SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE JAKO POTENCJALNY PREBIOTYK

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 530: SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE JAKO POTENCJALNY PREBIOTYK Joanna Le Thanh, Aneta Burchardt, Joanna Menclewicz, Anna Sip, GraŜyna Lewandowicz Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu Wstęp WaŜnym czynnikiem bezpośrednio zaleŝnym od zachowań konsumenta, tj. jego warunków ekonomicznych, upodobań i nawyków Ŝywieniowych, jest rodzaj stosowanej diety. Jej skład decyduje o właściwościach składników, które docierają do jelita grubego. Wiele produktów Ŝywnościowych zawiera składniki, które nie są trawione w górnej części przewodu pokarmowego (na odcinku Ŝołądek - jelito cienkie). Przykładem takich składników jest skrobia oporna, nieskrobiowe polisacharydy (błonnik pokarmowy) oraz oligosacharydy [FOOKS i in. 1999; LESZCZYŃSKI 2004]. Składniki, które w postaci niestrawionej docierają do jelita grubego mogą być metabolizowane przez mikroflorę jelitową i niejednokrotnie stymulować jej rozwój. Źródłem składników wykorzystywanych przez bakterie jelitowe jest wiele produktów dietetycznych [GIDLEY i in. 1995; LEWANDOWICZ, SORAL-ŚMIETANA 2004]. Na skład mikroflory jelitowej moŝna oddziaływać nie tylko za pośrednictwem diety ale równieŝ poprzez stosowanie preparatów probiotycznych zawierających wyselekcjonowane szczepy bakterii Lactobacillus czy Bifidobacterium. Powszechnie wiadomo, Ŝe dodatek drobnoustrojów probiotycznych do diety wywiera korzystny wpływ na zdrowie, przede wszystkim z uwagi na ich zdolność do antagonistycznego działania na drobnoustroje chorobotwórcze oraz bakterie gnilne. Liczebność korzystnych bakterii w produktach spoŝywczych podczas ich przechowywania, a następnie podczas pasaŝu jelitowego obniŝa się. Z tego teŝ względu bakterie probiotyczne często nie są w stanie utrzymać przewagi populacyjnej w przewodzie pokarmowym. W związku z tym w ostatnich latach uwaga naukowców koncentruje się na identyfikacji, a takŝe opracowywaniu funkcjonalnych składników Ŝywności, za pośrednictwem których moŝna by manipulować składem mikroflory jelitowej w taki sposób by korzystnie oddziaływała ona na nasze zdrowie. Modyfikacja składu mikroflory jelitowej jest zatem moŝliwa zarówno poprzez doustne podanie Ŝywych drobnoustrojów w postaci preparatów probiotycznych lub Ŝywności probiotycznej oraz za pośrednictwem Ŝywności zawierającej nietrawione w przewodzie pokarmowym składniki, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność określonych grup drobnoustrojów. Pierwotnie błonnik zawarty w ścianach komórkowych roślin uwaŝany był za główne źródło materiału opornego na hydrolizę enzymatyczną (trawienie), jednakŝe niedawno okazało się, Ŝe równieŝ oligosacharydy, jak i oporne frakcje skrobi,

2 406 J. Le Thanh i inni stanowią interesujące źródło węglowodanów wykorzystywanych przez mikroorganizmy w jelicie grubym [ASP 1996; LESZCZYŃSKI 2004]. Wśród tego typu produktów szczególne miejsce zajmują substancje o działaniu prebiotycznym, takie jak polisacharydy nieskrobiowe, a takŝe tzw. resistant starch czyli skrobia oporna na enzymy amylolityczne. Substancje te nie są trawione przez enzymy amylolityczne w przewodzie pokarmowym człowieka, natomiast stanowią źródło węglowodanów dla mikroflory jelitowej. W wyniku zachodzących tam procesów fermentacyjnych tworzą się krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe uczestniczące w formowaniu nabłonka jelitowego i wykazujące udowodnione działanie antykancerogenne [BROUNS i in. 2002]. Prebiotyki stymulują zatem rozwój probiotyków. Prebiotyki w sposób pośredni wpływają więc na skład mikroflory jelitowej, motorykę jelit, gospodarkę mineralną, syntezę witamin z grupy B oraz poziom cholesterolu i syntezy triglicerydów. Są pomocne w profilaktyce nowotworów, a takŝe mogą zmniejszać ryzyko powstawania wielu chorób cywilizacyjnych takich jak: osteoporoza (poprzez poprawę wchłaniania wapnia), otyłość (obniŝenie indeksu glikemicznego), wrzodziejące zapalenie jelita grubego, zaparcia, czy choroba wieńcowa [GIBSON 2004]. Pomimo szeregu dostępnych komercyjnie preparatów prebiotycznych i coraz większej ilości informacji na temat mikroflory jelitowej, wiedza dotycząca przemian jakim zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo ulegają prebiotyki jest nadal niewielka. Pierwszą próbę opracowania ilościowej, a tym samym porównywalnej, metody oceny przebiegu fermentacji substancji prebiotycznych w warunkach in vitro opracowali Palframan i wsp., którzy wprowadzili pojęcie indeksu prebiotycznego PI [VULEVIC i in. 2004]. Do wyznaczenia PI zaproponowali równanie, określające zmiany liczebności populacji kluczowych grup bakterii bytujących w jelicie grubym (Bifidobacterium, Lactobacillus, Clostridium oraz Bacteroides) [VULEVIC i in. 2004]. Częściej jednak badania nad prebiotykami dotyczą określenia ich wpływu na liczebność wybranego szczepu bakterii probiotycznych np. Bifidobacterium [SORAL-ŚMIETANA i in. 2005] lub Lactobacillus [LIBUDZISZ 2006]. W badaniach tych ocenia się takŝe ilość powstających krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych oraz tempo asymilacji substratu i na ich podstawie określa się tzw. efekt prebiotyczny [SORAL-ŚMIETANA i in. 2005; LIBUDZISZ 2006]. Ze względu na właściwości fizykochemiczne skrobi oraz jej znaczenie w Ŝywieniu człowieka, ogromne nadzieje wiąŝe się z produktami jej modyfikacji jako produktami dietetycznymi [LE THANH, LEWANDOWICZ 2007]. W szczególności duŝe oczekiwania istnieją w odniesieniu do procesów modyfikacji fizycznej, które w odróŝnieniu od sposobów polegających na reakcjach chemicznych nie budzą zastrzeŝeń z punktu widzenia Ŝywieniowego. W Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu opracowano metodę otrzymywania skrobi o podwyŝszonej oporności na enzymy amylolityczne na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku [GRAJEK i in. 2004]. Metodą tą moŝna otrzymać produkt o strawności obniŝonej do 50%. Celem niniejszej pracy było ustalenie czy skrobia modyfikowana fizycznie otrzymana w wyniku wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych jest metabolizowana przez probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus. Uzyskanie tych informacji moŝe w przyszłości doprowadzić do opracowania na ich bazie preparatów prebiotycznych i/lub gotowych symbiotyków. Materiały i metody Materiał badawczy stanowiła skrobia ziemniaczana modyfikowana fizycznie otrzymana na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku skrobiowego [GRAJEK i

3 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE in. 2004]. Do celów porównawczych zastosowano takŝe maltodekstrynę niskoscukrzoną (DE = 4,9) pochodzącą z Przedsiębiorstwa Przemysłu Ziemniaczanego w Łobzie oraz skrobię ziemniaczaną natywną wyprodukowaną przez WWPZ w Luboniu. Masę cząsteczkową skrobi ziemniaczanej, maltodekstryny N oraz homogenizatu oznaczano techniką GFC (ang. Gel Filtration Chromatography). UŜyto trzech sprzęŝonych szeregowo kolumn Ultrahydrogel TM (Waters). Analizy wykonano aparatem firmy Waters (Alliance HPLC System 2695) z detektorem refraktometrycznym (RI) Waters Dane przetwarzano za pomocą oprogramowania Empower Pro w opcji GPC. Analizę chromatograficzną prowadzono w następujących warunkach: temperatura injektora 25 C, temperatura kolumn 40 C, temperatura celi pomiarowej 35 C, przepływ rozpuszczalnika (woda dejonizowana) 0,700 ml/min. Krzywą kalibracyjną otrzymano przy uŝyciu standardów mas cząsteczkowych dekstranu (Polymer Standards Service- USA, Inc.). Badaniom poddano probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum oraz L. ramnosus. Wszystkie badane bakterie pochodziły z kolekcji czystych kultur Katedry Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu. Hodowle probiotycznych bakterii Lactobacillus prowadzono bez regulacji ph w temperaturze 37 C w płynnym podłoŝu MRS (standardowym podłoŝu dla bakterii z rodzaju Lactobacillus) oraz w zmodyfikowanych podłoŝach MRS. Modyfikacja podłoŝa MRS polegała na usunięciu z niego glukozy i zastąpieniu jej równowaŝną ilością - maltodekstryny, naturalnej skrobi ziemniaczanej lub skrobi modyfikowanej fizycznie (homogenizatu). Sterylizację podłoŝy prowadzono po dodaniu do nich alternatywnych w stosunku do glukozy źródeł węgla. W trakcie hodowli, w określonych interwałach czasowych, oznaczano liczebność komórek Lactobacillus metodą rozcieńczeń dziesiętnych i wyraŝano ją w jtk/ml. Wszystkie oznaczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Na podstawie otrzymanych danych określano maksymalną liczbę komórek badanych bakterii, obliczano ilość podziałów, czas generacji, maksymalną szybkość wzrostu (częstość podziałów) oraz czas trwania fazy wykładniczej. Hodowlę kontrolną (klasyczne podłoŝe MRS) prowadzono przez 50 godz., natomiast hodowle testowe (zmodyfikowane podłoŝa MRS) przez 75 godz. Czas hodowli testowych wydłuŝono o 50% by dokładnie prześledzić sposób oddziaływania zastosowanych źródeł węgla na ich przebieg. Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych SCFA oznaczono wykorzystując technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC. Oznaczenia wykonano na chromatografie cieczowym Merck-Hitachi L-7250, wyposaŝonym w kolumnę Amnimex HPX-87H 300 x 7,8mm oraz prekolumnę i detektor refraktometryczny typ DAD MERCK-HITACHI L Jako eluent stosowano 0,005M H 2 SO 4, przy przepływie 0,6 ml min -1. Próby sączono przez sączki 0,45 µm (Milipore) i nanoszono na kolumnę w ilości 30 µl. Identyfikacji jakościowej oraz ilościowej dokonano metodą standardu zewnętrznego z wykorzystaniem powierzchni pików (pomiar i integracja komputerowa). Wyniki i dyskusja Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku skrobiowego wykazuje obniŝoną do 50% strawność czyli zaledwie połowa skrobi ulega hydrolizie do glukozy po 16-tu godzinach inkubacji w obecności α- amylazy trzustkowej i glukoamylazy. Pod względem strukturalnym preparat ten w niewielkim stopniu róŝni się od naturalnej skrobi ziemniaczanej, a najpowaŝniejszą

4 408 J. Le Thanh i inni zmianą jaką powoduje zastosowany sposób obróbki jest częściowa degradacja makrocząsteczek tego polisacharydu (rys. 1). Na wykresie obrazującym rozkład mas cząsteczkowych naturalnej skrobi ziemniaczanej moŝna zaobserwować ostry pik amylopektyny dla czasu retencji 16,6 min, oraz trzy szerokie piki (czas retencji 22,5; 24,9; 30,7 min) odpowiadające amylozie (rys. 1). Handlowa maltodekstryna niskoscukrzona DE = 4,9 (co odpowiada stopniowi polimeryzacji DP 20) wykazuje duŝy szeroki pik z dwoma maksimami dla czasów retencji 40,5 i 36,2 min odpowiadający dominującej frakcji niskocząsteczkowej, oraz mały pik dla czasu retencji 17,9 min, wskazujący na obecność w produkcie niewielkiej ilości relatywnie wysokocząsteczkowej frakcji polisacharydowej. W odróŝnieniu od pozostałych zastosowanych wielkocząsteczkowych źródeł węgla, homogenizat skrobiowy wykazuje trimodalny rozkład mas cząsteczkowych. Najbogatszą frakcję stanowi niezdegradowana amylopektyna, ponadto występują frakcje odpowiadające zdegradowa.ym cząsteczkom skrobiowym. Charakterystyczny jest fakt, iŝ pik amylopektyny homogenizatu występuje przy nieco niŝszym czasie retencji (16,4 min) niŝ pik amylopektyny naturalnej skrobi ziemniaczanej (16,7 min). PowyŜsza obserwacja wskazuje, iŝ proces wysokociśnieniowej homogenizacji spowodował nie tylko degradację makrocząsteczek skrobiowych, ale równieŝ pewną zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie homogenizat-woda co w konsekwencji przesunęło pik GPC w kierunku niŝszych czasów retencji. Rys. 1. Fig. 1. Rozkład mas cząsteczkowych określony metodą filtracji Ŝelowej (GPC), 1 - skrobia, 2- homogenizat skrobi, 3 - maltodekstryna N Molecular mass distribution determined by the gel permeation chromatography method (GPC), 1 - starch, 2 - homogenised starch, 3 - maltodextrin N Zastąpienie glukozy w poŝywce MRS poliglukanami skrobiowymi o róŝnej masie cząsteczkowej czyli: maltodesktryną, naturalną skrobią ziemniaczaną oraz skrobią modyfikowaną fizycznie wpłynęło na przebieg hodowli badanych bakterii z rodzaju Lactobacillus (tab. 1). W trakcie fazy wzrostu wykładniczego składniki odŝywcze w komercyjnych podłoŝach hodowlanych występują zwykle w nadmiarze dlatego szybkość wzrostu bakterii jest największa, a zarazem maksymalna i charakterystyczna dla poszczególnych gatunków. Zdolność bakterii do wzrostu zaleŝy jednak nie tylko od indywidualnych właściwości bakterii ale w duŝej mierze jest uzaleŝniona od stosowanego substratu [VULEVIC i in. 2004]. Jak wynika z danych zamieszczonych w tabeli 1, w przypadku hodowli prowadzonych na podłoŝu z glukozą maksymalna liczebność komórek wykazywała niewielkie zróŝnicowanie gatunkowe i wynosiła dla L. acidophilus 9, jtk ml -1, dla L. casei 9, jtk ml -1 oraz dla L. plantarum i L. ramnosus 2, jtk ml -1. Maltodekstryna, która charakteryzowała się stopniem polimeryzacji DP 20 była równieŝ źródłem węgla bardzo efektywnie wykorzystywanym przez bakterie z rodzaju Lactobacillus. UmoŜliwiła ona wszystkim

5 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE badanym bakteriom intensywny wzrost, jednak maksymalna gęstość ich populacji była się nieco niŝsza od otrzymywanej w podłoŝu z glukozą. Wzrost bakterii z rodzaju Lactobacillus w pozostałych podłoŝach był słabszy niŝ w kontroli glukozowej, co moŝna tłumaczyć bardziej skomplikowaną strukturą wchodzących w ich skład substratów. Ze względu na to, iŝ pozostałymi źródłami węgla były cukry złoŝone, badane bakterie, do ich rozkładu musiały uruchomić syntezę specyficznych enzymów. To z kolei powodowało stopniową zmianę ich metabolizmu. Zmiana ta wpłynęła na obniŝenie liczebności komórek oraz na wydłuŝenie niektórych faz wzrostu - głównie fazy wykładniczego wzrostu (tab. 1). W przypadku skrobi ziemniaczanej czas trwania fazy wykładniczej wydłuŝył się do 13 godz. dla Lactobacillus acidophilus (tab. 1), natomiast dla pozostałych bakterii aŝ do 24 godz. (tab. 1). Maksymalna liczebność komórek wszystkich badanych lactobacillusów w podłoŝu ze skrobią ziemniaczaną była niŝsza niŝ w podłoŝu z glukozą i wynosiła średnio 8, jtk ml -1 (tab. 1). Wyjątek stanowiły bakterie Lactobacillus plantarum, których populacja w podłoŝu ze skrobią ziemniaczaną osiągnęła liczebność porównywalną do klasycznego podłoŝa MRS (tab. 1). Gęstość komórek w podłoŝu z homogenizatem była natomiast zbliŝona do wartości uzyskiwanych dla skrobi natywnej, co moŝe być spowodowane zbliŝoną masą cząsteczkową obu związków. Na uwagę zasługuje równieŝ fakt, Ŝe czas trwania fazy wykładniczej wszystkich badanych probiotycznych szczepów Lactobacillus na podłoŝach z homogenizatem był dwu- trzykrotnie krótszy niŝ na podłoŝach ze skrobią natywną. Tabela 1; Table 1 Parametry wzrostu bakterii z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłoŝu MRS z glukozą oraz w zmodyfikowanych podłoŝach MRS Wyszczególnienie; Specification Log maksymalnej liczebności komórek (jtk ml -1 ) The log of maximum cells viability (cfu ml -1 ) Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.) Time of exponential phase - t (h) Liczba podziałów (pokoleń) - n Number of generations - n Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.) Maximum specific growth rate - v (h) Czas generacji - g (godz.) Generation time - g (h) Log maksymalnej liczebności komórek (jtk ml -1 ) The log of maximum cells viability (cfu ml -1 ) Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.) Time of exponential phase - t (h) Parameters of Lactobacillus growth in classic as well as modified MRS broth Glukoza Glucose Maltodekstryna Maltodextrin Skrobia Potato starch Homogenizat skrobi Homogenised starch Lactobacillus acidophilus 8,99 8,6 7,97 7, Lactobacillus casei 9,9 4,8 3,7 2,7 1,0 0,6 0,3 0,3 1,0 1,7 3,3 3,3 8,82 8,58 7,74 7, Liczba podziałów (pokoleń) - n 5,14 6,5 4,5 4,9

6 410 J. Le Thanh i inni Number of generations - n Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.) Maximum specific growth rate - v (h) Czas generacji - g (godz.) Generation time - g (h) Log maksymalnej liczebności komórek (jtk ml -1 ) The log of maximum cells viability (cfu ml -1 ) Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.) Time of exponential phase - t (h) Liczba podziałów (pokoleń) - n Number of generations - n Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.) Maximum specific growth rate - v (h) Czas generacji - g (godz.) Generation time - g (h) Log maksymalnej liczebności komórek (jtk ml -1 ) The log of maximum cells viability (cfu ml -1 ) Czas trwania fazy wykładniczej - t (godz.) Time of exponential phase - t (h) Liczba podziałów (pokoleń) - n Number of generations - n Maksymalna właściwa szybkość wzrostu - v (godz.) Maximum specific growth rate (h) Czas generacji - g (godz.) Generation time - g (h) Lactobacillus plantarum Lactobacillus ramnosus 0,5 0,5 0,2 0,6 2,0 2,0 5 1,7 9,15 8,99 9,16 8, ,5 4,8 9,4 6,4 0,8 0,6 0,4 0,8 1,2 1,6 2,5 1,25 9,13 8,83 7,95 7, ,8 6,9 4,3 3,4 0,6 1,4 0,2 0,4 1,6 0,7 5,6 2,5 Wytwarzanie krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) jest typową cechą fizjologiczną bakterii z rodzaju Lactobacillus i jedną z przyczyn korzystnego oddziaływania tych mikroorganizmów na organizm człowieka. W związku z tym, Ŝe krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe wytwarzane podczas fermentacji wywierają pozytywny wpływ na organizm ludzki podwyŝszone stęŝenia tych kwasów w jelicie grubym są uznawane za poŝądane. Wszystkie kwasy tłuszczowe wytwarzane przez Lactobacillus obniŝają ph jelit powodując tym samym zmniejszenie ilości niekorzystnej dla nas mikroflory. SCFA mogą takŝe stymulować rozwój nabłonka jelitowego (kwas masłowy), a nawet wpływać korzystnie na rozwój hepatocytów (głównie kwas propionowy) [LIBUDZISZ 2006]. Jak wykazały przeprowadzone badania ilość kwasów wydzielanych przez cztery probiotyczne szczepy bakterii Lactobacillus zaleŝała od rodzaju źródła węgla obecnego w podłoŝu. Na rysunku 2 przedstawiono profil zmian stęŝenia najwaŝniejszych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w hodowli bakterii Lactobacillus acidophilus na podłoŝu zawierającym glukozę jako źródło węgla. Rysunek ten obrazuje sposób w jaki bakterie Lactobacillus wytwarzały krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe w sytuacji gdy zapewniono im optymalne warunki wzrostu. Fermentacja glukozy, będącej preferowanym źródłem węgla przez bakterie, dała stosunkowo wysoką produkcję kwasu mlekowego. Jego stęŝenie w 50 godz. hodowli oscylowało w granicach 25 g dm -3. Drugim, pod względem ilościowym, metabolitem wydzielanym podczas fermentacji do podłoŝa był kwas octowy. Jego ilość rosła stopniowo do wartości 5 g dm -3. W mniejszych ilościach wytwarzane były inne SCFA. Maksymalne stęŝenie kwasu propionowego w podłoŝu hodowlanym

7 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE zarejestrowano w 50 godz. hodowli. Wynosiło ono 1,7 g dm -3. Kwas masłowy był natomiast wydzielany w śladowych ilościach. Produkcja wszystkich SCFA zaczynała się około 6 godziny hodowli, czyli mniej więcej w połowie fazy wzrostu wykładniczego. Analizując dane zamieszczone na rysunku 2 stwierdzono równieŝ, Ŝe przez cały czas trwania hodowli bakterie Lactobacillus nie utylizowały krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. - - kwas mlekowy; lactic acid - - kwas propionowy; propionic acid - - kwas octowy; acetic acid - - kwas masłowy; butyric acid Rys. 2. Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŝywce zawierającej glukozę jako źródło węgla Fig. 2. The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in the medium with glucose as a carbon source Zastosowanie do hodowli L. acidophillus podłoŝa z maltodekstryną zamiast glukozy obniŝyło produkcję wszystkich SCFA (rys. 3). Maksymalne uzyskane stęŝenie kwasu mlekowego wynosiło 8,44 g dm -3, kwasu octowego 3,79 g dm -3, natomiast kwasu propionowego 1,03 g dm -3. Jedynie kwas masłowy podczas hodowli na podłoŝu z maltodekstryną był produkowany w porównywalnych ilościach jak w trakcie hodowli kontrolnych (podłoŝa z glukozą). W podłoŝu MRS zmodyfikowanym maltodekstryną L. acidophillus potrzebowały jednocześnie znacznie więcej czasu na wykorzystanie substratu stąd teŝ produkcja SCFA zaczynała się znacznie później w porównaniu z hodowlami kontrolnymi.

8 412 J. Le Thanh i inni - - kwas mlekowy; lactic acid - - kwas propionowy; propionic acid Rys. 3. Fig kwas octowy; acetic acid - - kwas masłowy; butyric acid Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŝywce zawierającej maltodekstrynę jako źródło węgla The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in the medium with maltodekstrin as a carbon source Zastosowanie naturalnej skrobi ziemniaczanej jako źródła węgla spowodowało zmianę proporcji ilościowych wytwarzanych krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w porównaniu z kontrolą glukozową (rys. 4). W trakcie hodowli na podłoŝu ze skrobią ziemniaczaną L. acidophillus produkowały najwięcej kwasu octowego. Kolejnym pod względem ilości wytwarzanym SCFA był kwas mlekowy, a następnie kolejno kwas propionowy i masłowy. Poziom produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w podłoŝu zawierającym homogenizat róŝnił się wyraźnie od stwierdzonego w pozostałych typach podłoŝy (rys. 5). Największe zmiany nastąpiły w produkcji kwasu mlekowego, mniejsze natomiast w produkcji kwasu octowego oraz propionowego. Bakterie L. acidophilus hodowane w podłoŝu z homogenizatem, podobnie jak w podłoŝu ze skrobią, produkowały, więcej kwasu octowego niŝ kwasu mlekowego. Podobne wyniki uzyskała WRONKOWSKA i in. [2006], w badaniach 24-godzinnej fermentacji róŝnych substratów skrobiowych z udziałem wybranych szczepów Bifidobacterium, gdzie w przypadku próby kontrolnej, czyli podłoŝa z glukozą głównym metabolitem fermentacji był kwas mlekowy, a fermentacja pozostałych substratów (tj. skrobi natywnych i skrobi modyfikowanych, opornych na enzymy amylolityczne) dała wysokie stęŝenia kwasu octowego [WRONKOWSKA i in. 2006].

9 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE kwas mlekowy; lactic acid - - kwas propionowy; propionic acid - - kwas octowy; acetic acid - - kwas masłowy; butyric acid Rys. 4. Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŝywce zawierającej skrobię jako źródło węgla Fig. 4. The short chain fatty acids concentration during Lactobacillus acidophilus growth in the medium with potato starch as a carbon source - - kwas mlekowy; lactic acid - - kwas propionowy; propionic acid Rys kwas octowy; acetic acid - - kwas masłowy; butyric acid Zawartość krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych podczas hodowli Lactobacillus acidophilus w poŝywce zawierającej homogenizat skrobi jako źródło węgla Fig. 5. The short chain fatty acids during Lactobacillus acidophilus growth in the medium with homogenized starch as a carbon source W badaniach VULEVIC A i in. [2004] zaobserwowano wyŝszą produkcję kwasu octowego niŝ mlekowego przy zastosowaniu jako źródła węgla zamiast glukozy trans-galaktooligosacharydów, frukto-oligosacharydów, sacharozy, czy teŝ gumy guar [VULEVIC i in. 2004]. Kwas octowy, który okazał się być głównym metabolitem fermentacji natywnej skrobi ziemniaczanej oraz skrobi modyfikowanej fizycznie prowadzonej przez probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus jest związkiem wykazującym silną antagonistyczną aktywność względem wielu bakterii, droŝdŝy i pleśni. Ponadto ustalono, Ŝe jest absorbowany z jelita grubego i stanowi zapasowe źródło energii dla tkanek [WRONKOWSKA i in. 2006].

10 414 J. Le Thanh i inni Proces produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych przez pozostałe badane szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus miał podobny przebieg jak w przypadku L. acidophilus. Ponadto charakter zmian wywołanych obecnością róŝnych źródeł węgla w podłoŝu był analogiczny (tab. 2). Tabela 2; Table 2 Ilości krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych wytworzonych przez bakterie z rodzaju Lactobacillus w klasycznym podłoŝu MRS z glukozą oraz podłoŝach zmodyfikowanych po 50 godz. fermentacji Production of short chain fatty acids by Lactobacillus in classic as well as modified MRS broth after 50h fermentation Źródło węgla w podłoŝu Carbon source L. acidophilus StęŜenie kwasu w podłoŝu po 50 godz. fermentacji Concentration of acids in broth after 50 h fermentation (g dm -3 ) mlekowy lactic octowy acetic propionowy propionic masłowy butyric Glukoza; Glucose 24,71 5,12 1,66 0,02 Maltodekstryna; Maltodextrin 7,98 3,69 1,00 0,09 Skrobia; Starch 1,46 3,33 1,08 0,09 Homogenizat skrobi; Homogenised starch 1,19 3,32 0,91 0,03 L. casei Glukoza; Glucose 26,47 5,15 1,69 - Maltodekstryna; Maltodextrin 8,54 2,15 1,02 0,06 Skrobia; Starch 1,67 2,65 1,02 0,12 Homogenizat skrobi; Homogenised starch 1,05 2,69 0,85 0,05 L. plantarum Glukoza; Glucose 14,89 2,56 0,73 0,05 Maltodekstryna; Maltodextrin 19,40 2,80 0,81 0,06 Skrobia; Starch 10,67 4,41 1,33 0,06 Homogenizat skrobi; Homogenised starch 0,59 4,03 1,50 0,01 L. ramnosus Glukoza; Glucose 15,08 1,97 0,99 0,05 Maltodekstryna; Maltodextrin 9,80 2,55 0,86 0,06 Skrobia; Starch 0,87 2,15 0,59 0,03 Homogenizat skrobi; Homogenised starch 1,07 3,60 1,07 0,05 Podsumowanie Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku skrobiowego wykazuje obniŝoną do 50% strawność in vitro. Zastosowany sposób obróbki powoduje częściową degradację makrocząsteczek tego polisacharydu oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimer-woda. Zastąpienie glukozy w podłoŝu MRS skrobią modyfikowaną fizycznie zmienia przebieg hodowli czterech badanych probiotycznych szczepów bakterii Lactobacillus. UŜycie jako źródła węgla maltodekstryny, nie wpływa w wyraźny sposób na intensywność wzrostu Ŝadnego z badanych szczepów. Podczas hodowli w podłoŝu ze skrobią ziemniaczaną natywną

11 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE następuje natomiast obniŝenie liczebności komórek oraz wydłuŝenie fazy wzrostu wykładniczego w stosunku do pozostałych testowanych w pracy źródeł węgla. W przypadku zastosowania podłoŝa ze skrobią modyfikowaną fizycznie zaobserwowano niŝszą liczebność komórek wszystkich Lactobacillus, w porównaniu do uzyskiwanej w podłoŝu z formą natywną skrobi. Maksymalna szybkość wzrostu komórek była jednak porównywalna w obu podłoŝach. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla, takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji wyraźnie obniŝyło produkcję kwasu mlekowego oraz zmieniło proporcje ilościowe pomiędzy pozostałymi SCFA wytwarzanymi przez Lactobacillus. W podłoŝach ze skrobią modyfikowaną fizycznie kwas octowy był głównym produktem fermentacji. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji powodowała podobne zmiany metabolizmu bakterii probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galakto-oligosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej. Literatura ASP, N-G Dietary carbohydrates: classification by chemistry and physiology. Food Chem. 57(1): BROUNS F., KETTLITZ B., ARRIGONI E Resistant starch and the butyrate revolution. Trends in Food Sci. and Techn. 13(8): FOOKS L.J., FULLER R., GIBSON G.R Prebiotics, probiotics and human gut microbiology. Intern. Dairy J. 9: GIBSON G.R Prebiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 18(2): GIDLEY M.J., COOKE D., DARKE A.H., HOFFMANN R.A., RUSSELL A.L., GREENWELL P Molecular order and structure in enzyme-resistant retrograded starch. Carbohydrate Polymers 28(1): GRAJEK W., JANKOWSKI T., LEWANDOWICZ G Sposób otrzymywania produktu skrobiowego o podwyŝszonej odporności na enzymy amylolityczne. Zgłoszenie patentowe RP nr P z dnia 8 czerwca LE THANH J., LEWANDOWICZ G Dietetyczne produkty skrobiowe. Przem. SpoŜ. 61(8): 54-58; 88. LESZCZYŃSKI W Resistant starch - classification, structure, production. Polish J. of Food and Nutrition Sci. 13/54(1): LEWANDOWICZ G. SORAL-ŚMIETANA M Starch modification by iterated syneresis. Carbohydrate Polymers 56(4): LIBUDZISZ Z Mikroflora przewodu pokarmowego człowieka i jej wpływ na organizm, w: Mikroorganizmy w Ŝywności i Ŝywieniu. Wydawn. AR w Poznaniu: VULEVIC J., RASTALL R.A., GIBSON G.R Developing a quantitative approach for determining the in vitro prebiotic potential of dietary oligosaccharides. FEMS Microbiology Letters 236: SORAL-ŚMIETANA M., WRONKOWSKA M., BIEDRZYCKA E., BIELECKA M., OCICKA K Native and physically-modified starches-utilization of resistant starch by Bifidobacteria (In Vitro). Polish J. of Food and Nutrition Sci. 14(55): WRONKOWSKA M., SORAL-ŚMIETANA M., KRUPA U., BIEDRZYCKA E In vitro fermentation of new modified starch preparations - changes of microstructure and bac-

12 416 J. Le Thanh i inni terial end-products. Enzyme and Microbial Techn. 40: Słowa kluczowe: skrobia, prebiotyk, Lactobacillus, krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe Streszczenie śywność funkcjonalna czyli produkty spoŝywcze wykazujące pozytywny (ponad efekt odŝywczy) wpływ na organizm człowieka budzą coraz większe zainteresowanie, zarówno konsumentów, jak i technologów Ŝywności. Szczególną rolę odgrywają wchodzące często w jej skład substancje o charakterze prebiotycznym, tj. niestrawne węglowodany, które selektywnie stymulują wzrost i/lub aktywność jednego lub kilku szczepów bakterii probiotycznych (Bifidobacterium, Lactobacillus) obecnych w jelicie grubym. Przykładem produktów będących źródłem substancji prebiotycznych są produkty skrobiowe zawierające tzw. skrobię oporną. Wcześniejsze prace wykonane w Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu wykazały, Ŝe skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleiku wykazuje strawność in vitro rzędu 50%. Celem pracy była ocena prebiotycznych właściwości skrobi modyfikowanej fizycznie otrzymanej na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji kleików skrobiowych poprzez określenie zdolności mikroorganizmów z rodzaju Lactobacillus do wykorzystywania jej jako źródła węgla. Cztery probiotyczne szczepy bakterii z rodzaju Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. ramnosus) hodowano w podłoŝach MRS zawierających jako źródło węgla zamiennie: glukozę, maltodekstrynę niskoscukrzoną, skrobię ziemniaczaną natywną, oraz skrobię modyfikowaną fizycznie na drodze homogenizacji wysokociśnieniowej. Zakres badań obejmował określanie intensywności wzrostu badanych mikroorganizmów oraz poziomu produkcji krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych metodą HPLC. Oznaczono ponadto rozkład mas cząsteczkowych wszystkich badanych preparatów skrobiowych. Stwierdzono, Ŝe wysokociśnieniowa homogenizacja kleiku powoduje częściową degradację makrocząsteczek skrobi oraz zmianę konformacyjną frakcji amylopektyny poprawiającą termodynamiczną zgodność polimer-rozpuszczalnik w układzie polimerwoda. Wprowadzenie skrobi modyfikowanej fizycznie do podłoŝa MRS zamiast glukozy powodowało zmianę przebiegu hodowli wszystkich badanych szczepów Lactobacillus. UŜycie jako źródła węgla maltodekstryny zamiast glukozy nie wpłynęło zarówno na maksymalną szybkość wzrostu jak i na liczebność komórek Lactobacillus. Hodowlana w podłoŝu ze skrobią ziemniaczaną natywną charakteryzowała się niŝszą intensywnością wzrostu badanych bakterii oraz najdłuŝszym czasem trwania fazy wzrostu wykładniczego w odniesieniu do pozostałych źródeł węgla. W przypadku zastosowania podłoŝa ze skrobią modyfikowaną fizycznie jako źródłem węgla, maksymalna liczebność komórek Lactobacillus była niŝsza od uzyskiwanej w podłoŝach z formą natywną skrobi, natomiast szybkość wzrostu komórek była porównywalna dla obu substratów. Zastosowanie wysokocząsteczkowych źródeł węgla, takich jak naturalna skrobia ziemniaczana oraz skrobia modyfikowana na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji powodowało intensywniejszą produkcję kwasu octowego niŝ mlekowego. Skrobia modyfikowana fizycznie na drodze wysokociśnieniowej homogenizacji wywołuje podobne zmiany metabolizmu bakterii probiotycznych jak znane substancje o charakterze prebiotycznym, tj. trans-galaktooligosacharydy, frukto-oligosacharydy oraz preparaty skrobi opornej.

13 SKROBIA MODYFIKOWANA FIZYCZNIE PHYSICALLY MODIFIED STARCH AS A POTENTIAL PREBIOTIC Joanna Le Thanh, Aneta Burchardt, Joanna Menclewicz, Anna Sip, GraŜyna Lewandowicz Department of Biotechnology and Food Microbiology, University of Life Sciences, Poznań Key words: starch, prebiotic, Lactobacillus, short chain fatty acids Summary The identification and development of food ingredients that beneficially affect human organism have attracted much interest recently. Prebiotics i.e. nondigestible carbohydrates that selectively stimulate the growth and/or activity of one, or a limited number of probiotic bacteria (e.g. Bifidobacterium, Lactobacillus) present in the colon seem to be especially important. Several starch products, particularly the so called resistant starch, are recommended earlier as the health beneficial food ingredients. The earlier researches performed in the Department of Biotechnology and Food Microbiology of Poznań University of Life Sciences demonstrated that the process of high-pressure homogenization of starch pastes led to obtain a product characterised by the in vitro digestibility of about 50%. The aim of the work was to evaluate the prebiotic potential of this type of physically modified starch. In order to estimate the prebiotic potential of physically modified starch, the growth of four probiotic species of Lactobacillus (L. acidophilus, L. casei, L. plantarum, & L. ramnosus) was investigated. Maltodextrin (DE = 4.9), native potato starch, as well as the homogenised starch were applied as the alternative (instead of glucose) carbon source in the MRS fermentation broth. Moreover, the short chain fatty acids (SCFA) production was determined. Molecular mass distribution of all starch preparations was also analysed. It was found that a high pressure homogenisation of starch pastes resulted in partial degradation of macromolecules of this polysaccharide, as well as in conformational change which improved the thermodynamic compatibility in polymer-water system. The application of physically modified starch as a carbon source in the modified MRS broth affected the growth of all Lactobacilli strains not only in comparison to glucose, but also to maltodextrin and native starch. The application of maltodextrin as a carbon source resulted neither in the decrease of the maximal growth rate, nor the maximum cell vialibility. In the case of the Lactobacilus culture on the MRS broth containing native potato starch, the lowering of maximum cell population, the longest duration of exponential growth phase in comparison to other carbon source as well as the decrease of maximal growth rate were observed. If modified starch is used as an alternative carbon source, the decrease of maximum cell population in comparison to native starch is observed, but the maximal growth rate was the same. The application of high molecular weight carbon sources i.e. native potato starch and starch modified physically by a high pressure homogenisation causes more effective production of acetic rather than lactic acid. Physically modified starch applied as a carbon source in the MRS broth caused similar changes in the metabolism of Lactobacillus probiotic strains as popular prebiotic substances i.e. trans-galacto-oligosaccharides, fructo- oligosaccharides and resistant starch preparations.

14 418 J. Le Thanh i inni Mgr Joanna Le Thanh Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii śywności Uniwersytet Przyrodniczy ul. Wojska Polskiego POZNAŃ maithanh@up,poznan.pl