transkrypcja chromatyny

Transkrypt

1 transkrypcja chromatyny problem: Jak to może e działać: dysocjacja histonów? kompleks pol II RNA >500 kd skip: split: nukleosom: 145 bp DNA = 100 kd rdzeń histonowy = 100 kd strip: + Skip czy Split czy Strip? Thoma 1991 Trends Genet 7: 175

2 skip? Jak by to się mogło o dziać? przesuwanie się wzdłuż pętli DNA Studitsky, Clark, Felsenfeld 1974 Cell 76, 371 tak działa pol III RNA i fagowe pol RNA (także zależne od ATP kompleksy remodelujące) Studitsky i in Trends Bioch Sci 29:

3 Jak by to się mogło o dziać? split? w ME transkrybowana chromatyna wydaje się być gładka (o jednakowej grubości), nić jest grubsza niż gołe DNA, przeciwciała wykrywają obecność histonów czy to są artefakty? Transcription kb CIN2 +3.5kb +3.0kb a +2.5kb transkrypcja eksponuje dwie, normalnie ukryte, reszty cysteinowe H3 na działanie czynników modyfikujących i chromatografię powinowactwa Hg mononukleosomy wydają się być niesfałdowane w postaci dwu tetramerów histonów + nieduże białka niehistonowe Prior & Allfrey 1983 Cell 34, 1a0a33a HSP kb w transkrybowanej chromatynie po trawieniu DNazą I pojawiają się powtórzenia połówek nukleosomów Lee & Garrard 1991 EMBO J. 10, 607 powolna transkrypcja przez pol II RNA powoduje wyparcie z nukleosomu jednego dimeru H2AH2B Studitsky i in Trends Bioch Sci 29:

4 strip? synteza histonów obrót histonów problem: które histony są dostępne do tworzenia nukleosomów? mitoza zależne od replikacji faza G 2 faza G konstytutywne zastępcze histony faza S M faza G 1 faza S faza G 2 M u wszystkich eukariota H3.3, u roślin wysoce zacetylowany H3.2 aktywna transkrypcja przez pol II RNA powoduje rozpad nukleosomów Kulaeva i in Mutat Res 618:

5 dynamiczna struktura chromatyny w obrębie wysp CpG struktura chromatyny jest zależna od stanu metylacji DNA modyfikacje histonów tworzą kod histonowy remodelowanie chromatyny * z udziałem dużych kompleksów remodelujących zależnych od ATP * niekiedy za pośrednictwem interferencji RNA (RNAi) NOBEL 2006 przykłady zależnej od RNA heterochromatynizacji: inaktywacja chromosomu X (Xi), wyciszenie centromerów i loci typu koniugacyjnego u drożdży rozszczepkowych Schizosaccharomyces pombe

6 modyfikacje histonów acetylacja lizyn metylacja lizyn (mono, di, tri) oraz arginin (mono, di) fosforylacja seryn i treonin ubikwitynacja Ckońcowych lizyn ADPrybozylacja koniugacja SUMO do lizyn Allfrey i in. PNAS 51, Bradbury, BioEssays 14, 916 K lizyna S seryna

7 acetylacja konserwowanych lizyn (N końce H3 i H4 oraz wzorce ich acetylacji są konserwowane) H4 Nterminus H3 Nterminus Ac Ac Ac Ac or Me AcSGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLRD Me ARTKQTARKSTGGKAPRKQLATKAARKSAP Ac Ac Ac Ac Ac Ac or Me AcetylCoA lizyna HAT (Histone AcetylTransferase) CoA enacetylolizyna brak wiązania DNA O O N C C g C C a b C d e C N+ odwracalne reakcje N C C C e N C C C C O O O P O O P HDAC (Histone Deacetylase) C wiązanie DNA P

8 rozmaitość kompleksów HAT

9 modyfikacje lizyny

10 LSD1 demetyluje histony a Mechanizm reakcji usuwania grup monmetylowych przez LSD1. Uważa się, że LSD1 katalizuje demetylację mono i dimetylowanych reszt lizynowych w reakcji oksydacji amin z FAD jako kemofactor. Loss of the methyl group from monomethyl lysine occurs through an imine intermediate, which is hydrolysed to form formaldehyde by a nonenzymatic process. b A polypeptide backbone cartoon structure of LSD1 bound to CoREST and the cofactor FAD. The twolobed amine oxidase (AO) domain is shown in orange and yellow. The Tower domain is in green and the SWIRM domain in blue. The CoREST linker region (pink) associates with the LSD1 Tower domain and the SANT domain (red) situated at the top of the Tower domain. c Depiction of the potential association of LSD1 CoREST with nucleosomal DNA. The bottom half shows a nucleosome with the core histone octamer in the centre and the associated DNA double helix in blue. The LSD1 CoREST complex modelled onto a nucleosome indicates that the SANT domain of CoREST (red) could interact with nucleosomal DNA, whereas LSD1 targets the histone H3 tail where it protrudes from the DNA gyres (shown by the arrow). d LSD1 w kompleksie CoREST bierze udział w represji genów neuronalnych w komórkach nieneuronalnych. LSD1 uczestniczy w represji poprzez usuwanie metylacji H3K4. e LSD1 w kompleksie receptora adrogenu (AR) staje się aktywatorem poprzez zmianę specyficzności do substratu, tak żę katalizuje usuwanie metylacji H3K9. Klose & Zhang 2007 Nature Revi Mol Cell Biol 8,

11 Peterson, Laniel 2004 Curr. Biol. 14:R54651

12 kod histonowy daje możliwość acetylacji H4 w 4 pozycjach, fosforylacji H3 w 2 pozycjach >4 000 kombinacji modyfikacji pojedynczego nukleosomu kod histonowy H4AcK8 H3AcK14 H3PhS10 H3MeK9 (trimetylacja) brak acetylacji H3 lub H4 H4AcK4 H4AcK12 H2APhS1 H2APhT119 H3PhT3 H3PhS10 H3PhS28 = transkrypcja = represja transkrypcji = tworzenie nowych nukleosomów w fazie S = skondensowana mitotyczna chromatyna Peterson, Laniel 2004 Curr Biol 14, R546

13 ogólne cechy chromatyny nieaktywnej aktywnej * deacetylacja histonów * H4AcK5, H3AcK9/14 * H4MeK12 * H3MeK9 * 5mCpG * brak metylacji DNA * obecność HP1 (izoformy α,β,γ) * msca nadwrażliwe na DNazę I

14 acetylacja histonów na promotorach aktywacja transkrypcji ACGGTC ADA2 ADA3 GCN5 HAT TH TH + hormon TACCCG p300 CPB HAT P/CAF HAT HAT TR/RXR receptor hormonu tarczycy przykład czynnika transkrypcyjnego koaktywator brak hormonu korepresor HDAC represja transkrypcji TACCCG NCoR Sin3 RPD3 HAT TAF 250 II pol.ii HAT TAF 250 II TBP TATA TBP TATA Wolffe 1997 Nature 387: 16 zmienione

15 aktywacja genów fazy S G2 mitoza S G1 kontrola przejścia G1S punkt R (ang. Restriction) CPB niska aktywność HAT Rcyklina E/ /kinaza cdk2 koaktywator P Rb słaba aktywność HAT + P korepresor korepresor Rb HDAC1 (ang. Histone Deacetylase) HAT TAF 250Rb TBP II TATA geny fazy S WYŁĄCZONE TAF 250 II TBP HAT TATA CPB P HAT pol.ii aktywny HAT (ang. Histone Acetyl Transferase) geny fazy S WŁĄCZONE AitSiAli et al. Nature 396, 184 (1998) zmienione

16 deacetylacja chromatyny wyciszenie transkrypcyjne np. inaktywacja chromosomu X me 5 5..pCpGp..3 represor transkrypcji MeCP2 korepresor HDAC Sin3 RPD3 5 me 3..pGpCp..5 º º metylacja C w CpG występuje w wyciszonych genach i inaktywowanych chromosomach X metylacja CpG jest utrzymywana po replikacji dzięki metylazie DNA specyficznej dla hemimetylowanego DNA 5mC wiąże represor transkrypcyjny MeCP2 (MethylCbinding Protein2) MeCP2 wiąże korepresor Sin3 z deacetylazą histonów RPD3 + + hypoacetylowane wyciszone włókno chromatyny Nan et al. Mol.Cell.Biol. 16, 414 (1996); Cell 88, 1 (1997); Jones et al. Nat.Genet. 19, 187 (1998)

17 acetylacja domen chromatynowych przykład: domena kurzych genów bglobinowych domain boundary DNA remaining DNase I kb b r b H b A b e domain boundary kompleksy nukleosomów z antyack DNA loop domain geny bglobiny msce nadwrażliwe na DNazę I ogólna wrażliwość na DNazę I kontrola: nieaktywny gen kurzej owalbuminy DNase I (u/ml) wysoki poziom acetylacji chromatyny w całych domenach (pętlach DNA) indukuje ogólną wrażliwość chromatyny na DNazę I wewnątrz tych domen w obrębie funkcjonalnych genów lub miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w strukturze chromatyny występują małe miejsca nadwrażliwe na DNazę I Hebbes, Clayton, Thorne, CraneRobinson 1994 EMBO J. 13, 1823

18 owady Dnmt2 nie ma Nkońcowej domeny odpowiedzialnej za interakcje z in. białkami metylacja DNA i histonów nie są ze sobą powiązane HMT metylotransferaza histonów MBP białka wiążące zmetylowane DNA Neurospora, Arabidopsis, człowiek metylacja DNA i histonów współdziałają w wyciszaniu genów różnice gatunkowe interakcji metylacji DNA i histonów

19 kooperatywna i samowzmacniająca się organizacja maszynerii modyfikujących chromatynę i DNA odpowiedzialnych za wyciszanie genów w komórkach normalnych i nowotworowych DNMT oddziałują z: deacetylazami histonów (HDACs) metylazami histonów (HMTases) zależnymi od ATP kompleksami remodelujacymi chromatynę białkami strukturalnymi chromatyny (z rodziny HP1) pośrednio z MBD (białkami wiążącymi zmetylowane DNA) kolejność deacetylacji histonów, metylacji histonów, metylacji DNA jest różna

20 komórki normalne metylacja DNA dotyczy regionów repetytywnych, a większość wysp CpG w promotorach jest niezmetylowana komórki nowotworowe powtarzalne DNA traci metylację, a wyspy CpG promotorów zyskują metylację, co powoduje wyciszenie bliskiego genu wiązanie DNMT do odpowiednich regionów prawdopodobnie zachodzi dzięki interakcjom białko białko

21 nukleosom metylowane CpG DNA modyfikacje histonów i metylacja DNA integrują funkcje jądrowe istnieje zależność struktury nukleosomowej, lokalizacji chromosomowej i aktywności transkrypcyjnej Esteller, Almouzni 2005 EMBO Rep 6: 6248

22 ATP zależne kompleksy remodelujące chromatynę 3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s. Peterson 2002 EMBO Rep 3:

23 ATP zależne kompleksy remodelujące chromatynę 3 klasy kompleksów konserwowane pomiędzy S.c., D.m., H.s. Peterson 2002 EMBO Rep 3:

24 biochemiczna aktywność ATPzależnych kompleksów remodelujących chromatynę

25 etapy działania kompleksów prowadzące do przesunięcia, transferu, rozpadu nukleosomu interakcje z czynnikami transkrypcyjnymi decydują o kierowaniu kompleksów do miejsc docelowych Vignali i in Mol Cell Biol 20:

26 regulacja cyklu komórkowego przez kompleks SWI/SNF

27 oddziaływania między: kompleksami HAT, kompleksami remodelującymi i czynnikami transkrypcyjnymi umożliwiają utworzenie PIC (ang. preinitiating complex)

28 enzymy remodelujące chromatynę ułatwiają różne etapy aktywacji genów A.promotor drożdżowego genu HO przed powstaniem PIC aktywator Swi5p rekrutuje SWI/SNF i HAT (Gcn5p), co zwabia aktywator SBF B. promotor ludzkiego IFNβ związane wyżej aktywatory rekrutują HATy podczas tworzenia PIC, acetylacja histonów ułatwia przyłączenie SWI/SNF, który niszczy strukturę nukleosomu związanego z promotorem C. promotor ludzkiego α 1 ATkompleksy HAT (CBP, P/CAF) i SWI/SNF przyłączają się do promotora po utworzeniu PIC stymulując ekspresję

29 zmiany struktury chromatyny, rekrutacji czynników transkrypcyjnych i kofaktorów w rejonie regulatorowym locus lizozymu w linii erytroblastów HD37 (Lys ), multipotencjalnych komórkach prekursorowych HD50 MEP (Lys ), niestymulowanych (Lys + ) i stymulowanych LPS komórkach prekursorowych makrofagów HD11 (Lys ++ ) białe owale czynniki transkrypcyjne związane z rdzeniami enhancerów, promotorem i 2.4kb silencerem; TR receptor hormonu tarczycy, związany do 2.4kb silencera obok msca CTCF CH 3 i Ac msca metylacji DNA i acetylacji histonów szare kółka nukleosomy owale z linia kreskowaną kompleksy czynników transkrypcyjnych obecne w niektórych komórkach lub stabilizowane po stymulacji LPS strzałki czarne i szare odpowiednio silne i słabe msca nadwrażliwe na DNazę I Lys Lys Lys + Lefevre i in Mol. Cell. Biol. 23: Lys ++

30 inne procesy zachodzące przy udziale enzymów modyfikacji histonów i/lub remodelujących chromatynę kompleks remodelujący NoRC wycisza geny rrna Mayer i in Intergenic transcripts regulate the epigenetic state of rrna genes Mol Cell 22: Wood i in Combinatorial chromatin modifications and memory storage: A code for memory? Learn Mem 13: naprawa DNA NER, NHEJ, rekombinacja homologiczna, naprawa genów transkrypcyjnie aktywnych Shim i in Mol Cell Biol 25: Kruhlak i in Cell Biol 172: Chai i in Genes Dev 19:

31 acetylacji podlegają nie tylko białka histonowe