aktualności biomérieux Zakażenia wyzwanie dla mikrobiologa i epidemiologa czerwiec 2008 diagnostyka źródłem dobrego zdrowia

Transkrypt

1 45 czerwiec 2008 aktualności biomérieux Zakażenia wyzwanie dla mikrobiologa i epidemiologa diagnostyka źródłem dobrego zdrowia

2 Spis treści od wydawcy 2 od wydawcy 3 Epidemiologia molekularna możliwosci i ograniczenia 10 Enzymy ESBL charakterystyka i metody wykrywania 14 Ocena podłoża ESBL 17 Vitek 2 compact 15 informacja o produkcie 18 Przydatność oznaczania prokalcytoniny w różnych sytuacjach klinicznych ty Europejski Zjazd Mikrobiologii Klinicznej i Chorób Zakaźnych 26 Analizator do badań moczu UF 1000i 27 Biblioteka techniczna 31 wydawca: biomérieux Polska Sp. z o.o. Osoba odpowiedzialna: Elżbieta Wójcik Osoby biorace udział w przygotowaniu nr 45: Piotr Czajka Ireneusz Popławski Barbara Krawczyńska Piotr Szczegłow Katarzyna Tajchert Czesław Mitek Adres redakcji i wydawcy: biomérieux Polska Warszawa, ul. Żeromskiego 17 tel. (22) fax (22) opracowanie graficzne i druk: Agencja Wydawnicza SOWA Szanowni Państwo, Firma biomérieux proponuje najbardziej kompletną na rynku ofertę wspomagającą placówki służby zdrowia w zwalczaniu zakażeń. Szpitale i przychodnie do ich zwalczania wprowadzają programy profilaktyczne obejmujące wykrywanie nosicieli, zarządzanie w przypadku epidemii oraz nadzór epidemiologiczny. Testy diagnostyczne mogą odegrać zasadniczą rolę w opanowaniu zakażeń pozwalając zmniejszyć ich częstotliwość i związane z nimi koszty. Poza grupą produktów firma biomérieux odgrywa wiodącą rolę w walce z zakażeniami poprzez podpisywanie umów i organizowanie spotkań naukowych na najwyższym szczeblu co sprzyja wymianie informacji i wiedzy na tak ważny dla zdrowia publicznego temat. W uznaniu roli i zaangażowania firmy w zwalczaniu zakażeń szpitalnych, światowej sławy kancelaria doradztwa strategicznego Frost & Sullivan przyznała firmie biomérieux europejską nagrodę roku 2007 (2007 European Technology Leadership Award for Healthcare Asssociated Infection Control). Temat zakażeń będziemy kontynuowali w następnych numerach Aktualności. W czerwcu 2008 biomérieux podpisała umowę o zakupie spółki AB BIODISK, szwedzkiej firmy zajmującej się diagnostyką in vitro. Jest ona znana na świecie jako firma działająca w dziedzinie oporności na leki przeciw drobnoustrojowe, w szczególności dotyczącej badania lekowrażliwości trudnych w hodowli i rzadko spotykanych organizmów. Wiodący produkt tej firmy Etest R jest wykorzystywany do określenia MIC antybiotyków, leków przeciwgrzybiczych i leków przeciwprątkowych. Dodanie do oferty biomérieux Etestu będzie doskonałym jej uzupełnieniem. Firma biomérieux będzie sprzedawała produkty firmy AB BIODISK pod marką biomérieux. O tej zmianie w ofercie firmy biomérieux Polska będziemy Państwa informowali w drugiej połowie roku Firma biomérieux Polska ma przyjemność zaprosić Państwa do odwiedzenia naszego stoiska oraz do wzięcia udziału w sesji naukowej w czasie Zjazdu Polskiego Towarzystwa Mikrobiologicznego w Szczecinie w dniach 4 7 września Serdecznie zapraszamy i do zobaczenia w Szczecinie Dr Elżbieta Wójcik Dyrektor Generalny biomérieux Polska

3 biologia molekularna Epidemiologia molekularna możliwości i ograniczenia dr Beata Krawczyk, mgr inż. Karolina Stojowska Katedra Mikrobiologii, Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska Na całym świecie laboratoria mikrobiologiczne do wykrywania, identyfikacji i typowania drobnoustrojów coraz częściej korzystają z osiągnięć diagnostyki molekularnej. Najbardziej popularne są metody oparte na analizie kwasów nukleinowych (DNA, RNA). Podstawowe narzędzia molekularne, takie jak enzymy restrykcyjne, ligazy, polimerazy DNA pozwalają pośrednio (np. analiza restrykcyjna, amplifikacja DNA in vitro przy zastosowaniu łańcuchowej reakcji polimerazy) lub bezpośrednio (np. sekwencjonowanie) badać zmienność genetyczną organizmów. To właśnie analiza zmienności genetycznej szczepów bakteryjnych pozwala określić charakter epidemii, odróżnić sytuację epidemiczną od endemicznej, dochodzić źródła zakażenia i jego drogi transmisji. Istnieje wiele różnych technik genetycznego typowania drobnoustrojów, które znalazły zastosowanie w badaniach epidemiologicznych [tabela 1]. Różnią się one celem molekularnym (gen/geny, genom, plazmidowe DNA), złożonością procedury (ilością etapów) i sposobem detekcji. Ogromnym przełomem w biologii molekularnej było odkrycie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR - ang. Polymerase Chain Reaction). Technika ta w ciągu kilku lat stała się jedną z podstawowych technik zarówno badawczych jak i diagnostycznych. Wprowadzenie do diagnostyki mikrobiologicznej techniki PCR znacznie usprawniło proces różnicowania znaczących klinicznie szczepów bakteryjnych, uprościło procedury badawcze umożliwiając ich automatyzację i doprowadziło do Tabela I. Molekularne metody typowania drobnoustrojów wykorzystywane w epidemiologii molekularnej Typowanie plazmidowe REAP REA PFGE rrn RFLP Rep PCR Rybotypowanie MLST RAPD LMPCR (np. AFLP) Czyste kultury bakteryjne Izolacja plazmowego DNA Zatopienie komórek w bloczku agarozowym Izolacja genomowego DNA Rozdział elektroforetyczny nienaruszonego plazmidowego DNA (żel agarozowy) Trawienie pazmidowego DNA enzymem restrykcyjnym Liza komórek degradacja białek komórkowych Trawienie restrykcyjne enzymem rzadko tnącym Umieszczenie bloczka w żelu agarozowym Trawienie genomowego DNA enzymem restrykcyjnym często tnącym Rozdział elektroforetyczny fragmentów restrykcyjnych w żelu agarozowym Amplifikacja sekwencji repetytywnych Amplifikacja 16S r RNA Amplifikacja genów housekeeping Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie Rekacja PCR z zastosowaniem przypadkowych starterów obniżona temperatura przyłączania startera Trawienie genomowego DNA dwoma enzymi restrykcyjnymi (rzadko i często tnacymi) Ligacja adaptorów do fragmentów restrykcyjnych Rekacja PCR z zastosowaniem dwóch starterów zawierających od 1 do 3 selektywne nukleotydy 3 Rozdział elektroforetyczny fragmentów restrykcyjnych plazmidowego DNA w żelu agarozowym Rozdział fragmentów restrykcyjnych w pulsacyjnym polu elektrycznym Hybryzydacja ze znakowaną sondą komplementarną do 16S rdna Rozdział elektroforetyczny produktów PCR w żelu agarozowym Rozdział elektroforetyczny produktów PCR w żelu poliakryloamidowym Rozdział elektroforetyczny produktów PCR w żelu poliakryloamidowym Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Detekcja wybarwianie bromkiem etydyny Wizualizacja w świetle UV Wizualizacja w świetle UV Wizualizacja w świetle UV Wizualizacja Wizualizacja w świetle UV Wizualizacja w świetle UV Wizualizacja w świetle UV

4 4 powstania szeregu komercyjnie dostępnych testów. Wiele laboratoriów i ośrodków referencyjnych wykorzystuje techniki oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy DNA (PCR) w diagnostyce bakterii, wirusów, grzybów i parazytów. Testy wykorzystujące amplifikację PCR są opisane dla prawie każdego mikroorganizmu. Dlatego, obecnie techniki typowania molekularnego drobnoustrojów można podzielić na dwie grupy: oparte o amplifikację DNA techniką PCR (np. RAPD - ang. Random Amplified Polymorphic DNA, rep-pcr (wykorzystanie sekwencji repetytywnych), MLST - ang. MultiLocus Sequence Typing, LM-PCR ang. Ligation 7,8% Mediated Polimerase Chain Reaction (np. AFLP) i nie oparte o amplifikację (Southern blotting, 8,2% REAP - ang. Restriction Enzyme Analysis of Plazmid), REA-PFGE - ang. Restriction Enzyme Analysis - Pulsed Field Gel Electrophoresis). 11,9% Największe zastosowanie w badaniach epidemiologicznych mają techniki fingerprinting, czyli techniki genomowego odcisku palca. Techniki te opierają się na analizie polimorficznych (zmiennych) regionów DNA. Polimorfizm (zróżnicowanie) genomowego DNA wynika z naturalnej zmienności w sekwencji nukleotydowej i nie musi prowadzić do zmian fenotypowych. Szacuje się, że ten typ zmienności występuje średnio raz na 100 nukleotydów. W obrębie genomu bakteryjnego można wyróżnić regiony zakonserwowane ewolucyjnie i regiony bardziej podatne na zmiany miejsca wysoce polimorficzne. To właśnie analiza tych regionów, pod względem długości i sekwencji nukleotydowej pozwala dokładnie różnicować drobnoustroje oraz badać ich pokrewieństwo genetyczne. W wyniku analizy fingerprinting uzyskuje się od kilku do kilkunastu fragmentów DNA o różnej długości, które rozdziela się przy pomocy technik elektroforetycznych. Otrzymuje się charakterystyczny dla badanego szczepu i wybranej metody profil prążków DNA (profil prążków przypomina swoim wyglądem kod paskowy; jest unikalny jak linie papilarne, stąd nazwa genetyczny odcisk palca ). Różnice we wzorach świadczą o odmienności genetycznej badanych organizmów. W Stanach Zjednoczonych większość laboratoriów klinicznych do wstępnego genotypowania szczepów wykorzystuje makrorestrykcyjną analizę genomowego DNA w zmiennym polu elektrycznym (REA- PFGE), często też w kombinacji z innymi metodami. Alternatywnie stosowane są metody DNA-fingerprinting (najczęściej techniki AFLP, RAPD i rep-pcr), bądź rybotypowanie oparte na hybrydyzacji. Metycylino-oporne szczepy S. aureus (MRSA) są rutynowo typowane genetycznie techniką REA-PFGE i DNA fingerprinting (RAPD i rep-pcr). Inne bakterie takie jak Staphylococcus epidermidis (MRSE), Klebsiella pneumoniae ESBL i Clostridium difficile są także typowane metodami molekularnymi. 3,7% 39,9% laboratoria kliniczne uniwersytety ośrodki referencyjne Instytuty badawcze laboratoria zdrowia publicznego inne 28,4% Ryc. 1. Udział laboratoriów w programie ESCMID [zmodyfikowane, na podstawie K. Maquelin i in. /Journal of Microbiological Methods 2007, 69: ]. 2,8% 7,3% 20,9% 13,3% 25,6% 30,1% analiza zakażeń szpitalnych nadzór epidemiologiczny analiza molekularna markerów narodowe badania referencyjne poznawcze kontrola jakości Ryc. 2. Wykorzystanie metod typowania molekularnego przez respondentów w różnych aspektach badań mikrobiologicznych [zmodyfikowane, na podstawie K. Maquelin i in. /Journal of Microbiological Methods 2007, 69: ]. W 2006 roku Europejskie Towarzystwo Mikrobiologii Klinicznej i Chorób Infekcyjnych (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - ESC- MID) przeprowadziło ankietę, która dostarczyła danych na temat wykorzystania diagnostyki molekularnej w Europie i w niektórych krajach spoza Europy. Miała ona udzielić odpowiedzi na pytania: jakie i jak często stosowane są molekularne narzędzia typowania diagnostycznego w mikrobiologii, do osiągnięcia jakiego celu są one aplikowane oraz jakiego typu laboratoria najczęściej je stosują. W programie udział wzięło 154 respondentów (82% z

5 21,5 % 1,8 % 6,4 % 0,4 % 5,3 % 5,3 % 9,6 % 31,9 % 16 % 1,8 % Ryc. 3 Metody typowania drobnoustrojów wykorzystywane przez respondentów [zmodyfikowane, na podstawie K. Maquelin i in. /Journal of Microbiological Methods 2007, 69: ]. Europy, 6% z Ameryki Północnej i południowej oraz 12% z Azji i in.), były to laboratoria kliniczne, uniwersytety medyczne, instytuty badawcze, laboratoria referencyjne, laboratoria zdrowia publicznego i in. (ryc.1). Okazało się, że 77,9% badanych aktywnie przeprowadza typowanie drobnoustrojów, w tym również typowanie molekularne (72,7%). Wykorzystywane są one do kontroli zakażeń szpitalnych, w nadzorze epidemiologicznym, w identyfikacji markerów molekularnych, w pracowniach referencyjnych, do kontroli jakości oraz w celach poznawczych (ryc.2). Najczęściej stosowane są trzy grupy metod typowania molekularnego: 1. REA-PFGE; 2. sekwencjonowanie DNA (w tym MLST); 3. techniki PCR-fingerprinting, w tym RAPD i rep-pcr. Metody fenotypowe stanowią zaledwie 2,2%. Zarówno technika PFGE, jak i metody oparte na sekwencjonowaniu są najczęściej wykorzystywane przez laboratoria referencyjne. Rybotypowanie i MLVA (ang. Multiple-Locus Variable Number Tandem Repeats Analysis) są dwa razy częściej stosowane w referencyjnych pracowniach, niż w innych badanych ośrodkach. Natomiast AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism) jest rzadziej stosowana w ośrodkach referencyjnych, wydaje się bardziej popularna w pozostałych instytucjach. Procentowy udział poszczególnych metod typowania drobnoustrojów przedstawiono na ryc. 3. Według respondentów najczęściej genotypowaniu poddawane są szczepy S.aureus (MRSA), E.coli i P. aeruginosa. Wobec tak szerokiego wachlarza metod, które oferuje diagnostyka molekularna do różnicowania mikroorganizmów, trudny jest wybór odpowiedniej techniki. Przy wyborze metody genotypowania, powinniśmy przede wszystkim uwzględnić jej potencjał różnicujący, jak i rozważyć potrzebę szukania genetycznych relacji i/lub badania struktury populacji. Jeżeli dysponujemy odpowiednimi danymi epidemiologicznymi i chcemy tylko potwierdzić związki epidemiczne szczepów, nie ma powodu, aby stosować techniki molekularne o wysokim potencjale różnicującym, czy szukać genetycznych relacji pomiędzy szczepami. Do tego typu badań można użyć szybkich i niedrogich technik, np. takich jak rep-pcr. Są one wystarczające do tego, aby zidentyfikować źródło zakażenia. W przypadku zakażeń pokarmowych np. Salmonella, typowanie genetyczne ma tylko potwierdzić lub wykluczyć związek epidemii (zakażenia) ze źródłem zakażenia (np. żywność, woda). Natomiast w sytuacji braku danych epidemiologicznych typowanie molekularne izolatów może posłużyć do identyfikacji potencjalnych zakażeń, bądź wskazania źródła zakażenia. W tym przypadku wymagane są techniki o wyższym potencjale różnicującym. Należy tu jednak pamiętać, że niektóre bakterie charakteryzują się RFLP naturalną kompetencją i łatwo RAPD nabywają DNA od innych Analiza Profili Białkowych PFGE MLVA Metody własne szczepów swojego gatunku (np. w przypadku pałeczek Ha- MLST emophilus Typowanie w oparciu o źródło węgla i n fl u e n z a e duża ich zmienność stwarza pro- AFLP blemy z ustaleniem rybotypowanie powiązań klonalnych). W takiej sytuacji, zbyt wysoki potencjał różnicujący techniki może błędnie zaklasyfikować szczepy izolowane pod koniec okresu epidemii jako nieepidemiczne, zwłaszcza, jeżeli nie ma szczepów endemicznych do porównania. Musimy również wziąć pod uwagę fakt, że w miarę upływu czasu i rozprzestrzeniania się drobnoustrojów, pomiędzy szczepami epidemicznymi wzrastają również różnice genotypowe, ale małe różnice nie zawsze oznaczają nowy typ genetyczny. Wybierając technikę MLST należy pamiętać, że wykrywa ona zmiany wolno akumulujące się w genomie, dlatego nadaje się do badań epidemiologicznych o charakterze globalnym. Dla uzyskania większego różnicowania bardziej przydatna jest technika REA- PFGE, wykazująca większy potencjał różnicujący niż MLST. W wielu przypadkach w charakterystyce genetycznej badanej puli bakterii zastosowanie wielu technik jednocześnie może okazać się najlepszym rozwiązaniem. Podczas, gdy molekularne metody typowania są szeroko stosowane w badaniach epidemiologicznych zakażeń szpitalnych, to użycie ich do badań endemii jest ograniczone. W badaniach epi- 5

6 6 demiologicznych analizie poddawane jest kilkadziesiąt izolatów w celu wykazania ich relacji klonalnych. Natomiast, dla prospektywnego nadzoru gromadzenie kolekcji szczepów i ich analiza jest procesem ciągłym, trwającym nieraz kilka lat. W takich sytuacjach zakłada się, że te same markery epidemiologiczne są używane stale podczas nadzoru i muszą być wystandaryzowane i powtarzalne (stałe) ponadczasowo. Taki system typowania zwany jest biblioteką typowania (ang. library typing). Rezultaty uzyskane z wykorzystaniem biblioteki typowania mają uniwersalne znaczenie dla epidemiologów, w przeciwieństwie do porównawczych systemów typowania, których rezultaty są stosowane tylko do rozwiązania lokalnego problemu. W typowaniu epidemiologicznie niezwiązanych izolatów musimy brać pod uwagę możliwość wystąpienia wysoce rozpowszechnionych klonów wśród populacji badanych mikroorganizmów. Predominujące klony mogą utrzymywać się w środowisku przez długi okres czasu bez znaczących mutacji i rozpowszechniać się bardzo szybko w stosunku do innych szczepów stanowiących tło badawcze. Epidemiologicznie niepowiązane szczepy mogą wykazywać identyczny genotyp, a odtworzenie łańcucha ich transmisji nie będzie możliwe. Np. metycylinooporne gronkowce MRSA uległy ewolucji ponad 40 lat temu, zaszedł wśród nich horyzontalny transfer genów i klonalne ich rozsiewanie się. Izoluje się niezwiązane epidemiologicznie gronkowce S. aureus o podobnym wzorze PFGE, z różnych regionów geograficznych, sugerując, że są to genotypy wszędobylskie. Wadą bieżących metod typowania genetycznego jest to, że na tak szerokim polu mikrobiologii do charakterystyki genetycznej mikroorganizmów wykorzystuje się niejednorodne słownictwo, eksperymentalne metodologie, różne sposoby przetwarzania danych i ich interpretacji. Dyskutuje się użyteczność dostępnych na rynku programów komputerowych przeznaczonych do analizy i interpretacji uzyskiwanych wzorów amplikonów. Programy te poddawane są przez cały czas weryfikacji i walidacji. Z tego powodu, wiele metod molekularnych, takich jak np. DNA fingerprinting czy analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych jest stosowana jako metoda z wyboru w analizach epidemicznych. W przypadku technik opartych na amplifikacji kwasów nukleinowych zagrożeniem jest również kontaminacja, inhibicja reakcji czy zbyt wysoka czułość na zmiany warunków eksperymentu. Z powodu braku standaryzacji, procedury wielu metod typowania genetycznego nie zapewniają powtarzalności wyników (wewnątrz- i zewnątrzlaboratoryjnej). Tylko niektóre z nich, uznane za złoty standard typowania genetycznego (sekwencjonowanie, PFGE) charakteryzuje optymalna typowalność, wysoki stopień powtarzalności i odtwarzalności, wysoki potencjał różnicujący. Standaryzacja molekularnych metod diagnostycznych (pełne zestawy diagnostyczne tzw. kity, bądź gotowe do użycia zestawy odczynników (tzw. ASRs ang. Analyte Specific Reagent) powinna doprowadzić do wzrostu liczby laboratoriów, które będą wykorzystywały metody diagnostyki molekularnej. Istnieje tendencja do usprawniania nowych technologii i metodologii, pojawiają się nowoczesne systemy do oczyszczania kwasów nukleinowych i zautomatyzowane platformy do amplifikacji. Wzrost automatyzacji czyni te techniki diagnostyczne bardziej atrakcyjnymi w laboratoriach klinicznych, stają się one przez to również łatwiejsze w standaryzacji i odtwarzalne w innych laboratoriach.

7 NOWOŚĆ W OFERCIE!!! Previ Color Gram Automatyczny system do barwienia metodą Grama Zrób sobie przerwę w barwieniu metodą Grama pozwól aby Previ Color Gram zrobił to za Ciebie w w w w w oszczędność czasu i odczynników wystandaryzowane barwienie w czasie 5 minut brak kontaminacji zmniejszenie odpadów przyjazny dla użytkownika i środowiska

8

9

10 mikrobiologia Enzymy ESBL charakterystyka i metody wykrywania Anna Baraniak 1, Elżbieta Stefaniuk 2,3 1 Zakład Mikrobiologii Molekularnej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 2 Zakład Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 3 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej w Warszawie 10 Gwałtowny wzrost oporności bakterii na antybiotyki stosowane w leczeniu zakażeń, w tym na antybiotyki ß-laktamowe, które w wielu przypadkach stanowią leki pierwszego rzutu, stanowi obecnie jeden z najpoważniejszych problemów współczesnej medycyny. Oporność bakterii na antybiotyki ß-laktamowe może być spowodowana kilkoma niezależnymi od siebie mechanizmami. Wyróżnia się cztery ich rodzaje: 1. mechanizmy związane z białkami wiążącymi penicylinę (PBP, ang. penicillin binding proteins), 2. zmniejszenie przepuszczalności osłon komórkowych bakterii, 3. wypompowywanie leku z komórki bakteryjnej, 4. wytwarzanie przez bakterie ß-laktamaz. Wydaje się, że najważniejszym mechanizmem oporności na antybiotyki ß-laktamowe jest wytwarzanie przez bakterie ß-laktamaz, czyli specyficznych enzymów katalizujących hydrolizę pierścienia ß-laktamowego w cząsteczce leku. Wiele spośród znanych ß-laktamaz to enzymy, które istniały jeszcze przed wprowadzeniem do lecznictwa antybiotyków. Najprawdopodobniej stanowiły one broń przed naturalnymi antybiotykami wytwarzanymi przez inne gatunki bakterii współwystępujące w danym środowisku. Ponadto wydaje się, że mogą one pełnić pewne funkcje w metabolizmie ściany komórkowej bakterii. Wraz z wprowadzeniem do lecznictwa antybiotykoterapii pojawiły się nowe ß-laktamazy (nabyte), wcześniej nieobserwowane u bakterii danego gatunku. Ich jedyną funkcją była obrona drobnoustrojów przed działaniem klinicznie stosowanych antybiotyków. Właśnie do tej grupy ß-laktamaz należą omawiane w dalszej części artykułu enzymy ESBL (ESBL, ang. extended-spectrum ß-lactamase). ß-Laktamazy ESBL należą obecnie do jednych z najgroźniejszych mechanizmów oporności bakterii na leki. Są to enzymy zdolne do hydrolizy wszystkich penicylin, cefalosporyn (oprócz cefamycyn) i aztreonamu. Hydrolizują oxyimino-ß-laktamy z szybkością większą niż 10% szybkości hydrolizy benzylopenicyliny. Aktywność większości tych enzymów hamowana jest przez specyficzne inhibitory ß-laktamowe, takie jak: kwas klawulanowy, tazobaktam i sulbaktam. W systemie funkcjonalnym ß-laktamaz, ESBL zostały zaklasyfikowane do dwóch podgrup grupy 2: podgrupy 2be (ß-laktamazy hamowane przez inhibitory ß-laktamowe) oraz podgrupy 2de (ß-laktamazy hydrolizujące kloksacylinę). Według podziału strukturalnego ß-laktamaz należą one do klasy A (podgrupa 2be) i D (podgrupa 2de). Są to enzymy o masie cząsteczkowej około 30 kda, w ich miejscu aktywnym znajduje się seryna. Enzymy ESBL występują głównie jako nabyte, kodowane plazmidowo ß-laktamazy. Geny kodujące je zlokalizowane są z reguły na plazmidach koniugacyjnych, przez co ulegają szybkiemu rozprzestrzenianiu, nawet pomiędzy szczepami należącymi do różnych gatunków. Ponadto, mogą one występować w obrębie lub w pobliżu ruchomych elementów genetycznych (transpozonów, sekwencji insercyjnych), a te również w obrębie integronów, co umożliwia ich przeniesienie pomiędzy różnymi replikonami DNA. Enzymy ESBL stanowią obecnie poważny problem kliniczny. Wytwarzane są przede wszystkim przez szpitalne szczepy pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, choć w ostatnim okresie obserwuje się je także w szczepach wywołujących zakażenia pozaszpitalne Identyfikowane są również u niektórych pałeczek niefermentujących, takich jak: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii i Alcaligenes xylosoxydans. Olbrzymie i stale narastające rozprzestrzenienie enzymów ESBL wśród ważnych klinicznie drobnoustrojów konsekwentnie zawęża możliwości terapeutyczne antybiotyków ß-laktamowych. Istnieje kilka przyczyn, które doprowadziły i stale prowadzą do wzrostu obecności pałeczek Enterobacteriaceae produkujących ESBL. Jedną z nich jest fakt, że wiele izolatów klinicznych o tym fenotypie zachowuje w badaniach in vitro wrażliwość na szereg antybiotyków należących do spektrum substratowego ESBL i pozostaje niewykrytych przez laboratoria mikrobiologiczne. Zastosowanie takich leków w terapii kończy się jednak często niepowodzeniem terapeutycznym ze względu na tzw. efekt inokulum, a ponadto może prowadzić do selekcji kolejnych mutantów ESBL o podwyższonej aktywności enzymatycznej lub zwiększonym poziomie produkcji. Fenotypy oporności szczepów produkujących enzymy ESBL mają bardzo zróżnicowany charakter i zależą od wielu czynników, min.:

11 1. różnic w preferencjach substratowych wariantów ESBL, 2. różnic w podatności na działanie inhibitorów, 3. różnic w poziomach aktywności enzymatycznej, 4. różnic w poziomach ekspresji 5. współwystępowaniu innych mechanizmów oporności (inne b-laktamazy, zmiany w przepuszczalności osłon komórkowych, wypompowywanie leku z komórki bakteryjnej). Wzrost częstości występowania ESBL związany jest także z tym, co wspomniano już wcześniej, że geny kodujące ESBL występują z reguły na plazmidach koniugacyjnych, przez co ulegają one szybkiemu rozprzestrzenieniu w populacjach bakteryjnych. Poważnym problemem w zwalczaniu szczepów o fenotypie ESBL-dodatnim jest wreszcie fakt, że często są one oporne również na antybiotyki z innych grup terapeutycznych (np. aminoglikozydy, fluorochinolony, kotrimoksazol), przez co jeszcze łatwiej mogą utrzymywać się we florze szpitalnej i wywoływać epidemie klonalne. Liczba scharakteryzowanych wariantów ESBL ciągle rośnie. Obecnie znanych jest ponad 200 różnych naturalnych wariantów ESBL, które ze względu na różnorodność strukturalną (pochodzenie ewolucyjne) zostały podzielone na 11 rodzin: TEM, SHV, CTX-M, PER, VEB, TLA, GES, BES, SFO, OXA, i BEL. Najbardziej rozpowszechnione są enzymy z trzech pierwszych omawianych rodzin ß-laktamaz. Szczególne miejsce wśród ESBL zajmuje rodzina TEM, do której należy większość zidentyfikowanych wariantów tych enzymów. Grupa ta pochodzi od tzw. ß-laktamaz o szerokim spektrum substratowym TEM-1 i TEM-2, które są najczęstszymi ß-laktamazami kodowanymi plazmidowo. W wyniku pojawienia się mutacji tzw. powiększającej kieszeń b-laktamową ß-laktamaza o szerokim spektrum substratowym staje się ß-laktamazą o rozszerzonym spektrum, czyli ESBL. Pojawianie się kolejnych mutacji powoduje powstawanie nowych wariantów tych enzymów. W Polsce, rodzina TEM jest najbardziej zróżnicowaną grupą ESBL, reprezentowaną przez 10 wariantów ß-laktamaz. Większość wariantów tych enzymów jest w mniejszym bądź większym stopniu ze sobą spokrewnionych. Jeszcze dziesięć lat temu ESBL z rodziny TEM stanowiły drugą grupę pod względem częstości występowania enzymów ESBL w naszym kraju. Jak wykazano w czasie pierwszego badania przeglądowego szczepów z rodziny Enterobacteriaceae oceniającego częstość występowania i rodzaje ESBL, większość, bo aż 60,4%, wykrytych enzymów stanowiły ß-laktamazy z rodziny SHV. Kolejne miejsce pod względem częstości występowania przypadło, jak wspomniano wcześniej, enzymom TEM (20,8%) i dopiero trzecią grupę zidentyfikowanych ESBL stanowiły enzymy CTX-M (18,8%). W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca rozwijająca się bardzo dynamicznie inna grupa enzy- 11

12 12 mów ESBL rodzina CTX-M. ESBL z tej rodziny przez wiele lat uważane były za enzymy sporadycznie występujące wśród klinicznych szczepów pałeczek Enterobacteriaceae. Gwałtowny wzrost występowania ß-laktamaz z rodziny CTX-M rozpoczął się od około 1996 r. wraz z identyfikacją nowych wariantów tych enzymów, w nowych regionach geograficznych i nowych gatunkach bakterii. Bezpośrednie pochodzenie ewolucyjne większości enzymów od niedawna jest znane i wywodzi się od gatunkowo-specyficznych ß-laktamaz niepatogennych bakterii z rodzaju Kluyvera. Jak wspominano wcześniej, przeprowadzone w Polsce (w 1998 r.) badanie przeglądowe szczepów z rodziny Enterobacteriaceae pokazało, że enzymy CTX-M stanowiły trzecią grupę ESBL pod względem częstości występowania ESBL. Kolejne badanie (w r.) zademonstrowało, że szczepy produkujące ß-laktamazy z tej rodziny izolowane są w całym kraju i występują u różnych gatunków Enterobacteriaceae. Z kolejnego przeprowadzonego w Polsce badania przeglądowego (w 2003 r.) obejmującego 13 ośrodków medycznych wynika, że enzymy CTX-M, a przede wszystkim CTX-M-3, dominują w naszych szpitalach i stanowią 82% wszystkich szczepów produkujących ESBL. Metody wykrywania ESBL Beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym są obecnie jednym z najistotniejszych klinicznie mechanizmów oporności bakterii Gram-ujemnych na leki. Drobnoustroje wytwarzające ESBL należy traktować z definicji jako szczepy oporne na wszystkie penicyliny i cefalosporyny (bez cefamycyn), z wyjątkiem ich połączeń z inhibitorami, oraz monobaktamy. W przypadku ciężkich zakażeń oraz w przypadku chorych z czynnikami ryzyka, szczepy ESBL+ należy traktować jako klinicznie oporne również na połączenia antybiotyków ß-laktamowych (penicylin i cefalosporyn) z inhibitorami ß-laktamaz. Wytwarzanie ESBL należy rutynowo oznaczać u wszystkich pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Szpitalne laboratoria mikrobiologiczne mogą dokonywać identyfikacji ESBL kilkoma różnymi metodami. I. Test dwóch krążków DDST Najbardziej rozpowszechniony jest tzw. test dwóch krążków, DDST (ang. double-disc synergy test). Za jego pomocą ESBL można oznaczać u wszystkich Enterobacteriaceae, a także u pałeczek niefermentujących. W teście tym szczep badany jest za pomocą 2 krążków z ceftazydymem 30 μg i cefotaksymem 30 μg ułożonych w pobliżu krążka zawierającego amoksycylinę z kwasem klawulanowym 20/10 μg. Odległości pomiędzy środkami krążków powinny wynosić 2-3 cm. Odkształcenia (powiększenia) stref wokół krążków z cefalosporynami od strony krążka z inhibitorem świadczą o obecności ESBL w danym szczepie. Powiększenia te mogą mieć bardzo różny kształt. Zaletą tego testu jest to, że wynik otrzymujemy stosunkowo szybko, natomiast wadą jest subiektywność odczytu i interpretacji oraz to, że niekiedy należy powtórzyć test ze zmodyfikowaną odległością - większą (4 cm) dla szczepów wrażliwych lub mniejszą (1.5 cm) dla szczepów wysoce opornych. II. Test DDST na podłożu MHA z kloksacyliną w stężeniu μg/ml Największe problemy w identyfikacji ESBL stwarzają dwie grupy szczepów: te o wysokim stopniu oporności (np. z derepresją lub nadprodukcją b-laktamaz AmpC, obniżoną przepuszczalnością osłon komórkowych dla antybiotyków b-laktamowych) i te, które wykazują wrażliwość in vitro na przynajmniej niektóre substraty ESBL, wskutek produkcji enzymu na niskim poziomie lub wytwarzania b-laktamazy o niskiej aktywności enzymatycznej. Wykrywanie ESBL w szczepach wysoce opornych w wyniku produkcji AmpC można prowadzić za pomocą testu DDST na podłożu MHA z kloksacyliną w stężeniu μg/ml. Kloksacylina hamuje aktywność enzymów AmpC,

13 wobec czego można obserwować, maskowany na podłożu MHA bez kloksacyliny, fenotyp ESBL. Omawiane szczepy można również badać za pomocą zmodyfikowanego testu DDST, w którym do podstawowego testu dwóch krążków dodaje się krążek z cefepimem 30 μg. W związku z tym, że cefepim jest bardzo słabym substratem ß-laktamaz AmpC, zmniejszenie wrażliwości lub oporność na ten antybiotyk jest najczęściej wynikiem produkcji ESBL. III. Metoda zalecana przez CLSI Kolejną metodą służącą do wykrywania fenotypu ESBL jest dwuetapowa procedura zalecana przez CLSI, możliwa do realizacji za pomocą metody dyfuzyjno-krążkowej. Procedura ta w swoim podstawowym, dwuetapowym wariancie jest długotrwała i zalecana jest wyłącznie do badania szczepów E. coli i Klebsiella spp. (oraz P. mirabilis, przy czym w przypadku tego gatunku CLSI zaleca oznaczanie ESBL jedynie u izolatów pochodzących z ciężkich zakażeń). Są to, co prawda, najistotniejsze drobnoustroje z punktu widzenia częstości wytwarzania ESBL, niemniej jednak, w określonym ośrodku mogą one stanowić mniejszość producentów ESBL. Pierwszy etap tej metody to test przeglądowy, w którym wykorzystywane są krążki z cefotaksymem, ceftazydymem, cefpodoksymem 10 μg (uznawany za najczulszy wśród oxyimino-beta-laktamów wskaźnik produkcji ESBL), ceftriaksonem 30 μg i aztreonamem 30 μg (dla P. mirabilis wyłącznie z cefotaksymem, ceftazydymem i cefpodoksymem). Wynik jest dodatni, jeśli strefa wokół dowolnego krążka jest mniejsza od określonej wartości granicznej (wartości te są zaostrzone w porównaniu z wartościami granicznymi do oznaczeń wrażliwości na leki). Drugi etap to test potwierdzający, w którym wykorzystywane są krążki z cefotaksymem, ceftazydymem i ich kombinacjami z kwasem klawulanowym. Wynik jest dodatni, jeśli strefa wokół krążków z klawulanianem jest większa bądź równa 5 mm. odpowiednio od krążków z cefotaksymem i ceftazydymem. Kolejne metody służące do identyfikacji ESBL, w których wykorzystywane się bezpośrednie połączenia oxyimino-beta-laktamów z klawulanianem to: E-test (AB Biodiosk) oraz testy automatyczne, m.in. VITEK, Phoenix czy WalkAway. IV. Metoda E-test E-testy pozwalają oznaczyć MIC cefotaksymu i ceftazydymu oraz ich kombinacje z inhibitorem. Wynik testu jest dodatni, jeśli stosunek MIC samej cefalosporyny do MIC jej kombinacji z klawulanianem wynosi co najmniej 8. Dostępne są również E-testy zawierające cefepim i cefepim z kwasem klawulanowym. V. ChromID ESBL Agar W metodzie tej do wykrywania i wstępnej identyfikacji pałeczek Enterobacteriaceae wytwarzających ESBL wykorzystano bogate podłoże agarowe wybiórczo-różnicujące zawierające mieszaninę antybiotyków, w tym cefpodoksym. Podłoże przeznaczone jest do posiewu bezpośredniego materiału klinicznego lub badanych szczepów bakteryjnych. Ocenę wytwarzania ESBL przez drobnoustroje, których wzrost uzyskano na podłożu po godz. inkubacji w war. tlenowych i temp. 37 C, przeprowadza się na podstawie charakterystycznego zabarwienia kolonii bakteryjnych. (podział rodziny Enterobacteriaceae na 3 grupy): a. Pałeczki należące do gatunku Escherichia coli przybierają zabarwienie kolonii od koloru różowego do koloru ciemnoczerwonego wina, b. Pałeczki grupy KESC - Klebsiella, Enterobacter, Serratia i Citrobacter rosną w postaci kolonii barwy od zielono-niebieskiej do brązowo-zielonej, c. Pałeczki Proteae grupa Proteus- Providencia-Morganella barwią się na kolor od jasno do ciemnobrązowego. Nowe podłoże chromogenne ChromID ESBL stanowi szybką i łatwą w interpretacji metodę przesiewową w wykrywaniu ESBL przydatną w programie monitorowania zakażeń szpitalnych. Wymienione powyżej metody wykrywania enzymów ESBL mogą być stosowane w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej wykonywanej przez laboratoria medyczne. Szczegółowa analiza enzymów ESBL może być prowadzona przez laboratoria referencyjne, które dysponują różnymi metodami biochemicznymi i biologii molekularnej, takimi jak: 1. wizualizacja ß-laktamaz i określenie ich punktu izoelektrycznego poprzez ogniskowanie izoelektryczne (IEF) 2. wykrycie aktywności ESBL w żelach IEF za pomocą tzw. testu wzrostowego (bioassay) 3. określenie przynależności ESBL do rodziny ß-laktamaz za pomocą specyficznej reakcji PCR 4. sekwencjonowanie genów kodujących ESBL. Identyfikacja wytwarzania ESBL przez Gram-ujemne pałeczki z zastosowaniem wyłącznie klasycznych metod diagnostycznych polegających na obserwacji ekspresji cech fenotypowych, wydaje się być satysfakcjonująca dla rutynowej diagnostyki, ale ze względu na różnorodność tej grupy enzymów, nie pozwala na uzyskanie w pełni wiarygodnych wyników w dociekaniach epidemiologicznych. Mimo szybkiego rozwoju metod biologii molekularnej nie należy jednak rezygnować z metod fenotypowych, z których przede wszystkim oznaczanie wrażliwości na leki ma kluczowe znaczenie dla działań leczniczych i może stanowić pierwszy sygnał do działań przeciwepidemicznych. 13

14 mikrobiologia Podłoże chromogenne ChromID ESBL firmy biomérieux w monitorowaniu zakażeń szpitalnych E. Stefaniuk 1,2, M. Herda 1, A. Kozińska 1, W. Hryniewicz 1,2 1 Zakład Epidemiologiii Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków w Warszawie 2 Centralny Ośrodek Badań Jakości w diagnostyce Mikrobiologicznej w Warszawie 14 Oporność pałeczek z rodzaju Enterobacteriaceae na leki ß-laktamowe uwarunkowana wytwarzaniem ß-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) jest jednym z ważnych problemów współczesnej epidemiologii. Mikrobiolodzy kliniczni, zespoły ds. zakażeń szpitalnych i specjaliści chorób zakaźnych oczekują szybkich metod diagnostycznych do wykrywania groźnych mechanizmów oporności na leki przydatnych w monitorowaniu zakażeń. Najskuteczniejszym sposobem kontroli zakażeń szczepami wytwarzającymi ESBL obok własciwej polityki antybiotykowej jest identyfikacja pacjentów zakażonych bądź skolonizowanych tymi szczepami, w tym monitorowanie pacjentów nowo przyjmowanych do szpitala, do oddziału (pacjenci którzy w wywiadzie podają, że w ciągu ostatnich 6 miesięcy byli hospitalizowani) oraz pacjentów przebywajacych w szpitalu w przypadku podejrzenia epidemii ESBL. Medyczne laboratoria mikrobiologiczne w chwili obecnej dysponują kilkoma metodami pozwalającymi wykryć mechanizm ESBL, różniącymi się między sobą nie tylko techniką oznaczenia ale również czasem uzyskania wyniku. W ostatnim czasie na rynku polskim pojawiło się podłoże chgromogenne ChromID ESBL firmy biomérieux przeznaczone do wykrywania i wstępnej identyfikacji izolatów bakteryjnych z rodziny Enterobacteriaceae charakteryzujących się mechanizmem ESBL. Podłoże ChromID ESBL zawiera mieszaninę antybiotyków, w tym cefpodoksym. Ocena wzrostu pałeczek Enterobacteriaceae produkującychch ESBL dokonywana jest na podstawie charakterystycznego zabarwienia kolonii bakteryjnych, umozliwiającego wstepną identyfikację izolatu do jednej z trzech grup drobnoustrojów: 1. pałeczki przynależące do gatunku Escherichia coli - zabarwienie kolonii od koloru różowego do koloru ciemnoczerwonego wina 2. pałeczki grupy KESC (Klebsiella spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Citrobacter spp.) - barwa kolonii od zielono-niebieskiej do brązowozielonej 3. pałeczki grupy Proteae (Proteus-Providencia- Morganella) kolonie koloru od jasno do ciemnobrązowego Cel badań Celem pracy była ocena przydatności podłoża chgromogennego ChromID ESBL do potwierdzenia mechanizmu ESBL w szczepach wytwarzających ten mechanizm, pochodzących z kolekcji własnej MI- KROBANK Narodowego Instytutu Leków (NIL) w Warszawie oraz do wykrycia izolatów ESBL-dodatnich w materiałach klinicznych od pacjentów hospitalizowanych. Materiał i metody 1. Potwierdzenie wytwarzania enzymów ESBL na podłożu ChromID ESBL oceniono w stosunku do 93 dobrze scharakteryzowanych fenotypowo i genotypowo szczepów Enterobacteriaceae, pochodzących z kolekcji MIKROBANK Narodowego Instytutu Leków w Warszawie. Izolaty należały do następujących garunków Escherichia coli n=20, Klebsiella pneumoniae n=15, Klebsiella oxytoca n=5, Serratia marcescens n=10, Enterobacter cloaceae n=15, Citrobacter freundii n=10, Proteus spp. n=15, Morganella morganii n=3. Pięćdziesiąt izolatów było producentami ESBL, u czterdziestu trzech nie stwierdzono we wcześniejszych badaniach obecnosci tego mechanizmu. Produkcja ESBL była zweryfikowana wcześniej metodami fenotypowymi i genotypowymi; określono również grupę, do jakiej należą enzymy wytwarzane przez poszczególne izolaty (CTX, TEM, SHV). Podczas badania wszystkie izolaty bakteryjne poddane zostały testom na wykrywanie ESBL z użyciem dwóch metod: posiew na podłoże chgromogenne ChromID ESBL i test dwóch krążków (metoda odniesienia). Posiew na podłoże chromogenne wykonywano zgodnie z zaleceniami producenta płytek, inkubacje

15 prowadzono w czasie godz. w warunkach tlenowych, w temperaturze 35±2 C. Kolonie drobnoustrojów o odpowiednim zabarwieniu wyhodowane na podłożu ChromID ESBL poddano reidentyfikacji z użyciem testów ID32E (odczyt w aparcie ATB Expression). Kontrolę właściwości odżywczych badanego podłoża chromogennego ChromID ESBL przeprowadzono z użyciem szczepów wzorcowych: Escherichia coli ATCC (kontrola ujemna, szczep ESBL-ujemny), Klebsiella pneumoniae ATCC (kontrola dodatnia, szczep ESBLdodatni), Citrobacter freundii MIKROBANK (kontrola dodatnia, szczep ESBL-dodatni, CTX M-3), Enterobacter cloacae MIKRO- BANK (kontrola dodatnia, szczep ESBL-dodatni, CTX M-3, derepresja AmpC), Klebsiella pneumoniae MIKROBANK (kontrola dodatnia, szczep ESBL-dodatni, TEM 47). 2. Trzydzieści materiałów klinicznych od pacjentów z zakażeniem dolnych dróg oddechowych n=15, zakażeniem układu moczowego n=10 i zakażeniem ran n=5 posiano bezpośrednio na podłoże ChromID ESBL i równolegle opracowywano zgodnie z procedurą rutynową NIL dla poszczególnych rodzajów materiałów. W przypadku wykrycia metodą rutynową w materiale klinicznym szczepu z rodziny Enterobacteriaceae, obecność mechanizmu ESBL sprawdzano dwiema metodami: posiew na podłoże ChromID ESBL i metodą dwóch krążków. Szczepy ESBL-dodatnie wykryte w bezpośrednim posiewie materiału klinicznego na podłoże ChromID ESBL poddawano identyfikacji gatunkowej oraz oznaczeniu testem dwóch krążków. Jako kontrolę wykorzystano ww szczepy wzorcowe z kolekcji ATCC i MIKROBANK. Wyniki 1. Bezpośrednia identyfikacja Enterobacteriaceae ESBL-dodatnich z wykorzystaniem ChromID ESBL możliwa była po godzinnej inkubacji. Wynik dodatni otrzymano dla 47 badanych izolatów. Kolonie E.coli ESBL-dodatnie przybierały barwę od różowej do ciemnej czerwieni, Klebsiella, Enterobacter, Serratia i Citrobacter od zielono-niebieskiej do ciemno-zielonej, Proteus i Morganella barwę brązową o różnym nasileniu. Odczyt zabarwienia kolonii bakteryjnych nie stwarzał problemów, a uzyskany wzrost był odpowiedni do przeprowadzenia reidentyfikacji izolatów do poziomu gatunku. Testy biochemiczne ID32E potwierdziły wczesniej znaną przynależność gatunkowa poszczególnych szczepów. 2. Metodą posiewu na podłożu chromogennym ChromID ESBL firmy biomerieux nie stwierdzono u 46 badanych izolatów (E. coli n=10, K. pneumoniae n=5, K. oxytoca n=3, Serratia marcescens n=5, Enterobacter cloaceae n=5, Citrobacter freundii n=5, Proteus spp. n=10). Rozbieżności dotyczyły trzech szczepów gatunku K. oxytoca. Wcześniej wykonane badania biochemiczno-genetyczne nie wykryły w tych szczepach obecności ESBL, wykazały natomiast nadprodukcję chromosomalnej ß-laktamazy K1 (OXY) powszechnej dla Klebsiella oxytoca. 3. Testem dwóch krążków wytwarzanie ESBL zidentyfikowano u 50 badanych szczepów, co było zgodne z wcześniejszą charakterystyką fenotypowo-genotypową tych szczepów, przeprowa- Tabela 1. Wyniki diagnostyki mikrobiologicznej materiałów klinicznych od pacjentów, prowadzonej w kierunku wykrycia i identyfikacji ESBL ESBL-dodatni ESBL-ujemny 15 Materiał kliniczny Wyhodowany czynnik Test dwóch ChromID Test dwóch ChromID (badany/dodatni) n/n etiologiczny zakażenia (n) ktążków ESBL ktążków ESBL mocz Escherichia coli n= n=10/8 Proteus vulgaris n= plwocina Klebsiella pneumoniae n= n=15/5 Escherichia coli n= wymaz z rany Eschericia coli n= n=5/3 Enterobacter cloacae n= Proteus mirabilis n=

16 dzoną w Zakładach Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej i Mikrobiologii Molekularnej NIL. 4. Test dwóch krążków wykazał brak wytwarzania ß-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym u 43 badanych izolatów z rodziny Enterobacteriaceae. 5. Rozbieżne wyniki uzyskano w przypadku trzech szczepów ESBL-ujemnych K.oxytoca z nadprodukcją cefalosporynaz z grupy OXY. W materiałach klinicznych, w których metodami rutynowymi wykryto szczepy Enterobacteriaceae ESBL-dodatnie, na podłożu ChromID ESBL uzyskano wzrost charakterystycznie zabarwionych kolonii. 6. W przypadku 16 materiałów klinicznych wyhodowany czynnik etiologiczny należał do rodziny Enterobacteriaceae i dla tych materiałów przeprowadzono dalszą diagnostykę objętą zakresem niniejszego badania. W posiewie wszystkich 16 materiałów na podłożu ChromID ESBL uzyskano wzrost charakterycznie zabarwionych kolonii. Wyniki identyfikacji gatunkowej czynników etiologicznych zakażeń oraz wyniki oznaczania produkcji ESBL przedstawiono w tabeli Cechy charakterystyczne metody wykrywania i wstępnej identyfikacji szczepów wytwarzajacych ESBL z wykorzystaniem podłoża chromogennego ChromID ESBL firmy biomerieux w porównaniu z zastosowana metodą odniesienia testem dwóch krążków przedstawia tabela 2. Wnioski 1. Podłoże chromogenne ChromID ESBL firmy bio- Merieux jest przydatnym podłożem chromogennym do wykrywania i wstępnej identyfikacji szczepów Gram-ujemnych tlenowych pałeczek Enterobacteriaceae wytwarzajacych ESBL o wysokiej czułości i specyficzności. 2. Charakterystyczne zabarwienie kolonni szczepów wytwarzajacych ESBL pozwala na wstępną identyfikację do odpowiedniej grupy Enterobacteriaceae oraz wykrycie mechanizmu ESBL. 3. Wzrost innych drobnostrojów jest przyhamowany. 4. Podłoże ChromID ESBL firmy biomerieux stanowi szybką, łatwą w interpretacji i wiarygodną metodę przesiewową w wykrywaniu ESBL przydatną w programie monitorowania zakażeń szpitalnych. 5. Włączenie podłoża chromogennego ChromID ESBL firmy biomerieux do procedur kontroli zakażeń szpitalnych przyczyni się do usprawnienia nadzoru nad drobnoustrojami alarmowymi. Tabela 2. Cechy charakterystyczne metody wykrywania i wstępnej identyfikacji szczepów wytwarzających ESBL z wykorzystaniem podłoża chromogennego ChromID ESBL firmy biomerieux w porównaniu z zastosowaną metodą odniesienia testem dwóch krążków. Wyniki: test dwóch krążków (DDT)/ ChromID ESBL izolaty Enterobacteriaceae materiały kliniczne DDT (+) / ChromID ESBL (+) 50 7 DDT (-) / ChromID ESBL (-) 40 9 DDT (+) / ChromID ESBL (-) 0 0 DDT (-) / ChromID ESBL (+) 3 0 Cechy charakterystyczne metody ChromID ESBL izolaty Enterobacteriaceae materiały kliniczne 16 Całkowita zgodność (%) 96,8 100 Czułość (%) Specyficzność (%) 93,5 100

17 Przełom w diagnostyce mikrobiologicznej!!!j Pełna automatyzacja w małym laboratorium Firma biomérieux Polska wprowadza do swojej oferty automatyczny analizator mikrobiologiczny Vitek2 compact 15 służący do identyfikacji drobnoustrojów i oznaczania ich wrażliwości. Otrzymywanie wyników tego samego dnia Karty VITEK 2 unikalna idea w ID/AST w Wyniki ID/AST, średnio w ciągu 5-8 godzin (1). w Ograniczenie czynności manualnych, bez dodatkowych odczynników. w Optymalne bezpieczeństwo dzięki szczelności kart. w Maksymalna kontrola zapewniona przez kody kreskowe. w Obniżenie kosztów odpadów dzięki niskiej wadze testów. (1) Rommler, et al, Poster C-123, ASM Orlando, May 2006 Szeroki wachlarz możliwości Identyfikacji w Drobnoustroje Gram dodatnie i Gram ujemne w Drożdżaki w Beztlenowce w Neisseria, Haemophilus, Corynebacterium Oznaczania lekowrażliwości w Drobnoustroje Gram dodatnie i Gram ujemne w Drożdżaki Określania mechanizmów oporności MRSA, MRSE, VISA, GISA, VRE, HLAR, ESBL Prezentacji wyników w W kategoriach wrażliwości w W rozszerzonym zakresie MIC. Dzięki rozszerzonemu zakresowi najmniejszych stężeń hamujących możliwe jest wykrywanie niskiego poziomu oporności drobnoustrojów. Spojrzenie na wyniki Oprogramowanie VITEK Compact jest przeznaczone do szybkiego wydawania wyników. w Łatwe w użyciu, w środowisku Windows. w Drzewo nawigacyjne i filtry umożliwiające dostęp do wyników. w Wyszukiwanie wyników poprzez: pacjenta, datę,organizm, wykonującego, numer próby. w Proste połączenie z LIS. w Automatyczne zatwierdzanie i przesyłanie wyników. w Zaawansowany System Ekspertowy (AES), ułatwiający wybór odpowiedniego antybiotyku. Kompaktowe rozwiązanie dla małego laboratorium w Moduł na 15 miejsc pomiarowych. w System złożony z komputera PC i komory inkubacyjnopomiarowej. w Wymiary: Wysokość 60cm, Głębokość 68 cm, Szerokość 72 cm w Waga: 75 kg 17

18 Prokalcytonina Przydatność oznaczania prokalcytoniny w różnych sytuacjach klinicznych dr n. med. Wojciech Walas Oddział Intensywnej Terapii Dzieci WCM w Opolu 18 Zakażenia stanowią istotny problem zarówno w lecznictwie otwartym jak i zamkniętym. Zwykle rozpoznanie opiera się na wywiadzie i badaniu fizykalnym, w wybranych przypadkach wykonuje się badania dodatkowe obrazowe, laboratoryjne i mikrobiologiczne. U niektórych chorych rozpoznanie i różnicowanie zakażenia z innymi stanami chorobowymi może być trudne. Przykładem jest sepsa, będąca rodzajem zespołu uogólnionej reakcji zapalnej (SIRS) spowodowanego zakażeniem, przy czym obraz kliniczny SIRS jest zbliżony niezależnie od przyczyny. Przykładem zawodności niektórych powszechnie uznanych objawów infekcji jest gorączka, która z zasady nie występuje u wcześniaków, jest natomiast częsta u pacjentów oddziałów intensywnej terapii pomimo braku zakażenia. Badania mikrobiologiczne mają niekwestionowane znaczenie w diagnostyce zakażeń. Czas oczekiwania na wyniki jest jednak zazwyczaj stosunkowo długi, ujemny wynik nie wyklucza infekcji, a wynik dodatni może być wynikiem kolonizacji bakteryjnej. W praktyce klinicznej rozpoznanie zakażenia jest wypadkową analizy wywiadu, wyniku badania fizykalnego i wyników badań dodatkowych, wśród których ważne miejsce przypada tzw. markerom (wykładnikom) zakażenia. Idealny marker zakażenia powinien posiadać następujące cechy: w duża czułość, dająca małe ryzyko przeoczenia zakażenia, w duża swoistość, umożliwiająca różnicowanie z innymi patologiami, w wczesny wzrost, umożliwiający wykrycie zakażenia w początkowym stadium, w charakter ilościowy, umożliwiający monitorowanie dynamiki zakażenia i leczenia, w dostępność, akceptowalna cena, prosta metodyka oznaczania. Klasyczne markery zakażenia Powszechnie dostępne badania krwi, takie jak OB, liczba leukocytów i płytek, wskaźniki neutrofilowe, czy stężenie białka C-reaktywnego (CRP) są przydatne w diagnostyce zakażeń, jednak w wielu sytuacjach ich wartość jest ograniczona. Wysoki poziom OB występuje m.in. u pacjentów ze schorzeniami reumatologicznymi. Podwyższoną liczbę leukocytów, odmłodzenie w układzie białokrwinkowym, czy obniżenie liczby płytek obserwuje się np. u noworodków po przebytym niedotlenieniu okołoporodowym. CRP jest podwyższone m. in. u chorych z urazem wielonarządowym czy oparzonych. Nowsze markery zakażenia Parametry biochemiczne takie jak ceruloplazmina, haptoglobina, frakcja C-3 dopełniacza, kwaśne alfa- 1-glikoproteiny, czy elastaza granulocytów są użyteczne, nie stanowią jednak zasadniczego przełomu w rozpoznawaniu zakażeń. Oznaczanie poziomu surowiczego antygenu amyloidu (SAA), białka wiążącego lipopolisacharydy (LBP), neopteryny, czy interleukiny (szczególnie Il-2, Il-6 i Il-8) stanowi niekwestionowany postęp w wybranych grupach pacjentów, jednak badania te są drogie a zatem dostęp do nich jest bardzo ograniczony. Duże nadzieje wiąże się z badaniem ekspresji genów metodą mikromacierzy DNA, jednak ta obiecująca metoda stanowi dotychczas jedynie obiekt zainteresowań badawczych. Z przedstawionego krótkiego przeglądu wynika, że nie istnieje parametr laboratoryjny który spełniałby postulaty idealnego markera zakażenia. Markerem, który skutecznie opiera się próbie czasu, stając się jednocześnie coraz bardziej dostępnym jest prokalcytonina (PCT). W opinii autora tego opracowania parametr ten jest z punktu widzenia lekarza praktyka bardzo użyteczny w rozpoznawaniu i monitorowaniu zakażeń. Poniżej przedstawione są podstawowe informacje dotyczące PCT, oraz doświadczenia własne w wykorzystywaniu jej oznaczeń u noworodków i dzieci leczonych w oddziale intensywnej terapii. Prokalcytonina Prokalcytonina jest prekursorem kalcytoniny hormonu biorącego udział w regulacji gospodarki wapniowo-fosforanowej. Jest polipeptydem o masie cząsteczkowej 13 kda. W warunkach fizjologii powstaje w komórkach C tarczycy i nie wykazuje aktywności hormonalnej. Na początku lat 90-tych ubiegłego wieku zauważono wzrost PCT w posocznicy, zarówno u dorosłych jak u dzieci, oraz 4 godziny po dożylnym wstrzyknięciu endotoksyny E. coli. Obecnie odróżnia się PCT fizjologiczną, od tzw. zapalnej, powstającej w organizmie w odpowiedzi na zakażenie (zwłaszcza bakteryjne). Uważa się że ta druga wytwarzana jest w odpowiedzi na toksyny bakteryjne przez komórki neuroendokrynne w płucach, jelitach i trzustce, a także przez granulocyty, limfocyty i monocyty. Jej naturalna funkcja nie jest znana, ale przypuszcza się, że może brać udział w hamowaniu nadmiernego odczynu zapalnego. Początek wzrostu stężenia PCT w surowicy