Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

Transkrypt

1 Nowoczesne metody diagnostyczne Diagnostyka laboratoryjna a wprowadzanie nowych metod diagnostycznych dr hab. Beata Krawczyk Katedra Mikrobiologii PG Publikacja współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego

2 Laboratoria rządowe i prywatne Laboratoria kliniczne naukowe Lb Laboratoria kliniczne i diagnostyka w szpitalach Laboratoria referencyjne 2

3 Diagnostyka molekularna w medycynie Zastosowanie Specjalności Diagnostyka: chorób dziedzicznych niektórych typów Genetyka, onkologia nowotworów chorób infekcyjnych Wirusologia, bakteriologia, chorób inwazyjnych y mikologia, parazytologia Badania prognostyczne, Choroby genetycznie monitorowanie terapii uwarunkowane, farmako- genetyka, choroby infekcyjne i inwazyjne Ustalanie pokrewieństwa, badanie śladów biologicznych Transplantologia, medycyna sądowa 3

4 Materiał kliniczny Barwienie metodą Grama i mikroskopia Mikrobiologia klasyczna Hodowle Testy na obecność przeciwciał Testy na obecność antygenu: ELISA, przeciwciała monoklonalne Kwasy nukleinowe: sondy DNA, amplifikacja DNA, sekwencjonowanie DNA Hybrydyzacja in situ Podłoża stałe Pożywki płynne diagnostyka DNA Proste testy biochemiczne (katalaza, indol) barwienie otoczek, badanie ruchliwości itp. Identyfikacja gatunkowa systemy yautomatyczne: enzymologia i biochemia; Testy wrażliwości na antybiotyki Analiza epidemiczna: Prewencja Racjonalna terapia i nadzór epidemiologiczny BIOFIZYKA, BIOCHEMIA I TECHNOLOGIE OMICS Metody biologiczne Klasyczne: fagotypowanie, serologia, antybiogramy Molekularne: techniki amplifikacji, analiza RFLP detekcja SNP sekwencjonowanie 4

5 Obecnie w diagnostyce mikrobiologicznej znajdują zastosowanie klasyczne metody badania drobnoustrojów oparte na analizie ich cech fenotypowych (metody fenotypowe) orazmetodyoparte oparte na analizie ichmateriału genetycznego, wykorzystujące nowoczesne techniki biologii molekularnej (metody genotypowe). 5

6 Odkrycia biologii molekularnej, które wpłynęły na rozwój diagnostyki molekularnej. Data Odkrycia 1953 poznanie struktury helikalnej dwuniciowego DNA 1958 izolacja polimerazy DNA I E. coli 1960 pierwsza technika hybrydyzacji 1969 hybrydyzacja in situ 1970 odkrycie enzymów restrykcyjnych i odwrotnej transkryptazy 1975 Southern blotting 1977 sekwencjonowanie DNA, (genom φ174) 1983 pierwsza synteza oligonukleotydów 1985 analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych 1985 wynalezienie PCR 1986 zastosowanie fluorescencji w hybrydyzacji in situ (FISH) Chipy DNA 1988 odkrycie termostabilnejt polimerazy DNA -optymalizacja PCR 1995 sekwencjonowanie bakterii 1992 koncepcja real-time PCR 1996 pierwsze aplikacje mikromacierzy DNA 2001 pierwsza wersja sekwencji ludzkiego genomu 6

7 środowisko Genotyp genom Metody genotypowe Metody wykorzystujące właściwości kwasów nukleinowych Metody oparte na analizie kwasów nukleinowych -analizie genu -analizie fragmentu genu -analizie genomu Ekspresja genu Klasyczne Biotypowanie Typowanie bakteriofagowe Typowanie bakteriocynowe Antybiogramy Metody fenotypowe Fenotyp Molekularne Analiza białek- PAGE, MLEE Immunodiagnostyka 7

8 Laboratoria na świecie wykorzystujące nowoczesne metody diagnostyczne (dane z 2008 roku) 7,8 % 3,7 % 8,2 % 39,9 % Laboratoria kliniczne Uniwersytety Ośrodki Referencyjne 11,9 % Instytuty badawcze Laboratoria zdrowia publicznego inne 28,4 % Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp

9 Diagnostyka molekularna cel badawczy 20,9% 30,1% 2,8% 7,3% analiza zakażeń szpitalnych nadzór epidemiologiczny analiza molekularna markerów narodowe badania referencyjne poznawcze kontrola jakości 13,3% 25,6% Zmodyfikowane na podst. Current Trends in the Epidemiological typing of clinically relevant microbes in Europe Maquelin, Kees; Cookson, Barry; Tassios, Panayotis; van Belkum, Alex; for the European Society for Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID) Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM); JMM 2007; pp

10 Wprowadzanie nowych metoddiagnostycznych: diagnostycznych: 1. powinno skrócić czas oczekiwania na wynik poprzez automatyzację, komputerowe opracowanie danych ( szybkość uzyskiwania wyników); 2. ograniczyć czynności (manipulacje z próbką); 3. granice oznaczalności i wykrywalności powinny być na poziomie metod już stosowanych lub niższe; 4. zapewnić odpowiednią powtarzalność i odtwarzalność wyników; 5. zapewnić precyzję i dokładność testu; 6. powinny być łatwe w aplikacji; 7. nie powinny wymagać drogiego i wysoce specjalistycznego sprzętu; 8. uwzględniać ć koszty aparatury i jej jjd dostępność; 9. koszt analizy pojedynczej próbki; 10. nowe metody powinny uwzględniać takie aspekty analizy jak możliwość wykrywania takich drobnoustrojów, które są trudne w hodowli lub nie dają się hodować, bądź są wolno rosnące. 10

11 Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI International Organization for Standarization (ISO)/Technical Committee 212 wytyczne do walidacji nowych, nie farmakopealnych, szybkich testów mikrobiologicznych [PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology; Technical Report: Evaluation, Validation and Implementation of New Microbiological Testing Methods. 2000,33]. tworzenie testów lb laboratoryjnych i regulacja ich kontroli jakości; wytyczne walidacji metod molekularnych PDA Parenteral Drug Association Clinical Laboratory Improvement Act (CLIA) w USA ICH (The International Conferencer on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) oraz monografii EP (European Pharmacopeia) 11

12 Fazy procesu kontroli nowych testów w diagnostyce Projekt i weryfikacja metody Walidacja metody Wdrożenie i kontrola jakości 12

13 Projekt metody Założenia projektu, specyfikacja (opis, dokumentacja) weryfikacja Projekt i weryfikacja metody Czy test spełnia nasze oczekiwania i uwzględnia przedstawione przez nas kryteria? Równorzędna metoda Udoskonalona jakościowo walidacja Walidacja metody Czy nowy test można porównać do innych równoważnych testów, czy spełnia kliniczne wymagania specyfikacji w stosunku do istniejących i testów diagnostycznych? wdrożenie (realizacja) Wdrożenie i kontrola jakości Utrzymanie metody testowanie kontrola jakości raport 13

14 Etapy ewaluacji nowych systemów diagnostycznych Dokumentacja (opis) metody i procedury techniki, która będzie wykorzystana w badaniach Wyróżnienie akceptowanych kryteriów Wybór populacji pacjentów (dobrze udokumentowanych klinicznie) Przygotowanie dwóch identycznych kolekcji szczepów i rozdzielenie pomiędzy dwie metody (badaną i referencyjną) Przeprowadzenie badania nowym i referencyjnym testem Badanie wpływu substancji interferujących Analiza każdej próbki dwukrotnie z wykorzystaniem nowej i referencyjnej metody porównanie wyników Określenie stosunku wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnych Pomiar dokładności i precyzji w stosunku do metody referencyjnej (walidacja metody) 14

15 Wybór techniki przewidzianej do charakterystyki metody badawczej zależy od możliwości: wykorzystania wzorców i materiałów odniesienia zastosowania metody porównawczej wykorzystania y badań między laboratoryjnych ę yj y 15

16 Dana metoda może zostać poddana walidacji dopiero wówczas, gdy została poddana procesowi optymalizacji. Proces optymalizacji metody polega na badaniu wpływu zmian każdego z wybranych czynników poszczególnych etapów procedury na efektywność metody. Analizie podlegają czynniki wpływające na: 1) jakość otrzymanych wyników; 2) czas trwania procedury; 3) koszt. 16

17 Proces optymalizacji metody diagnostycznej polega na określeniu parametrów krytycznych metody Weryfikacja zoptymalizowanej procedury jest to kompleksowy efekt jednoczesnej zmiany wszystkich parametrów na ostateczny wynik analizy Równocenność ość metod eod jest to ocena podobieństwa wyników testów przeprowadzonych nową metodą, w porównaniu z wynikami testów prowadzonych metodą stosowaną dotychczas. 17

18 Każda nowo wprowadzana metoda powinna być walidowana Walidacji należy dokonywać także wówczas, gdy kontrola jakości stosowanej metody stwierdziła zmienność jej parametrów w czasie oraz gdy planuje się rozszerzenie stosowania danej metody. Odpowiada na pytanie, czy nowy test można porównać do innych równoważnych testów; czy spełnia kliniczne wymagania specyfikacji, j, w stosunku do istniejących testów diagnostycznych 18

19 Kryteria walidacji metod mikrobiologicznych można podzielić na dwie grupy: testy jakościowe pozwalają na stwierdzenie czy w badanej próbce są drobnoustroje (i jakie?), lub że ich nie ma testy ilościowe pozwalają określić liczbę drobnoustrojów w badanej próbce 19

20 Do walidowanych parametrów metody badawczej zgodnie z wytycznymi ICH (ang ang. The International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) należą: specyficzność, dokładność, precyzja, granica wykrywalności i oznaczalności, liniowość, zakres pomiarowy elastyczność danej metody badawczej

21 CLIA wyróżnia specyficzność analityczną specyficzność kliniczną przewidywane wartości negatywne czułość kliniczną przewidywane wartości pozytywne 21

22 Czułość testu = próby prawdziwie pozytywne/próby prawdziwie pozytywne + fałszywie negatywne x 100%; gdy liczba fałszywie negatywnych prób będzie równa zero, to test ma czułość 100% Specyficzność testu = prawdziwie negatywne/prawdziwie negatywne +fałszywie pozytywne x 100%; gdy liczba fałszywie pozytywnych prób będzie równa zero, to test jest specyficzny w 100%. 22

23 Zakres Zk (zasięg) pomiaru analitycznego metoda może dokonywać pomiaru próbki bezpośrednio bez konieczności jej rozcieńczania, bez względu na stężenie. Zakres (zasięg) pomiaru klinicznego (zasięg kliniczny) dotyczy możliwości pomiaru próbki po jej rozcieńczeniu lub bez rozcieńczenia. 23

24 Wdrożenie i kontrola jakości Systematyczne badanie czynników wpływających na wynik badania Porównanie z wzorcami odniesienia połączone ł z systematycznym badaniem czynników wpływających na wynik Porównawcze badania między laboratoryjne ę yj przy użyciu tej samej metody badawczej Porównanie wyników uzyskanych innymi metodami badawczymi 24

25 Czynniki, które decydują o wyborze metody diagnostycznej a. Właściwości próbki pób b. Właściwości mikroorganizmu c. Charakterystyka celu molekularnego d. Czułość i specyficzność metody e. Powtarzalność f. Potencjał różnicujący metody g. Stopień trudności metody (doświadczenia personelu) h. Zaplecze badawcze (sprzęt (p ę jakim dysponujemy) yp y) i. Łatwość interpretacji wyników j. Czas wymagany do analizy k. Całkowity koszty stosowanej metody l. Koszty pojedynczej próbki 25

26 Podział technik molekularnych ze względu charakter procedury METODY SYSTEM DETEKCJI ELEKTROFOREZA CHARAKTERYSTYKA PROCEDURY WIELKOŚĆ ENDONUKLEAZY RODZAJ MATERIAŁU FRAGMENTÓW RESTRYKCYJNE GENETYCZNEGO NIE OPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH REA PFGE w zmiennym m polu elektrycznym kpz jedna genomowe DNA analiza profili plazmidowych i REAP (ang. Restriction Enzyme Analysis of Plazmid) konwencjonalna 1,5 150 kpz jedna lub kilka plazmidowe DNA rybotypowanie oparte na hybrydyzacji konwencjonalna 1,1 14 kpz kilka OPARTE NA REAKCJI AMPLIFIKACJI KWASÓW NUKLEINOWYCH totalne RNA genomowe DNA RAPD konwencjonalna pz genomowe DNA rep PCR konwencjonalna pz genomowe DNA PCR RFLP konwencjonalna pz jedna/dwie genomowe DNA AFLP konwencjonalna pz jedna/dwie genomowe DNA PCR MP konwencjonalna jedna genomowe DNA pz ADSRRS konwencjonalna dwie genomowe DNA 26