Znaczenie modyfikacji histonów w transformacji nowotworowej

Transkrypt

1 Znaczenie modyfikacji histonów w transformacji nowotworowej Paulina Gomulak * Janusz Błasiak Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź * Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, ul. Banacha 12/16, Łódź; tel./ faks: (42) , pgomulak@biol.uni. lodz.pl Artykuł otrzymano 3 kwietnia 2012 r. Artykuł zaakceptowano 5 czerwca 2012 r. Słowa kluczowe: chromatyna, ekspresja genów, epigenetyka, modyfikacje histonów, transformacja nowotworowa Wykaz skrótów: DNMT metylotransferaza DNA; DSB pęknięcia dwuniciowe DNA; HAT acetylotransferaza histonów; HDAC deacetylaza histonów; HDM demetylaza histonów; HMT metylotransferaza histonów; HR rekombinacja homologiczna; NER naprawa DNA przez wycinanie nukleotydów; NHEJ naprawa DNA przez niehomologiczne łączenie końców STRESZCZENIE Potranslacyjne modyfikacje histonów należą do mechanizmów epigenetycznych, które biorą udział w prawidłowym rozwoju oraz utrzymaniu wzoru ekspresji genów. Modyfikacje histonów mogą wpływać na organizację struktury chromatyny lokalnie jak i globalnie. Efekty modyfikacji histonów mogą wpływać na siebie antagonistycznie lub synergistycznie regulując dostęp białek wiążących się z chromatyną, co warunkuje przejście pomiędzy chromatyną transkrypcyjnie aktywną i nieaktywną. Nieprawidłowe funkcjonowanie tego mechanizmu towarzyszy wielu stanom patologicznym, również nowotworom. Do tej pory nie udało się stwierdzić czy modyfikacje histonów należy zaliczyć do przyczyn czy do następstw transformacji nowotworowej. Opierając się na badaniach dotyczących przywracania ekspresji genów wyciszonych poprzez podanie inhibitora deacetylazy histonów czy poprzez knockout genu kodującego metylotransferazę histonów w nowotworach, wydaje się, że przynajmniej część modyfikacji histonów może mieć charakter przyczynowy. Modyfikacje histonów mogą mieć charakter odwracalny, co wykorzystuje się do tworzenia nowej puli leków przeciwnowotworowych, inhibitorów enzymów modyfikujących histony. WPROWADZENIE W komórkach eukariotycznych DNA jądrowy występuje w postaci nukleoproteinowego kompleksu zwanego chromatyną. Chromatyna to uporządkowana i hierarchiczna struktura, której podstawową jednostką jest nukleosom tworzony przez oktamer histonowy oraz nawiniętą na niego podwójną helisę DNA (Ryc. 1). Pomiędzy nukleosomami występują odcinki DNA łącznikowego, z którymi wiąże się histon H1. W skład chromatyny wchodzą także białka kwaśne, zwane resztkowymi lub niehistonowymi. Oktamer histonowy to białkowy rdzeń zawierający po dwie cząsteczki każdego z kanonicznych białek histonowych: H2A, H2B, H3 i H4. W skład histonów mogą wchodzić również warianty histonu H2A, takie jak: H2AX, H2A.Z; H2A.Bbd czy macroh2a, które również mogą występować w oktamerze histonowym [1]. Białka histonowe to małe, zasadowe białka, których sekwencja aminokwasowa jest zachowana ewolucyjnie. Zawierają one niepolarną globularną domenę, zwaną również zawinięciem histonowym (ang. histon fold), znajdującą się wewnątrz oktameru histonowego oraz N-terminalną domenę, ogon histonu, bogatą w aminokwasy zasadowe, zwłaszcza reszty argininy (R) i lizyny (K), nadające jej polarny charakter. Ogon histonu, który jest wysunięty poza rdzeń histonowy, jak również domeny globularne białek histonowych oraz Rycina 1. Organizacja struktury chromatyny. DNA jest nawinięty na oktamer histonowy tworząc nukleosom. Nukleosomy formują nukleofilament o średnicy 30 nm, który następnie tworzy uporządkowane struktury wyższych rzędów. Najbardziej skondensowaną postacią chromatyny jest chromosom metafazowy. białka niehistonowe mogą podlegać modyfikacjom potranslacyjnym. Modyfikacje te polegają na dołączaniu różnych grup funkcyjnych do cząsteczki białka i obejmują m.in. metylację (me), acetylację (ac) i fosforylację (ph). Reszta lizyny ulega mono-, di- i trimetylacji, a reszta argininy tylko mono- lub dimetylacji (symetrycznie lub asymetrycznie) [2,3]. Ponadto histony mogą podlegać ubikwitylacji, 292

2 takiego enzymu jest bardzo prawdopodobne z uwagi na przejściową obecność cytruliny w histonach oddziałujących z sekwencją promotorową [14]. Izomeryzacja reszty proliny jest odwracalna z uwagi na właściwości izomeraz przekształcające formy cis- i trans- [15]. Rycina 2. Schematyczne przedstawienie modyfikacji histonów. Zaznaczone zostały modyfikacje N-końcowych ogonów histonowych; odpowiednio: Ac acetylacja (żółty kwadrat), Me metylacja (różowe koło), P fosforylacja (zielony trójkąt). sumoilacji, ADP-rybozylacji, propionylacji, biotynylacji [4,5]. Oprócz przyłączania grup funkcyjnych do histonów może następować deiminacja reszty argininy do cytruliny w sekwencji aminokwasów histonu czy izomeryzacja cis- -trans wiązania peptydowego zawierającego resztę proliny [4,5]. Modyfikacje potranslacyjne zachodzą w różnych resztach aminokwasowych takich jak lizyna, arginina czy seryna położonych w różnych miejscach w sekwencji białka oraz w różnych histonach, w większości w H3 lub H4 (Ryc. 2) [2,4,6]. ENZYMY MODYFIKUJĄCE HISTONY Dołączenie lub odłączenie grup funkcyjnych do/od histonów jest katalizowane przez szereg enzymów, które przeważnie cechuje specyficzność w stosunku do substratu. Acetylotransferazy histonów (HAT) przyłączają grupę acetylową do reszty lizyny, podczas gdy deacetylazy histonów (HDAC) ją usuwają [7,8]. Z kolei kinazy dołączają grupy fosforanowe do reszty seryny lub treoniny, a fosfatazy histonów (ang. PPTase) powodują ich odłączenie [9]. Metylotransferazy histonów (HMT) wprowadzają grupy metylowe do reszty lizyny (HKMT ang. histone lysine methyltransferases) [10] lub do reszty argininy (PRMT, ang. protein arginine methyltransferases) [11]. Grupy metylowe zarówno z reszt lizyny jak i argininy są usuwane przez demetylazy histonów (HDM) [12]. Większość modyfikacji histonów ma charakter dynamiczny. Do tej pory zidentyfikowano większość enzymów, które odpowiadają za odłączanie grup funkcyjnych. Jedynym wyjątkiem jest metylacja argininy. Pomimo, że stwierdzono iż modyfikacja ta ma charakter dynamiczny, nie zidentyfikowano enzymu przeprowadzającego jej demetylację [11]. Natomiast demetylacji reszty argininy towarzyszy proces deiminacji wskazując, że deiminacja może działać antagonistycznie w stosunku do metylacji tego aminokwasu [13]. Deiminacja reszty argininy prowadzi do powstania cytruliny, natomiast nie znaleziono enzymu katalizującego reakcję odwrotną. Występowanie ORGANIZACJA STRUKTURY CHROMATYNY Modyfikacje potranslacyjne ogonów histonowych mają znaczenie dla organizacji struktury chromatyny, szczególnie za utrzymanie równowagi pomiędzy chromatyną luźną, aktywną transkrypcyjnie (euchromatyną) a chromatyną skondensowaną, nieaktywną (heterochromatyną) [2]. Również modyfikacje domeny globularnej mają wpływ, choć w mniejszym stopniu, na organizację struktury chromatyny [16]. Równowaga pomiędzy euchromatyną a heterochromatyną jest utrzymywana poprzez modulację oddziaływań histon-histon oraz histon- -DNA (oddziaływania cis) lub wiązanie/oddysocjowanie niehistonowych białek efektorowych regulujących strukturę chromatyny (oddziaływanie trans) [17]. Pierwszy z przedstawionych mechanizmów nazywany jest oddziaływaniem cis i obejmuje on oddziaływania na poziomie intra- lub internukleosomalnym poprzez oddziaływania elektrostatyczne i zawady steryczne. Dla przykładu, acetylacja H4K16 wpływa na formowanie włókna 30 nm oraz na struktury wyższych rzędów [18]. Z drugim mechanizmem, opartym na tzw. oddziaływaniu trans, związana jest koncepcja kodu histonowego, która traktuje wzór modyfikacji białek histonowych jako znacznik służący do rekrutacji białek niehistonowych, które w połączeniu ze zmodyfikowanymi białkami histonowymi regulują strukturę chromatyny w odpowiedzi na zewnętrzny bodziec [2]. W ten sposób modyfikacje histonów mogą być rozpatrywane jako proces pośredniczący pomiędzy cytoplazmatyczną sygnalizacją kaskadową a procesami jądrowymi. Potwierdzeniem tej hipotezy jest rekrutacja m. in. białek cyklu komórkowego i naprawy DNA do fosforylowanego histonu H2AX, γh2ax [19]. Przeważnie białka efektorowe oddziałujące ze zmodyfikowanymi histonami mają aktywność enzymatyczną i dalej modyfikują strukturę chromatyny. Jest to szczególnie istotne w aspekcie regulacji wieloetapowych procesów komórkowych, jak cykl komórkowy, transkrypcja, replikacja czy naprawa DNA, gdyż każdy etap tych procesów może wymagać przebudowy struktury chromatyny. MODYFIKACJE HISTONÓW A EKSPRESJA GENÓW Modyfikacje histonów poprzez kondensację/dekondensację chromatyny mogą wpływać na ekspresję genów. Mechanizmy, które wpływają na zmianę ekspresji genetycznej i nie wynikają ze zmiany sekwencji DNA są nazywane mechanizmami epigenetycznymi. Modyfikacje histonów należą do tych mechanizmów. Mogą one prowadzić do aktywacji bądź represji ekspresji genów w zależności od rodzaju przyłączonej grupy funkcyjnej oraz od rodzaju reszty aminokwasowej, która ulega modyfikacji. Regulacja transkrypcji poprzez pojedynczą modyfikację histonów prawdopodobnie wywołuje odpowiedź biologiczną, która może inicjować dalsze etapy przebudowy chromatyny [4]. Jednakże dopiero w połą- Postępy Biochemii 58 (3)

3 czeniu z wieloma zmianami modyfikacji histonów oraz dzięki oddziaływaniom białko-białko (ang. cross-talk) następuje zmiana struktury chromatyny. Oddziaływania białko-białko obejmują m.in. zmiany modyfikacji w tym samym nukleosomie lub histonie lub pomiędzy różnymi nukleosomami czy histonami [17]. Mogą one oddziaływać lokalnie poprzez ukierunkowaną rekrutację czynników transkrypcyjnych specyficznych dla danej sekwencji DNA lub globalnie powodując zmiany w prawie wszystkich nukleosomach [20,21]. Takie skoordynowane działanie powoduje kondensację chromatyny i w konsekwencji wyciszenie ekspresji genów, bądź rozluźnienie jej struktury, gdy konieczna jest aktywność transkrypcyjna [22]. Zatem różne kombinacje potranslacyjnych modyfikacji histonów mogą modulować procesy komórkowe. Przeważnie acetylacja reszty lizyny koreluje dodatnio z aktywacją transkrypcji, natomiast jej metylacja z aktywacją lub represją [23]. Dołączenie grupy acetylowej powoduje neutralizację ładunku dodatniego grupy ε-aminowej reszty lizyny i w następstwie osłabienie oddziaływania histon-dna, rozluźnienie struktury DNA i aktywację ekspresji genów [24]. Utrata acetylacji jest związana z wyciszeniem ekspresji genów [21]. Z kolei metylacja jest związana zarówno z aktywacją jak i represją ekspresji genów w zależności od położenia reszty aminokwasowej w białku oraz poziomu metylacji. Trimetylacja reszty lizyny 4 w histonie H3 (H3K4me3) oraz H3K36 (H3K36me3) w obszarze sekwencji promotorowych genów koreluje dodatnio z produkcją tych genów, a trimetylacja H3K9 (H3K9me3) i H3K27 (H3K27me3) z tymi sekwencjami genów, których ekspresja jest wyciszona [22,25,26]. Trimetylacja H3K9 oraz H3K27 stanowi dwa główne mechanizmy wyciszania. Interesującym wydaje się ścisła równowaga pomiędzy metylacją H3K4 a H3K27, która może wpływać na wyciszenie ekspresji genów kontrolujących rozwój morfologiczny w komórkach macierzystych [27]. Dołączanie grupy metylowej zachodzi również na reszcie argininy i może wpływać zarówno na aktywację jak i represję ekspresji genów [11]. Deacetylacja histonu H4 w K16 oraz trimetylacja w K20 są wyznacznikami domen heterochromatyny i korelują dodatnio z hipermetylacją DNA w sekwencjach powtarzających się [28]. Ogólnie można powiedzieć, że hypoacetylacja i hipermetylacja histonów są charakterystyczne dla zmetylowanych sekwencji DNA, które nie ulegają ekspresji m.in. inaktywowanego chromosomu X u kobiet, genów podlegających piętnowaniu rodzicielskiemu (ang. genomic imprinting) i genów tkankowo-specyficznych. Natomiast fosforylacja histonów koreluje z aktywacją transkrypcji [29]. Jest to spowodowane wprowadzeniem ładunku ujemnego, a zatem zwiększeniem odpychającego oddziaływania elektrostatycznego histon-dna, rozluźnieniem struktury chromatyny i ułatwieniem dostępu dla grupy białek biorących udział w transkrypcji. Ubikwitylacja białek jest zwykle związana ze znakowaniem tych, które mają ulec degradacji w proteasomach, ale przyłączenie ubikwityny, 76-aminokwasowego białka, do ogona histonów koreluje z dekondensacją chromatyny i aktywacją transkrypcji [30]. Ponadto, ubikwitylacja ogona histonów może być przejściową modyfikacją wiodącą do dalszej metylacji histonu [31]. Jednak jej dokładna funkcja nie jest jeszcze poznana. Sumoilacja histonów negatywnie reguluje transkrypcję, prawdopodobnie poprzez wpływanie na metylację i deacetylację histonów [32]. Modyfikacje histonów oraz metylacja DNA są osobnymi mechanizmami epigenetycznymi, które współdziałając ze sobą regulują strukturę chromatyny jak również ekspresję genów. Do tej pory nie udało się ustalić, który z tych mechanizmów zachodzi wcześniej podczas wyciszania transkrypcji. Prawdopodobnie każdy z tych dwóch mechanizmów może inicjować wyciszanie ekspresji genów [33]. Na przykład metylacja reszty cytozyny w wyspie CpG może powodować przyłączenie białek wiążących się ze zmetylowanym DNA, MBP (ang. methyl- -binding domain proteins), które rekrutują HDAC prowadząc do kondensacji chromatyny i wyciszania ekspresji genów [34]. Z kolei HMT bezpośrednio kierują metylotransferazy DNA (DNMT) do specyficznych sekwencji w genomie celem stabilnego wyciszenia transkrypcji [35]. Dalej DNMT może z kolei rekrutować HDAC i MBP, co koreluje z zagęszczeniem chromatyny i wyciszeniem ekspresji genów [36]. Również HMT oraz HDM wpływają na stabilność DNMT i poprzez to na poziom metylacji DNA [37,38]. Z kolei, metylacja DNA może prowadzić do metylacji H3K9 poprzez białka efektorowe i tym samym prowadzić do stabilizacji heterochromatyny [39]. ZMIANY MODYFIKACJI HISTONÓW W KOMÓRKACH NOWOTWOROWYCH Podczas transformacji nowotworowej następują zmiany wzoru modyfikacji histonów oraz zmiany ich genomowej lokalizacji [40]. Zmiany modyfikacji histonów mają naturę dynamiczną i zachodzą na każdym etapie onkogenezy począwszy od zmian preneoplastycznych a skończywszy na nowotworze złośliwym [41,42]. Zmiany te zachodzą już w guzach niezłośliwych i akumulują się w miarę postępu choroby [41,42]. Może to być jeden z mechanizmów prowadzących do inicjacji, progresji i promocji nowotworu. Mechanizmy te mogą przyczyniać się do onkogenezy poprzez zaburzenie regulacji transkrypcji, naprawy DNA, replikacji czy cyklu komórkowego [43]. Zaburzenia te mogą być wynikiem zmiany ekspresji genów poprzez aktywację onkogenów i represję genów supresorowych wskutek zmian wzoru modyfikacji histonów w sekwencjach promotorowych. Podczas onkogenezy następują globalne zmiany obejmujące utratę acetylacji H4K16 i trimetylacji H4K20 w powtarzających się sekwencjach DNA [33]. Dodatkowo te sekwencje DNA ulegają hipometylacji [33]. Prowadzi to do aktywacji transpozonów, ich translokacji i niestabilności genomowej, która jest obserwowana m.in. w nowotworach. Przeprowadzono badania na niewielkiej grupie osób z rakiem jelita grubego, które korelowały występowanie H3K4me3 oraz H3K27me3 w komórkach nowotworowych i w komórkach prawidłowych. Chociaż, oczekuje się, iż przejścia pomiędzy chromatyną transkrypcyjnie aktywną, której wyznacznikiem był H3K4me3 i nieaktywną, H3K27me3, lub vice versa będą miały największe konsekwencje dla kancerogenezy, to wyniki tych badań wskazują na występowanie niewielkiej ich liczby. Natomiast znacznie częściej obserwowano zwiększenie wy

4 stępowania tej samej modyfikacji histonów w danym fragmencie DNA. Zazwyczaj geny, które są aktywnie transkrybowane w komórkach prawidłowych i w ich sekwencjach promotorowych występuje H3K4me3, ulegają zwiększonej aktywacji w komórkach nowotworowych w wyniku zwiększenia się liczby tej modyfikacji histonów w tym obszarze. Z kolei w komórkach nowotworowych obserwowano zwiększenie efektywności wyciszania ekspresji genów wraz ze zwiększeniem się liczby H3K27me3 w sekwencjach promotorowych tych genów w porównaniu do komórek prawidłowych. Wyniki te wskazują, że zmiana ekspresji przynajmniej części genów poprzez zmiany modyfikacji histonów może występować na dużą skalę i może występować u większości pacjentów z rakiem jelita grubego [44]. Wyciszanie ekspresji genów jest korelowane ze szczególną kombinacją zmian modyfikacji histonów obejmującą deacetylację H3 i H4, utratę trimetylacji H3K4 i nabycie metylacji H3K9 oraz trimetylacji H3K27 w regionie promotorowym [40,45]. Przykładowo metylacja H3K27 przez Ezh2, HMT, powodowała rekrutację DNMT, która bezpośrednio oddziaływała z Ezh2 i powodowała metylację DNA [46]. Metylacja DNA w regionie promotorowym może dalej prowadzić do trwałego wyciszenia ekspresji genów. Jeśli nastąpi utrata ekspresji genów supresorowych może dojść do nowotworzenia. Jednakże potrzebne jest doświadczalne potwierdzenie udziału Ezh2 w wyciszaniu ekspresji genów supresorowych. Natomiast TRRAP, element kompleksu HAT, regulował acetylację H3 i H4 w sekwencjach promotorowych genów kodujących białka punktu kontrolnego mitozy, Mad1/2 [47]. Defekty punktu kontrolnego mitozy były spowodowane obniżeniem ilości Mad1/2 wynikającym z nieprawidłowego poziomu transkrypcji ich genów zależnego od TRRAP. Utrata TRRAP powodowała nieprawidłową segregację chromosomów oraz defekty w funkcjonowaniu punktu kontrolnego mitozy. Wydaje się prawdopodobnym, iż błędy te mogą prowadzić do niestabilności chromosomowej i w końcu do transformacji nowotworowej. Z kolei, sekwencje promotorowe genów aktywnie transkrybowanych cechują się obecnością acetylowanych postaci H3 i H4 oraz metylacją H3K4 [25,48]. Nabywane tych zmian może być podstawą aktywacji onkogenów. W komórkach nowotworowych raka prostaty zmniejszony poziom modyfikacji H3K4me2 oraz H3K18ac obserwowano u pacjentów z gorszą prognozą przebiegu choroby, u których ryzyko wznowy było większe [49]. Również w przypadku raka piersi, pacjentów z średnim i niskim poziomem acetylacji lizyny (H3K9ac, H3K18ac i H4K12ac), metylacji reszt lizyny (H3K4me2 i H4K20me3) Rycina 3. Model wyciszania ekspresji genów podczas transformacji nowotworowej. W komórkach prawidłowych histony H3 znajdujące się w obszarze wyspy CpG w rejonie miejsca startu transkrypcji mają acetylowaną resztę lizyny w pozycji 9 (H3K9). Modyfikacja ta powoduje lokalną dekondensację struktury chromatyny, co ułatwia przyłączanie czynników transkrypcyjnych i aktywną transkrypcję. W komórkach nowotworowych może następować hipermetylacja DNA utrzymywana przez metylotransferazy DNA (DNMT), metylotransferazy histonów (HMT) oraz deacetylazy histonów (HDAC). Hipermetylacji DNA towarzyszy deacetylacja i metylacja H3K9. Te modyfikacje epigenetyczne prowadzą do kondensacji chromatyny, co stanowi zawadę steryczną dla czynników transkrypcyjnych i w konsekwencji wycisza transkrypcję. Postępy Biochemii 58 (3)

5 Rycina 4. Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) powodują aktywację kinaz ATM i ATR, które fosforylują resztę seryny w histonie H2AX w pozycji 139. Podobny efekt ma miejsce podczas działania inhibitora deacetylaz histonów (TSA), roztworu hipotonicznego lub chlorochiny. Wszystkie te czynniki nie wprowadzają DSB, ale rozluźniają strukturę chromatyny. Zatem po powstaniu DSB może dojść do reorganizacji struktury chromatyny, co dopiero aktywuje ATM/ATR. i argininy (H4R3me2) zakwalifikowano do podgrupy o gorszej prognostyce choroby włączając w to raka podstawnokomórkowego i raka HER-2 dodatniego [50]. Także w raku pęcherza, w raku naciekającym i nienaciekającym błony mięśniowe pęcherza oraz w raku pęcherza z przerzutami globalny poziom metylacji (H3K4me1, H3K4me3, H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) był niższy niż w prawidłowych komórkach nabłonka pęcherza moczowego [51]. Intuicyjnie wydaje się, iż postępowi choroby powinien towarzyszyć wzrost poziomu modyfikacji histonów. Jednak kilka powyżej wymienionych obserwacji świadczy o zmniejszaniu się poziomu modyfikacji histonów wraz z zaawansowaniem choroby. Możliwe, iż spadek modyfikacji histonów powoduje redystrybucję tych modyfikacji w całym genomie do ograniczonej liczby genów lub kondensację chromatyny, co zmniejszałoby dostępność DNA i powodowało większą odporność DNA na genotoksykanty [52]. Ponieważ zmiana wzoru metylacji DNA oraz modyfikacji histonów zachodzi w procesie nowotworzenia, zaproponowano model przedstawiający związek pomiędzy nimi, mający na celu wyjaśnienie wyciszania ekspresji genów supresorowych w komórkach nowotworowych [53] (Ryc. 3). W komórkach prawidłowych wyspy CpG znajdują się w pobliżu miejsca startu transkrypcji genu ulegającego ekspresji, w miejscu chronionym przed metylacją DNA. H3K9 występuje w postaci acetylowanej, co rozluźnia strukturę chromatyny ułatwiając dostęp czynnikom transkrypcyjnym. W komórkach nowotworowych wyspy CpG w sekwencji otaczającej miejsce startu transkrypcji genów supresorowych są hipermetylowane. Hipermetylacja DNA jest utrzymywana przez DNMT, HDAC oraz HMT. Hipermetylacji DNA w miejscu startu transkrypcji towarzyszy deacetylacja histonów oraz metylacja H3K9 wyciszająca ekspresję genów. W konsekwencji współdziałania mechanizmów epigenetycznych następuje zablokowanie dostępu miejsca startu transkrypcji dla czynników promujących ekspresję genów. Udział hipoacetylacji i hipermetylacji H3 i H4 w wyciszaniu ekspresji genów supresorowych, np. p21 WAF1, pomimo braku hipermetylacji wyspy CpG w sekwencji promotorowej, oraz udział HMT w rekrutowaniu DNMT do sekwencji promotorowych dał podstawę do hipotezy mówiącej o zachodzeniu metylacji histonów na wczesnych etapach wyciszania ekspresji genów w transformacji nowotworowej, która następnie inicjuje/utrzymuje metylację DNA [54-56]. Ten sekwencyjny model został potwierdzony w badaniu przeprowadzonym in vitro [57]. Wywołano przejściowe wyciszenie ekspresji genu reporterowego w wyniku wiązania specyficznego kompleksu 296

6 represora transkrypcji. Wiązanie to indukowało metylację H3K9 w rejonie sekwencji promotorowej tego genu. Kiedy usunięto represor transkrypcji większość klonów aktywnie transkrybowała gen reporterowy, ale u części klonów zaobserwowano trwałe, dziedziczne wyciszenie tego genu spowodowane hipermetylacją DNA w sekwencji promotorowej. Badania nad reekspresją stabilnie wyciszonych genów wskazują, że chociaż zmiany modyfikacji histonów zachodziły wcześniej niż hipermetylacja DNA, to ta ostatnia była dominującym czynnikiem determinującym wyciszenie ekspresji genów [53,58]. Obserwowano brak przywracania ekspresji genów, które uległy trwałemu wyciszeniu i wykazywały hipermetylację wysp CpG w sekwencji promotorowej, w komórkach nowotworowych po podaniu inhibitora HDAC, trichostatyny A (TSA), oraz przywracanie ekspresji genów, których wyspy CpG były niezmetylowane [58]. Synergistyczne działanie 5-aza-2 -deoksycytydyny, inhibitora metylacji DNA, i TSA powodowało reekspresę genów, których sekwencje promotorowe były zmetylowane. Podobny proces obserwowano dla ekspresji SLIT2. W większości przypadków metastatycznego raka prostaty ekspresja SLIT2 jest wyciszona i koreluje dodatnio z trimetylacją H3K27 przeprowadzaną przez Ezh2. Ponowną ekspresję SLIT2 przywracano po podaniu inhibitorów Ezh2, ale także po podaniu 5-aza-2 -deoksycytydyny [59]. Ponadto niektóre HMT zawierają domeny podobne do domen wiążących grupy metylowe (MBD, ang. metyl-binding domain) co wskazuje, że może istnieć dodatkowe oddziaływanie pomiędzy modyfikacjami histonów a metylacją DNA [60]. Oprócz regulacji ekspresji genów modyfikacje histonów modulują stopień kondensacji chromatyny. Równowaga pomiędzy euchromatyną a heterochromatyną może regulować dostęp czynników naprawy DNA do uszkodzeń DNA. Zatem w zamkniętej heterochromatynie DNA może być mniej dostępny dla czynników naprawczych, co powoduje spadek liczby naprawianych uszkodzeń DNA. Akumulacja nienaprawionych uszkodzeń może prowadzić do mutacji i być podstawą procesu nowotworzenia. Acetylacja histonów jest ważnym procesem regulującym dostępność chromatyny. Jednak inne modyfikacje, w tym fosforylacja i metylacja mogą również odgrywać znaczącą rolę w tym procesie. Udział modyfikacji histonów w naprawie DNA i w następstwie utrzymaniu stabilności genomu został po raz pierwszy pokazany dla acetylacji H4. Mutacja w genie kodującym H4 powodująca zmianę kodonu lizyny w ogonie histonu zwiększała wrażliwość DNA na czynniki uszkadzające, w tym metanosulfonian metylu i kamptotecynę, ale nie na promieniowanie UV świadcząc, że modyfikacja lizyny H4 może mieć udział w naprawie dwuniciowych pęknięć DNA (DSB, ang. double-strand break) [61]. Nieprawidłowa naprawa DSB może prowadzić do niestabilności chromosomowej, co może być przyczyną transformacji nowotworowej. Podjednostka katalityczna Esa1 enzymu NuA4, HAT, której substratami są lizyny w H4, jest również niezbędna dla naprawy DSB. Mutanty mające zniesioną aktywność HAT poprzez mutację w Esa1 były wrażliwe na te same czynniki uszkadzające jak mutanty H4 [61]. Esa1 jest drożdżowym homologiem białka Tip60 człowieka. Komórki mające defekt Tip60 poddane działaniu promieniowania γ akumulują DSB i nie wchodzą na szlak apoptozy [62]. Mutacje Tip60 znoszące aktywność acetylotransferazy mogą powodować osłabienie mechanizmów naprawy pęknięć DNA i prowadzić do mutacji lub niestabilności genomowej. Mutacje w genach kodujących podjednostki NuA4, Gcn5 lub Yng2, powodują defekt naprawy DNA oraz prowadzą do zatrzymania widełek replikacyjnych co świadczy o udziale NuA4 w naprawie DNA w fazie S cyklu komórkowego [63]. Mutanty yng2, które utraciły aktywność acetylotransferazy NuA4 wymagają naprawy poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ, ang. non-homologous end joining), gdyż mechanizm naprawy DSB poprzez rekombinację homologiczną (HR) jest niesprawny. Inaktywacja Gcn5, HAT specyficznej względem H3, powodowała podobną wrażliwość mutantów gcn5 na czynniki uszkadzające DNA w porównaniu do mutantów yng2 wskazując, że deacetylacja chromatyny wpływa na naprawę DNA. NuA4 był rekrutowany do fosforylowanej postaci H2A, co może wskazywać, iż ta modyfikacja histonów reguluje nakierowanie NuA4 do DSB [64]. Acetylacja histonów wpływa także na naprawę DNA przez wycinanie nukleotydów (NER, ang. nucleotide excision repair). Działanie inhibitorów HDAC prowadzi do globalnego zwiększenia acetylacji histonów i zwiększa wydajność naprawy NER. Również naprawa uszkodzeń wywołanych przez promieniowanie UV jest korelowana dodatnio ze zwiększonym poziomem acetylacji histonów [65]. Kompleks HAT zawierający Gcn5, TFTC, był przyłączany do uszkodzeń DNA powodowanych przez promieniowanie UV i preferencyjnie acetylował histony w nukleosomach, w których DNA uległ uszkodzeniu. Ponadto podjednostki TFTC były rekrutowane do uszkodzeń DNA wspólnie z XPA, białkiem uczestniczącym w NER. Wydaje się, że deacetylacja histonów po zakończeniu naprawy DNA usprawnia proces przywracania struktury chromatyny, która uległa reorganizacji podczas naprawy DNA [66]. Jednym z najwcześniej zachodzących zdarzeń w miejscu DSB jest fosforylacja histonu H2AX. Modyfikacja ta jest wywołana przez szlak sygnalizacyjny inicjowany w odpowiedzi na DSB. Fosforylowana postać H2AX określana jest jako γh2ax. Modyfikacja ta jest zależna od enzymów z grupy kinaz białkowych pokrewnych z kinazą fosfatydylo- -3-inozytolu (PIKK, ang. phosphoinositide 3-kinase-related), do których należą m.in. kinaza ATM (ang. ataxia teleangiectasia mutated), ATR (ang. ataxia teleangiectasia related) oraz DNA- -PK (ang. DNA-dependent protein kinase) [67]. Dotychczas postulowano, że podobnie jak kinaza Mec1 (białko homologiczne do ATM występujące u drożdży) ma powinowactwo do struktur końcowych DNA powstających w następstwie DSB tak ATM i ATR kierują się w pobliże DSB i fosforylują H2AX. Z kolei późniejsze wyniki badań wskazują, że DSB wywoływały zmianę struktury chromatyny wyższego rzędu, co prowadziło do aktywacji ATM [68]. Zastosowanie inhibitora HDAC w postaci TSA lub innych czynników zmieniających organizację struktury chromatyny, takich jak roztwór hipotoniczny lub chlorochina, powodowało aktywację ATM pomimo braku DSB. Te dane wskazują na możliwość regulacji naprawy DNA poprzez zmianę organizacji struktury chromatyny. Nieprawidłowości we wzorze modyfikacji histonów korelują z obniżoną lub nieprawidłową aktywnością enzymów modyfikujących histony w komórkach nowotworowych Postępy Biochemii 58 (3)

7 [69]. Wzór ekspresji enzymów modyfikujących histony jest różny dla komórek nowotworowych i prawidłowych oraz jest specyficzny względem typu nowotworu [70]. Na przykład Ezh2 ulega nadprodukcji w kilku nowotworach, w tym w raku piersi, metastatycznym raku prostaty oraz w białaczkach i koreluje dodatnio ze słabą prognozą [71-74]. Ezh2 modyfikuje histony zlokalizowane w pobliżu pewnych genów, jednakże, do tej pory nie wykazano bezpośredniego udziału tych genów w nowotworzeniu. Naprodukcja Ezh2 korelowała ze wzrostem proliferacji limfocytów B, a antysensowa inhibicja Ezh2 prowadziła do obniżenia syntezy DNA [71,75]. Nadprodukcja tego białka była pozytywnie korelowana z progresją raka piersi. Ostatnie wyniki badań wskazują, że wyjaśnieniem tego mechanizmu może być zahamowanie naprawy DNA w macierzystych komórkach nowotworowych wywołane nadprodukcją Ezh2 [76]. Zmianę syntezy HDAC obserwuje się w kilku nowotworach. Dla przykładu nadprodukcję HDAC1 w raku żołądka, prostaty, okrężnicy i piersi, HDAC2 w raku szyi, żołądka i okrężnicy a HDAC3 i HDAC6 odpowiednio w raku okrężnicy i piersi [77-84]. Powyższe obserwacje skłaniają do rozważenia możliwości represji transkrypcji genów supresorowych w komórkach nowotworowych poprzez nadprodukcję i kierowanie HDAC do sekwencji promotorowych. W komórkach nowotworowych histony zlokalizowane w sekwencji promotorowej genu supresorowego p21 WAF1 były hipoacetylowane, co korelowało dodatnio z wyciszoną transkrypcję tego genu [85]. Inhibitory HDAC zwiększały acetylację histonów w regionie promotorowym i ekspresję p21 WAF1, co korelowało dodatnio z hamowaniem wzrostu komórek nowotworowych. Oprócz zmiany syntezy enzymów katalizujących modyfikacje histonów również ich mutacje są korelowane z występowaniem nowotworów. P300 (EP300) oraz CBP należą do rodziny koaktywatorów p300-cpb i mają aktywność HAT. Mutacje zmiany sensu lub mutacje nonsensowne, jak również utrata heterozygotyczności w p300 jest korelowana dodatnio z występowaniem kilku nowotworów [86,87]. Mikrodelecja w CBP w komórkach rozrodczych jest przyczyną zespołu Rubinsteina-Taybiego, który zwiększa ryzyko wystąpienia nowotworu wieku dziecięcego [88]. Translokacja genu MLL, kodującego HMT H3K4, prowadząca do powstania genów fuzyjnych z p300 lub CBP jest obserwowana w białaczce [89]. U myszy CBP+/ obserwowano zwiększoną częstość występowania nowotworów układu krwiotwórczego w porównaniu do myszy CBP+/+ [88]. Jednak warto mieć na uwadze fakt, iż p300 oprócz modyfikacji histonów acetyluje p53 w odpowiedzi na uszkodzenia DNA, zatem bezpośredni udział p300 w nowotworzeniu poprzez modyfikacje histonów wymaga potwierdzenia [90]. Mutacja nonsensowna w genie kodującym HDAC2 koreluje dodatnio z kilkoma nowotworami sporadycznymi, a mutacja zmiany ramki odczytu w tym genie powodowała utratę syntezy HDAC2, a tym samym i aktywności enzymatycznej [91]. Wyniki ostatnich badań wskazują, że przejściowy stan chromatyny, częściowo warunkowany przez aktywność KDM5A/RBP2/Jarid1A, HDM, pośredniczy w nabywaniu tolerancji na leki przeciwnowotworowe. Knockdown KDM5A/RBP2/Jarid1A zwiększał wrażliwość komórek nowotworowych na cisplatynę, a przejściowa ekspresja KDM5A/RBP2/Jarid1A zwiększała populację komórek nowotworowych opornych na działanie inhibitorów kinazy tyrozynowej receptora dla naskórkowego czynnika wzrostu oraz inhibitora receptora dla insulinopodobnego czynnika wzrostu-1 [92]. Obserwowano również zwiększoną wrażliwość komórek chłoniaka Hodgkina na działanie cisplatyny po wcześniejszym podaniu vorinostatu, inhibitora HDAC [93]. PODSUMOWANIE Zmiany modyfikacji histonów należą do mechanizmów epigenetycznych, które towarzyszą zmianom genetycznym podczas inicjacji, promocji i progresji nowotworzenia. Zmiany te mogą zachodzić wcześnie podczas transformacji nowotworowej i promować zmiany genetyczne. Również na dalszych etapach onkogenezy zmiany modyfikacji histonów mogą sprzyjać powstawaniu mutacji. Poprzez utrzymanie równowagi, szczególnie pomiędzy acetylacją i metylacją histonów w sekwencjach promotorowych, modyfikacje histonów regulują ekspresję genów. Zaburzenia wzoru modyfikacji histonów mogą prowadzić do aktywacji ruchomych elementów genetycznych, zwiększenia transkrypcji onkogenów, a także inaktywacji genów supresorowych. Powoduje to defekty w replikacji i naprawie DNA oraz niesprawność punktów kontrolnych cyklu komórkowego prowadząc do niestabilności genomowej i transformacji nowotworowej. Modyfikacje histonów wpływają również na organizację struktury chromatyny wskazując obszary domen euchromatyny i heterochromatyny. Zamknięcie struktury chromatyny utrudnia dostęp czynników naprawczych do uszkodzeń DNA. Prowadzi to do akumulacji nienaprawionych uszkodzeń, których utrwalenie może być przyczyną onkogenezy. Nieprawidłowości wzoru modyfikacji histonów występujące w nowotworach mogą być konsekwencją anormalnej ekspresji lub mutacji w genach kodujących białka biorące udział w modyfikacji histonów. Mechanizm zmian modyfikacji histonów w nowotworzeniu jest trudny do ustalenia z uwagi na liczności kopii genów kodujących histony oraz enzymów, które katalizują modyfikacje histonów, niehistonowych białek efektorowych, które są rekrutowane do miejsc modyfikacji histonów oraz oddziaływań histon-histon. Pomimo tego spekuluje się, iż zmiany modyfikacji histonów są jednym z czynników promujących transformację nowotworową. Ustalenie wzoru modyfikacji histonów specyficznego względem danego nowotworu może mieć znaczenie dla celów klinicznych, szczególnie dla wczesnej diagnostyki, prognozy i predykcji choroby oraz przewidywania wznowy guza. Dla przykładu dimetylacja H3K4 oraz acetylacja H4K18 zostały zaproponowane jako epigenetyczne wyznaczniki (markery), na podstawie których można oszacować ryzyko wznowy raka prostaty [49]. Kilka czynników zaburzających modyfikacje histonów jest poddanych testom klinicznym lub jest już stosowanych w medycynie. Inhibitor HDAC, entinostat, jest w drugiej fazie badań klinicznych przeciwko ziarnicy złośliwej, rakowi piersi w zaawansowanym stadium oraz metastatycznemu rakowi płuc. Podanie tego związku w połączeniu z czynnikiem demetylującym DNA, preparat vidaza, szczurom z gruczolakorakiem płuc, u których występowały mutacje KRAS/p53 lub KRAS/EGFR zmniejszało o 75% masę guza. Obserwowano reekspresję genów proapoptotycznych, genów kodujących regulatory cyklu komórkowego, białka biorące udział w naprawie DNA oraz w przebudowie tkan

8 ki [94]. Inne inhibitory HDAC, walproinian magnezu oraz panobinostat, są w trzeciej fazie badań klinicznych. Pierwszy z nich przeciwko kilku nowotworom w tym chłoniakom skóry T-komórkowym, drugi, przeciwko nowotworom szyi i jajnika. Natomiast vorinostat oraz romidepsyna są stosowane w medycynie w leczeniu chłoniaków skóry T-komórkowych. Pomimo iż mechanizm/y modyfikacji histonów nie są w pełni poznane już teraz wydaje się, że zrozumienie ich roli w procesie nowotworzenia będzie miało znaczenie dla terapii przeciwnowotworowej. PIŚMIENNICTWO 1. Henikoff S, Ahmad K (2005) Assembly of variant histones into chromatin. Annu Rev Cell Dev Biol 21: Gräff J, Mansuy IM (2008) Epigenetic codes in cognition and behaviour. Behav Brain Res 192: Gary JD, Clarke S (1998) RNA and protein interactions modulated by protein arginine methylation. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 61: Kouzarides T (2007) Chromatin modifications and their function. Cell 128: Chen Y, Sprung R, Tang Y, Ball H, Sangras B, Kim SC, Falck JR, Peng J, Gu W, Zhao Y (2007) Lysine propionylation and butyrylation are novel post-translational modifications in histones. Mol Cell Proteomics 6: Portela A, Esteller M (2010) Epigenetic modifications and human disease. Nat Biotechnol 10: Roth SY, Denu JM, Allis CD (2001) Histone acetyltransferases. Annu Rev Biochem 70: Grozinger CM, Schreiber SL (2002) Deacetylase enzymes: biological functions and the use of small-molecule inhibitors. Chem Biol 9: Keppler BR, Archer TK (2008) Chromatin-modifying enzymes as therapeutic targets Part 2. Expert Opin Ther Targets 12: Rea S, Eisenhaber F, O Carroll D, Strahl BD, Sun ZW, Schmid M, Opravil S, Mechtler K, Ponting CP, Allis CD, Jenuwein T (2000) Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyltransferases. Nature 406: Di Lorenzo A, Bedford MT (2011) Histone arginine methylation. FEBS Lett 585: Lachner M, O Sullivan RJ, Jenuwein T (2003) An epigenetic road map for histone lysine methylation. J Cell Sci 116: Cuthbert GL, Daujat S, Snowden AW, Erdjument-Bromage H, Hagiwara T, Yamada M, Schneider R, Gregory PD, Tempst P, Bannister AJ, Kouzarides T (2004) Histone deimination antagonizes arginine methylation. Cell 118: Thompson PR, Fast W (2006) Histone citrullination by protein arginine deiminase: is arginine methylation a green light or a roadblock? ACS Chem Biol 1: Göthel SF, Marahiel MA (1999) Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of ubiquitous folding catalysts. Cell Mol Life Sci 55: Bradbury EM (1992) Reversible histone modifications and the chromosome cell cycle. Bioessays 14: Fischle W, Wang Y, Allis CD (2003) Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol 15: Shogren-Knaak M, Ishii H, Sun JM, Pazin MJ, Davie JR, Peterson CL (2006) Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions. Science 311: Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM (1998) DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273: Rundlett SE, Carmen AA, Suka N, Turner BM, Grunstein M (1998) Transcriptional repression by UME6 involves deacetylation of lysine 5 of histone H4 by RPD3. Nature 392: Vogelauer M, Wu J, Suka N, Grunstein M (2000) Global histone acetylation and deacetylation in yeast. Nature 408: Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K (2007) High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell 129: Hebbes TR, Thorne AW, Crane-Robinson C (1988) A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO J 7: Norton VG, Imai BS, Yau P, Bradbury EM (1989) Histone acetylation reduces nucleosome core particle linking number change. Cell 57: Liang G, Lin JC, Wei V, Yoo C, Cheng JC, Nguyen CT, Weisenberger DJ, Egger G, Takai D, Gonzales FA, Jones PA (2004) Distinct localization of histone H3 acetylation and H3-K4 methylation to the transcription start sites in the human genome. Proc Natl Acad Sci USA 101: Bannister AJ, Schneider R, Myers FA, Thorne AW, Crane-Robinson C, Kouzarides T (2005) Spatial distribution of di- and tri-methyl lysine 36 of histone H3 at active genes. J Biol Chem 280: Bernstein BE, Mikkelsen TS, Xie X, Kamal M, Huebert DJ, Cuff J, Fry B, Meissner A, Wernig M, Plath K, Jaenisch R, Wagschal A, Feil R, Schreiber SL, Lander ES (2006) A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell 125: Fraga MF, Ballestar E, Villar-Garea A, Boix-Chornet M, Espada J, Schotta G, Bonaldi T, Haydon C, Ropero S, Petrie K, Iyer NG, Pérez- Rosado A, Calvo E, Lopez JA, Cano A, Calasanz MJ, Colomer D, Piris MÁ, Ahn N, Imhof A, Caldas C, Jenuwein T, Esteller M (2005) Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of histone H4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet 37: Sawicka A, Seiser C (2012) Histone H3 phosphorylation - A versatile chromatin modification for different occasions. Biochimie, w druku 30. Johnsen SA (2012) The enigmatic role of H2Bub1 in cancer. FEBS Lett 586: Shilatifard A (2006) Chromatin modifications by methylation and ubiquitination: implications in the regulation of gene expression. Annu Rev Biochem 75: Shiio Y, Eisenman RN (2003) Histone sumoylation is associated with transcriptional repression. Proc Natl Acad Sci USA 100: Vaissière T, Sawan C, Herceg Z (2008) Epigenetic interplay between histone modifications and DNA methylation in gene silencing. Mutat Res 659: Nan X, Ng HH, Johnson CA, Laherty CD, Turner BM, Eisenman RN, Bird A (1998) Transcriptional repression by the methyl-cpg-binding protein MeCP2 involves a histone deacetylase complex. Nature 393: Zhao Q, Rank G, Tan YT, Li H, Moritz RL, Simpson RJ, Cerruti L, Curtis DJ, Patel DJ, Allis CD, Cunningham JM, Jane SM (2009) PRMT5- mediated methylation of histone H4R3 recruits DNMT3A, coupling histone and DNA methylation in gene silencing. Nat Struct Mol Biol 16: Jones PL, Veenstra GJ, Wade PA, Vermaak D, Kass SU, Landsberger N, Strouboulis J, Wolffe AP (1998) Methylated DNA and MeCP2 recruit histone deacetylase to repress transcription. Nat Genet 19: Estéve PO, Chin HG, Benner J, Feehery GR, Samaranayake M, Horwitz GA, Jacobsen SE, Pradhan S (2009) Regulation of DNMT1 stability through SET7-mediated lysine methylation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 106: Wang J, Hevi S, Kurash JK, Lei H, Gay F, Bajko J, Su H, Sun W, Chang H, Xu G, Gaudet F, Li E, Chen T (2009) The lysine demethylase LSD1 (KDM1) is required for maintenance of global DNA methylation. Nat Genet 41: Fuks F, Hurd PJ, Wolf D, Nan X, Bird AP, Kouzarides T (2003) The methyl-cpg-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J Biol Chem 278: Sharma S, Kelly TK, Jones PA (2010) Epigenetics in cancer. Carcinogenesis 31: Postępy Biochemii 58 (3)

9 41. Pogribny IP, Ross SA, Tryndyak VP, Pogribna M, Poirier LA, Karpinets TV (2006) Histone H3 lysine 9 and H4 lysine 20 trimethylation and the expression of Suv4-20h2 and Suv-39h1 histone methyltransferases in hepatocarcinogenesis induced by methyl deficiency in rats. Carcinogenesis 27: Van Den Broeck A, Brambilla E, Moro-Sibilot D, Lantuejoul S, Brambilla C, Eymin B, Khochbin S, Gazzeri S (2008) Loss of histone H4K20 trimethylation occurs in preneoplasia and influences prognosis of nonsmall cell lung cancer. Clin Cancer Res 14: Sawan C, Herceg Z (2010) Histone modifications and cancer. Adv Genet 70: Enroth S, Rada-Iglesisas A, Andersson R, Wallerman O, Wanders A, Påhlman L, Komorowski J, Wadelius C (2011) Cancer associated epigenetic transitions identified by genome-wide histone methylation binding profiles in human colorectal cancer samples and paired normal mucosa. BMC Cancer 11: Nguyen TT, Cho K, Stratton SA, Barton MC (2005) Transcription factor interactions and chromatin modifications associated with p53-mediated, developmental repression of the alpha-fetoprotein gene. Mol Cell Biol 25: Viré E, Brenner C, Deplus R, Blanchon L, Fraga M, Didelot C, Morey L, Van Eynde A, Bernard D, Vanderwinden JM, Bollen M, Esteller M, Di Croce L, de Launoit Y, Fuks F (2006) The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 439: Li H, Cuenin C, Murr R, Wang ZQ, Herceg Z (2004) HAT cofactor Trrap regulates the mitotic checkpoint by modulation of Mad1 and Mad2 expression. EMBO J 23: Heintzman ND, Stuart RK, Hon G, Fu Y, Ching CW, Hawkins RD, Barrera LO, Van Calcar S, Qu C, Ching KA, Wang W, Weng Z, Green RD, Crawford GE, Ren B (2007) Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet 39: Seligson DB, Horvath S, Shi T, Yu H, Tze S, Grunstein M, Kurdistani SK (2005) Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature 435: Elsheikh SE, Green AR, Rakha EA, Powe DG, Ahmed RA, Collins HM, Soria D, Garibaldi JM, Paish CE, Ammar AA, Grainge MJ, Ball GR, Abdelghany MK, Martinez-Pomares L, Heery DM, Ellis IO (2009) Global histone modifications in breast cancer correlate with tumor phenotypes, prognostic factors, and patient outcome. Cancer Res 69: Schneider AC, Heukamp LC, Rogenhofer S, Fechner G, Bastian PJ, von Ruecker A, Müller SC, Ellinger J (2011) Global histone H4K20 trimethylation predicts cancer-specific survival in patients with muscle-invasive bladder cancer. BJU Int 108: E Kurdistani SK (2007) Histone modifications as markers of cancer prognosis: a cellular view. Br J Cancer 97: Fahrner JA, Eguchi S, Herman JG, Baylin SB (2002) Dependence of histone modifications and gene expression on DNA hypermethylation in cancer. Cancer Res 62: Richon VM, Sandhoff TW, Rifkind RA, Marks PA (2000) Histone deacetylase inhibitor selectively induces p21 WAF1 expression and geneassociated histone acetylation. Proc Natl Acad Sci USA 97: Jackson JP, Johnson L, Jasencakova Z, Zhang X, PerezBurgos L, Singh PB, Cheng X, Schubert I, Jenuwein T, Jacobsen SE (2004) Dimethylation of histone H3 lysine 9 is a critical mark for DNA methylation and gene silencing in Arabidopsis thaliana. Chromosoma 112: Cao R, Wang L, Wang H, Xia L, Erdjument-Bromage H, Tempst P, Jones RS, Zhang Y (2002) Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing. Science 298: Ayyanathan K, Lechner MS, Bell P, Maul GG, Schultz DC, Yamada Y, Tanaka K, Torigoe K, Rauscher FJ 3rd (2003) Regulated recruitment of HP1 to an euchromatic gene induces mitotically heritable, epigenetic gene silencing: a mammalian cell culture model of gene variegation. Genes Dev 17: Cameron EE, Bachman KE, Myöhänen S, Herman JG, Baylin SB (1999) Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the reexpression of genes silenced in cancer. Nat Genet 21: Yu J, Cao Q, Yu J, Wu L, Dallol A, Li J, Chen G, Grasso C, Cao X, Lonigro RJ, Varambally S, Mehra R, Palanisamy N, Wu JY, Latif F, Chinnaiyan AM (2010) The neuronal repellent SLIT2 is a target for repression by EZH2 in prostate cancer. Oncogene 29: Zhang Y, Reinberg D (2001) Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev 15: Bird AW, Yu DY, Pray-Grant MG, Qiu Q, Harmon KE, Megee PC, Grant PA, Smith MM, Christman MF (2002) Acetylation of histone H4 by Esa1 is required for DNA double-strand break repair. Nature 419: Ikura T, Ogryzko VV, Grigoriev M, Groisman R, Wang J, Horikoshi M, Scully R, Qin J, Nakatani Y (2000) Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis. Cell 102: Choy JS, Kron SJ (2002) NuA4 subunit Yng2 function in intra-s-phase DNA damage response. Mol Cell Biol 22: Allard S, Utley RT, Savard J, Clarke A, Grant P, Brandl CJ, Pillus L, Workman JL, Côté J (1999) NuA4, an essential transcription adaptor/ histone H4 acetyltransferase complex containing Esa1p and the ATMrelated cofactor Tra1p. EMBO J 18: Brand M, Moggs JG, Oulad-Abdelghani M, Lejeune F, Dilworth FJ, Stevenin J, Almouzni G, Tora L (2001) UV-damaged DNA-binding protein in the TFTC complex links DNA damage recognition to nucleosome acetylation. EMBO J 20: Utley RT, Lacoste N, Jobin-Robitaille O, Allard S, Côté J (2005) Regulation of NuA4 histone acetyltransferase activity in transcription and DNA repair by phosphorylation of histone H4. Mol Cell Biol 25: Foster ER, Downs JA (2005) Histone H2A phosphorylation in DNA double-strand break repair. FEBS J 272: Bakkenist CJ, Kastan MB (2003) DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature 421: Esteller M (2006) Epigenetics provides a new generation of oncogenes and tumour-suppressor genes. Br J Cancer 94: Özdağ H, Teschendorff AE, Ahmed AA, Hyland SJ, Blenkiron C, Bobrow L, Veerakumarasivam A, Burtt G, Subkhankulova T, Arends MJ, Collins VP, Bowtell D, Kouzarides T, Brenton JD, Caldas C (2006) Differential expression of selected histone modifier genes in human solid cancers. BMC Genomics 7: Varambally S, Dhanasekaran SM, Zhou M, Barrette TR, Kumar-Sinha C, Sanda MG, Ghosh D, Pienta KJ, Sewalt RG, Otte AP, Rubin MA, Chinnaiyan AM (2002) The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer. Nature 419: Kleer CG, Cao Q, Varambally S, Shen R, Ota I, Tomlins SA, Ghosh D, Sewalt RG, Otte AP, Hayes DF, Sabel MS, Livant D, Weiss SJ, Rubin MA, Chinnaiyan AM (2003) EZH2 is a marker of aggressive breast cancer and promotes neoplastic transformation of breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci USA 100: Valk-Lingbeek ME, Bruggeman SW, van Lohuizen M (2004) Stem cells and cancer; the polycomb connection. Cell 118: Visser HP, Gunster MJ, Kluin-Nelemans HC, Manders EM, Raaphorst FM, Meijer CJ, Willemze R, Otte AP (2001) The Polycomb group protein EZH2 is upregulated in proliferating, cultured human mantle cell lymphoma. Br J Haematol 112: Su IH, Basavaraj A, Krutchinsky AN, Hobert O, Ullrich A, Chait BT, Tarakhovsky A (2003) Ezh2 controls B cell development through histone H3 methylation and Igh rearrangement. Nat Immunol 4: Chang CJ, Yang JY, Xia W, Chen CT, Xie X, Chao CH, Woodward WA, Hsu JM, Hortobagyi GN, Hung MC (2011) EZH2 promotes expansion of breast tumor initiating cells through activation of RAF1-β-catenin signaling. Cancer Cell 19: Choi JH, Kwon HJ, Yoon BI, Kim JH, Han SU, Joo HJ, Kim DY (2001) Expression profile of histone deacetylase 1 in gastric cancer tissues. Jpn J Cancer Res 92:

10 78. Halkidou K, Gaughan L, Cook S, Leung HY, Neal DE, Robson CN, Halkidou K (2004) Upregulation and nuclear recruitment of HDAC1 in hormone refractory prostate cancer. Prostate 59: Wilson AJ, Byun DS, Popova N, Murray LB, L Italien K, Sowa Y, Arango D, Velcich A, Augenlicht LH, Mariadason JM (2006) Histone deacetylase 3 (HDAC3) and other class I HDACs regulate colon cell maturation and p21 expression and are deregulated in human colon cancer. J Biol Chem 281: Zhang Z, Yamashita H, Toyama T, Sugiura H, Ando Y, Mita K, Hamaguchi M, Hara Y, Kobayashi S, Iwase H (2005) Quantitation of HDAC1 mrna expression in invasive carcinoma of the breast. Breast Cancer Res Treat 94: Huang BH, Laban M, Leung CH, Lee L, Lee CK, Salto-Tellez M, Raju GC, Hooi SC (2005) Inhibition of histone deacetylase 2 increases apoptosis and p21 Cip1/WAF1 expression, independent of histone deacetylase 1. Cell Death Differ 12: Song J, Noh JH, Lee JH, Eun JW, Ahn YM, Kim SY, Lee SH, Park WS, Yoo NJ, Lee JY, Nam SW (2005) Increased expression of histone deacetylase 2 is found in human gastric cancer. APMIS 113: Zhu P, Martin E, Mengwasser J, Schlag P, Janssen KP, Göttlicher M (2004) Induction of HDAC2 expression upon loss of APC in colorectal tumorogenesis. Cancer Cell 5: Zhang Z, Yamashita H, Toyama T, Sugiura H, Omoto Y, Ando Y, Mita K, Hamaguchi M, Hayashi S, Iwase H (2004) HDAC6 expression is correlated with better survival in breast cancer. Clin Cancer Res 10: Gui CY, Ngo L, Xu WS, Richon VM, Marks PA (2004) Histone deacetylase (HDAC) inhibitor activation of p21 WAF1 involves changes in promoter-associated proteins, including HDAC1. Proc Natl Acad Sci USA 101: Gayther SA, Batley SJ, Linger L, Bannister A, Thorpe K, Chin SF, Daigo Y, Russell P, Wilson A, Sowter HM, Delhanty JD, Ponder BA, Kouzarides T, Caldas C (2000) Mutations truncating the EP300 acetylase in human cancers. Nat Genet 24: Muraoka M, Konishi M, Kikuchi-Yanoshita R, Tanaka K, Shitara N, Chong JM, Iwama T, Miyaki M (1996) p300 gene alterations in colorectal and gastric carcinomas. Oncogene 12: Iyer NG, Özdag H, Caldas C (2004) p300/cbp and cancer. Oncogene 23: Yang XJ (2004) The diverse superfamily of lysine acetyltransferases and their roles in leukemia and other diseases. Nucleic Acids Res 32: Grossman SR (2001) p300/cbp/p53 interaction and regulation of the p53 response. Eur J Biochem 268: Ropero S, Fraga MF, Ballestar E, Hamelin R, Yamamoto H, Boix- Chornet M, Caballero R, Alaminos M, Setien F, Paz MF, Herranz M, Palacios J, Arango D, Orntoft TF, Aaltonen LA, Schwartz S Jr, Esteller M (2006) A truncating mutation of HDAC2 in human cancers confers resistance to histone deacetylase inhibition. Nat Genet 38: Sharma SV, Lee DY, Li B, Quinlan MP, Takahashi F, Maheswaran S, McDermott U, Azizian N, Zou L, Fischbach MA, Wong KK, Brandstetter K, Wittner B, Ramaswamy S, Classon M, Settleman J (2010) A chromatin-mediated reversible drug-tolerant state in cancer cell subpopulations. Cell 141: Kewitz S, Bernig T, Staege MS (2012) Histone deacetylase inhibition restores cisplatin sensitivity of Hodgkin s lymphoma cells. Leuk Res 36: Belinsky SA, Grimes MJ, Picchi MA, Mitchell HD, Stidley CA, Tesfaigzi Y, Channell MM, Liu Y, Casero RA Jr, Baylin SB, Reed MD, Tellez CS, March TH (2011) Combination therapy with vidaza and entinostat suppresses tumor growth and reprograms the epigenome in an orthotopic lung cancer model. Cancer Res 71: The significance of histone modifications in malignant transformation Paulina Gomulak *, Janusz Blasiak Department of Molecular Genetics, University of Lodz, 12/16 Banacha St., Lodz, Poland * pgomulak@biol.uni.lodz.pl Key words: chromatin, epigenetics, gene expression, histone modification, malignant transformation ABSTRACT Posttranslational modifications of histones belong to epigenetic mechanisms involved in normal development and maintaining the pattern of gene expression. Histone modifications can influence the global and local organization of chromatin structure. The effects of histone modifications can have mutual synergistic or antagonistic influence regulating access of chromatin-binding proteins and in this way determining the transition between transcriptionally active and inactive chromatin. Deregulation of this mechanism may be associated with many pathological conditions, including cancer. The question whether histone modifications belong to the reasons or the consequences of neoplastic transformation remaines unanswered. Based on research on restoring silenced gene expression through administration of histone deacetylase inhibitor or by knockout of the gene encoding the histone methyltransferase in cancer, it seems that at least some modifications of histones may have a causal nature. Histone modifications may be reversible which is a rationale to generate a new set of anticancer drugs inhibitors of enzymes that modify histones. Postępy Biochemii 58 (3)