Jolanta Szymańska BADANIE BIOTRANSFORMACJI IZOTOPOWYMI

Transkrypt

1 Uniwersytet Warszawski Wydział Chemii Jolanta Szymańska BADANIE BITRANSFRMACJI L-ALANINY I JEJ PCDNYC METDAMI IZTPWYMI Praca doktorska wykonana w Pracowni Chemii Biomolekuł Promotor: Prof. dr hab. Marianna Kańska Warszawa 2014

2 Praca doktorska została wykonana w ramach Interdyscyplinarnych Studiów Doktoranckich w zakresie chrony Środowiska i Zarządzania środowiskiem. Stypendium doktoranckie było finansowane z projektu PKL /10 Chemia, fizyka i biologia na potrzeby społeczeństwa XXI wieku: nowe makrokierunki studiów I, II i III stopnia w Priorytecie IV PKL. Projekt nr: PKL /10 Chemia, fizyka i biologia na potrzeby społeczeństwa XXI wieku: nowe makrokierunki studiów I, II i III stopnia w Priorytecie IV PKL

3 Składam wyrazy wdzięczności mojemu promotorowi Pani prof. dr hab. Mariannie Kańskiej za zaproponowanie interesującej tematyki badań, opiekę nad moją pracą, wsparcie i cenne wskazówki oraz ciepłą, serdeczną atmosferę jaka panowała w trakcie jej wykonywania.

4 Składam serdeczne podziękowania Panu dr Ryszardowi Kańskiemu za pomoc i cenne rady podczas wykonywania badań.

5 Serdecznie dziękuję moim koleżankom z Pracowni Chemii Biomolekuł: dr Małgorzacie Pająk dr Katarzynie Pałce dr Elżbiecie Winnickiej za pomoc podczas wykonywania badań, dyskusje naukowe oraz za przyjazną atmosferę jaka panowała w laboratorium.

6 Składam serdeczne podziękowania moim najbliższym za wiarę we mnie i wsparcie w chwilach zwątpienia.

7 SPIS TREŚCI WYKAZ SKRÓTÓW STSWANYC W PRACY WPRWADZENIE CELE BADAŃ PRZEGLĄD LITERATURY Klasyfikacja enzymów ksydoreduktazy Dehydrogenazy Kofaktory dehydrogenaz Stereospecyficzność dehydrogenaz Dehydrogenazy aminokwasowe Dehydrogenaza L-alaninowa gólna charakterystyka enzymu AlaD Budowa enzymu AlaD Mechanizm reakcji katalizowanej przez AlaD Dehydrogenaza L-mleczanowa gólna charakterystyka enzymu LD Budowa enzymu LD Mechanizm reakcji katalizowanej przez LD Dehydrogenaza mrówczanowa gólna charakterystyka enzymu FD Budowa enzymu FD Mechanizm reakcji katalizowanej przez FD Liazy Kofaktory liaz Tryptofanaza gólna charakterystyka enzymu tryptofanazy, Tpase Budowa enzymu Tpase Mechanizm reakcji katalizowanej przez Tpase Metody syntezy izotopomerów koenzymu NAD(P) Metody syntezy alaniny i jej izotopomerów Syntezy halogenopochodnych alaniny Metody syntezy fluoropochodnych alaniny Znaczenie halogenopochodnych aminokwasów Metody syntezy tryptofanu i jego pochodnych Efekty izotopowe jako metoda badania mechanizmów reakcji enzymatycznych Efekty izotopowe w reakcjach enzymatycznych... 55

8 Enzymy efektywne katalizatory reakcji chemicznych Kinetyka reakcji enzymatycznych Efekty izotopowe Podział efektów izotopowych Kinetyczny efekt izotopowy Rozpuszczalnikowy efekt izotopowy Metody pomiarowe kinetycznych efektów izotopowych BADANIA WŁASNE Syntezy enzymatyczne Synteza izotopomeru [(4R)- 2 ]-NAD Badania wstępne i śledzenie postępu reakcji pracowanie warunków enzymatycznej syntezy izotopomeru [(4R)- 2 ]-NAD Synteza izotopomeru [(4R)- 2 ]-NAD z użyciem enzymu FD Synteza L-alaniny i jej pochodnej znakowanej deuterem Enzymatyczna synteza L-Ala Enzymatyczna synteza izotopomeru [2-2 ]-L-Ala Syntezy halogenopochodnych alaniny Enzymatyczna synteza 3-F-L-Ala Enzymatyczna synteza izotopomeru 3-F-[2-2 ]-L-Ala Próba otrzymania 3-Br-L-Ala Syntezy L-tryptofanu i jego pochodnej znakowanej deuterem Enzymatyczna synteza L-Trp Synteza [2-2 ]-L-Trp Próba syntezy 3,3-di-F-L-Trp Wyznaczanie efektów izotopowych deuteru Metodyka badań i optymalizacja warunków pomiarów kinetycznych ksydacyjna deaminacja L-alaniny katalizowana przez AlaD Redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego katalizowane przez AlaD ksydacyjna deaminacja 3-fluoro-L-alaniny katalizowana przez AlaD Redukcyjne aminowanie kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowane przez AlaD Redukcja kwasu 3-fluoropirogronowego katalizowana przez LD PDSUMWANIE I WNISKI CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA Wykaz stosowanych odczynników i aparatury Syntezy enzymatyczne Enzymatyczna synteza koenzymu [(4R)- 2 ]-NAD z użyciem FD Enzymatyczna synteza L-alaniny i jej pochodnych Synteza L-alaniny Synteza [2-2 ]-L-alaniny Synteza 3-fluoro-L-alaniny Synteza 3-fluoro-[2-2 ]-L-alaniny Synteza L-tryptofanu i jego pochodnych Synteza L-tryptofanu Synteza [2-2 ]-L-tryptofanu

9 6.3. Wyznaczanie efektów izotopowych Badanie kinetyki reakcji katalizowanych przez AlaD Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji L-alaniny, L-Ala, w buforze protonowanym Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji L-alaniny, L-Ala, w buforze deuterowanym Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze protonowanym o stężeniu 0,75 M Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze deuterowanym o stężeniu 0,75 M Badanie kinetyki reakcji redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze protonowanym o stężeniu 0,025 M Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego, PA, w buforze deuterowanym o stężeniu 0,025 M Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-L-alaniny, 3-F-L-Ala, w buforze protonowanym Badanie kinetyki oksydacyjnej deaminacji 3-fluoro-L-alaniny, 3-F-L-Ala, w buforze deuterowanym Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F- PA, w buforze protonowanym Badanie kinetyki redukcyjnego aminowania kwasu 3-fluoropirogronowego, 3- F-PA, w buforze deuterowanym Badanie kinetyki reakcji katalizowanej przez LD Badanie kinetyki redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, w buforze protonowanym Badanie kinetyki redukcji 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, w buforze deuterowanym BIBLIGRAFIA DRBEK NAUKWY

10 WYKAZ SKRÓTÓW STSWANYC W PRACY Ǻ Angstrem, m A 2 pm kwas mezo-diaminopimelinowy AA D-alanylo-D-alanina ACS system transportu Ala-Cys- Ser AD dehydrogenaza alkoholowa AlaD dehydrogenaza L-alaninowa AlaR racemaza alaninowa AldD dehydrogenaza aldehydowa AMP adenozyno-5 -monofosforan ATP adenozyno-5 -trifosforan BCG Bacillus Calmette-Guérin boc grupa tert-butoksykarbonylowa D deuter Da Dalton D-AA oksydaza D-aminokwasowa D-Ala D-alanina DMS dimetylosulfotlenek E a energia aktywacji EC Enzyme Commission komisja enzymatyczna FDG 2-[ 18 F]fluoro-2-deoksy-D-glukoza FD dehydrogenaza mrówczanowa FMN mononukleotyd flawinowy GABA kwas γ-aminomasłowy GPT transferaza glutaminowopirogronianowa h stała Planca PLC wysokosprawna chromatografia cieczowa k stała szybkości reakcji z udziałem lżejszego izotopu k* stała szybkości reakcji z udziałem cięższego izotopu K d stała dysocjacji KIE kinetyczny efekt izotopowy K M stała Michaelisa-Menten LA kwas L-mlekowy L-Ala L-alanina LD dehydrogenaza L- mleczanowa L-Trp L-tryptofan M jednostka stężenia [mol/dm 3 ] m/z stosunek masy do ładunku MBA metylobenzyloamina Mz jednostka częstotliwości, mega (10 6 ) herc MS spektroskopia mas NAD(P) + utleniony dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy lub jego fosforan NAD(P) zredukowany dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy lub jego fosforan NAG N-acetyloglukozoamina NaMDS heksametylodisilazydek sodu NAM kwas N-acetylomuraminowy NMR magnetyczny rezonans jądrowy p stopień podstawienia izotopowego PA kwas pirogronowy PCR reakcja łańcuchowa polimerazy pd ujemny logarytm ze stężenia deuteronów PET pozytonowa tomografia emisyjna Ph grupa fenylowa p ujemny logarytm ze stężenia protonów PLP, 5 -fosforan pirydoksalu, PMP, PNP pirydoksaminy, pirydoksyny ppm parts per milion, 10-6 R f współczynnik retencji SIE rozpuszczalnikowy efekt izotopowy TA transaminaza TLC chromatografia cienkowarstwowa TMS tetrametylosilan TF ES(-) analizator czasu przelotu, elektrorozpylanie przy jonizacji ujemnej Tpase tryptofanaza TRIS tri-(hydroksymetylo)- metyloamina TTN, k cat stała katalityczna U unit, jednostka aktywności enzymatycznej UV-VIS promieniowanie ultrafioletowe i widzialne V max szybkość maksymalna α efekt izotopowy dla 100% stopnia podstawienia α p zmierzona wartość efektu izotopowego β + promieniowanie pozytonowe δ przesunięcie chemiczne λ długość fali ν częstotliwość fali υ szybkość reakcji 1

11 1. WPRWADZENIE 1. WPRWADZENIE Uczony jest w swojej pracowni nie tylko technikiem, lecz również dzieckiem wpatrzonym w zjawiska przyrody, wzruszające jak czarodziejska baśń Maria Skłodowska-Curie rganizmy żywe są zdolne do przeprowadzania wielu skomplikowanych procesów metabolicznych w temperaturze fizjologicznej, za co odpowiedzialne są enzymy wydajne biokatalizatory, przyspieszające reakcje chemiczne w znacznie wyższym stopniu niż jakiekolwiek poznane dotąd katalizatory chemiczne. Reakcje biotransformacji to przemiany chemiczne zachodzące w obecności enzymów w postaci wolnej lub związanej z użyciem całych komórek. Nazwa enzym została po raz pierwszy użyta w 1898 roku przez niemieckiego badacza Wilhelma Kühne, jednak istnienie enzymów było znane już w XVIII wieku, kiedy to włoski uczony Spallanzani zaobserwował i opisał trawienie mięsa pod wpływem soku żołądkowego sępa. 50 lat później udało się wyizolować ze słodu enzym, znany dzisiaj jako amylaza, natomiast w roku 1834 Theodor Schwann wyodrębnił pierwszy biokatalizator pochodzenia zwierzęcego pepsynę [1]. W roku 1907 Eduard Buchner otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii za swoje badania nad zdolnością ekstraktów z drożdży do fermentacji cukrów i udowodnienie, że jest ona możliwa bez obecności żywych komórek [2]. Kolejnym krokiem milowym było wyizolowanie i otrzymanie w postaci krystalicznej czysto białkowego enzymu ureazy, co pozwoliło w późniejszych latach na badanie struktur enzymów metodami rentgenografii strukturalnej [3]. Pierwszym enzymem, którego strukturę opisano i przedstawiono w postaci trójwymiarowej, był lizozym, co dało początek rozwojowi biologii strukturalnej [4]. Dotychczas poznano ponad trzy tysiące biokatalizatorów, jednak liczba ta wzrasta w szybkim tempie. Enzymy tworzą trójwymiarowe struktury, z centrum aktywnym jako specyficznym miejscem wiązania substratu, a większość z nich składa się z białkowego apoenzymu 2

12 1. WPRWADZENIE i kofaktora (takiego jak cząsteczka organiczna, bądź jon metalu), którego obecność jest konieczna do prawidłowego przebiegu katalizy enzymatycznej. W ostatnich latach znacząco wzrosła rola i zastosowanie enzymów w syntezie organicznej oraz ich znaczenie w kontekście tzw. zielonej chemii. Enzymy charakteryzują się dużą specyficznością względem katalizowanej reakcji i preferowanych substratów. Przekształcają tylko określone rodzaje grup funkcyjnych w ściśle określonym miejscu w cząsteczce, wykazują chemoselektywność, regioselektywność i enancjoselektywność [5]. Procesy biokatalityczne umożliwiają syntezę pojedynczych enancjomerów, co ma niebagatelne znaczenie w farmakologii, gdyż izomery leków mogą się znacząco od siebie różnić pod względem właściwości farmakokinetycznych, farmakodynamicznych, skuteczności oraz działań niepożądanych dla organizmu człowieka [6]. Reakcje enzymatyczne charakteryzują się wysoką wydajnością, gdyż enzymy nie katalizują reakcji ubocznych. Ponadto zwykle działają w łagodnych warunkach temperaturowych (20-40 C) i w środowisku wodnym, a odpady powstające wskutek reakcji, w których uczestniczą, są mało szkodliwe dla środowiska. Wadą stosowania enzymów jest jednak ich wysoki koszt oraz trudności w izolacji, a także nietrwałość i wrażliwość na czynniki środowiskowe, które przy niezachowaniu optymalnych warunków mogą powodować denaturację. Ważne jest również stosowanie wysokiej czystości odczynników, gdyż nawet niewielkie zanieczyszczenia mogą powodować inhibicję enzymów. W miarę rosnącego postępu w dziedzinie enzymologii można zauważyć, iż enzymy stają się coraz bardziej uniwersalnymi biokatalizatorami i ich wykorzystanie nie ogranicza się do umiarkowanych warunków środowiskowych, charakterystycznych dla organizmów mezofilnych. Pozyskiwanie znacznie bardziej stabilnych enzymów z mikroorganizmów ekstremofilnych, rozwijających się w warunkach ekstremalnych temperatur, p czy też zasolenia, pozwala na ich szersze zastosowanie w wielu gałęziach nauki i przemysłu. Przykładem może być termostabilna polimeraza DNA, która jest używana do powielania łańcuchów DNA w warunkach laboratoryjnych, co ma kluczowe znaczenie w badaniach nad genomem, klonowaniem, diagnostyce klinicznej i kryminalistyce. Ponadto niektóre enzymy katalizują reakcje w bezwodnych rozpuszczalnikach organicznych, co umożliwia ich wykorzystanie w syntezie organicznej, gdyż wiele związków nie rozpuszcza się w wodzie. Należy jednak 3

13 1. WPRWADZENIE pamiętać, że suche, liofilizowane enzymy muszą zawierać pewną ilość wody, aby nie uległy denaturacji i zachowały konformację natywną odpowiedzialną za ich aktywność. Niewątpliwą zaletą syntez w warunkach bezwodnych jest fakt, iż enzymy w takim środowisku nie ulegają rozpuszczeniu, dzięki czemu można je łatwo usunąć po reakcji i użyć ponownie [5]. Preparaty enzymatyczne znajdują zastosowanie w wielu gałęziach przemysłu, takich jak: spożywczy, farmaceutyczny, tekstylny czy papierniczy. Często stosuje się specjalne szczepy mutantów mikroorganizmów, które charakteryzują się nadprodukcją określonych enzymów, co zwiększa efektywność procesów technologicznych. Coraz częściej spotykanym rozwiązaniem, szczególnie w biotechnologii, jest immobilizacja enzymów na nośniku stałym poprzez mikrokapsułkowanie czy zamykanie w matrycy polimerowej w formie żelu. Unieruchomienie enzymów zwiększa ich odporność na warunki środowiskowe, takie jak skrajne p i ekstremalna temperatura, a także pozwala na ich wielokrotne wykorzystanie, łatwe wydzielenie produktów reakcji oraz prowadzenie procesów ciągłych [7]. Wysoka selektywność enzymów sprawia, że możliwe są reakcje multienzymatyczne, gdzie w jednym naczyniu reakcyjnym znajduje się wiele rodzajów enzymów, stanowiących zespół biokatalizatorów katalizujących kolejne reakcje zachodzące w obrębie tej samej przemiany. dkąd Robert Koch, będący pionierem w zakresie mikrobiologii medycznej, ogłosił swą teorię dotyczącą rozwoju chorób bakteryjnych, za którą otrzymał w 1905 roku Nagrodę Nobla, trwają intensywne badania nad patogenezą chorób zakaźnych wywoływanych przez rozmaite mikroorganizmy [8]. gromnym przełomem w leczeniu chorób bakteryjnych było odkrycie w 1928 roku przez Alexandra Fleminga pierwszego antybiotyku penicyliny [9]. Fakt ten zapoczątkował lawinę odkryć nowych antybiotyków, zarówno naturalnych, jak i syntetycznych, które stały się orężem człowieka w walce z chorobami wcześniej nieuleczalnymi, powodującymi śmierć i choroby milionów ludzi. Niestety warto przy tym zauważyć, iż wiele antybiotyków pochodzenia naturalnego nie znajduje zastosowania w lecznictwie ze względu na zbyt wysoką toksyczność, w związku z czym za wskazane należy uznać intensywne badania nad opracowaniem ich syntetycznych pochodnych. Rozwój w tej dziedzinie będzie mógł się dokonywać m.in. dzięki pełniejszemu poznaniu mechanizmów procesów (tj. dotyczących metabolizmu białek, asymilacji azotu, 4

14 1. WPRWADZENIE sporulacji, germinacji, syntezy ściany komórkowej) zachodzących w komórkach bakterii. Należy bowiem podkreślić, iż tylko tego typu działania mogą umożliwić świadome projektowanie nowych leków, których efekty nie będą jak miało to miejsce wielokrotnie w przeszłości dziełem przypadku. Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu na jej metabolizm poprzez hamowanie namnażania się (działanie bakteriostatyczne). Antybiotyki funkcjonują według różnych mechanizmów, jedne wpływają negatywnie na biosyntezę kwasów nukleinowych lub białek, inne zaś zakłócają syntezę bakteryjnej ściany komórkowej (jak ma to miejsce w przypadku np. penicyliny). Mechanizm działania penicyliny jako antybiotyku polega na blokowaniu aktywności enzymów bakteryjnych poprzez ich strukturalne podobieństwo do naturalnego substratu i wskutek tego zahamowaniu syntezy peptydoglikanu [10]. Mając na uwadze, iż produktem redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego (PA) z udziałem bakteryjnej dehydrogenazy L-alaninowej (ang. L-alanine dehydrogenase, AlaD, EC ) jest L-alanina (L-Ala) - ważny składnik i prekursor peptydoglikanu, istnieje przypuszczenie, że enzym ten bierze udział w procesie biosyntezy ściany komórkowej. Ponadto AlaD uczestniczy w katabolizmie L-alaniny (rysunek 1.1.) oraz zapewnia energię niezbędną w sporulacji, czyli procesie tworzenia form przetrwalnikowych bakterii z rodzaju Bacillus. pirogronian EC EC aminotransferaza alaninowa L-alanina EC pirogronian dehydrogenaza L-alaninowa dehydrogenaza L-mleczanowa kwas L-mlekowy pirogronian EC EC dehydrogenaza D-aminokwasowa D-alanina racemaza alaninowa Rysunek 1.1. Biotransformacje L-alaniny i kwasu pirogronowego[11] 5

15 1. WPRWADZENIE Niedawne odkrycie obecności enzymu AlaD w chorobotwórczym szczepie bakterii Mycobacterium tuberculosis jest dodatkowym bodźcem do badania mechanizmu działania tego enzymu, gdyż może on stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu gruźlicy dawniej powszechnej i często śmiertelnej choroby zakaźnej, której nawrót obserwuje się nawet w krajach wysokorozwiniętych [12]. Według niektórych źródeł 3-fluoro-L-alanina (3-F-L-Ala), będąca nienaturalnym aminokwasem i produktem enzymatycznej syntezy z udziałem AlaD, ma potencjalne znaczenie antybakteryjne i przeciwwirusowe [13]. Podłożem tego działania może być fakt, iż związek ten, zamiast L-alaniny, wbudowuje się do żywych komórek mikroorganizmów, powodując nieprawidłowości w metabolizmie oraz jest inhibitorem niektórych enzymów, takich jak racemaza alaninowa (ang. alanine racemase, AlaR, EC ) uczestnicząca w biosyntezie ściany komórkowej bakterii. Pomimo wielu badań pewne szczegóły mechanizmu reakcji katalizowanej przez AlaD nie zostały do końca poznane i wyjaśnione. Gruntowne zrozumienie sposobu działania AlaD mogłoby przyczynić się do pełniejszego poznania procesów metabolicznych zachodzących u bakterii oraz opracowania nowych farmaceutyków przeciwbakteryjnych. W ramach mojej pracy doktorskiej podjęłam się próby zbadania mechanizmu biotransformacji L-alaniny katalizowanej przez dehydrogenazę L-alaninową. Do badania reakcji oksydacyjnej deaminacji L-alaniny i 3-fluoro-L-alaniny oraz redukcyjnego aminowania kwasu pirogronowego i 3-fluoropirogronowego (3-F-PA) zastosowałam metodę rozpuszczalnikowych (ang. SIE, solvent isotope effect) i kinetycznych efektów izotopowych (ang. KIE, kinetic isotope effect). Ponadto na podstawie wyznaczonego SIE dla redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego do (R)-3-fluoromlekowego (3-F-LA) katalizowanej przez dehydrogenazę L-mleczanową (ang. L-lactate dehydrogenase, LD, EC ) wyjaśniłam pewne detale dotyczące mechanizmu działania tego biokatalizatora. Wspomniane metody izotopowe nie są powszechnie stosowane, ale dostarczają wielu użytecznych informacji na temat mechanizmów skomplikowanych procesów katalizowanych przez enzymy. Metoda ta opiera się na badaniu kinetyki reakcji enzymatycznych z udziałem lżejszych i cięższych izotopów tego samego pierwiastka; 6

16 1. WPRWADZENIE w przypadku niniejszej pracy są to izotopy wodoru prot i deuter. Znakowanie związków w specyficznych pozycjach i wyznaczanie efektów izotopowych w reakcjach z ich udziałem pozwala na określenie etapu determinującego szybkość reakcji, poznanie struktury kompleksu aktywnego oraz wykrycie różnych nietypowych efektów np. tunelowania protonu. Wyznaczanie efektów izotopowych w badanych przeze mnie biotransformacjach wymaga zaplanowania i wykonania syntez izotopomerów L-alaniny, 3-fluoro-L-alaniny oraz koenzymu NAD specyficznie znakowanych deuterem, dlatego etapem wyjściowym dla prowadzonych przeze mnie badań mechanistycznych było opracowanie metod enzymatycznej syntezy znakowanych substratów. Uzyskana pochodna 3-fluoro-L-alanina posłużyła ponadto do enzymatycznej syntezy L-tryptofanu (L-Trp) w wyniku reakcji sprzęgania z indolem katalizowanej przez tryptofanazę (ang. tryptophanase, Tpase, EC ) enzym z klasy liaz katalizujący rzadką w przyrodzie reakcję tworzenia wiązania pomiędzy aromatycznym i alifatycznym atomem węgla. 7

17 2.CELE BADAŃ 2.CELE BADAŃ Celem prowadzonych przeze mnie eksperymentów było zbadanie mechanizmu odwracalnej biotransformacji L-alaniny i jej fluoropochodnej katalizowanych przez enzym dehydrogenazę L-alaninową z wykorzystaniem rozpuszczalnikowych, SIE i kinetycznych efektów izotopowych, KIE. Ponadto wyznaczenie SIE dla reakcji redukcji kwasu 3-fluoropirogronowego, 3-F-PA, do kwasu (R)-3-fluoromlekowego, 3-F-LA, pozwoliło na otrzymanie pewnych informacji na temat detali mechanizmu działania dehydrogenazy L-mleczanowej. Stosowane przeze mnie metody izotopowe wymagały zsyntetyzowania odpowiednich, selektywnie znakowanych deuterem izotopomerów L-Ala, 3-F-L-Ala i koenzymu NAD. trzymana przeze mnie fluoropochodna L-Ala posłużyła do opracowania nowej, nie opisanej dotychczas w literaturze, metody syntezy L-tryptofanu zachodzącej w wyniku reakcji sprzęgania 3-F-L-Ala z indolem, katalizowanej przez enzym tryptofanazę. W związku z założeniami do zadań mojej pracy doktorskiej należało: 1. pracowanie i optymalizacja warunków syntezy oraz metod identyfikacji i izolacji izotopomerów: L-alaniny znakowanej deuterem w pozycji C-2; 3-fluoro-L-alaniny znakowanej deuterem w pozycji C-2; koenzymu NAD znakowanego deuterem w pozycji 4R pierścienia nikotynoamidowego; L-tryptofanu znakowanego deuterem w pozycji C-2. 8

18 2.CELE BADAŃ 2. pracowanie optymalnych warunków pomiarów kinetycznych oraz wyznaczenie efektów izotopowych w reakcjach biotransformacji L-Ala i 3-F-L-Ala oraz redukcji 3-F-PA do 3-F-LA: a) wyznaczenie kinetycznych efektów izotopowych w reakcjach katalizowanych przez enzym AlaD, tj. oksydacyjnej deaminacji L-Ala w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego; oksydacyjnej deaminacji 3-F-L-Ala w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego; redukcyjnego aminowania PA z udziałem koenzymów NAD i [(4R)- 2 ]- NAD w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego; redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem koenzymów NAD i [(4R)- 2 ]- NAD w środowisku buforów protonowanego i deuterowanego. b) wyznaczenie rozpuszczalnikowych efektów izotopowych w reakcjach katalizowanych przez enzym AlaD, tj. oksydacyjnej deaminacji L-Ala i [2-2 ]-L-Ala; oksydacyjnej deaminacji 3-F-L-Ala i 3-F-[2-2 ]-L-Ala; redukcyjnego aminowania PA z udziałem koenzymów NAD i [(4R)- 2 ]- NAD; redukcyjnego aminowania 3-F-PA z udziałem koenzymów NAD i [(4R)- 2 ]- NAD. oraz katalizowanej przez enzym LD: redukcji 3-F-PA do 3-F-LA. 3. Interpretacja uzyskanych wyników. 9

19 EC 4 LIAZY EC 1 KSYDREDUKTAZY 3. PRZEGLĄD LITERATURY 3. PRZEGLĄD LITERATURY 3.1. K L A S Y F I K A C J A E N Z Y M Ó W Według zasad klasyfikacji, opracowanych przez Międzynarodową Unię Biochemii i Biologii Molekularnej, enzymy zostały podzielone na sześć klas ze względu na typ katalizowanej reakcji. Każdemu enzymowi został przypisany: czteroczęściowy kod enzymatyczny EC (ang. Enzyme Commission) i odpowiednia nomenklatura nazewnictwa wskazująca na rodzaj biotransformacji. Zgodnie z powyższym wyszczególniono sześć grup: EC 1 oksydoreduktazy, EC 2 transferazy, EC 3 hydrolazy, EC 4 liazy, EC 5 izomerazy, EC 6 ligazy. Poniżej przedstawiłam klasyfikację enzymów, używanych przeze mnie w przeprowadzonych eksperymentach (tabela 3.1) [14]: EC 1.1 działają na grupę hydroksylową EC 1.2 działają na grupę aldehydową lub ketonową EC EC EC funkcję kofaktora pełni NAD + lub NADP + EC dehydrogenaza alkoholowa EC dehydrogenaza L-mleczanowa EC dehydrogenaza mrówczanowa EC 1.4 działają na grupę aminową EC dehydrogenaza L-alaninowa EC 4.1 liazy węgiel-węgiel; tworzą lub rozrywają wiązanie C-C EC inne EC tryptofanaza Tabela 3.1. Klasyfikacja wybranych enzymów 10

20 3. PRZEGLĄD LITERATURY 3.2. K S Y D R E D U K T A Z Y ksydoreduktazy to enzymy należące do klasy 1, katalizujące reakcje utleniania i redukcji, czyli przemiany z udziałem protonów, elektronów i tlenu. Klasa ta obejmuje następujące enzymy: dehydrogenazy, reduktazy, oksydazy, oksygenazy, hydroksylazy i peroksydazy. ksydoreduktazy odszczepiają elektrony i protony, a następnie przenoszą je między substratem i koenzymem, który jest niezbędny do prawidłowej aktywności enzymatycznej [7]. Głównym przedmiotem badań prezentowanych w niniejszej rozprawie doktorskiej są reakcje z udziałem dehydrogenaz i liaz, dlatego też dalsze rozdziały poświęciłam na przedstawienie najważniejszych właściwości i struktur wybranych enzymów D E Y D R G E N A Z Y Dehydrogenazy to ogólna nazwa enzymów katalizujących, zwykle w sposób odwracalny, odszczepienie atomów wodoru z rozmaitych substratów takich, jak aminokwasy, aldehydy, 1 i 2 alkohole, 2- i 3-hydroksykwasy, cukry i inne. Enzymy te utleniają substrat poprzez odszczepienie anionu wodorkowego ( - ), który jest następnie przenoszony na cząsteczkę koenzymu NAD(P) +, który ulega redukcji do NAD(P) [7] Kofaktory dehydrogenaz Większość enzymów z podklasy dehydrogenaz katalizuje reakcje z udziałem koenzymów nikotynoamidowych dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NAD + ) lub jego fosforanu (NADP + ), które pełnią rolę przenośników elektronów i protonów z substratu na koenzym lub odwrotnie. Biorą one udział m.in. w syntezie i degradacji węglowodanów, kwasów tłuszczowych i aminokwasów. Formy utlenione koenzymów pełnią funkcję akceptorów protonów i elektronów pochodzących od innych cząsteczek, ulegając w ten sposób redukcji. Jeden atom wodoru wraz z dwoma elektronami jest przenoszony z substratu na koenzym, natomiast drugi pozostaje w środowisku reakcji jako proton (schemat 3.1). 11

21 3. PRZEGLĄD LITERATURY N + R N e e - N R N Schemat 3.1. Redukcja kofaktora NAD + Koenzym NAD + jest dinukleotydem składającym się 5 -monofosforanu adenozyny (AMP) i nukleotydu nikotynoamidowego. Cząsteczka koenzymu NADP + różni się od NAD + obecnością grupy fosforanowej przy C-2 -rybozy w nukleotydzie adeninowym (schemat 3.2) [15]. pro-r pro-s P N N 2 nukleotyd nikotynoamidowy N 2 nukleotyd adeninowy (AMP) P N N N N P Schemat 3.2. Budowa koenzymu NAD(P) NAD + i NADP + są koenzymatycznymi formami witaminy PP (niacyny, czynnika przeciwpelagrycznego), tj. kwasu nikotynowego i jego amidu. Wolny kwas nikotynowy ulega przemianie w amid, który następnie jest przekształcany w koenzym NAD + na dwa sposoby poprzez rybonukleotyd nikotynoamidowy lub kwas nikotynowy. Witamina PP, w przeciwieństwie do innych witamin, może być syntetyzowana również in vivo z L-tryptofanu. Reakcje, zachodzące z udziałem wspomnianych koenzymów, można w łatwy sposób monitorować spektrofotometrycznie, gdyż zmiana układu wiązań w pierścieniu 12

22 3. PRZEGLĄD LITERATURY nikotynoamidowym skutkuje pojawieniem się maksimum absorpcji promieniowania UV przy innej długości fali, charakterystycznej dla każdej z form: forma utleniona NAD(P) + λ max = 260 nm; forma zredukowana NAD(P) λ max = 340 nm. W wyniku redukcji koenzymu NAD(P) + powstaje nowe centrum stereogeniczne w pierścieniu nikotynoamidowym, co jest przyczyną nierównocenności atomów wodoru w pozycji C-4 (atomy wodoru pro-s i pro-r) [16] Stereospecyficzność dehydrogenaz W zależności od rodzaju enzymu, podczas katalizy enzymatycznej z udziałem dehydrogenaz, następuje stereospecyficzne przeniesienie anionu wodorkowego z substratu w pozycję pro-r lub pro-s atomu węgla C-4 pierścienia nikotynoamidowego. Jest to spowodowane zdolnością dehydrogenaz do rozróżniania diastereotopowych atomów wodoru koenzymu NAD. Na tej podstawie wprowadzono podział dehydrogenaz na dwie grupy: pro-r stereospecyficzne w których przeniesienie wodoru zachodzi w pozycję pro-r płaszczyzny pierścienia nikotynoamidowego, pro-s stereospecyficzne w których przeniesienie wodoru zachodzi w pozycję pro-s płaszczyzny pierścienia nikotynoamidowego (schemat 3.3). N 2 N 2 CN 2 CN 2 pro-r pro-s Schemat 3.3. Pozycja deuteru względem płaszczyzny pierścienia amidu kwasu nikotynowego w NAD [16] Stereospecyficzność dehydrogenaz wynika z ich położenia względem koenzymu. W dehydrogenazach pro-r stereospecyficznych konformacja przy wiązaniu glikozydowym między amidem kwasu nikotynowego a rybozą jest anti, co oznacza, że jeden atom wodoru, połączony z atomem węgla C-4 nikotynoamidu, jest zwrócony w kierunku 13

23 3. PRZEGLĄD LITERATURY białka, drugi zaś w kierunku miejsca wiązania substratu. Dehydrogenazy pro-s stereospecyficzne przyjmują natomiast konformację odwrotną syn [16]. Większość enzymów z grupy dehydrogenaz aminokwasowych wykazuje pro-s stereospecyficzność. W tym przypadku jedynymi znanymi wyjątkami są AlaD i dehydrogenaza L-lizynowa, które są pro-r stereospecyficzne (tabela 3.2) [17]. Enzym Źródło enzymu Stereospecyficzność dehydrogenaza L-glutaminianowa dehydrogenaza L-alaninowa drożdże wątroba wołowa roślina Bacillus subtilis Bacillus sphaericus pro-s pro-s pro-s pro-r pro-r dehydrogenaza L-leucynowa Bacillus sphaericus pro-s dehydrogenaza L-fenyloalaninowa Bacillus sphaericus pro-s Tramitichromis intermedius pro-s dehydrogenaza L-lizynowa Agrobacterium tumefaciens pro-r dehydrogenaza L-walinowa Streptococcus thermovulgaris pro-s dehydrogenaza alkoholowa Saccharomyces cerevisiae pro-r dehydrogenaza L-mleczanowa mięsień królika pro-r dehydrogenaza mrówczanowa Candida boidinii pro-r Tabela 3.2. Zestawienie stereospecyficzności wybranych dehydrogenaz [18] Dehydrogenazy aminokwasowe Dehydrogenazy aminokwasowe (EC ) katalizują odwracalną reakcję oksydacyjnej deaminacji α-aminokwasów do odpowiednich α-ketokwasów oraz amoniaku i są sklasyfikowane według specyficzności substratowej (schemat 3.4). Większość dehydrogenaz katalizuje przemiany α-aminokwasów, jednakże niektóre działają również na β- i ε-aminokwasy. Dehydrogenazy aminokwasowe mają podobne struktury, jednak różnią się od siebie specyficznością substratową, stereospecyficznością oraz stabilnością w różnych warunkach środowiskowych. Enzymy te uczestniczą w metabolizmie azotu i węgla przeprowadzając proces oksydacyjnej deaminacji. Pozostałe szkielety węglowe są metabolizowane w procesie glikolizy lub cyklu kwasu cytrynowego z wytworzeniem energii. W procesie 14

24 3. PRZEGLĄD LITERATURY odwrotnym redukcyjnego aminowania organizmy wiążące azot pobierają amoniak ze środowiska i wbudowują go w ketokwasy tworząc aminokwasy [17]. C R C N 2 R + NAD(P) NAD(P) + N 3 C C Schemat 3.4. gólna reakcja z udziałem dehydrogenaz aminokwasowych [18] Większość dehydrogenaz współdziała tylko z jedną z form koenzymów nikotynoamidoadeninowych, jednak nieliczne wykorzystują obie formy koenzymatyczne. gólny mechanizm działania dehydrogenaz aminokwasowych obejmuje oderwanie anionu wodorkowego z substratu i redukcję koenzymu NAD(P) +, a następnie przyłączenie cząsteczki wody związanej z enzymem, co w rezultacie prowadzi do utworzenia pośredniej karbinoloaminy. ddysocjowanie grupy aminowej z substratu z utworzeniem cząsteczki amoniaku skutkuje powstaniem ketokwasu [17]. W większości dehydrogenazy aminokwasowe działają na L-aminokwasy, a redukcyjne aminowanie α-ketokwasu jest preferowanym kierunkiem reakcji [18] Dehydrogenaza L-alaninowa gólna charakterystyka enzymu AlaD Dehydrogenaza L-alaninowa (EC ) jest ważnym enzymem uczestniczącym w katabolizmie L-alaniny u bakterii. Należy do rodziny dehydrogenaz aminokwasowych i katalizuje oksydacyjną deaminację L-alaniny oraz reakcję odwrotną redukcyjne aminowanie kwasu pirogronowego (schemat 3.5). N 2 L-Ala + NAD + dehydrogenaza L-alaninowa + + NAD 2 + N EC PA Schemat 3.5. dwracalna reakcja oksydacyjnej deaminacji L-alaniny 15

25 3. PRZEGLĄD LITERATURY ptymalne warunki do działania AlaD Najbardziej właściwą temperaturą do działania AlaD jest 30 C a optymalne p wynosi 10-10,5 dla oksydacyjnej deaminacji i 8-9 dla redukcyjnego aminowania [19]. Specyficzność substratowa Do prawidłowej aktywności enzym AlaD wymaga obecności koenzymu NAD +, który nie może być zastąpiony przez NADP +. Specyficzność substratowa w kierunku oksydacyjnej deaminacji jest wysoka, gdyż enzym katalizuje przemiany prawie wyłącznie z udziałem L-Ala. Specyficzność w kierunku redukcyjnego aminowania jest niższa i poza pirogronianem, enzym katalizuje m.in. reakcje z udziałem α-ketomaślanu, α-ketowalerianu i β-hydroksypirogronianu [19]. Inhibitory AlaD Silnymi inhibitorami dla enzymu AlaD są p-chlorortęciobenzoesan i chlorek rtęci (II), będące typowymi związkami hamującymi aktywność enzymów posiadających grupy tiolowe w centrum aktywnym. Ponadto, właściwości inhibicyjne wykazują jony Cu 2+ i Pb 2+ [19]. Występowanie i znaczenie biologiczne d odkrycia AlaD w 1955 roku przez Wiame i Pierarda enzym ten był przez wiele lat jednym z najintensywniej badanych dehydrogenaz aminokwasowych [20]. Jej obecność odkryto zarówno w organizmach eukariotycznych, jak i prokariotycznych, głównie bakteriach należących do szczepów Bacillus, Acholeplasma, Anabaena, Archeoglobus, Carnobacterium, Enterobacter, Geobacillus, alobacterium, Mycobacterium, Phormidium, Pseudomonas i Streptomyces [21]. AlaD została zidentyfikowana i wyizolowana z komórek wegetatywnych i przetrwalnikowych cyjanobakterii oraz bakterii z rodzaju Bacillus (B. cereus, B. subtilis, B. sphaericus), które produkują ten enzym pod wpływem bodźca, jakim jest obecność L-alaniny w środowisku [22]. Enzym AlaD jest ważnym obiektem badań w wielu obszarach nauki, w tym w medycynie i epidemiologii. AlaD uczestniczy w katabolizmie L-alaniny i jest 16

26 3. PRZEGLĄD LITERATURY ważnym źródłem węgla i azotu dla mikroorganizmów. Bakterie z rodzaju Bacillus, aby przetrwać w niekorzystnych warunkach środowiskowych, przeprowadzają proces sporulacji, czyli wytworzenia form spoczynkowych przetrwalników. Procesem odwrotnym jest germinacja, czyli powrót komórki do formy wegetatywnej, dla którego jednym z sygnałów biochemicznych jest wzrost stężenia alaniny w środowisku. Udowodniono, że AlaD uczestniczy w produkcji energii niezbędnej do sporulacji i germinacji powstałych przetrwalników poprzez oksydacyjną deaminację L-alaniny i wytworzenie pirogronianu, który jest metabolizowany w cyklu Krebsa [23,24]. Ponadto, w komórkach Rhodopseudomonas capsulata, Streptomyces clavuligerus i Anabeana cylindrica AlaD uczestniczy w procesie asymilacji azotu w środowisku wysokiego stężenia amoniaku [18]. Wytwarzanie tego enzymu przez mikroorganizmy jest wzbudzane głównie przez obecność substratu L-alaniny, jednak istnieje teoria, według której indukcja wywołana L-Ala zależy od jej przemiany w D-Ala przez racemazę alaninową [25]. Przeprowadzone niedawno badania wykazały obecność enzymu AlaD w chorobotwórczym szczepie Mycobacterium tuberculosis, wywołującym gruźlicę. Pomimo wielu badań nad mechanizmem patogenezy tej choroby stanowi ona wciąż globalne zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na oporność na antybiotyki, trudności w diagnostyce oraz zdolność do pozostawania prątków gruźlicy w płucach w fazie uśpienia. Enzym AlaD jest prawdopodobnie zaangażowany w biosyntezę peptydoglikanu głównego składnika ściany komórkowej, która jest niezbędna do przetrwania większości bakterii. Co więcej aminokwasy: L-Ala i D-Ala są ważnymi składnikami peptydoglikanu, bez których jego synteza jest niemożliwa [12, 26-28]. Struktura warstwy peptydoglikanu ma postać łańcuchów polisacharydowych zbudowanych z kwasu N-acetylomuraminowego (NAM) i N-acetyloglukozoaminy (NAG) usieciowanych poprzez wiązania 4 3 i 3 3 między oligopeptydami, zbudowanymi zazwyczaj z trzech do pięciu aminokwasów: D-alaniny, L-alaniny, kwasu D-glutaminowego i kwasu mezo-diaminopimelinowego (A 2 pm), tworzących siatkową, trójwymiarową strukturę (rysunek 3.1) [29]. W przypadku pentapeptydu, pierwsze trzy aminokwasy są zmienne, natomiast dwa kolejne charakteryzują się stałością i są z góry określone (stanowią one zawsze terminalny dipeptyd 17

27 3. PRZEGLĄD LITERATURY D-alanylo-D-alaninę, AA), co determinowane jest przez rolę, jaką pełnią one w biosyntezie peptydoglikanu [30]. A B NAG NAM oligopeptyd Rysunek 3.1. A. Klasyczny model warstwy peptydoglikanu w M. tuberculosis (szare pola oznaczają N-acetyloglukozoaminę, białe pola kwas N-acetylomuraminowy, A 2 pm kwas mezo-diaminopimelinowy, zaznaczone są oddziaływania 4 3 między peptydami [30]. B. Siatkowa struktura peptydoglikanu [31] AA, kluczowa struktura w biosyntezie peptydoglikanu, jest odpowiedzialna za sieciowanie łańcuchów polisacharydowych, gdyż przedostatni aminokwas D-Ala tworzy wiązanie peptydowe z aminokwasem innego oligopeptydu. Fakt ten sprawia, iż końcowy dipeptyd jest obiektem oddziaływania antybiotyków blokujących syntezę bakteryjnej ściany komórkowej [32]. Antybiotyki takie jak wankomycyna i ristocetyna rozpoznają i wiążą się z peptydem AA zakłócając w ten sposób biosyntezę peptydoglikanu, natomiast penicylina powoduje inhibicję enzymów syntetyzujących końcowy dipeptyd [30]. pracowanie leku będącego inhibitorem enzymu AlaD, odpowiedzialnego za dostarczanie L-Ala w wyniku redukcyjnego aminowania pirogronianu, może mieć kluczowe znaczenie w zablokowaniu syntezy terminalnego dipeptydu AA, gdyż powstająca L-Ala jest przekształcana do D-Ala przez racemazę alaninową [33]. Podobnie, jak w przypadku antybiotyków z grupy penicylin mogłoby to spowodować zatrzymanie biosyntezy ściany komórkowej i obumarcie bakterii. Ponadto, pewne perspektywy dla dalszych badań nad patogenezą gruźlicy stwarza fakt, iż enzym AlaD występuje jedynie w wirulentnym szczepie M. tuberculosis, natomiast jest nieobecny w szczepionce przeciwgruźliczej BCG (fr. Bacillus Calmette- Guérin), która zawiera atenuowany szczep bakterii Mycobacterium bovis wywołujący chorobę bydła [34]. 18

28 3. PRZEGLĄD LITERATURY Wszystko to sprawia, że z medycznego punktu widzenia AlaD jest interesującym obiektem badań, gdyż może stanowić potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu oraz zapobieganiu gruźlicy. Wnikliwe poznanie i zrozumienie mechanizmu działania tego enzymu mogłoby przyczynić się do opracowania nowych leków oraz szczepionek przeciwgruźliczych Budowa enzymu AlaD Struktura przestrzenna białkowego enzymu AlaD jest znana i została opisana dla enzymów pozyskanych z różnych źródeł przy użyciu rentgenografii strukturalnej [22,35,36]. Metoda ta polega na analizowaniu obrazów dyfrakcyjnych promieni rentgenowskich tworzonych przez analizowany kryształ i pozwala na dokładne ustalenie struktury związku chemicznego, w tym wyznaczenie położenia poszczególnych atomów względem siebie, ustalenie konfiguracji absolutnej, czy kątów i długości wiązań między atomami. Analiza krystalograficzna enzymów dostarcza wielu cennych informacji na temat struktury 1-, 2-, 3- i 4-rzędowej białka, budowy centrum aktywnego czy konformacji natywnej białka. Informacje na temat struktury białka AlaD w połączeniu z przeprowadzonymi przeze mnie badaniami izotopowymi mogą pomóc w lepszym wyjaśnieniu mechanizmu działania AlaD. Enzym AlaD składa się z części białkowej apoenzymu i części niebiałkowej kofaktora, którego funkcję pełni koenzym NAD +. W zależności od pochodzenia AlaD ma różną strukturę białkową. Biokatalizator wyizolowany z halofilnych bakterii alobacterium cutirubrum i. salinarium ma postać monomeru, enzym z Pseudomonas sp., Rhizobium lupini i Streptomyces fradiae jest tetramerem, a z Streptomyces aureofaciens oktamerem. Najczęstszą formą enzymu AlaD, występującą w mikroorganizmach z rodzaju Bacillus, Thermus i Mycobacterium, jest heksamer o ciężarze od 228 do 290 kda, który składa się z sześciu identycznych podjednostek o masie cząsteczkowej w zakresie kda (rysunek 3.2) [18]. Jedną z najlepiej opisanych i scharakteryzowanych struktur krystalograficznych AlaD jest enzym wyizolowany z prątka gruźlicy Mycobacterium tuberculosis. Każdy łańcuch polipeptydowy tego enzymu składa się z 371 aminokwasów, przy czym sekwencja aminokwasów i struktura białka w bakteryjnej AlaD wykazują większą rozbieżność w porównaniu z innymi dehydrogenazami aminokwasowymi takimi jak, PheD, LeuD 19

29 3. PRZEGLĄD LITERATURY i GluD. AlaD mechanizmem katalizy oraz sposobem zwijania białka przypomina bardziej enzymy z rodziny dehydrogenaz D-2-hydroksykwasowych [35]. Rysunek 3.2. Struktura krystalograficzna heksameru AlaD z Mycobacterium tuberculosis (podjednostki enzymu są zaznaczone różnymi kolorami) [37] Budowa podjednostki AlaD Każda podjednostka AlaD składa się z dwóch domen, odseparowanych od siebie szczeliną domeny wiążącej NAD + (reszty aminokwasów ) oraz domeny katalitycznej (reszty aminokwasów i ), która przyłącza substrat. W pojedynczej podjednostce znajduje się 13 α-helis i 15 β-kartek. Domeny dehydrogenaz, zależnych od NAD +, charakteryzują się obecnością białkowych motywów Rossmanna, które są odpowiedzialne za przyłączanie koenzymu. Analiza struktury trzeciorzędowej enzymu AlaD pozwoliła na ustalenie, że domena wiążąca NAD + ma postać centralnie umiejscowionej 7-łańcuchowej β-kartki otoczonej przez α-helisy. Natomiast domena katalityczna charakteryzuje się obecnością 8-łańcuchowej β-kartki zawierającej motyw Rossmanna oraz β-spinki. Pomimo odmiennej sekwencji aminokwasów obie domeny są do siebie strukturalnie zbliżone [36,37]. Czwartorzędowa budowa AlaD Budowa heksameryczna enzymu jest skutkiem połączenia trzech dimerów i utworzenia struktury potrójnego dimeru (rysunek 3.3). Dwa łańcuchy polipeptydowe łączą się poprzez dwie α-helisy tworząc dimer, w którym domeny wiążące NAD + znajdują się w środku, natomiast domeny katalityczne wychodzą na zewnątrz enzymu. Większość reszt aminokwasowych, wchodzących w skład centrum aktywnego, jest 20

30 3. PRZEGLĄD LITERATURY umiejscowiona w szczelinie między domenami. Upakowanie podjednostek w formę heksameru generuje dwie powierzchnie międzyfazowe, czyli interfejsy: interfejs dimeru i trimeru [36,37]. Rysunek 3.3. Dimer powstały w wyniku połączenia dwóch podjednostek enzymu. Jedna podjednostka enzymu jest zaznaczona na niebiesko (domena wiążąca NAD + ) i czerwono (domena katalityczna), druga podjednostka - na szaro. Pozycja centrów aktywnych jest wskazana poprzez ligandy NAD + (na żółto)[36] Struktura apo- i holodehydrogenazy L-alaninowej Apoenzym, zanim zwiąże się z kofaktorem i utworzy holoenzym, występuje w postaci konformacji otwartej, przy czym sposób ich oddziaływania jest podobny wśród różnych dehydrogenaz (rysunek 3.4). Główną różnicą strukturalną między apoenzymem i holoenzymem jest zmiana orientacji dwóch domen wiążących NAD + względem domeny katalitycznej. Rysunek 3.4. Struktura form apoenzymu (z lewej) i holoenzymu (z prawej) AlaD z Mycobacterium tuberculosis [38] 21

31 3. PRZEGLĄD LITERATURY W czasie tworzenia kompleksu AlaD-NAD + domena katalityczna każdej podjednostki enzymu obraca się o około 16 względem domeny wiążącej NAD +. Jest to wynikiem przejścia z otwartej konformacji w zamkniętą po związaniu enzymu z kofaktorem. brót następuje w tzw. regionie zawiasowym w obrębie reszt aminokwasowych i , które są częścią dwóch odcinków heliakalnych łączących domeny. Podczas tworzenia się struktury holoenzymu domena katalityczna zmierza w kierunku domeny wiążącej NAD +, co prowadzi do powstania konformacji zamkniętej, gdzie reszty aminokwasów, wchodzących w skład centrum aktywnego, są bliżej koenzymu NAD. Przejście z konformacji otwartej w zamkniętą stwarza dogodne warunki dla katalizy, gdyż zapewnia odpowiednią orientację substratu ułatwiając dostęp cząsteczek wody i amoniaku do centrum aktywnego [36]. Wiązanie enzymu AlaD z NAD + Podczas wiązania enzymu z kofaktorem w pozycji C- 2 pierścienie rybozy, wchodzące w skład dinukleotydu, przyjmują w kompleksie konformacje endo, a pierścień adeniny wiąże się z resztami Ile 199, Val 239, Leu 240 i Leu 249 poprzez oddziaływania hydrofobowe. Dodatkowo, w tworzeniu kompleksu uczestniczą wiązania wodorowe, zarówno pomiędzy grupami 2 - i 3 - hydroksylowymi nukleotydu adeninowego i resztą kwasową Asp 198, jak również między grupą 2 -hydroksylową i atomem azotu w pozycji ε reszty Lys 203. Grupa difosforanowa kontaktuje się z atomami reszt aminokwasów pętli i łańcuchem bocznym Ser 134 poprzez wiązania wodorowe, które występują również między grupami hydroksylowymi rybozy nukleotydu nikotynoamidowego a resztą Asp 270 [36]. Pro-R stereospecyficzność enzymu AlaD jest determinowana przez ukierunkowanie grupy amidowej, związanej mostkiem wodorowym z łańcuchem aminokwasów Ile 267, Val 298 i Met 301 tak, że wodór z pozycji 4-pro-R zwraca się w kierunku centrum aktywnego [39]. Forma zredukowana koenzymu jest silniej wiązana przez enzym niż utleniona, co wynika z wartości stałych dysocjacji (K d NAD + = 12,81, K d NAD = 0,276). Znacznie niższa wartość K d dla zredukowanej formy koenzymu wskazuje na to, że preferowanym kierunkiem reakcji in vivo katalizowanej przez AlaD jest redukcyjne aminowanie PA, czyli tworzenie L-Ala. 22

32 3. PRZEGLĄD LITERATURY Struktura potrójnego kompleksu AlaD-NAD + -PA Zapoczątkowanie etapu katalitycznego wymaga utworzenia kompleksu enzymu AlaD z PA i NAD (rysunek 3.5). Reszty Arg 15 i Lys 75 stabilizują pirogronian w centrum aktywnym poprzez wiązania wodorowe i elektrostatyczne z atomem tlenu grupy karboksylowej (rysunek 3.6). W rezultacie przesunięcia domeny katalitycznej względem domeny wiążącej NAD + pirogronian znajduje się w mniejszej odległości od koenzymu, co sprzyja przeniesieniu anionu wodorkowego [36]. Rysunek 3.5. Struktura podjednostki enzymu tworzącej kompleks z pirogronianem i NAD [36] Rysunek 3.6. ddziaływania enzymu AlaD z NAD + i PA w ramach potrójnego kompleksu AlaD-NAD + - PA (wiązania wodorowe zaznaczone przerywaną linią, atomy tlenu cząsteczki wody zaznaczone czerwonymi kropkami)[37] Mechanizm reakcji katalizowanej przez AlaD Postulowany mechanizm działania enzymu dehydrogenazy L-alaninowej obejmuje w pierwszym etapie związanie koenzymu NAD + przez apoenzym i utworzenie holodehydrogenazy L-alaninowej. W trakcie tworzenia kompleksu AlaD-NAD + domena katalityczna przesuwa się względem domeny wiążącej koenzym, stabilizując konformację zamkniętą holoenzymu. W kolejnym etapie, w zależności od kierunku 23

33 3. PRZEGLĄD LITERATURY reakcji, substrat L-alanina lub pirogronian w postaci monoanionów przyłącza się do centrum aktywnego enzymu AlaD. Mechanizm katalizy przebiega poprzez dwa związki pośrednie iminopirogronian i karbinoloaminę. W procesie oksydacyjnej deaminacji L-alaniny w pierwszej kolejności następuje przeniesienie anionu wodorkowego i redukcja koenzymu NAD + do NAD, co skutkuje utworzeniem iminopirogronianu (1) (schemat 3.6). Cząsteczka wody, aktywowana przez resztę is 96 pełniącą rolę katalizatora kwas/zasada, atakuje pośredni iminopirogronian w wyniku czego powstaje karbinoloamina (2). W kolejnym etapie następuje protonowanie przez resztę is 96 grupy aminowej powstałego produktu pośredniego (3) a następnie oderwanie protonu z grupy hydroksylowej przez resztę is 96 (lub Asp 270), inicjujące proces eliminacji cząsteczki amoniaku (4). Poza pirogronianem, produktem końcowym jest jon amonowy, gdyż amoniak jest prawdopodobnie protonowany przez resztę is 96. W reakcji oksydacyjnej deaminacji reszta is 96 jest aktywna w formie nieprotonowanej, natomiast względem redukcyjnego aminowania występuje w postaci protonowanej [17,37,40]. W procesie odwrotnym redukcyjnym aminowaniu oddziaływania pirogronianu z centrum aktywnym obejmują wiązania wodorowe grupy karboksylowej z resztą aminokwasową Arg 15 oraz wiązanie wodorowe grupy karbonylowej z resztą protonowanej Lys 75, która polaryzuje atom tlenu ułatwiając w ten sposób atak nukleofilowy cząsteczki amoniaku i utworzenie karbinoloaminy. Prawdopodobnie amoniak nie tworzy kompleksu z AlaD-NAD-PA, tylko reaguje bezpośrednio z utworzeniem karbinoloaminy. Protonowanie grupy hydroksylowej i uwolnienie cząsteczki wody sprawia, że powstaje pośredni iminopirogronian, który jest następnie redukowany z utworzeniem L-alaniny w wyniku przeniesienia anionu wodorkowego z pozycji 4-pro-R koenzymu NAD. W kilku etapach reakcji reszta is 96 jest potencjalnym katalizatorem kwas/zasada i uczestniczy w przeniesieniu protonu. Według niektórych doniesień w literaturze, w pewnych stadiach rolę is 96 przejmuje Asp 270, jednak nie jest do końca jasne, czy Asp 270 jest donorem protonu dla cząsteczki wody po ataku nukleofilowym, a is 96 akceptorem protonu grupy aminowej karbinoloaminy, czy odwrotnie. Konformacja zamknięta kompleksu AlaD-NAD- PA zapewnia środowisko hydrofobowe a niewielka odległość (3 Ǻ) między atomem wodoru C-4 pierścienia nikotynoamidowego i C-2 pirogronianu tworzy dogodne 24

34 3. PRZEGLĄD LITERATURY warunki do przeniesienia anionu wodorkowego. Ze względu na zwartą strukturę kompleksu enzymu z PA i NAD substrat jest niedostępny dla rozpuszczalnika na tym etapie katalizy. Ścisłe upakowanie pirogronianu względem pierścienia nikotynoamidowego w kompleksie AlaD-NAD-PA sprawia, że enzym musi zmienić konformację na bardziej otwartą, aby umożliwić dostęp cząsteczki amoniaku. Jest to możliwe dzięki wytworzeniu wąskiego tunelu, którym wnika on do miejsca aktywnego [36]... N 2 3 C C 2 - is 96 N: : N 2 + (1) C C - (2) 3 2 N R N 2 N 3 + Lys 75 is 96 N +.. : N 2 N 2 N C C 2 - N + Lys 75 N 2 N 3 + R N R Lys 75 : N is 96 (3) 3 C C 2 - N : N C C 2 - N + is 96 N R N 2 N + 3 Lys 75 (4) N R N 2 N 3 + Lys 75 Schemat 3.6. Prawdopodobny mechanizm działania dehydrogenazy L-alaninowej [17,36,37] 25