Modyfikacje histonów rdzeniowych

Transkrypt

1 Modyfikacje histonów rdzeniowych

2 Fosforylacja (seryna, treonina) Acetylacja (lizyna) Modyfikacje histonów rdzeniowych Metylacja (lizyna, arginina) ADP-rybozylacja Ubikwitynylacja (lizyna) Sumoilacja (lizyna) Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:

3 Modyfikacja Acetylacja Metylacja Fosforylacja Modyfikowane reszty aminokwasowe K-ac K-me1, K-me2, K-me3 R-me1, R-me2s, R-me2a S-ph, T-ph, Y-ph Funkcja biologiczna Aktywacja transkrypcji, replikacja DNA, naprawa DNA, składanie chromatyny Aktywacja, elongacja i represja transkrypcji Aktywacja i represja transkrypcji, naprawa DNA, mitoza, apoptoza Ubikwitynacja K-ub Aktywacja transkrypcji, mejoza Sumoilacja K-su Represja transkrypcji ADP-rybozylacja E-ar Aktywacja transkrypcji (?) Biotynylacja K-bio Regulacja ekspresji genów, odpowiedź na uszkodzenia DNA Krotonylacja K-cr Aktywacja transkrypcji (?) Deiminacja R Cit Regulacja transkrypcji Izomeryzacja prolin P(trans) P(cis) Regulacja transkrypcji

4 Ubikwitynylacja Sumoilacja C. David Allis, «Epigenetics» Cold Spring Harbor Laboratory Press Modyfikacja wszystkich 4 histonów rdzeniowych, związana przede wszystkim z represją transkrypcji

5 Histone tail clipping

6 METYLACJA HISTONÓW

7 Metylacji w histonach rdzeniowych podlegają lizyny i argininy Cell, Vol 109, , June 2002 Review Histone Methylation: Dynamic or Static? Andrew J. Bannister, Robert Schneider, and Tony Kouzarides

8 Metylotransferazy lizynowe Shilatifard 2008

9 Figure 2 Strukturalna charakterystyka białek zawierających SET domenę SUV39 FAMILY SET2 FAMILY SUV39H1 histone H3 lysine 9 methyltransferases (412) RIZ (1388) SUV39H2 (350) RIZ (1365) G9A (1001) RIZ (2596) GLP (917) ESET (1307) RIZ (2969) CLLL8 (719) RIZ (2061) SET1 FAMILY RIZ FAMILY hset1a RIZ (1719) hset1b MLL (3969) BLIMP (789) PRESET SET POSTSET CHROMO ANKYRIN TUDOR MLL2 (2715) PFM1 (801) RRM PHD MBD PWWP ALR (5262) BROMO FYRN AWS BAH EZH2 (746) FYRC HMG WW AT HOOK EZH1 (747) RING SANT C2H2 Current Opinion in Genetics & Development

10 Roślinne białka z domeną SET Ng et al. 2007

11 Lizynowe demetylazy histonowe LSD1 (lysine-specific demethylase 1) demetyluje mono- i di- metylowane lizyny (H3K4me2/me1) (H3K9me2/me1) Rodzina Jumonji zawierająca domenę JmjC (H3K9me3, H3K36me3)

12 Drzewo filogenetyczne rodziny demetylaz JmjC

13 H3K4

14 Skład podjednostkowy kompleksów metylotransferaz H3K4 MLL- mixed lineage leukaemia gene Current Opinion in Cell Biology 2008, 20:

15 Mechanizmy rekrutacji metylotransferazy H3K4 Molecular Cell 25, January 12, 2007

16 Molecular Cell 25, January 12, 2007

17 Molecular Cell 25, January 12, 2007

18 3 (+1) główne polimerazy RNA Eukaryota polimeraza Polimeraza I Polimeraza II Polimeraza III produkty geny rrna (18S; 28S; 5,8S) hn/mrna, większość snrna (U1, U2, U4, U5), mirna małe RNA: trna, snorna, 5S rrna, U6 snrna Polimeraza mitochondrialna

19 Kluczowe znaczenie domeny karboksylowej (C-końcowej) RNA Pol II CTD to domena C-końcowa największej podjednostki RNA polimerazy II. U człowieka liczy ponad 350 aminokwasów złożonych z wielokrotnych powtórzeń 7- aminokwasowego motywu o sekwencji konsensusowej: tyr-ser-pro-thr-ser-pro-ser. CTD ma kluczowe znacznie dla mechanizmów, które łączą zdarzenia potranskrypcyjne z transkrypcją. Na przykład, praktycznie wszystkie kompleksy zaangażowane w obróbkę RNA (RNA processing) zawierają składniki, które wiążą się do CTD.

20 Domena CTD polimerazy II RNA koordynuje wydarzenia transkrypcyjne Domena CTD zawiera powtarzającą się sekwencję aminokwasową (YSPTSPS) Hyperfosforylacja domeny CTD determinuje nowy zestaw regulatorów przyłączających się do pol II i zaznacza przejście od inicjacji do elongacji transkrypcji. Zatrzymanie w pobliżu promotora i uwolnienie promotora; przejście do fazy produktywnej transkrypcji jest zależne od fosforylacji CTD Saunders et al. Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, (August 2006) doi: /nrm1981

21 Metylacja H3K4 i H3K36 w procesie transkrypcji Cell Research (2011) 21:

22 Zależności pomiędzy modyfikacjami histonowymi Cell Research (2011) 21:

23

24 H3K9

25 H3K9-SUV39H1 pierwsza zidentyfikowana metylotransferaza histonowa Regulation of chromatin structure by site-specific histone methyltransferases Rea S, Eisenhaber F, O'Carroll D, Strahl BD, Sun ZW, Schmid M, Opravil S, Mechtler K, Ponting CP, Allis CD, Jenuwein T. Nature Aug 10;406(6796):593-9.

26 Konstytutywna heterochoromatyna zawiera histon H3 metylowany w lizynie 9 Mysia metylotransferaza Suv39h metyluje Lizynę 9 Histonu H3 w obszarach pericentromerowych Myszy pozbawione Suv39h wykazują obniżoną żywotność,ich genom jest niestabilny co prowadzi do zwiększonego ryzyka powstawania nowotworów U myszy pozbawionych Suv39h następują zaburzenia oddziaływań międzychromosomowych Cell, Vol 107, , November 2001 Loss of the Suv39h Histone Methyltransferases Impairs Mammalian Heterochromatin and Genome Stability Antoine H.F.M. Peters 51, Dónal O'Carroll 5 61, Harry Scherthan 62, Karl Mechtler1, Stephan Sauer1, Christian Schöfer3, Klara Weipoltshammer3, Michaela Pagani1, Monika Lachner1, Alexander Kohlmaier1, Susanne Opravil1, Michael Doyle 61, Maria Sibilia 61, and Thomas Jenuwein1

27 Białko HP1 (heterochromatin protein)

28 HP1 HP1 HP1 HP1 H3K9me obszary heterochromatyny wyciszone obszary euchromatyny H3K9me chromatyna obszarów aktywnych transkrypcyjnie

29 Drosophila

30 Histon H3 metylowany w lizynie 9 zlokalizowany jest na nieaktywnym chromosomie X

31 Metylacja lizyny 9 histonu H3 bierze udział w represji transkrypcji Białko Rb rekrutuje enzym deacetylazy histonowej HDAC i w ten sposób reprymuje ekspresję genu Represja genu cykliny E przez białko Rb (Retinoblastoma) jest zależna od oddziaływań białka RB z białkami HP1 oraz Suv39H1. Białko Rb kieruje metylacją histonu H3 i jest niezbędne dla wiązania się HP1 z promotorem cykliny E Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters SOREN J. NIELSEN*, ROBERT SCHNEIDER*, UTA-MARIA BAUER*, ANDREW J. BANNISTER*, ASHBY MORRISON, DONAL O'CARROLL, RON FIRESTEIN, MICHAEL CLEARY, THOMAS JENUWEIN, RAFAEL E. HERRERA & TONY KOUZARIDES* Nature 412, (2001);

32 Figure 4 (a) SUV39 methylase Deacetylase HP1 (b) E2F RB CH3 K9 H3 Methylase OFF X? Przykłady represji transkrypcji możliwe zaangażowanie metylacji lizyny 9 histonu H3 w proces represji KRAB Deacetylase KAP1 H3 HP1 CH3 K9 OFF X KAP1 korepresor transkrypcji kolokalizuje z białkiem HP1 w wielu miejscach jądra interfazowego (c) Methylase Deacetylase IKAROS H3 HP1 CH3 K9? OFF X IKAROS represor transkrypcji, rekrutuje deacetylazy histonowe, kolokalizuje z białkiem HP1 Current Opinion in Genetics & Development

33 Metylotransferazy lizynowe Current Opinion in Cell Biology 2008, 20: Aktywacja transkrypcji H3K4 H3K36 H3K79 Represja transkrypcji H3K9 H3K27 H4K20 H3K9

34 Uzyskanie przeciwciał specyficznych w stosunku do metylowanej cytozyny w DNA, a także poznanych potranslacyjnych modyfikacji histonów rdzeniowych zrewolucjonizowało naszą wiedzę o chromatynie Podstawowe narzędzie badawcze

35 Immunoprecypitacja chromatyny - CHIP

36 ChIP chip ChIP Seq Immunoprecypitacja Immunoprecypitacja Oczyszczanie DNA Oczyszczanie DNA Amplifikacja Dołączenie sekwencji adaptorowych Hybrydyzacja do mikromacierzy Tworzenie zbiorów Sekwencjonowanie Mapowanie rejonów w genomie Mapowanie rejonów w genomie nature reviews genetics volume 9 march 2008 ChIP chromatin immunoprecipitation

37 Bing Li i wsp., Cell 128 (2007) Rola modyfikacji potranslacyjnych histonów w regulacji procesu transkrypcji

38 Modyfikacje histonowe wyznaczają funkcjonalne elementy w genomie ssaków

39 Domeny białkowe specyficznie wiążące modyfikowane histony Cell Research (2011) 21:

40 Identyfikacja nowych białek rozpoznających określone modyfikacje potranslacyjne białek histonowych Chromatografia powinowactwa do peptydu (peptide pull-down assay) Joanna Wysocka, Methods 40 (2006)

41 Badanie roli metylacji lizyn histonu H3 Identyfikacja białek oddziałujących z metylowanymi lizynami histonu H3 Aktywacja transkrypcji H3K4me3 Elongacja transkrypcji H3K36me3 Wyciszenie transkrypcji H3K9me3 H3K27me3 H4K20m3 SILAC ang. stable isotope labeling by amino acids in cell culture Cell 142, , September 17, 2010

42 Etapy analizy Interaktomu metylowanych lizyn histonu H3 Porównawcza Spektrometria Mas Cell 142, , September 17, 2010

43 Cell 142, , September 17, 2010 Interaktom metylowanych lizyn histonów H3 i H4

44 Cell 142, September 17, 2010 Białka odczytujące wzór modyfikacji histonowych decydują o efekcie biologicznym danej modyfikacji

45 Poszukiwanie partnerów białkowych dla modyfikowanych potranslacyjnie histonów rdzeniowych Identyfikacja białek wiążących metylowany histon H3 u Arabidopsis thaliana

46 Utworzenie listy białek jądrowych specyficznie wiążących modyfikowany potranslacyjnie histon H3 u Arabidopsis thaliana Identyfikacja białek wiążących di-metylowany (K4 lub K9) histon rdzeniowy H3 u roślin za pomocą techniki chromatografii powinowactwa do peptydu (peptide pull-down assay).. Antoni Palusiński, Daniel Buszewicz, Maciej Kotliński

47 Wykorzystywane peptydy H3 H3 K4 me2 biotyn a biotyn a H3 K9 me2 biotyn a

48 Fot. Maciej Kotliński Materiał badawczy Fot. Maciej Kotliński Komórki Arabidopsis thaliana T87 ekotyp Columbia-0 (~8-dniowe).

49 Poszukiwanie unikatowych partnerów modyfikowanych peptydów po rozdziale związanych białek w żelu ic K4 H3 m 1 2 H3 K4 me2 H3 mock 1 2 AL4 (At2g26210) i AL6 (At2g02470) oraz ~ AL1 lub AL7 AL2 (At3g11200) i AL7 (At1g14510) oraz ~AL1 lub AL6 Rodzina białek Alfin1-like Zawierają domenę palca cynkowego typu PHD (zinc-finger plant homeodomain)

50 Wielkoskalowa analiza białek wytrąconych z eluatu, które wiążą modyfikowane peptydy Pominięto rozdział eluatów w żelu. Po elucji, białka wytrącano na granicy faz metanol/chloroform. Wytrącone białka trawiono trypsyną i poddawano analizie za pomocą metod spektrometrii mas. Interakcję białek z peptydem stwierdzano na podstawie porównania parametru Mascot score zidentyfikowanych białek z poszczególnych eluatów Metodę zastosowano do identyfikacji partnerów histonu H3 dimetylowanego na lizynie 9 (H3K9me2).

51 Klasa białek H3 H3K9me2 H3 i H3K9me2 Histony Białka budujące kompleksy polimeraz RNA zależnych od DNA Deacetylazy histonowe z rodziny HD ATP-azy remodelujące chromatynę Białka z rodziny Podjednostki Mediatora Specyficzne czynniki transkrypcyjne Białka z domeną WD Metylotransferaza DNA (CMT3) Czynniki splicingowe Białka uczestniczące w składaniu chromatyny Topoizomerazy DNA Białka chromatynowe związane z kompleksem Polycomb Białka wiążące DNA Represory transkrypcji Czynniki translacyjne Białka budujące rybosomy Małe jąderkowe nukleoproteiny Białka wiążące RNA Białka budujące cytoszkielet Kinazy białkowe Białka z domeną F-box Inne Nieznane SUMA