Wykład 3. Organizacja jądra komórkowego struktura chromatyny

Transkrypt

1 Wykład 3 Organizacja jądra komórkowego struktura chromatyny

2 Struktura jądra komórkowego Matriks jądrowa - jądro komórkowe pozbawione chromatyny Nukleoplazma Heterochromatyna Euchromatyna Jąderko Otoczka jądrowa Błona wewnętrzna otoczki jądrowej Błona zewnętrzna otoczki jądrowej Blaszka jądrowa Przestrzeń okołojądrowa

3 Blaszka jądrowa lamina jądrowa LMNB1: lamina B1 LMNB2: lamina B2 i B3 LMNA: lamina A i C Lamina Dimer Polimer Protofilament Filament (10 nm dł.)

4 Laminopatie Gen LMNA EMD: dystrofia mięśniowa Emery ego-dreiffus a DCM: kardiomiopatia LGMD1B: dystrofia mięśniowa typu 1B CMT2: Charcot-Marie-Tooth neuropatia typu 2 MAD: mandibuloacral dysplasia

5 Niektóre mutacje w genie LMNA powodują syndrom przedwczesnego starzenia progerię Hutchinson a-gilford a oraz atypowy syndrom Wernera

6 Funkcje części peryferyjnej jądra komórkowego

7 Struktura jądra komórkowego Matriks jądrowa - jądro komórkowe pozbawione chromatyny Nukleoplazma Heterochromatyna Euchromatyna Jąderko Otoczka jądrowa Błona wewnętrzna otoczki jądrowej Błona zewnętrzna otoczki jądrowej Blaszka jądrowa Przestrzeń okołojądrowa

8 DNA w jądrze jest ściśle upakowane 2 metry DNA w każdej komórce 5 x km DNA w ludzkim ciele Nić DNA Włókno nukleosomowe Włókno 30-sto nm Chromatyna interfazowa Skondensowany fragment chromosomu Całkowita długość 46 chromosomów metafazowych wynosi tylko 200 µm Chromosom metafazowy

9 Główna powtarzająca się jednostka strukturalna chromatyny to nukleosom Oudet et al. (1975). Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. Cell 4,

10 Modele struktury włókna 30-sto nm

11 Upakowanie DNA chromosomowego u bakterii

12 Konsekwencją nawinięcia DNA na nukleosomy i jego ścisłego upakowania w jądrze komórkowym jest utrudniony dostęp innych białek do DNA: transkrypcja, replikacja i naprawa DNA odbywa się w kontekście chromatyny

13 Rodzaje chromatyny Euchromatyna otwarta (luźna); aktywna transkrypcyjnie Euchromatyna zamknięta (zwarta); nieaktywna transkrypcyjnie (cicha), ale może przejść w euchromatynę otwartą Heterochromatyna; permanetnie w stanie wysokiego skondensowania (zwarta, cicha); brak transkrypcji (!) W różnych typach komórek (tkanek) inne obszary chromatyny będą skondensowane lub luźne

14 Regulacja organizacji chromatyny w czasie i przestrzeni 1. Kowalencyjne modyfikacje potranslacyjne histonów 2. Wymiana histonów na ich warianty sekwencyjne lub na histony o innych modyfikacjach potranslacyjnych, a także przesuwanie nukleosomów wzdłuż DNA przez ATP-zależne kompleksy przebudowujące chromatynę 3. Metylacja DNA

15 Struktura atomowa nukleosomu H3 H2A H2B H4 Ogony histonów Oktamer histonowy = H3-H4 tetramer + 2 (H2A-H2B dimer)

16 Struktura atomowa nukleosomu Ogony histonów Nukleosom = oktamer histonowy + histon łącznikowy pz DNA (1,7 obrotu)

17 Histony najbardziej uniwersalne białka u eukariontów H1 (H5) najbardziej zmienny (213 aa) H2A i H2B silnie konserwatywne (129 i 125 aa) H3 i H4 najbardziej konserwatywne białka w przyrodzie (135 i 102 aa) H4 między histonem z grochu i krowy różnica tylko dwóch aminokwasów

18 Histony u archebakterii Tetramer (2 + 2) Podobieństwo strukturalne do tetrameru eukariotycznego (H3+H4) 2 Brak ogonów

19 Warianty sekwencyjne histonów Rodzaj histonu H3, H4, H2A, H2B H3.3, H2A.X, H2A.Z, H2A Bbd, Macro H2A Liczba kopii genów Co najmniej dwie Obecność intronów Nie Czas syntezy Tylko początek fazy S cyklu komórkowego Jedna Tak W różnych fazach cyklu komórkowego; niezależnie od syntezy DNA Poliadenylacja mrna histonu Nie Tak

20 Regulacja organizacji chromatyny w czasie i przestrzeni 1. Kowalencyjne modyfikacje potranslacyjne histonów 2. Wymiana histonów na ich warianty sekwencyjne lub na histony o innych modyfikacjach potranslacyjnych, a także przesuwanie nukleosomów wzdłuż DNA przez ATP-zależne kompleksy przebudowujące chromatynę 3. Metylacja DNA

21 Kowalencyjne modyfikacje histonów dotyczą głównie ich N-końcowych ogonów 4 9

22 Acetylacja histonów Seria acetylo-lizyn (bardziej obojętne niż dodatnio naładowane lizyny) na ogonach histonów osłabia interakcje elektrostatyczne między histonami a DNA, co pozwala na rozluźnienie chromatyny, dostępność DNA dla czynników transkrypcyjnych i aktywację transkrypcji Inne funkcje: regulacja replikacji DNA, naprawy DNA poprzez przebudowę chromatyny; acetylowane lizyny są wtedy miejscami przyłączenia dla odpowiednich białek regulacyjnych za pośrednictwem bromodomeny Za acetylację odpowiedzialne są acetylotransferazy (HAT), a donorem grupy acetylowej jest acetylo-coa Acetylacja jest odwracalna; deacetylacje przeprowadzają deacetylazy (HDAC)

23 Metylacja histonów Metylacja lizyny powoduje zwiększenie hydrofobowego i kationowego charakteru tej reszty aminokwasowej; w zależności od enzymy lizyna może być mono, di lub trimetylowana. Di (H3Lys9) i trimetylacja (H3Lys27), także metylacja H3 Lys14, stanowi sygnał, że dany region powinien być transkrypcyjnie wyciszony i tworzyć heterochromatynę. Natomiast Lys4 i 36 zmetylowane są w euchromatynie. Za metylację odpowiedzialne są metylotransferazy (HMT) zawierające domenę SET, np. Set1, Set7, Set9, a donorem grupy metylowej jest S-adenozyl- L-metionina (SAM) lub S-adenozylhomocysteina (AdoHcy); metylacja H3K79 katalizowana jest przez Dot1 spoza rodziny Set. Usunięcie grup metylowych: wymiana nukleosomów modyfikacje chemiczne zmetylowanych reszt lub enzymatyczna demetylacja Chromodomena

24 Fosforylacja histonów Fosforylacja Ser 10 histonu H3 niezbędna jest do kondensacji chromosomów i prawidłowej mitozy; także pozytywna rola w aktywacji transkrypcji: hamuje metylację lizyny 9 histonu H3 i promuje acetylację lizyn położonych w jej sąsiedztwie Zidentyfikowano ufosforylowane seryny na wszystkich histonach (fosforylacja wariantu H2A niezbędna jest w aktywacji naprawy DNA i regulacji cyklu komórkowego po uszkodzeniu DNA)

25 Ubikwitynacja histonów H2A-Ub Ubikwitynacja polega na przyłączeniu wiązaniem kowalencyjnym cząsteczki ubikwityny (76 aa, małe globularne białko) lub pokrewnej cząsteczki sumo Ubikwitynacji ulegają specyficzne lizyny na C-końcach histonu H2A (nie u drożdży) i H2B; sumoilacji podlega z kolei histon H4 Proces ubikwitynacji H2B wymaga trzech enzymów: enzym aktywujący ubikwitynę E1, który tworzy ester z Ub i przenosi ją następnie na enzym E2, nośnik ubikwityny (u drożdży jest to Rad6), który łączy się z enzymem E3 ligazą ubikwityna-białko (Bre1), która liguje Ub z histonem (np. H2B Lys123 u drożdży, Lys 120 u ludzi). Ubikwitynacja histonów skorelowana jest z aktywacją transkrypcji, a sumolacja z represją Proteaza Ubp8, składnik kompleksu SAGA, katalizuje usuwanie Ub z histonów regulacja ekspresji Ubikwitynacja histonu H2B jest niezbędna do metylacji Lys4 i Lys79 w histonie H3

26 Hipoteza kodu histonowego (Brian D. Strahl & C. David Allis; 2000, Nature) Chromatyna posiada specyficzne wzory modyfikacji potranslacyjnych, które można uznać za zakodowana informację odczytywaną przez białka modyfikujące i przebudowujące chromatynę Odpowiednie wzory modyfikacji chromatyny umożliwiają przyłączanie się do chromatyny białkom regulacyjnych biorących udział w regulacji transkrypcji i naprawie DNA lub/oraz odsłaniają DNA, do którego mogą się przyłączać bezpośrednio inne czynniki regulacyjne Określona modyfikacja specyficznej reszty aminokwasu w histonie może regulować modyfikację tej samej reszty aminokwasowej w innym histonie lub innej reszty w tym samym histonie Odpowiedni wzór modyfikacji chromatyny w danym regionie chromosomu może być dziedziczony

27 Kod histonowy przykłady wzorów modyfikacji chromatyny oraz relacje między modyfikacjami histonów Euchromatyna Heterochromatyna

28 Dziedziczenie metylacji histonów metylaza

29 Wymiana histonów Nawijanie DNA na nukleosomy po replikacji Wymiana histonów podczas transkrypcji Wymiana histonów

30 ATP-zależna przebudowa chromatyny Remodeling (przebudowa, wymiana histonów i nukleosomów) chromatyny: - wymiana histonów na warianty histonowe lub na te same, ale o innych modyfikacjach - usunięcie histonów z regionów regulacyjnych DNA - przesunięcie nukleosomów (cis wzdłuż tej samej cząsteczki DNA i trans między różnymi cząsteczkami DNA) - odciąganie fragmentów DNA od histonów, tworzy się pętla DNA Za remodeling chromatyny odpowiedzialne są kompleksy wielobiałkowe zawierające podjednostki ATPazowe, które warunkują ATP-zależne zmiany konformacyjne w nukleosomach; wyróżniamy cztery typy kompleksów odpowiedzialnych za remodeling: 1. SWI2 (zawierają bromodomenę,wszystkie rodzaje przebudowy chromatyny), 2. ISWI (przesuwanie nukleosomów) 3. INO80/SWR (wymiana histonów) 4. CHD (zawierają chromodomenę, regulacja transkrypcji)

31 Powstawanie cichej i aktywnej chromatyny zależne od modyfikacji potranslacyjnych histonów Rozprzestrzenianie Cicha Chromatyna

32 Metylacja DNA Kowalencyjnym modyfikacjom nie ulegają tylko histony, ale także samo DNA w postaci metylacji cytozyn w obrębie wysp CpG; wyst. u ssaków i roślin, ale nie u niższych zwierząt czy drożdży DNA metylotransferazy: DNMT Rola metylacji DNA: imprinting, inaktywacja chromosomu X, rozwój embrionalny, represja sekwencji powtórzonych i transpozonów Do zmetylowanego DNA przyłączają się białka z domeną MBD (methyl-cpg binding domain), do którego z kolei przyłącza się kompleks deacetylazy histonowej, co prowadzi do kondensacji chromatyny i represji ekspresji genów; mogą się również przyłączać metylotransferazy histonowe Mutacje w regulatorach metylacji DNA związane są z chorobami: syndrom Rett a i zespół łamliwego chromosomu X (dodatkowe wyspy CpG w promotorze FMR1, wyciszenie tego genu)

33 Udział metylacji DNA w rozprzestrzenianiu i utrzymywaniu stanu wyciszonej chromatyny Do H3K9-Me przyłącza się adaptor HP1, który nie tylko przyłącza HMT, ale także DNMT, który metyluje DNA Samonapędzający się cykl ustanawiania i podtrzymywania epigenetycznego stanu wyciszenia chromatyny - Przyłączanie MBD do zmetylowanej cytozyny w DNA - MBD umożliwia przyłączenie HDAC - następuje deacetylacja H3K9 -MBD przyciąga także HMT -HMT metyluje H3K9 -Do H3K9-Me przyłącza się adaptor HP1, który przyciąga HMT

34 Zaburzenia metylacji DNA mogą prowadzić do nowotworów Heterochromatyna konstytutywna Komórki normalne Komórki rakowe Asocjacja i oddziaływanie między Suv20h-HP1-DNMT Trimetylacja H4K20 i metylacja DNA Brak oddziaływania między Suv20h-HP1-DNMT Brak trimetylacji H4K20 i hypometylacja DNA

35 Epigenetyczna informacja oznacza dziedziczne zmiany funkcji genów, które są przekazywane komórkom potomnym, ale które nie są wynikiem zmian w sekwencji DNA, lecz modyfikacjami chromatyny. Przykładem mechanizmów epigenetycznych są modyfikacje potranslacyjne histonów, metylacja DNA i aktywna przebudowa chromatyny.

36 Niehistonowe składniki chromatyny Białka HMG Kompleksy przebudowujące chromatynę Czynniki transkrypcyjne np. aktywatory i represory transkrypcji Białka biorące udział w replikacji i naprawie DNA

37 Białka HMG niehistonowe składniki chromatyny HMG = high mobility proteins, białka o zwiększonej ruchliwości elektroforetycznej; druga po histonach najbardziej liczna grupa białek chromatyny Biorą udział w ustanawianiu aktywnej i wyciszonej chromatyny, w dostrajaniu regulacji transkrypcji HMG reagują z nukleosomami, czynnikami transkrypcyjnymi, histonem H1 oraz kompleksami przebudowującymi chromatynę 3 rodziny HMG: HMGA, HMGB, HMGN; dosyć małe, do 30 kda; liczne post-translacyjne modyfikacje HMGA i B bezpośrednio przyłączają się do DNA na zewnątrz nukleosomów, a HMGN przyłącza się wewnątrz nukleosomów między spiralą DNA a oktamerem histonowym

38 Mechanizm działania białek HMG