MAPOWANIE GENETYCZNE MARKERÓW STS W GENOMIE ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) I ICH ANALIZA FUNKCJONALNA

Transkrypt

1 Fragm. Agron. 29(4) 2012, MAPOWANIE GENETYCZNE MARKERÓW STS W GENOMIE ŁUBINU WĄSKOLISTNEGO (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) I ICH ANALIZA FUNKCJONALNA Katarzyna Kamel, Magdalena Kroc, Wojciech Święcicki Instytut Genetyki Roślin Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu kkam@igr.poznan.pl Synopsis. Łubin wąskolistny jest jednym z trzech gatunków uprawnych łubinów. W ostatnich latach obserwuje się wzrost zainteresowania uprawą łubinu, cennego źródła białka pochodzenia krajowego. Niestety wiedza z zakresu genetyki tego gatunku, a w szczególności struktury i organizacji genomu, jest wciąż ograniczona. Celem prowadzonych badań było uzupełnienie najnowszej wersji mapy genetycznej łubinu wąskolistnego o nowe markery zdefiniowane sekwencyjnie, projektowane dla sekwencji kodujących. Opracowano 85 markerów polimorficznych, spośród których 81 wykazało sprzężenie na mapie genetycznej. Wzbogacenie mapy o nowe markery STS zwiększyło jej długość do 2611,1 cm, a średnia odległość pomiędzy markerami wynosi obecnie 3,76 cm. Kolejnym etapem była analiza funkcjonalna in silico 68 sekwencji nukleotydowych opracowanych markerów łubinu wąskolistnego. Terminy GO zostały przypisane dla 32 sekwencji. Produkty genów zdefiniowano pod względem funkcji molekularnej, komponentu komórkowego oraz procesów biologicznych. Słowa kluczowe key words: łubin wąskolistny narrow-leafed lupin, mapowanie genetyczne genetic mapping, markery zdefiniowane sekwencyjnie sequence-specific markers, adnotacja funkcjonalna functional annotation WSTĘP Łubin wąskolistny jest jednym z trzech gatunków użytkowych należących do rodzaju Lupinus uprawianych w Polsce. Swoją popularność zawdzięcza wysokiej zawartości białka w nasionach, stosunkowo niewielkim wymaganiom glebowym oraz asymilacji azotu atmosferycznego dzięki symbiozie z bakteriami brodawkowymi z rodzaju Bradyrhizobium. W ostatnich latach wzrasta zainteresowanie uprawą łubinu, cennego źródła białka pochodzenia krajowego, w związku z zamiarem ograniczenia importu śruty sojowej. Uprawa i wykorzystanie łubinu napotyka jednak na trudności związane z niestabilnością plonów oraz podatnością na choroby, w tym antraknozę i fuzariozę. Lepsze poznanie struktury i organizacji genomu łubinu wąskolistnego może ułatwić hodowlane ulepszenie gatunku i pełne wykorzystanie jego walorów uprawnych i użytkowych. Celem przeprowadzonych prac było wzbogacenie najnowszej wersji mapy genetycznej łubinu wąskolistnego [Nelson i in. 2010] o nowe markery zdefiniowane sekwencyjne (STS ang. Sequence Tagged Sites). Niezwykle ważnym aspektem badań struktury genomów jest możliwość powiązania poszczególnych sekwencji z informacjami na temat ich biologicznej funkcji [Conesa i in. 2005], dlatego w dalszej kolejności przeprowadzono analizę funkcjonalną in silico sekwencji nukleotydowych opracowanych markerów łubinu wąskolistnego. Pozwoliło to na przyporządkowanie im terminów GO (ang. Gene Ontology) oraz ich zdefiniowanie pod wzglę-

2 Mapowanie genetyczne markerów STS w genomie łubinu wąskolistnego dem funkcji molekularnej, lokalizacji komórkowej oraz procesów biologicznych, w których mogą uczestniczyć. MATERIAŁ I METODY Mapowanie genetyczne markerów STS w genomie łubinu wąskolistnego przeprowadzono w latach w Pracowni Analizy Genomu Instytutu Genetyki Roślin PAN. Populację mapującą stanowiło 89 linii wsobnych rekombinantów kombinacji krzyżówkowej linii hodowlanej (83A:476) i typu dzikiego (P27255) w pokoleniu F8 (współpraca z Department of Agriculture and Food, Perth, Western Australia). Wykorzystywane grupy starterów (GLIP, Leg, MLG i cross-legume), różniące się nieznacznie sposobem projektowania, zostały opracowane dla sekwencji różnych gatunków roślin motylkowatych. Strategia ich projektowania polegała na wykorzystaniu ewolucyjnie konserwatywnych sekwencji kodujących dla motylkowatych gatunków modelowych (Lotus japonicus, Medicago truncatula) oraz kilku gatunków uprawnych (Glicyne max, Phaseolus vulgaris) i referencyjnego genomu Arabidopsis thaliana. Sekwencje wykorzystanych starterów otrzymano w ramach współpracy z kilkoma ośrodkami naukowymi w ramach 6 PR UE Grain Legumes. W mapowaniu genetycznym wykorzystano dane źródłowe najnowszej wersji mapy łubinu wąskolistnego [Nelson i in. 2010], przy czym do konstrukcji mapy wykorzystano jedynie markery szkieletowe. Analizę sprzężeń nowych markerów STS wykonano za pomocą oprogramowania Map Manager v.qtxb20 [Manly i in. 2001], a wizualizację mapy z wykorzystaniem programu komputerowego MapChart [Voorrips 2002]. Do analizy funkcjonalnej zastosowano aplikację Blast2GO [Götz i in. 2011]. WYNIKI I DYSKUSJA Analizie poddano łącznie 375 par starterów. Produkty reakcji PCR uzyskane z linii rodzicielskich analizowano w pierwszej kolejności pod względem polimorfizmu obserwowanego bezpośrednio w żelu agarozowym, tj. wielkości produktu amplifikowanego daną parą starterów oraz amplifikacji produktu tylko u jednego z rodziców. W przypadku braku polimorfizmu obserwowanego bezpośrednio w żelu agarozowym produkty amplifikacji obu linii rodzicielskich sekwencjonowano w poszukiwaniu polimorfizmu na poziomie pojedynczego nukleotydu SNP. Gdy wykryta mutacja SNP zmieniała bezpośrednio miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny, opracowywano markery typu CAPS (ang. Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) natomiast, gdy wykryty polimorfizm nukleotydu nie zmieniał bezpośrednio miejsca restrykcyjnego dla enzymu, opracowywano marker typu dcaps (ang. derived-caps). Łącznie wytypowano 85 markerów polimorficznych, spośród których 81 wykazało sprzężenia na mapie genetycznej gatunku (28 uwzględniono wcześniej w publikacji Nelson i inni 2010) (rys. 1). Polimorfizm markerów opracowanych z zastosowaniem badanej puli starterów wyniósł 22,7%. Polimorfizmem typu CAPS/dCAPS charakteryzowało się 68 markerów. Dla 13 markerów polimorfizm obserwowano bezpośrednio w żelu agarozowym (polimorfizm wielkości amplifikowanego produktu lub obecność produktu amplifikacji tylko u jednego z rodziców). Nowe markery zlokalizowano we wszystkich z dwudziestu opisanych grup sprzężeń łubinu wąskolistnego (od NLL-01 do NLL-20), a ich rozmieszczenie w poszczególnych grupach sprzężeń było zróżnicowane. Najwięcej 10 markerów zmapowano w grupie NLL-06. Obecnie całkowita długość mapy wynosi 2611,1 cm, a średnia odległość między markerami to 3,76 cm.

3 K. Kamel, M. Kroc, W. Święcicki 72 DAWA1065,250 DAWA403,208 2,0 DAWA894,120 2,6 DAWA772,330c 5,3 Lup330 6,0 M61E35A206 7,2 DAWA391,200 7,9 DAWA101,235c 9,7 PPE 10,3 DAWA627,250 16,1 DAWA194,238 17,9 UWA081 21,9 DAWA486,270 24,3 DAWA789,560 24,9 DAWA919,090c 28,2 DAWA631,170 38,4 mtmt_gen_ ,0 Leg178 59,7 DAWA612,130 64,8 DAWA793,405 69,9 DAWA180,240 70,5 DAWA181,210 71,1 DAWA261,060 72,3 DAWA808,500 74,5 DAWA545,140 75,2 Lup257 75,9 Lup170 77,8 Ms-U63 78,4 UWA226 81,8 mtmt_gen_ ,5 mtmt_gen_ ,1 DAWA91,195 85,4 DAWA478,500 91,9 DAWA394,070c 94,3 DAWA400,300c 94,9 DAWA516, ,0 DAWA523, ,6 DAWA765, ,4 mtmt_est_ ,4 DAWA532, ,0 DAWA749, ,6 DAWA956, ,2 DAWA109,260c 118,8 Leg ,7 DAWA289,630c 126,4 DAWA80, ,0 Lup ,2 TaM3 135,7 TaM1 138,3 Tardus 139,8 TaM2 143,4 UWA026a 152,1 DAWA700,150c 164,4 UWA ,2 M49E38B99 174,5 UWA ,1 NLL-01 DAWA533,450 DAWA45,320 5,0 Lup222 6,6 Lup098 12,8 DAWA1002,230c 17,6 DAWA376,275 26,5 DAWA321,460c 28,3 LSSR14 35,0 3GM 43,9 DAWA188,310 45,8 DAWA497,400 51,0 Lup081 51,8 A060c 53,4 DAWA843,090 53,8 DAWA841,150 54,4 DAWA150,125 58,4 DAWA402,210c 60,2 LG96 60,8 LG97 61,5 UWA216c 63,7 REP 64,2 DAWA247,330c 64,9 DAWA588,185c 65,5 K227 66,2 M62E35A160 68,5 M62E35A152 69,1 UWA018 71,4 DAWA489,135 DAWA210,130 72,8 DAWA725,480 73,4 DAWA19,235 73,9 DAWA1084,135 91,0 Lup244 98,8 mtmt_deg_ ,5 Leg ,2 DAWA300, ,8 Lup ,6 NLL-02 UWA210a DAWA763,270 9,6 DAWA539,265 10,2 UWA076 12,1 DAWA27,225 13,0 UWA017 15,4 CPCB2 17,3 Lup056 21,8 Ms-U182 26,6 DAWA507,450c 37,1 DAWA404,180 48,5 DAWA822,075 49,2 DAWA73,105 49,8 DAWA192,350c 51,0 DAWA888,295 52,9 M60E32B195 58,5 M60E32B105 59,6 DAWA847,260c 60,3 DAWA520,350 61,6 Leucospermus 62,8 DAWA1045,150 63,4 M59E35B442 65,8 A445B443 67,0 DAWA518,260 69,1 DAWA622,450 70,3 DAWA544,146 71,4 M47E41A75 74,3 DAWA554,140 77,1 DAWA52,125 80,2 UWA118 81,0 UWA147a 82,5 UWA109a 83,9 GCSP 86,2 DAWA317,135 86,8 DAWA139,180 87,4 DAWA869,360c 89,9 MTIC_219 98,0 LG ,2 Leg ,7 Lup ,8 Lup ,2 DAWA587, ,5 mtmt_gen_ ,9 DAWA839, ,5 DAWA500,175c 142,8 AAT 158,9 NLL-03 UWA021b DAWA790,440 4,0 DAWA159,290c 6,4 DAWA993,095 24,1 DAWA568,150c 27,1 DAWA515,298 35,0 7GM 37,4 Lup145 38,1 UWA208a 40,9 mtmt_gen_ ,5 DAWA149,150 45,4 DAWA314,310c 50,8 DAWA605,330 52,6 mtmt_gen_ ,3 Lup204 64,1 DAWA256,230 68,5 M59E38A226 72,8 M59E38B220 73,9 DAWA606,225 76,8 DAWA936,365 79,8 DAWA660,135 82,9 DAWA470,230 89,3 Leg266 90,6 DAWA383,145c 91,8 DAWA973,230c 92,4 DAWA471,200 96,1 M47E41B ,3 DAWA216, ,2 DAWA851,180c 106,2 DAWA102, ,8 DAWA63, DAWA918, ,8 DAWA873, ,4 DAWA1073, ,9 DAWA969, ,1 Lup DAWA1047, ,8 Leg ,7 NLL-04 mtmt_gen_00237 DAWA603,450c 5,1 DAWA509,350c 21,3 DAWA1080,185 26,7 Lup220 35,1 Lup263 40,2 DAWA1087,250c 41,0 Pis_GEN_58 57,3 M59E35B183 71,3 UWA065 76,2 A130c 78,5 DAWA1010,180 81,6 DAWA474,800 83,0 DAWA282,550 83,7 DAWA94,110 84,3 DAWA20,195 DAWA1003,,210 88,0 DAWA381,180 91,4 PTDT6 94,7 DAWA178,450 97,5 DAWA591,145 99,4 DAWA42,380c 99,9 DAWA726, ,1 DAWA785,135c 112,7 M49E41B ,7 M60E32B ,9 Pis_PR_ ,7 Lup ,8 DAWA670,475c 168,6 M59E38A DAWA537, ,3 DAWA663, ,5 DAWA671, ,1 UWA158c 181,6 PT1b 182,8 DAWA393, ,5 DAWA852, ,1 NLL-05 Leg218 CHS9 4,2 FENR 12,2 DAWA750,450c 21,2 UWA029c 27,5 DAWA1046,125c 31,3 DAWA572,265c 32,1 DAWA205,425 35,9 UWA101 38,1 UWA119c 38,8 DAWA365,110 42,1 UWA026b 44,9 UWA230 46,2 4GM 51,9 DAWA494,550c 53,8 DAWA141,150 56,9 M49E38A102 62,4 Pis_GEN_12_2_1 72,6 20m ,1 DAWA513,450c 76,3 Leg301 79,0 DAWA354,100 80,9 Leg168 84,1 DAWA832,295 85,4 DAWA253,100c 88,8 DAWA551,250 89,4 DAWA736,245 93,2 DAWA436,450 93,8 M48E38A303 94,5 M48E38B168 95,0 UWA166 98,5 DAWA270,550 99,2 LG16 100,4 17MGM 102,4 mtmt_deg_ ,3 Leg ,8 Leg ,6 DAWA406,095c 129,6 UWA ,4 UWA210b 132,1 LSSR18 132,7 DAWA22, ,1 DAWA508, ,1 DAWA320, ,6 Lup ,0 DAWA618,150c 152,5 DAWA836,140c 154,5 UWA ,8 mtmt_gen_ ,4 DAWA667, ,6 NLL-06 DAWA345,090 DAWA575,375c 0,6 Leg100 3,0 trals 5,4 DAWA254,475 11,2 DAWA71,165 11,8 UWA242a 15,2 Leg133 18,9 Lup156 22,2 DAWA1025,,450 28,5 UWA097a 29,3 DAWA741,170 36,1 DAWA444,300c 36,7 Leg363 42,1 UNK27 42,8 A131 45,3 UWA100 47,1 GH3 Leg43 47,9 DAWA524,198 48,5 DAWA506,198 49,1 DAWA639,150 49,7 DAWA1072,650 50,9 DAWA54,100 53,4 M59E38B198 55,5 LSSR07 56,6 DAWA305,278 60,3 LSSR06a 63,7 M47E41A177 65,0 DAWA608,170c 66,4 DAWA166,450 67,0 MTIC_114 68,9 psat_est_ ,4 DAWA396,550 77,9 DAWA504,280 79,7 DAWA632,550 80,9 Iucundus 82,0 DAWA604,335 83,2 DAWA134,265 83,8 DAWA525,185 84,4 DAWA147,245 85,6 DAWA255,360 88,0 DAWA679,430 89,2 DAWA874,450c 110,6 DAWA96, ,4 DAWA74, ,7 NLL-07 Rys. 1a. Mapa genetyczna łubinu wąskolistnego z naniesionymi nowymi markerami STS (podkreślone) Fig. 1a. Linkage map of the narrow-leafed lupin genome with the new STS markers (underlined)

4 Mapowanie genetyczne markerów STS w genomie łubinu wąskolistnego DAWA364,180 DAWA348,400 2,4 Lup282 9,0 DAWA209,290 11,5 DAWA15,390 22,2 LSSR01 26,6 LeM1 32,2 LeM2 33,1 Lentus 34,1 DAWA964,275 35,3 DAWA72,160 38,6 d212len 40,6 A077b 42,6 LSSR05 48,3 DAWA88,325c 50,5 DAWA1029,357 51,1 CWI1 58,6 DAWA250,170 59,3 M47E41B295 60,7 M47E41A310 61,8 M47E41A142 64,6 DAWA308,198 65,9 Leg208 67,2 DAWA577,150 71,2 LG1 91,3 UWA216b 96,7 M61E35A ,8 DAWA933, ,7 DAWA275, UWA242c 118,6 LG77 123,5 LG75 124,2 DAWA912, ,5 DAWA204,550c 126,1 DAWA203, ,0 psat_est_ ,8 Leg ,4 M49E38B ,7 NLL-08 DAWA416,290 Lup319 6,4 UWA163 10,6 M62E35A173 20,1 DAWA901,140c 4 DAWA610,148 45,8 UWA160b 48,0 DAWA184,165 48,7 Lup233 50,1 PT1a 51,3 mtmt_gen_ ,0 DAWA172,230 58,4 DAWA196,230c 59,6 Lup241 61,0 dlssr46 64,2 CNGC4 68,4 80a ,8 Leg404 71,2 DAWA442,060 71,4 DAWA986,190 72,1 Lup310 72,9 UWA106a 73,6 Lup297 76,6 M59E38A187 79,9 Lup174 89,2 mtmt_est_ ,9 Lup ,4 DAWA557, ,1 mtmt_est_ ,9 DAWA297, ,8 mtmt_est_ ,7 DAWA195, ,2 Leg228 UWA256b 126,7 NLL-09 Lup301 Lup166 0,5 DAWA502,150 4,3 DAWA1023,195 10,8 DAWA90,225c 15,6 DAWA942,140c 18,1 DAWA689,125 21,0 DAWA981,295 22,5 DAWA913,290c 23,1 DAWA984,250 25,0 DAWA948,215c 25,6 Lup273 30,2 290Ku 42,7 KuHM1 Ku 49,4 A071b 5 UWA214 50,6 A130a 52,3 Lup158 53,7 Lup054 55,1 DAWA306,255c 55,8 DAWA1015,175 56,4 mtmt_est_ ,5 VBP1 59,9 psat_est_ ,1 UWA157 76,1 Lup130 85,5 NLL-10 DAWA1091,420 DAWA40,430 0,6 DAWA233,120 2,4 DAWA356,300c 10,6 DAWA938,320 12,5 DAWA257,190 13,1 Lup243 14,5 A242b 18,9 UWA061a 24,0 LSSR10 25,2 psat_est_ ,4 M59E38B123 34,7 DAWA1019c 38,7 M61E35A114 43,9 AntjM2 47,6 Lanr1 50,3 DAWA224,170 54,4 A060a 60,1 UWA107b 63,1 M59E35B187 65,2 DAWA582,425 67,2 SHK75 74,8 PRAT DAWA50,190c 77,5 Leg128 81,6 Leg917 83,5 DAWA674,200c 85,0 DAWA113,145 86,8 DAWA142,100 87,4 DAWA100,250c 91,1 DAWA335,480 92,9 DAWA414,400 97,3 DAWA669,090c 98,5 mtmt_gen_00650 DAWA301,550c 102,5 DAWA319, ,3 DAWA932, ,6 Leg ,0 UWA ,4 mtmt_con_ ,6 DAWA531,125c 123,1 DAWA563,130c 123,7 NLL-11 DAWA543,150 DAWA220,190 17,6 UWA147b 35,4 A077a 36,6 M48E41A144 37,2 psat_est_ ,6 DAWA218,290 40,4 DAWA701,500 Leg215 42,4 Lup206 44,4 UWA096 49,5 Leg188 51,1 LG13 54,9 Leg066 56,7 LG11 59,3 mtmt_gen_ ,4 M47E35A80 88,0 DAWA103,050 91,8 Lup247 93,3 SUSY 109,3 Lup ,7 A ,3 UWA128b 131,4 Lup ,1 FIS1 150,5 DAWA346, ,9 DAWA395,040c 155,9 NLL-12 DAWA501,170 DAWA917,125 2,6 DAWA566,410c 5,8 DAWA658,250 6,4 LG80 15,7 UWA242b 22,2 UWA060 23,2 UWA097c 32,2 ACTN 32,8 DAWA996,370 45,8 Lup077 48,2 DAWA1088,220 51,7 DAWA583,330 53,2 DAWA223,270 57,6 M47E32B195 59,7 HPAT 62,3 DAWA336,400 64,6 DAWA384,100 65,8 DAWA827,135 69,2 DAWA648,070 72,5 DAWA998,338 73,8 DAWA212,195 79,7 PDC 98,5 DAWA427, ,9 DAWA788, ,0 Lup045 mtmt_gen_ ,7 NLL-13 DAWA243,225 DAWA140,170 4,4 DAWA413,600 13,7 AnMts13 27,9 DAWA902,475 31,4 DAWA510,300c 33,9 M59E35B414 41,6 M59E35A334 45,1 DAWA248,185 46,6 DAWA476,190 47,2 DAWA1062,425 47,8 DAWA512,800 48,4 DAWA46,310 49,0 DAWA687,140 49,6 mtmt_est_ ,2 M62E35A182 55,2 M47E41B131 57,5 M48E38A365 63,3 DAWA51,150 64,8 DAWA801,215c 66,8 DAWA44,340c 76,6 DAWA462,160c 78,4 Lup194 86,0 UWA252 88,2 DAWA943,080c 102,3 UWA153b 105,6 NLL-14 Rys. 1b. Mapa genetyczna łubinu wąskolistnego z naniesionymi nowymi markerami STS (podkreślone) Fig. 1b. Linkage map of the narrow-leafed lupin genome with the new STS markers (underlined)

5 K. Kamel, M. Kroc, W. Święcicki 74 Lup051 DAWA372,100 13,5 DAWA278,140 22,9 DAWA613,430 24,1 DAWA ,7 DAWA128,380 27,3 Lup168 28,7 UWA074 33,3 DAWA143,095 35,6 DAWA598,140 36,8 DAWA288,175 37,4 DAWA43,360 38,0 DAWA553,165c 38,6 UWA106c 41,8 30MGM 51,7 DAWA707,100 60,5 DAWA374,082 61,7 DAWA892,175c 66,9 UWA030 68,6 UWA207 70,6 MTIC_272 73,4 DAWA906,255 75,4 DAWA85,110 86,5 DAWA18,240c 91,6 A130b 98,5 DAWA982, ,5 DAWA905, ,9 DAWA879, ,6 DAWA65,290c 11 UWA153a 113,7 Lup ,3 NLL-15 DAWA695,340 DAWA703,335 1,3 DAWA463,150 3,1 dlssr15 16,3 Pis_GEN_20 38,1 DAWA135,340 46,2 DAWA877,325c 55,1 DAWA720,110 55,8 DAWA665,250 56,4 DAWA31,025 59,6 DAWA302,400c 60,8 DAWA552,180 62,0 DAWA330,190 62,6 DAWA160,280c 79,9 Leg217 90,9 Leg081 92,9 DAWA876,335c 107,4 DAWA586, ,1 A060b 111,0 UWA160c 118,8 NLL-16 Lup019 DAWA842,145 5,9 DAWA122,240 8,5 M62E35B462 16,5 Lup111b 30,5 DAWA47,295 37,2 DAWA753,199c 43,0 SGR 52,3 DAWA600,250c 62,2 DAWA910,130c 62,9 DAWA208,295 63,6 DAWA480,400c 66,1 MTIC_251b Lup248 67,3 Lup275 68,5 UWA148 70,6 Lup230 71,6 DAWA264,170 73,0 Lup111a 77,8 DAWA573,230 81,6 Leg051 84,1 DAWA662,500 87,3 DAWA664,290 89,1 ASNEP 92,4 Mollis MoA 101,2 UWA ,5 LSSR11 110,4 DAWA804, ,5 Lup ,9 NLL-17 UWA044 DAWA186,135 1,2 DAWA1051,180 1,9 Leg187 9,8 DAWA541,180 13,8 DAWA766,175 14,4 DAWA200,250 30,8 mtmt_con_ ,6 DAWA361,310c 36,8 UWA053b 38,9 UWA083b 40,7 DAWA197,190c 41,1 M48E41A200 41,9 DAWA927,130 42,6 DAWA82,140 43,3 DAWA696,320 44,5 DAWA312,340c 45,6 DAWA659,215c 47,4 DAWA435,040 49,2 DAWA754,190 52,3 DAWA369,290 53,0 Lup091 55,0 DAWA1005,135 58,4 DAWA16,320 59,8 Lup115 67,4 Lup251 71,3 DAWA641,480c 75,7 DAWA620,575 78,2 UNK7 85,6 DAWA398,395 98,7 NLL-18 DAWA896,340c DAWA850,195c 0,6 ACL 2,9 Lup228 3,5 DAWA949,150c 8,3 DAWA967,200 16,7 DAWA959,100c 17,4 DAWA465,370 24,3 UWA127 25,8 DAWA1009,250c 37,0 DAWA39,460 38,8 Lup290 40,1 DAWA1076,270c 41,6 Lup186 42,4 A095 43,7 UWA075 45,9 Leg44 50,7 dlssr61 54,5 DAWA316,150 67,0 UWA054 67,7 UWA088 68,9 UWA029b 70,8 UWA109b 77,7 DAWA825,375c 93,5 NLL-19 DAWA93,090 DAWA359,360 0,6 DAWA127,540c 2,3 DAWA1082,170 4,3 DAWA868,050 9,9 Leg146 12,2 Leg199 24,1 DAWA366,050c 34,2 DAWA41,400 37,3 1GM 44,5 Lup210 46,0 M60E38A141 52,4 DAWA461,190 57,6 DAWA59,210 61,4 DAWA928,245 62,6 DAWA691,075 63,2 DAWA ,8 DAWA315,225 65,0 DAWA49,230 65,6 DAWA157,490 67,4 DAWA211,265 71,2 DAWA98,340 73,1 DAWA935,450 75,5 Lup315 77,5 LG57 78,2 DAWA295265c 79,5 DAWA479,425 83,3 DAWA198,450c 85,7 DAWA751,330c 87,5 DAWA592,090 93,4 NLL-20 Rys. 1c. Mapa genetyczna łubinu wąskolistnego z naniesionymi nowymi markerami STS (podkreślone) Fig. 1c. Linkage map of the narrow-leafed lupin genome with the new STS markers (underlined)

6 Mapowanie genetyczne markerów STS w genomie łubinu wąskolistnego procesy wielokomórkowe (multicellular organismal 6% procesy systemu odporności (immune system procesy sygnałowe (signaling) procesy rozwojowe (developmental 6% oddziaływanie na inne organizmy (multi-organism lokalizacja (localization) regulacja biologiczna (biological regulation) organizacja komponentów komórkowych (cellular component organization) 2% reprodukcja (reproduction) odpowiedź na bodźce (response to stimulus) 11% organizacja ściany komórkowej lub biogeneza (cell wall organization or biogenesis) 2% procesy metaboliczne (metabolic 29% procesy komórkowe (cellular 26% Rys. 2. Terminy GO zidentyfikowane dla 32 sekwencji markerów STS, sklasyfikowane według procesów biologicznych (terminy poziomu 2) Fig. 2. Gene Ontology (GO) terms for the 32 STS markers, defined according to the biological processes (level 2 terms) Wzbogacanie map genetycznych w markery reprezentujące sekwencje unikatowe w genomie, które dodatkowo ulegają ekspresji jest bardzo użyteczne, ze względu na możliwość identyfikacji i izolacji ważnych genów, wykrywania loci cech ilościowych oraz selekcję materiału hodowlanego z wykorzystaniem markerów MAS (ang. Marker Assisted Selection) [Sato i in. 2005]. Ponadto, niezwykle cenna jest możliwość ich wykorzystania w mapowaniu porównawczym genomów gatunków pokrewnych, umożliwiająca wykorzystanie wiedzy dotyczącej struktury i funkcji genów gatunków modelowych w analizie i identyfikacji genów odpowiedzialnych za ważne cechy użytkowe gatunków o słabiej poznanych genomach [Zhu i in. 2005, Ellwood i n. 2008]. Analizę funkcjonalną in silico przeprowadzono dla 68 sekwencji nukleotydowych opracowanych markerów łubinu wąskolistnego (markery o polimorfizmie CAPS/dCAPS) z wykorzystaniem oprogramowania Blast2GO. Gatunkami, dla których najczęściej odnajdywano homologię sekwencji w analizie BLAST (Top-Hit species distribution) były: soja (Glycine max) 11 sekwencji i Medicago truncatula 6 sekwencji. Na tej podstawie można przypuszczać, że

7 76 K. Kamel, M. Kroc, W. Święcicki najbardziej reprezentatywnym genomem referencyjnym dla łubinu wąskolistnego jest genom soi. Podobne wyniki odnotowali Pazos-Navarro i inni (2011) w badaniach dotyczących mało poznanego gatunku motylkowatego Bituminaria bituminosa. W badaniach własnych terminy GO zostały zidentyfikowane dla 32 sekwencji (47% analizowanych sekwencji) i zostały sklasyfikowane pod względem lokalizacji komórkowej (terminy poziomu 3), procesów biologicznych (terminy poziomu 2) oraz funkcji molekularnej (terminy poziomu 2). Największa pula produktów genów (52%) zidentyfikowanych pod kątem funkcji molekularnej charakteryzowała się aktywnością katalityczną, 41% uczestniczyło w wiązaniu, 4% w transdukcji sygnału, a wykazywało aktywność transportową. W przypadku segregacji według lokalizacji komórkowej 54% terminów GO nie zostało precyzyjnie sklasyfikowanych (zostały określone jako niezdefiniowana części komórki lub jako niezdefiniowane organellum komórkowe), 36% przydzielono do organelli związanych z membranami, 6% do kompleksów białkowych, a po 2% do pęcherzyków lub organelli niezwiązanych z membranami. Przeanalizowane terminy GO charakteryzowały się bardzo dużą różnorodnością pod względem procesów biologicznych, w których uczestniczą. Najwięcej produktów genów zidentyfikowano jako elementy uczestniczące w procesach metabolicznych (29%) oraz w procesach komórkowych (26%). Na rysunku 2 przedstawiono dystrybucję analizowanych sekwencji pod kątem procesów biologicznych. Mapowanie genetyczne połączone z analizą funkcjonalną in silico daje możliwość rozwiązania jednego z najważniejszych problemów badań struktury genomów, a mianowicie powiązania sekwencji nukleotydowych opracowanych markerów z informacjami dotyczącymi ich ekspresji oraz z pełnioną przez nie funkcją biologiczną. Adnotacja funkcjonalna pozwala na pogrupowanie genów w klasy funkcjonalne, które mogą okazać się bardzo użyteczne w poznaniu i zrozumieniu funkcji poszczególnych genów [Conesa i in. 2005, Götz i in. 2008]. Dlatego też tworzenie map genetycznych bogatych w markery STS połączone z ich równoczesną analizą funkcjonalną jest niezwykle ważnym narzędziem w poznaniu struktury, organizacji i funkcji genomów uprawnych gatunków niemodelowych, w tym łubinu wąskolistnego. WNIOSKI 1. Wykorzystanie starterów zaprojektowanych dla ewolucyjnie konserwatywnych sekwencji kodujących pozwoliło wzbogacić mapę genetyczną łubinu wąskolistnego w 81 markerów zdefiniowanych sekwencyjnie. 2. Adnotacja funkcjonalna in silico nowych markerów STS umożliwiła ich podział pod względem klas funkcjonalnych. 3. Na podstawie przeprowadzonej analizy funkcjonalnej można przypuszczać, że genom Glycine max jest najbardziej reprezentatywnym genomem referencyjnym dla łubinu wąskolistnego. 4. Uzyskane wyniki stanowią podstawę do dalszej identyfikacji markerów bliskosprzężonych z cechami użytkowymi łubinu wąskolistnego, które mogą uprościć selekcję materiału hodowlanego. Opracowane markery mogą być również wykorzystane w analizie syntenii genomów roślin motylkowatych.

8 Mapowanie genetyczne markerów STS w genomie łubinu wąskolistnego PIŚMIENNICTWO Conesa A., Götz S., García-Gómez J.M., Terol J., Talón M., Robles M Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research. Bioinformatics 21: Ellwood S.R., Phan H.T.T., Jordan M., Hane J., Torres A.M., Avila C.M., Cruz-Izquierdo S., Oliver R.P Construction of a comparative genetic map in faba bean (Vicia faba L.), conservation of genome structure with Lens culinaris. BMC Genomics 9: Götz S., Arnold R., Sebastián-León P., Martín-Rodríguez S., Tischler P., Jehl M.-A., Dopazo J., Rattei T., Conesa A B2G-FAR, a species centered GO annotation repository. Bioinformatics 27: Götz S., García-Gómez J.M., Terol J., Williams T.D., Nagaraj S.H., Nueda M.J., Robles M., Talón M., Dopazo J., Conesa A High-throughput functional annotation and data mining with the Blast2GO suite. Nucleic Acids Res. 36: Manly K.F., Cudmore R.H. Jr, Meer J.M Map Manager QTX, cross-platform software for genetic mapping. Mamm. Genome 12: Nelson M.N., Moolhuijzen P.M., Boersma J.G., Chudy M., Leśniewska K., Bellgrad M., Oliver R.P., Święcicki W., Wolko B., Cowling W.A., Ellwood S.R Aligning a new reference genetic map of Lupinus angustifolius with the genome sequence of the model legume, Lotus japonicus. DNA Res. 17: Pazos-Navarro M., Dabauza M., Correal E., Hanson K., Teakle N., Real D., Nelson M.N Next generation DNA sequencing technology delivers valuable genetic markers for the genomic orphan legume species, Bituminaria bituminosa. BMC Genet. 12: Sato S., Isobe S., Asamizu E., Ohmido N., Kataoka R., Nakamura Y., Kaneko T., Samurai N., Okumura K., Klimenio I., Sasamoto S., Wada T., Watanabe A., Kohara M., Fujishiro T., Tabata S Comprehensive structural analysis of the genome of red clover (Trifolium pratense L.). DNA Res. 12: Voorrips R.E MapChart: Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs. J. Hered. 93: Zhu H., Choi H.-K., Cook D.R., Shoemaker R. C Bridging model and crop legumes through comparative genomics. Plant Physiol. 137: K. Kamel, M. Kroc, W. Święcicki GENETIC MAPPING OF STS MARKERS IN NARROW-LEAFED LUPIN (LUPINUS ANGUSTIFOLIUS L.) GENOME AND THEIR FUNCTIONAL ANNOTATION Summary Narrow-leafed lupin (NLL) is one of the three lupin crop species. Lupin farming gained recently much attention, due to the fact that lupin is a valuable source of protein. Unfortunately, our knowledge of the structure and organization of its genome is still rather limited. The main goal of this study was to saturate the most up-to-date reference genetic map of NLL with gene-based, sequence-tagged site markers. A total number of 85 polymorphic markers were generated and 81 of them were located on the narrow-leafed lupin genetic map. The total map length is now 2611,1 cm and the average distance between markers is 3,76 cm. The next step of our studies was the in silico functional analysis of 68 nucleotide sequences of lupin markers. Gene ontology (GO) terms were identified for 32 sequences and defined according to the molecular function, cellular component and biological processes.