ogólne Produkcja pierwotna planktonu jest głównym źródłem autochtonicznej materii organicznej w większości ekosystemów wodnych. Jest to proces realizowany głównie przez glony i cyanobakterie (fitoplankton), lecz również przez chemolitotrofy oraz bakterie fotosyntetyzujące. Produkcja pierwotna przeliczona na jednostkę objętości lub powierzchni określana jest mianem produktywności. Tempo produkcji pierwotnej zależy od: (i) biomasy i składu gatunkowego zespołów producentów pierwotnych (zawartości barwników roślinnych w wodzie), (ii) warunków świetlnych (długość dnia, natężenie radiacji, spektrum, fotoinhibicja, samozacienianie), (iii) temperatury, (iv) dostępności biogenów - głównie fosforu i azotu, lecz również mikroelementów np. Si, Fe, a czasem nawet CO 2 (środowiska silnie zakwaszone), (v) obecności inhibitorów (metale ciężkie, allelopatia) oraz (vi) ilości i aktywności fito-, cyjanoi bakteriofagów (grazing, sloppy feeding). Najczęściej stosowane metody pomiaru produkcji pierwotnej fitoplanktonu to opracowana przez Steemana Nielsena metoda radioizotopowa z użyciem H 14 CO 3 oraz metoda tlenowa. Produkcję pierwotną chemolitotrofów określa się mierząc np. różnicę w tempie inkorporacji H 14 CO 3 w próbkach niewzbogaconych oraz wzbogaconych dodatkiem inhibitorów fotosyntezy, inkubowanych w ciemności. 3

4 Zasada pomiaru Kompleks reakcji biochemicznych zachodzących podczas fotosyntezy fitoplanktonu opisuje uproszczone równanie: światło 6 CO H 2 O C 6 H 12 O 6 +6O 2 +6H 2 O Metoda pomiaru tempa produkcji pierwotnej fitoplanktonu oparta jest na stechiometrii powyższego równania, tzn. na analizie przyrostu stężenia tlenu rozpuszczonego w badanych próbkach wody w czasie ich inkubacji na świetle w warunkach in situ. Podczas ekspozycji świetlnej próbek wody zachodzi równolegle wytwarzanie (fotosynteza) i zużywanie tlenu (respiracja). Dlatego też w analizowanych pod kątem tempa fotosyntezy próbkach wody należy wprowadzić korektę ilości tlenu zużytego przez mikroorganizmy wodne podczas oddychania. Odczynniki Do pomiaru tempa produkcji pierwotnej fitoplanktonu odczynniki i procedura oznaczania tlenu w wodzie. metodą tlenową niezbędne są Oznaczenie Próbki badanej wody należy rozlać do 6 jasnych i 3 ciemnych (owiniętych szczelnie folią aluminiową) butelek do oznaczania tlenu (ok. 100 ml; o dokładnie znanej pojemności). Butelki (3 jasne i 3 ciemne) należy szczelnie zamknąć korkiem szklanym (uważając, aby nie było w nich pęcherzyków powietrza) i inkubować je przez okres 6-8 godz. (dla celów niniejszych ćwiczeń próbki będą inkubowane w termo-iluminostacie). W pozostałych 3 butelkach oznaczyć zawartość tlenu rozpuszczonego (początkowe stężenie tlenu w czasie To O P 2 ). Podobnie oznaczyć stężanie tlenu rozpuszczonego w wodzie po inkubacji, w J butelkach jasnych (O 2 ) i ciemnych (O C 2 ). 4

5 Obliczenia Różnica pomiędzy zawartością tlenu w butelkach jasnych (O J 2 ) po okresie ich świetlnej ekspozycji (dla celów niniejszych ćwiczeń próbki będą inkubowane w termoiluminostacie), a początkową ilością tlenu (O P 2 ) w wodzie (o ile tempo wytwarzania tlenu w fotosyntezie przewyższa tempo jego zużywania w procesie respiracji mikroplanktonu) odpowiada produkcji pierwotnej netto (P n ). P n = O 2 J O 2 P T inkub. (mg O 2 L -1 godz. -1 ) Uwzględniając ilość tlenu zużytego w procesie respiracji mikroplanktonu (R m ) oraz jego ilość powstającą równolegle podczas produkcji pierwotnej netto (P n ) w ogólnym bilansie ilości O 2 w badanych próbkach wody podczas ich kilkugodzinnej inkubacji na świetle można wyliczyć wyrażoną tlenem produkcję pierwotną brutto (P b ). P b = [(O 2 J O 2 P ) +(O 2 P O 2 C ) T inkub. (mg O 2 L -1 godz. -1 ) P O 2 C O 2 J O 2 P n P b T inkub - początkowe stężenie tlenu - stężenie tlenu po inkubacji w ciemnej butelce - stężenie tlenu po inkubacji w jasnej butelce - produkcja pierwotna netto - produkcja pierwotna brutto - czas inkubacji (godz.) Aby wyrazić tempo produkcji pierwotnej planktonu w jednostkach węgla organicznego powstałego w fotosyntezie (P n, P b ) należy w powyższych równaniach uwzględnić stosunek molowy węgla do tlenu (0.375) i pomnożyć uzyskany wynik przez

6 Respiracja planktonu (metoda tlenowa) Respiracja planktonu- uwagi ogólne Tempo respiracji (oddychania) planktonu jest funkcją składu gatunkowego i kondycji fizjologicznej poszczególnych składników planktonu (bakterii, glonów oraz mikroorganizmów zooplanktonowych), zawartości tlenu oraz stężenia składu i dostępności substratów oddechowych (głównie materii organicznej lecz również np. niektórych utlenionych połączeń azotu czy siarki (oddychanie beztlenowe). Na intensywność oddychania a raczej na stosunek produkcji do respiracji może wpływać również obecność w środowisku substancji toksycznych dla mikroorganizmów planktonowych. Rys. 1. Uproszczony schemat procesów oddechowych mikroorganizmów W profundalu głębokich zbiorników wodnych oraz w partiach cieków silnie zanieczyszczonych materią organiczną dominują procesy oddychania beztlenowego. W 6

7 środowiskach zawierających dostateczną ilość tlenu przeważają procesy oddychania tlenowego. Zakładając, że w badanej wodzie ani stężenie ani biomasa i aktywność mikroorganizmów nie limitują tempa respiracji można określić dla niej wartość BZT 5 (biologicznego zapotrzebowania na tlen). Zgodnie z definicją BZT 5 to wyrażane w mgo 2 /dm 3, biologiczne zużycie tlenu podczas 5-cio dobowej inkubacji próbki w ciemności, w temp. 20 o C w obecności inhibitora nitryfikacji (np. Nitrapiryny). BZT 5 stanowi zwykle około 70% całkowitej ilości tlenu potrzebnej do całkowitego wyrespirowania materii organicznej dostępnej dla mikroorganizmów w badanej próbce wody. Zasada pomiaru Respiracja mikroplanktonu Kompleks reakcji biochemicznych zachodzących podczas procesu oddychania tlenowego (utlenianie biologiczne) planktonu opisuje uproszczone równanie: DOM + O 2 CO 2 + H 2 O + związki organiczne W wyniku utlenienia biologicznego rozpuszczonych związków organicznych (DOM) przez mikroorganizmy wodne powstają związki mineralne, dwutlenek węgla i woda. W procesie tym zużywany jest tlen, który jest ostatecznym akceptorem elektronów i protonów odrywanych od substratów oddechowych w łańcuchu oddechowym. Metoda pomiaru tempa respiracji mikroplanktonu polega na analizie ubytku tlenu rozpuszczonego w badanych próbkach wody po ich inkubacji w ciemności w warunkach in situ. (UWAGA: dla celów niniejszych ćwiczeń próbki będą inkubowane w termo-iluminostacie). Odczynniki Do pomiaru tempa produkcji pierwotnej fitoplanktonu odczynniki i procedura oznaczania tlenu w wodzie. metodą tlenową niezbędne są Oznaczenie 7

8 Próbki badanej wody należy rozlać do serii ciemnych (owiniętych szczelnie foli aluminiową) butelek do oznaczania tlenu (ok. 100 ml; o dokładnie znanej pojemności). Butelki należy szczelnie zamknąć korkiem szklanym (uważać, aby nie było w butelkach pęcherzyków powietrza) i inkubować przez okres godz. (dla celów niniejszych ćwiczeń próbki będą inkubowane w termo-iluminostacie). W 3 butelkach w czasie To oznaczyć początkową zawartość tlenu rozpuszczonego w wodzie. Podczas inkubacji próbek w odstępach 8 godz. ponownie oznaczać w nich stężenie tlenu rozpuszczonego w wodzie. Obliczenia Różnica pomiędzy początkowym stężeniem tlenu w próbkach a ilością tlenu w próbkach po określonym czasie ich inkubacji jest miarą tempa respiracji planktonu (R) R = O 2 P O 2 K T inkub. (mg O 2 L -1 godz. -1 ) P O 2 K O 2 - początkowe stężenie tlenu - stężenie tlenu po inkubacji R T - respiracja w przedziale czasu To - T inkub. T inkub - czas inkubacji próbki (godz) Aby wyrazić tempo respiracji mikroplanktonu w jednostkach węgla organicznego zużytego podczas oddychania (R ) należy w powyższych równaniach uwzględnić stosunek molowy węgla do tlenu (0.375) i pomnożyć uzyskany wynik przez

9 Tlen rozpuszczony Zasada pomiaru Tlen rozpuszczony w wodzie w środowisku silnie alkalicznym łączy się z Mn(OH) tworząc nierozpuszczalny kompleks wodorotlenkowy, który po zakwaszeniu ulega rozpuszczeniu i w obecności dodanych jonów J-1 uwalnia wolny jod (J2). Ilość uwolnionego J2 (równoważna ilości O uprzednio związanego w nierozpuszczalnym kompleksie) jest odmiareczkowywana tiosiarczanem sodu (Na2S2O3) do odbarwienia wobec skrobi, jako wskaźnika. Kompleks reakcji chemicznych prowadzący do uwalniania J2 i redukcji powstającego jodu tiosiarczanem opisują równania: 1. Mn OH- = Mn(OH)2 (biały osad) 2. 2 Mn(OH)2 + O2 = 2 MnO(OH)2 (jasnobrązowy osad) 3. MnO(OH)2 + 4 H+ = Mn H2O 4. Mn I- = Mn2+ + I2 5. I2 + 2 S2O32- = 2 I- + S4O62- Metoda pomiaru tempa produkcji pierwotnej fitoplanktonu oparta jest na stechiometrii powyższego równania, tzn. na analizie przyrostu stężenia tlenu rozpuszczonego w badanych próbkach wody w czasie ich inkubacji na świetle w warunkach in situ. Podczas ekspozycji świetlnej próbek wody zachodzi równolegle wytwarzanie (fotosynteza) i zużywanie tlenu (respiracja). Dlatego też w analizowanych pod kątem tempa fotosyntezy próbkach wody należy wprowadzić korektę ilości tlenu zużytego przez mikroorganizmy wodne podczas oddychania. Odczynniki 1. Jodek potasu, cz.d.a. (KJ) 9

10 2. Siarczan manganawy, cz.d.a. (MnSO4 x 4H2O) lub chlorek manganawy, cz.d.a. (MnCl2 x 4H2O) 3. Azydek sodu, cz.d.a. (NaN2) 4. Wodorotlenek potasu, cz.d.a. (KOH) 5. Kwas orto-fosforowy (85%), cz.d.a. (H3PO4 ) 6. Roztwór skrobi stabilizowany cynkiem Do pomiaru tempa produkcji pierwotnej fitoplanktonu odczynniki i procedura oznaczania tlenu w wodzie. metodą tlenową niezbędne są Przygotowanie odczynników i roztworów 1. Roztwór siarczanu manganawego (Mn+2 ) Rozpuścić 12.5 g chlorku manganawego (MnSO4 x 4H2O) w 250 ml przegotowanej i oziębionej wody dejonizowanej. 2. Alkaliczny roztwór jodku potasu W 100 ml kolbie miarowej, w wodzie dejonizowanej rozpuścić: 7 g KOH, 30 g jodku potasu i 0,05 g azydku sodu. Po ostudzeniu roztwór uzupełnić do kreski. 3. Kwas fosforowy 20% Do kolby miarowej 200 ml dodać 50 ml 85% H3PO4 i dopełnić do kreski 4. Roztwór tiosiarczanu sodu M Do kolby miarowej 1000 ml przenieść 100 ml 0,125 M r-ru Na2S22O3 i uzupełnić wodą dejoniozowaną do kreski. Dodać 0.2 g węglanu sodu w celu stabilizacji. Oznaczenie Napełnić badaną próbką wody 3 butelki szklane (z korkiem szlifowym; o znanej pojemności ml) po sam brzeg szyjki butelki. Uważać, aby podczas napełniania butelek nie wprowadzić do nich pęcherzyków powietrza. Do każdej butelki dodać 2.0 ml roztworu siarczanu manganawego (1) i 2.0 ml alkalicznego roztworu jodku potasu (2) zanurzając końcówkę pipety w badanej próbce. Zamknąć butelki korkiem szlifowym tak aby nie było pęcherzyków powietrza i dokładnie wymieszać (Jeżeli oznaczenie tlenu nie wykonuje się od 10

11 razu to butelki należy przechowywać w ciemności zanurzone w wodzie.) Butelki pozostawić na ok minut w ciemności aby osad całkowicie opadł na dno. Następnie do każdej butelki dodać 2 ml H3PO4 (3) w celu rozpuszczenia osadu i dokładnie wymieszać. Do kolby Erlenmayera przenieść ilościowo 100 ml zawartości każdej butelki Miareczkować M Na2S2O3 do prawie całkowitego odbarwienia się próbki (kolor blado żółty), a następnie dodać 1 ml wskaźnika skrobiowego (próbka zabarwia się na kolor ciemno niebieski). Odmiareczkować pozostały jod r-rem Na2S2O3do całkowitego odbarwienia się próbki. Obliczenia 1 ml zużytego na miareczkowanie M r-ru tiosiarczanu sodu odpowiada 1,08159 mg O2/l. CO2 A Vbut. - stężenie tlenu w próbce - ilość tiosiarczanu zużytego na zmireczkowanie próbki (ml) objętość butelki Winklera 11

12 Parametry fizykochemiczne Zmienne warunki fizykochemiczne determinują skład taksonomiczny mikroorganizmów wodnych oraz wpływają na natężenie ich biologicznej aktywności. Nawet nieznaczne zmiany temperatury, odczynu czy zawartości soli mineralnych wywołują silne reakcje ze strony żywych organizmów. Te zaś dzięki aktywności metabolicznej modelują z kolei strukturę abiotyczną środowiska, w którym funkcjonują. Efekt wpływu aktywności mikroorganizmów na środowisko bytowania może być szczególnie wyraźny w niewielkich układach zamkniętych, które z natury są wysoce niestabilne. Generalnie im mniejszy układ modelowy (np. akwarium wypełnione wodą) tym trudniej utrzymać w nich równowagę czy inaczej mówiąc homeostazę. Przykładem tego typu układów eksperymentalnych są małe ekosystemy prezentowane na ćwiczeniach, poddane ingerencji ze strony eksperymentatorów. Głównym celem tej części ćwiczeń jest prześledzenie zmian wartości wybranych czynników fizyko-chemicznych w badanych układach eksperymentalnych. Zadaniem badawczym będzie dokonanie pomiarów właściwości fizykochemicznych wody in situ, określić zawartości chlorofilu a i feofityny metodą fluorymetryczną, obliczyć zmiany indeksu troficznego wody pobranej z wariantów eksperymentalnych na podstawie stężenia chlorofilu a. Pobór prób Próby wody do analiz laboratoryjnych zostaną pobrane według schematu podanego we wstępnej części niniejszego konspektu. Analiza właściwości fizycznych i chemicznych wody in situ Analizy in situ z wykorzystaniem sondy wieloparametrycznej Wybrane parametry fizykochemiczne badanej wody jeziorowej zostaną określone in situ za pomocą sondy wieloparametrycznej YSI Urządzenie to umożliwia szybkie i precyzyjne pomiary bez konieczności transportowania próbek wody do laboratorium i poddawania ich czasochłonnym analizom. Pomiary w środowisku pozwalają na ograniczenie tzw. błędu efektu zamknięcia, wynikającego z zachodzących w czasie zmian bio-fizyko-chemicznych w próbce po jej odseparowaniu od środowiska. W wyposażenie sondy wchodzi seria czujników umożliwiających jednoczesny pomiar parametrów wymienionych w poniższej tabeli. 12

13 Zakres 0 do 500% Rozpuszczony tlen % wysycenia Rozdzielczość 0.1% Dokładność 0 do 200%: ±2% ; 200 do 500%: ±6% Zakres 0 do 50 mg/l Rozpuszczony tlen mg/l Rozdzielczość 0.01 mg/l Dokładność 0 to 20 mg/l: ±2% ; 20 do 50 mg/l: ±6% odczytu Przewodnictwo Zakres Rozdzielczość 0 do 100 ms/cm do 0.1 ms/cm (zależnie od zakresu) Temperatura Dokładność Zakres Rozdzielczość ±0.5% ms/cm -5 to +45 C 0.01 C Dokładność ±0.15 C Zakres 0 to 14 ph Rozdzielczość 0.01 Dokładność ±0.2 Głębokość Zakres Rozdzielczość 0 do 61 m m Mętność Dokładność Zakres Rozdzielczość ±0.12 m 0 do 1,000 NTU 0.1 NTU Chlorofil Dokładność Zakres Rozdzielczość ±5% lub 2 NTU 0 do 400 μg/l 0.1 μg/l Chl; 0.1%FS Dokładność ±10% Promieniowanie Wyrażone w µmol fotonów * m -1 s- 1 13

14 fotosyntetycznie czynne (PAR) Podstawowa charakterystyka mierzonych parametrów i sposób ich pomiaru Temperatura Jest kluczowym czynnikiem warunkującym aktywność metaboliczną organizmów wodnych. Wpływa m.in. na rozpuszczalność związków chemicznych zawartych w wodzie (Np. tlenu cząsteczkowego) oraz umożliwia stratyfikacje termiczną. Energia termiczna kumulowana jest w jeziorach dzięki różnorodnym procesom, z których najważniejsze to: bezpośrednia absorpcja promieniowania słonecznego, transfer ciepła z powietrza, kondensacja pary wodnej, transfer energii z sedymentu, transfer z lądu otaczającego zbiornik (precypitacja, spływy powierzchniowe, wody gruntowe), aktywność metaboliczna organizmów. Do pomiaru temperatury czujnik sondy wykorzystuje termistor - opornik półprzewodnikowy wykonany z tlenków metali, którego rezystancja w sposób ściśle określony zależy od energii cieplnej. Tlen Obecność tlenu cząsteczkowego rozpuszczonego warunkuje aktywność oddechową tlenowych organizmów wodnych. Jego zawartość w wodzie jest wypadkową dwóch przeciwstawnych procesów. Z jednej strony rozpuszczania tlenu atmosferycznego i jego wytwarzania przez organizmy fotoautotroficzne, z drugiej zaś abiotycznego i biologicznego utleniania związków chemicznych. Stężenie tlenu rozpuszczonego determinuje skład taksonomiczny mikroorganizmów zasiedlających zbiorniki wodne, tempo degradacji materii organicznej oraz wpływa na labilność biologiczną związków biogennych. Ilość rozpuszczonego tlenu zależy od ciśnienia atmosferycznego, hydrostatycznego i temperatury, a także zasolenia. W idealnym słodkowodnym jeziorze dimiktycznym w okresie wiosennego mieszania się wód wysycenie wody tlenem sięga 100%, co w temp 4 o C osiąga zawartość mg O 2 w litrze wody. Tlen cząsteczkowy rozpuszczony w wodzie mierzony jest przez czujnik elektrochemiczny anodowo-katodowy. Tlen dyfunduje z wody przez błonę teflonową do wypełnionego roztworem KCl wnętrza czujnika, gdzie ulega redukcji i generuje przepływ prądu, którego natężenie jest proporcjonalne do ciśnienia tlenu w roztworze. Aby zapobiec ubytkom tlenu w czasie reakcji elektrochemicznej elektrody są pulsacyjnie polaryzowane i depolaryzowane (tzw. Rapid Pulse System). Przewodność elektryczna właściwa (konduktywność) Konduktywność jest wielkością fizyczną charakteryzującą przewodnictwo elektryczne materiału (także elektrolitu). Stanowi odwrotność oporności właściwej. Określa się ją na podstawie ilość ładunków przeniesionych przez przewodnik o danym przekroju i długości w 14

15 określonym czasie przy znanym przyłożonym napięciu i wyraża w układzie SI w simensach na metr (Sm -1 ). Ze względu na niewielki stopień dysocjacji cząsteczek H 2 O woda czysta chemicznie jest słabym elektrolitem i charakteryzuje się niewielkim przewodnictwem właściwym (jej konduktywność w temp. 25 O C wynosi ok. 0,055 µscm -1 ), które rośnie wraz ze wzrostem stężeń rozpuszczonych w wodzie jonów, takich jak: Ca, Mg, Na, K, CO 3, SO 4, Cl. Woda akwenów słodkowodnych w temp. 25 O C ma zwykle konduktywność w zakresie µscm -1, zaś woda morska ok µscm -1. Dopuszczalna konduktywność wody pitnej nie powinna przekraczać 2000 µscm -1. Stosując odpowiednie przeliczniki możliwe jest, w pewnym uproszczeniu, oszacowanie na podstawie konduktywności zawartości materii rozpuszczonej w wodzie (TDS - Total Dissolved Solids ). W przypadku używanej sondy przewodność właściwa mierzona jest przez konduktometr wyposażony w 4 elektrody niklowe. Przelicznik konduktywności na TDS wynosi 0,65 [TDS (g/l)=0,65*konduktywność(mscm -1 )]. Odczyn Odczyn ph wód zależy m.in. od zawartość dwutlenku węgla w postaci wolnej i związanej (a ściśle równowagi pomiędzy CO 2, H 2 CO 3, HCO - 3 i CO 2-3), stężenia kwasów organicznych (np. kwasów huminowych ) oraz jonów mineralnych i innych związków takich jak np. kwasy nieorganiczne dostające się do zbiorników na skutek opadów kwaśnych deszczy w rejonach silnie uprzemysłowionych. W przypadku większości jezior słodkowodnych ph mieści się w granicach 6,5 8,5. Jest to także zakres ph tolerowany przez większość żyjących w wodnych mikroorganizmów. Odczyn ph jest parametrem stosunkowo dynamicznym i w strefie fotycznej ulegać może znacznym dobowym wahaniom będących efektem intensywnej fotosyntezy i respiracji organizmów planktonowych skutkujących zmianami stężenia rozpuszczonego CO 2. Odczyn badanej wody zmierzony zostanie potencjometrycznie za pomocą ph-metru. Mętność Mętność odzwierciedla zawartość zwieszonych w wodzie cząstek materii organicznej żywej (głównie organizmy planktonowe) i martwej (detrytusu) oraz nieorganicznej (zawiesiny mineralne). Wysoka mętność może wskazywać na występowanie intensywnego rozwój mikroorganizmów planktonowych, ale też na obecność upostaciowanego detrytusu lub cząstek nieorganicznych adsorbujących materię organiczną i stanowiących podłoże kolonizacji dla żyjących w biofilmach mikroorganizmów osiadłych. Mętność zostanie określona w umownych jednostkach NTU (nephelometric turbidity units) skalibrowanych na podstawie roztworów dostarczanych przez producenta sondy. Pomiar mętności odbywa się na zasadzie detekcji natężenia światła rozpraszanego na cząstkach zawiesiny. Dioda sondy emituje promieniowanie o długości fali bliskiej podczerwieni a następnie odczytuje natężenie wyemitowanego światła rozproszonego. Kąt między emiterem a detektorem wynosi 90 O (Rys. 1). 15

16 Należy pamiętać, iż mętność jest bardzo zgrubnym wskaźnikiem obecności zawiesiny, a na uzyskiwane wartości NTU może wpływać nie tylko zagęszczenie cząstek ale też ich wielkość czy skład chemiczny. Chlorofil Chlorofil obecny jest w komórkach większości organizmów fotoautotroficznych. Jego stężenie pozwala na ocenę potencjalnej produktywności pierwotnej ekosystemu i jest ściśle związane ze statusem troficznym wód. Zdolność chlorofilu do fluorescencji jest wykorzystywana do pomiarów jego koncentracji in situ. Znajomość natężenia fluorescencji wzbudzonego chlorofilu pozwala prosto i szybko uzyskać odpowiedź na pytanie o obecność zawierającego chlorofil fitoplanktonu w badanym środowisku i ocenić relatywne różnice w jego zagęszczeniu występujące zarówno pomiędzy poszczególnymi stanowiskami poboru prób (lub na różnych głębokościach), jak i zmiany zachodzące w czasie. Sonda wyposażona jest w podzespół którego dioda emituje promieniowanie o długości fali ok. 470 nm, wzbudzające chlorofil. Wzbudzony chlorofil wraca do stanu początkowego emitując światło widzialne o spektrum mieszczącym się w zakresie nm, którego natężenie mierzone jest przez foto-detektor. (Rys. 2). 16

17 Zmierzone natężenie fluorescencji po odpowiedniej kalibracji z wykorzystaniem wzorcowych roztworów rodaminy może być przeliczone na stężenie chlorofilu. Procedura ta obarczona jest jednak dużym błędem. Natężenie mierzonej fluorescencji chlorofilu zależy bowiem zarówno od składu taksonomicznego fitoplanktonu jaki i stężeń związków rozpuszczonych w wodzie oraz zawiesiny upostaciowanej materii organicznej zaburzających odczyty za sprawa m.in. zjawisk pochłaniania, rozpraszania czy wygaszania fluorescencji. Dokładne analizy koncentracji chlorofilu w badanych próbkach dokonuje się spektrolub fluorymetrycznie po jego uprzedniej ekstrakcji z komórek (patrz rozdział Chlorofil a i feofityna ). Głębokość Głębokość określana jest na podstawie pomiarów różnicy pomiędzy ciśnieniem atmosferycznym a ciśnieniem hydrostatycznym wywieranym na zanurzoną sondę. Promieniowanie fotosyntetycznie czynne (PAR - photosynthetically active radiation ) Mianem PAR określamy część widma promieniowania słonecznego mieszczącą w granicach długości fal od 400 do 700 nm. Obejmuje ono praktycznie cały zakres światła widzialnego. Fotony o energii odpowiadającej zakresowi tych długości fal zdolne są do wzbudzania chlorofilu i warunkują proces fotosyntezy (najwydajniej w zakresie światła niebieskiego i czerwonego). Na podstawie detekcji PAR można wyznaczyć miąższość strefy fotycznej, czyli głębokość, do której dociera światło (a ściśle 1% światła) i zachodzić może proces fotosyntezy. Natężenie promieniowania PAR określane jest jako gęstość przepływu fotonów i wyrażane w µmols -1 m -1. Analiza danych Dane zgromadzone przez sondę zostaną przepisane do komputera z zastosowaniem oprogramowania EcoWatch i posłużą do dalszych analiz statystycznych. 17

18 Żyzność jezior Indeks Troficzny Carlsona Status troficzny jest pojęciem, którym posługujemy się w celu ogólnego scharakteryzowania żyzności zbiorników wodnych. Najczęściej określa się go za pomocą zaproponowanego w 1977r. liczbowego Indeksu Troficznego Carlsona (TSI). Indeks Carlsona oblicza się na podstawie różnorodnych parametrów związanych z szeroko rozumianą zasobnością i produktywnością ekosystemów wodnych. Początkowo obejmowały one: widzialność krążka Secchiego, stężenie fosforu całkowitego i zawartość chlorofilu a. Późniejsze modyfikacje umożliwiły korzystanie także z innych parametrów np. charakteryzujących aktywność enzymatyczną mikroorganizmów heterotroficznych. Wartości Indeksu Carlsona mieszczą się w zakresie od 0 do ponad 100. Im wyższa wartość indeksu tym wyższy stopień eutrofizacji zbiornika. Przyjmuje się, że wartość TSI < 40 są charakterystyczne dla zbiorników oligotroficznych, mezotroficznych, eutroficznych i > 70 hipereutroficznych. Rysunek za: Moore, L. ; K Thornton, [Ed.] Lake and Reservoir Restoration Guidance Manual. USEPA>EPA 440/ Ze zmianą indeksu troficznego związane są zmiany charakterystyki fizykochemicznej wody, struktury taksonomicznej żyjących w niej organizmów oraz stopnia ich aktywności metabolicznej. Na jednym krańcu znajdują się dobrze natlenione (nawet w warstwie hypolimnionu) zbiorniki oligotroficzne, ubogie w makrofity, o niewielkiej liczebności i aktywności zasiedlających je mikroorganizmów, na drugim krańcu zbiorniki hipereutroficzne, w których występuje bujny wzrost makrofitów, w okresie letniej stratyfikacji może dochodzić do deficytów tlenowych nawet w górnych warstwie epilimnionu, maja miejsce intensywne zakwity glonów oraz cjanobakterii, a produkcja pierwotna fitoplanktonu limitowana jest głównie dostępem światła. 18

19 Obliczenia Indeks Troficzny Carlsona zostanie obliczony na podstawie stężenia chlorofilu a: TSI (Chl a ) = 10*[6-((2,04-0,68lnChl a ) / ln2))] Chlorofil a i feofityna Zasada oznaczenia Sumaryczna zawartość chlorofilu a i feofityny (chlorofil a pozbawiony jonu magnezu) zostanie oznaczona fluorymetrycznie po ekstrakcji acetonem z komórek fitoplanktonu osadzonych uprzednio na filtrach membranowych. Fluorescencja barwników zmierzona zostanie przy promieniowaniu ekscytacji 436 nm i emisji 680 nm. W celu określenia udziału samego chlorofilu a we frakcji barwników próbkę należy zmierzyć dwukrotnie. Przed oraz po zakwaszeniu powodującym przemianę chlorofilu a w feofitynę, a następnie wyliczyć stężenia barwników na podstawie odpowiedniego modelu matematycznego. Odczynniki i wyposażenie 1. Aceton 90% 2. Filtry GF/F o odpowiedniej średnicy porównaniu M HCl 4. Wirownicze probówki polietylenowe z korkiem 5. Zestaw do filtracji 6. Mikrowirówka 7. Fluorymetr TD 700 Turner Przygotowanie odczynników Roztwór 0,2 M HCl Naważkę 0,1 M HCl przenieść do 500 ml kolby miarowej i dopełnić wodą dejonizowaną do kreski. Oznaczanie 1. Przefiltrować znaną objętość próbki wody (0.02 do 0,05 L w zależności od ilości sestonu) przez filtr w trzech powtórzeniach. Filtr umieścić w probówkach ze szczelnym korkiem. 2. Dodać do każdej probówki zawierającej filtr 10 ml 90% acetonu. Probówki szczelnie zamknąć 19

20 3. Acetonowy ekstrakt w probówkach wstawić do lodówki (4 o C) na 24 godz. w celu finalnej ekstrakcji barwników. 4. Ekstrakt odwirować przez 12 min. Przy 5000 RPM. 5. Zmierzyć fluorescencję ekstraktu przy em. 680 nm i ex. 436 nm. 6. Ekstrakt po zmierzeniu wlać ponownie do probówki i zakwasić 0,15 ml 0,1 M HCl i wymieszać. 7. Zmierzyć fluorescencję powtórnie po 3-5 min. od wymieszania. Obliczenia Zawartość chlorofilu a i feofityny wyrażoną w µg/l wylicza się ze wzorów: Chlorofil a = [(R / (R - 1)) x (Rd Rc)] x [Ve/Vp] feofityna = [(R / (R-1)) x (RxRc-Rd)] x [Ve/Vp] Gdzie: R współczynnik kalibracyjny (wartość uzyskana ze stosunku fluorescencji standardu chlorofilu a przed i po jego zakwaszeniu) Rd stężenie w ekstrakcie przed zakwaszeniem RcRc stężenie w ekstrakcie po zakwaszeniu Ve objętość ekstraktu acetonowego (ml) Vp objetość przesączonej wody (ml) 20