(12) OPIS PATENTOWY. (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US97/03313

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US97/03313 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W097/32011, PCT Gazette nr 38/97 (19)PL (11) (13)B1 (51) IntCl7 C12N 9/02 C12N 15/82 C07H 21/04 (54) Izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, sposób wytwarzania roślin oraz sposób zwalczania chwastów (30) Pierwszeństwo: ,US,60/ ,US,60/ (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 04/99 (73) Uprawniony z patentu: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, Bazylea, CH (72) Twórcy wynalazku: Sandra L. Volrathr, Durham, US Marie A. Johnson, Raleigh, US Sharon L. Potter, Raleigh, US Eric R. Ward, Durham, US Peter B. Heifetz, Durham, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 05/04 (74) Pełnomocnik: Wierzchoń Jan, Jan Wierzchoń & Partnerzy, Biuro Patentów i Znaków Towarowych PL B1 (57) 1. Izolowana cząsteczka DNA (a) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mająca sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPO4 ph 7,0, 1 mm EDTA w 50 C; i ii) płukanie w 2 X SSC, 1% SDS w 50 C.

2 Izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, sposób wytwarzania roślin oraz sposób zwalczania chwastów Zastrzeżenia patentowe 1. Izolowana cząsteczka DNA (a) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mająca sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPC>4 ph 7,0, 1 mm EDTA w 50 C; i ii) płukanie w 2 x SSC, 1% SDS w 50 C. 2. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową określoną jako SEKW. ID NR: Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje enzym protox, który ma wprowadzoną co najmniej jedną modyfikację aminokwasu, nadającą enzymowi cechę oporności na herbicydy hamujące protox. 4. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 5. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 4, znamienna tym, że walina jest zastąpiona przez leucynę. 6. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie seryny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż seryna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 7. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 6, znamienna tym, że seryna jest zastąpiona przez prolinę. 8. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502 w SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 9. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 8, znamienna tym, że walina jest zastąpiona przez alaninę. 10. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie alaniny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż alanina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 11. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że alanina jest zastąpiona przez walinę lub treoninę. 12. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie glicyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż glicyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje

3 enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 13. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 10, znamienna tym, że glicyna jest zastąpiona przez serynę. 14. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że modyfikacja obejmuje zastąpienie izoleucyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż izoleucyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. 15. Izolowana cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę. 16. Chimerowy gen zawierający izolowaną cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybiydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaP0 4 ph 7,0, 1 mm ED ta w 50 C;i ii) płukanie w 2 x SSC, 1% SDS w 50 C, operacyjnie połączoną z heterologicznym promotorem aktywnym w roślinie. 17. Chimerowy gen według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu. 18. Chimerowy gen według zastrz. 16, znamienny tym, że dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium. 19. Sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, znamienny tym, że: i) transformuje się materiał roślinny izolowaną cząsteczką DNA określoną w zastrz albo genem chimerowym określonym w zastrz , ii) selekcjonuje się stransformowany materiał, a następnie iii) regeneruje się wyselekcjonowany materiał w morfologicznie normalne, płodne, zdrowe rośliny. 20. Sposób zwalczania chwastów, znamienny tym, że rośliny wytworzone sposobem określonym w zastrz. 19 traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do zwalczania chwastów, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny. * * * Przedmiotem wynalazku jest izolowana cząsteczka DNA kodująca enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, chimerowy gen, zawierający izolowaną cząsteczkę DNA, sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, oraz sposób zwalczania chwastów. Enzym oksydaza protoporfirynogenu, określany zwyczajowo jako protox, bierze udział w szlaku biosyntezy chlorofilu/hemu. Szlaki biosyntezy, które prowadzą do produkcji chlorofilu i hemu mają szereg wspólnych etapów. Chlorofil jest barwnikiem zbierającym światło obecnym we wszystkich zielonych organizmach fotosyntetyzujących. Hem jest kofaktorem hemoglobiny, cytochromu, oksygenaz P450 o mieszanych funkcjach, peroksydaz i katalaz (Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York, (1975)), a zatem, jest niezbędnym składnikiem wszystkich organizmów tlenowych.

4 Ostatni wspólny etap w biosyntezie chlorofilu i hemu to utlenianie protoporfirynogenu IX do protoporfiryny IX. Oksydaza protoporfirynogenu (protox) jest enzymem, który katalizuje ten ostatni etap utleniania (Matringe i wsp., Biochem. J. 260:231, (1989)). Enzym protox został oczyszczony częściowo lub całkowicie z szeregu organizmów, w tym drożdży Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois i Labbe, w Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E.H. Daley, red. McGrawHill, New York str , (1990)), z etioplastów jęczmienia (Jacobs i Jacobs, Biochem. J. 244:219, (1987)) i z wątroby myszy (Daley i Karr, Biochem. 26: 2697, (1987)). Geny kodujące protox wyizolowano z dwóch organizmów prokariotycznych, Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Microbiol. 39: 1155, (1993) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813, (1994)). Te wyizolowane geny nie mają podobnych sekwencji; także przewidywane produkty białkowe nie wykazują identyczności sekwencji aminokwasów. Białko E. coli ma masę około 21 kda i asocjuje z błoną komórkową. Białko B. subtilis ma masę 51 kda, jest rozpuszczalne i ma aktywność cytoplazmatyczną. Geny kodujące protox wyizolowano obecnie także z człowieka (Nishimura i wsp., J. Biol. Chem. 270 (14); , (1995) i rośliny (międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/IB95/00452, zgłoszone 8 czerwca 1995 r., opublikowane 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/34659). Geny protox są stosowane do wytwarzania roślin opornych lub tolerancyjnych na określone herbicydy. Stosowanie herbicydów do zwalczania niepożądanej roślinności, takiej jak chwasty lub rośliny niepożądane w plonach, stało się praktyką nieomal uniwersalną. Mimo tego szerokiego stosowania, zwalczanie chwastów pozostaje znacznym i kosztownym problemem dla rolników. Skuteczność herbicydów zależy od właściwego ich stosowania. Przykładowo, uzyskanie dobrej kontroli nad chwastami, za pomocą herbicydów, zależy od czasu, rodzaju i sposobu stosowania herbicydu, oraz od stadium rozwoju chwastu. Ponieważ różne gatunki chwastów są oporne na herbicydy, produkcja skutecznych herbicydów staje się coraz bardziej ważna. Herbicydy, które wykazują dużą skuteczność i szerokie spektrum działania przeciw chwastom, jak też szybszą degradację w glebie, często wykazują wyższą fitotoksyczność w stosunku do roślin uprawnych. Zaczęto więc wytwarzać rośliny uprawne, które są oporne lub tolerancyjne w stosunku do herbicydów. Hybrydy roślin uprawnych lub odmiany oporne na herbicydy pozwalają na stosowanie herbicydów bez ryzyka zniszczenia plonów. Nadanie roślinie cechy oporności może pozwolić na stosowanie herbicydu w tych uprawach roślin, w których stosowanie herbicydu, ze względu na wrażliwość plonu na herbidyd, było wykluczone lub ograniczone (np. do stosowania przed kiełkowaniem). Przykładowo, opis patentowy US (Andersona i wsp.) ujawnia rośliny posiadające oporność na herbicydy imidazolinowe lub sulfonamidowe. Oporność jest nadawana przez zmieniony enzym syntazę acetohydroksykwasów (AHAS). Opis US (Goodmana i wsp.) ujawnia komórki roślinne i rośliny zawierające gen kodujący zmutowaną syntetazę glutaminy (GS), oporne na hamowanie ich rozwoju przez herbicydy, które były znane jako inhibitory GS, np. fosfinotrycyny i sulfoksiminy metioniny. Z opisu US (Bedbrooka i wsp.) są znane rośliny, które wyrażają zmutowaną syntazę acetomleczanu, która czyni je opornymi na herbicydy sulfonylomocznikowe, zaś z opisu US (Somersa i wsp.) są znane rośliny tolerancyjne na herbicydy cykloheksanodionowe i herbicydy oparte na kwasie arylofenoksypropanowym. Tolerancję nadaje zmieniona karboksylaza acetylokoenzymu A (ACCaza). Enzym protox stanowi cel szeregu związków herbicydowych. Herbicydy, które hamują protox obejmują wiele różnych strukturalnych klas cząsteczek (Duke i wsp. Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli i wsp., Pesticide Biochem Physiol. 43: 193 (1992); Matringe i wsp., FEBS Lett. 245: 35 (1989), Yanase i Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)). Te herbicydy obejmują etery difenylowe (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)- fenoksy)-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-- nitro fenoksy)-4-(trifluorobenzen), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo]-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-oksadiazol-2(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargiloksyfenylo-3,4,5,6-tetrahydroftalamid; chloroftalin, N-(chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4 nitropirazolilo-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydynowe (np. LS ) i

5 fenopilan i jego analogi O-fenylopirrolidonowe i piperydynokarbaminianowe. Wiele z tych związków kompetycyjnie hamuje normalną reakcję katalizowaną przez enzym, wydają się działać jako analogi substratu. Zwykle efekt hamowania protox jest określany przez pomiar fluorescencji w około 622 do 635 nm, po wzbudzeniu w około 395 do 410 nm (Jacobs i Jacobs, Enzyme 28:206, (1992); Sherman i wsp., Plant Physiol. 97:280, (1991)). Oznaczenie to jest oparte na fakcie, że protoporfiryna IX jest barwnikiem fluorescencyjnym, a protoporfirynogen IX nie fluoryzuje. Przewidywany sposób działania herbicydów hamujących protox obejmuje akumulację protoporfirynogenu IX w chloroplaście. Uważa się, że ta akumulacja doprowadza do wyciekania protoporfirynogenu IX do cytosolu, gdzie jest utleniana przez aktywność peroksydazy do protoporfiryny IX. Po ekspozycji na światło, protoporfiryna IX powoduje wytwarzanie singletowego tlenu w cytosolu. Ten singletowy tlen może z kolei doprowadzić do tworzenia innych czynnych form tlenu, co może powodować peroksydację lipidów i dysrupcję błon komórkowych, oraz doprowadza do szybkiej śmierci komórek (Lee i wsp., Plant Physiol. 102:881,(1993)). Nie wszystkie enzymy protox są wrażliwe na herbicydy, które hamują roślinne enzymy protox. Oba enzymy protox kodowane przez geny izolowane z Escherichia coli (Sasarman i wsp., Can. J. Microbiol. 39: 1155, (1993) i Bacillus subtilis (Dailey i wsp., J. Biol. Chem. 269: 813, (1994)) są oporne na te inhibitory herbicydowe. Ponadto, opisano mutanty jednokomórkowego glonu Chlamydomonas reinhardtii oporne na herbicyd fenylimidowy S (Kataoka i wsp., J. Pesticide Sci. 15:449, (1990); Shibata i wsp., w Research in Photosynthesis, tom III, N. Murata, red., Kluwer: Holandia str , (1992)). Przynajmniej jeden z tych mutantów wydaje się mieć zmienioną aktywność protox, która jest oporna nie tylko na inhibitor herbicydowy, na którym selekcjonowano mutanta, ale także na inne klasy inhibitorów protox (Oshio i wsp., Z. Naturforsch. 48c:339 (1993); Sato i wsp. w ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, red. ACS Press: Washington, D.C., (1994)). Opisano także zmutowaną linię komórkową tytoniu oporną na inhibitor S (Che i wsp., Z. Naturforsch. 48c:350, (1993)). Zgodnie z wynalazkiem izolowana cząsteczka DNA stanowi cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaP0 4 ph 7,0, 1 mm EDTA w 50 C; i ii) płukanie w 2 X SSC, 1 % SDS w 50 C. Korzystnie, izolowana cząsteczka DNA zawiera sekwencję nukleotydową określoną jako SEKW. ID NR: 9. Korzystnie, izolowana cząsteczka DNA koduje enzym protox, który ma wprowadzoną co najmniej jedną modyfikację aminokwasu, nadającą enzymowi cechę oporności na herbicydy hamujące protox. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, walina jest zastąpiona przez leucynę. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie seryny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż seryna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, seryna jest zastąpiona przez prolinę. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie waliny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502 w SEKW. ED NR: 10 przez aminokwas inny niż walina i wprowadzenie

6 modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, walina jest zastąpiona przez alaninę. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie alaniny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż alanina i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, alanina jest zastąpiona przez walinę lub treoninę. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie glicyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż glicyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególności, glicyna jest zastąpiona przez serynę. Korzystnie, modyfikacja obejmuje zastąpienie izoleucyny występującej w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID NR: 10 przez aminokwas inny niż izoleucyna i wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. W szczególno ści, izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę. Każdy powyżej wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Według wynalazku chimero wy gen zawiera izolowaną cząsteczkę DNA (a) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy zawierający sekwencję aminokwasową określoną jako SEKW. ID NR: 10, lub (b) kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) pszenicy, mającą sekwencję nukleotydową, która hybrydyzuje do sekwencji nukleotydowej określonej jako SEKW. ID NR: 9 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPCU ph 7,0, 1 mm EDTA w 50 C; i ii) płukanie w 2 X SSC, 1% SDS w 50 C, operacyjnie połączoną z heterologicznym promotorem aktywnym w roślinie. Korzystnie, chimerowy gen dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do chloroplastu. Korzystnie, chimerowy gen dodatkowo zawiera sekwencję sygnałową połączoną w sposób funkcjonalny z cząsteczką DNA, przy czym sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania białka kodowanego przez cząsteczkę DNA do mitochondrium. Sposób wytwarzania roślin, które wykazują cechę tolerancji lub cechę oporności na herbicyd hamujący oksydazę protoporfirynogenu, według wynalazku charakteryzuje się tym, że: i) transformuje się materiał roślinny powyżej zdefiniowaną izolowaną cząsteczką DNA albo powyżej zdefiniowanym genem chimerowym, ii) selekcjonuje się stransformowany materiał i następnie iii) regeneruje się wyselekcjonowany materiał w morfologicznie normalne, płodne, zdrowe rośliny. Sposób zwalczania chwastów, według wynalazku charakteryzuje się tym, że rośliny wytworzone powyżej określonym sposobem traktuje się herbicydem hamującym oksydazę protoporfirynogenu, stosowanym w ilości wystarczającej do zwalczania chwastów, zasadniczo bez oddziaływania na rośliny. Izolowane cząsteczki DNA, kodujące enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny oraz zmodyfikowane formy enzymów oksydazy protoporfirynogenu są oporne na związki, które hamują niezmodyfikowane naturalnie występujące enzymy roślinne protox. Cząsteczki DNA kodujące takie oporne na inhibitory enzymy roślinne protox są wprowadzane pod kontrolą odpowiedniego promotora, w postaci genów hybrydowych, do roślin. Wprowadzone do genonu rośliny zmodyfikowane geny eksprymują w roślinie oporne na inhibitory roślinne enzymy protox.

7 Geny te mogą być stosowane do nadawania oporności na herbicydy hamujące protox w całych roślinach i jako selekcjonowalne markery do transformacji roślin. Rośliny, w tym ich potomstwo, tkanki roślinne i nasiona roślin, zawierające geny wyrażalne w roślinach, kodujące zmodyfikowane enzymy protox, są oporne na inhibitory protox w ilościach, które normalnie są hamujące dla naturalnie występujących w roślinach aktywności protox. Sposób według wynalazku umożliwia wytwarzanie roślin, w tym materiał roślinny, taki jak na przykład tkanki roślinne, protoplasty, komórki, kalusy, narządy, nasiona roślin, zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty, wraz z dowolnym innym rozmnażającym się materiałem i częściami roślin, jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie pochodzące z roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, które produkują formę roślinnego enzymu protox opornego na inhibitor. Takie rośliny mogą być stabilnie transformowane za pomocą genu struktury kodującego oporny protox, lub mogą być wytwarzane za pomocą bezpośrednich technik selekcji, w których linie opome na herbicyd są izolowane, charakteryzowane i rozwijane, a także przez stosowanie technologii transformacji plastydów, w przypadkach gdy jest korzystne, aby geny protox były wyrażane w chloroplaście rośliny. Zmodyfikowane geny są stosowane jako sondy do wykrywania obecności genów kodujących opome na inhibitor formy enzymu roślinnego protox i do ilościowego określania poziomów opornych na inhibitor transkryptów protox w tkance roślinnej. Mogą być też stosowane do identyfikowania lub badania przesiewowego roślin lub tkanki roślinnej zawierającej i/lub eksprymującej gen kodujący oporną na inhibitor formę roślinnego enzymu protox. Sekwencja kodująca DNA dla enzymu oksydazy protoporfirogenu (protox) z dowolnego organizmu eukariotycznego może być uzyskana za pomocą metod standardowych. Roślinami do których zmodyfikowane enzymy protox mogą być wprowadzane są zwłaszcza rośliny uprawne, takie jak kukurydza, jęczmień, pszenica, sorgo, żyto, ow ies, trawy darniowe i paszowe, proso, ryż, trzcina cukrowa, soja, bawełna, burak cukrowy, rzepak oleisty i tytoń. OPIS LISTY SEKWENCJI SEKW. ID NR: 1: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l Arabidopsis thaliana. SEKW. ID NR: 2: Sekwencja aminokwasów protox-l Arabidopsis kodowana przez SEKW. ID NR: 1. SEKW. ID NR: 3: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 Arabidopsis thaliana. SEKW. ID NR: 4: Sekwencja aminokwasów protox-2 Arabidopsis kodowana przez SEKW. ID NR: 3. SEKW. ID NR: 5: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l kukurydzy. SEKW. ID NR: 6: Sekwencja aminokwasów protox-l kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR: 5. SEKW. ID NR: 7: Sekwencja DNA kodująca białko protox-2 kukurydzy. SEKW. ID NR: 8: Sekwencja aminokwasów protox-2 kukurydzy kodowana przez SEKW. ID NR: 7. SEKW. ID NR: 9: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l pszenicy. SEKW. ID NR: 10: Sekwencja aminokwasów protox-l pszenicy kodowana przez SEKW. ID NR: 9. SEKW. ID NR: 11: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l soi. SEKW. ID NR: 12: Sekwencja aminokwasów protox-l soi kodowana przez SEKW. IDNR: 11. SEKW. ID NR: 13 : Sekwencja promotora genu protox-l Arabidopsis thaliana. SEKW. IDNR: 14: Sekwencja promotora genu protox-l kukurydzy. SEKW. ID NR: 15: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l bawełny. SEKW. ID NR: 16: Sekwencja aminokwasów protox-l bawełny kodowana przez SEKW. IDNR: 15. SEKW. ID NR: 17: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l buraka cukrowego. SEKW. ID NR: 18: Sekwencja aminokwasów protox-l buraka cukrowego kodowana przez SEKW. IDNR: 17.

8 SEKW. ID NR: 19: Sekwencja DNA kodująca białko protox-l rzepaku. SEKW. ID NR: 20: Sekwencja aminokwasów protox-l rzepaku kodowana przez SEKW. IDNR: 19. SEKW. ID NR: 21: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 ryżu. SEKW. ID NR: 22: Sekwencja aminokwasów protox-1 ryżu kodowana przez SEKW. ID NR: 21. SEKW. ID NR: 23: Sekwencja DNA kodująca białko protox-1 sorgo. SEKW. ID NR: 24: Sekwencja aminokwasów protox-l sorgo kodowana przez SEKW. ID NR: 24. SEKW. ID NR: 25: Sekwencja intronu protox-l kukurydzy. SEKW. ID NR: 26: Sekwencja promotora protox-l buraka cukrowego. SEKW. ID NR: 27: Primer Pclp_Pla dla górnej nici promotora genu plastydowego clpp SEKW. ID NR: 28: Primer Pclp_P1b dla dolnej nici promotora genu plastydowego clpp SEKW. ID NR: 29: Primer Pclp_P2b dla górnej nici promotora genu plastydowego clpp SEKW. ID NR: 30: Primer Trpsl6_Pla dla górnej nici genu plastykowego rps16 SEKW. ID NR: 31: Primer Trpsl6_Pl a dla dolnej nici genu plastydowego rps16 SEKW. ID NR: 32: Primer minpsb_u dla górnej nici genu plastydowego psba SEKW. ID NR: 33: Primer minpsb U dla dolnej nici genu plastydowego psba SEKW. ID NR: 34: Primer APRTXP1 a dla górnej nici SEKW. ID NR: 35: Primer APRTXP1 b dla dolnej nici DEPOZYTY Następujące cząsteczki wektorów zdeponowano w Agricultural Research Service, Patent Cuture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois USA, w podanych poniżej datach: Protox 1 a pszenicy w wektorze pbluescript' SK zdeponowano 19 marca 1996 jako pwdc-13 (NRRL#B 21545). Protox-1 soi w wektorze pbluescript SK zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pwdc-12 (NRRL#B-21516). Protox-1 bawełny w wektorze pbluescript SK zdeponowano 1 lipca 1996 jako pwdc- 15(NRRL#B-21594). Protox -1 buraka cukrowego w wektorze pbluescript SK zdeponowano 29 lipca 1996 jako pwdc-16 (NRRL#B-21595N). Protox-1 rzepaku w wektorze pbluescript SK zdeponowano 23 sierpnia 1996 jako pwdc-17 (N RRU B-21615). Protox ryżu w wektorze pbluescript SK zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pwdc- 18(NRRL#B-21648). Protox-1 sorgo w wektorze pbluescript SK zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pwdc- 19 (NRRL#B-21649). Opornego mutanta parac-2cys w plazmidzie pmut-1 zdeponowano 14 listopada 1994 pod nazwą pwdc-7 w Agricultural Research Culture Collection i uzyskał nazwę depozytową NRRL# 21339N. AraPT1Pro zawierający promotor Protox-l1Arabidopsis zdeponowano 15 grudnia 1995 jako pwdc-11 (NRRUB-21515). Plazmid zawierający promotor Protox-1 kukurydzy w formie fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-l kukurydzy zdeponowano 19 marca 1996 jako pwdc-14 (NRRL#B ). Plazmid zawierający promotor Protox-1 buraka cukrowego zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pwdc-20 (NRRL#B-21650). Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox pszenicy są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 9 i 10. Podano również sekwencje kodujące DNA i odpowiednie sekwencje aminokwasów dla innych roślin. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox soi są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 11 i 12. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox bawełny są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 15 i 16. Sekwencja

9 kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox buraka cukrowego są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 17 i 18. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox rzepaku są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 19 i 20. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox ryżu są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 21 i 22. Sekwencja kodująca DNA i odpowiednia sekwencja aminokwasów dla enzymu protox sorgo są podane odpowiednio jako SEKW. ID NR: 23 i 24. Sekwencje kodujące DNA i odpowiednie sekwencje aminokwasów dla enzymów protox Arabidopsis thaliana i kukurydzy, które były uprzednio wyizolowane są podane jako SEKW. ID NR: 1-4 {Arabidopsis) oraz SEKW. ID NR: 5-8 (kukurydza). Wyizolowane cząsteczki DNA kodujące enzym oksydazę protoporfirogenu (protox) rośliny dwuliściennej, charakteryzują się tym, że wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z SEKW. ID NR: 12, 16, 18 i 20. Wyizolowane cząsteczki DNA kodujące enzym oksydazę protoporfirogenu (protox) rośliny jednoliściennej, charakterystyzują się tym, że wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów wybraną z grupy złożonej z SEKW. ID NR: 10, 22 i 24. Sekwencja kodująca DNA dla enzymu oksydazy protoporfirogenu (protox) z dowolnego organizmu eukariotycznego może być uzyskana stosując metody standardowe. Izolowane cząsteczki DNA kodujące enzym protox mają odpowiednie sekwencje nukleotydów, które hybrydyzują do sekwencji nukleotydowej SEKW. ID NR: 9, 11, 15, 17, 19, 21 i 23 w następujących warunkach hybrydyzacji i płukania: i) hybrydyzacja w 7% soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS), 0,5 M NaPC>4 ph 7,0, 1 mm EDTA w 50 C; i ii) płukanie w 2 X SSC, l % SDS w 50 C. Izolowane eukariotyczne sekwencje mogą być manipulowane zgodnie ze standardowymi technikami inżynierii genetycznej, aby odpowiadać pożądanemu celowi. Przykładowo, cała sekwencja protox lub jej części mogą być zastosowane jako sondy zdolne do specyficznej hybrydyzacji do sekwencji kodujących protox i mrna. Aby uzyskać specyficzną hybrydyzację w różnych warunkach, sondy zawierają sekwencje, które są unikalne wśród sekwencji kodujących protox i korzystnie mają przynajmniej 10 nukleotydów długości, a najbardziej korzystnie przy najmniej 20 nukleotydów długości. Takie sondy mogą być zastosowane do amplifikacji i analizy sekwencji kodujących protox z wybranego organizmu za pomocą dobrze znanego procesu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Technika ta może być użyteczna do izolowania dodatkowych sekwencji kodujących protox z pożądanego organizmu lub jako oznaczenie diagnostyczne, aby określić obecność sekwencji kodujących protox u organizmu. Czynniki, które wpływają na stabilność hybryd, określają ostrość warunków hybrydyzacji. Jednym z czynników jest temperatura topnienia Tm, która może być łatwo obliczona według wzoru podanego w DNA PROBES, George H. Keller i Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd. 1993, Section one: Molecular hybridization Technology, str. 8 i dalsze. Korzystna temperatura hybrydyzacji leży w zakresie około 25 C poniżej wyliczonej temperatury topnienia Tm, korzystnie w zakresie C poniżej wyliczonej temperatury topnienia Tm, zaś w przypadku oligonukleotydów w zakresie 5-10 C poniżej temperatury topnienia Tm. Do modyfikacji mogą być stosowne cząsteczki, które hybrydyzują do cząsteczki DNA kokującej zmodyfikowany enzym protox, korzystnie do sondy oligonukleotydowej otrzymywanej ze zmodyfikowanej cząsteczki DNA, zawierającej ciągły fragment sekwencji wymienionego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) o długości przynajmniej 10 nukleotydów, w umiarkowanie ostrych warunkach. Sondy nukleotydowe mogą być stosowane, w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), do specyficznej hybrydyzacji z roślinnym genem protox lub z mrna o długości przynajmniej 10 nukleotydów. Sondy zdolne do specyficznej hybrydyzacji do eukariotycznej sekwencji DNA kodującej aktywność oksydazy protoporfirogenu lub odpowiedniego mrna, mogą być stosowane do wykrywania wymienionych sekwencji DNA w organizmach eukariotycznych.

10 Specyficzne sondy hybrydyzacyjne protox mogą też być stosowane do zmapowania położenia naturalnych eukariotycznych genów (lub genu) protox w genomie wybranego organizmu stosując standardowe techniki oparte na wybiórczej hybrydyzacji sondy do genomowych sekwencji protox. Techniki te obejmują identyfikację polimorfizmów DNA określonych lub zawartych w sekwencji sondy protox, i użycie takich polimorfizmów do śledzenia segregacji genu protox w stosunku do innych markerów o znanej pozycji na mapie w populacji do mapowania pochodzącej z samozapylenia mieszańca z dwóch polimorficznych linii rodzicielskich (Helentjaris i wsp., Plant Mol. Biol. 5:109 (1985); Sommer wsp. Biotechniques 12:1982 (1982); D' Ovidio i wsp., Plant Mol. Biol. 15:169 (1990)). Podczas gdy każda eukariotyczna sekwencja protox jest rozważana jako użyteczna sonda do mapowania genów protox z dowolnego organizmu eukariotycznego, preferowanymi sondami są sekwencje protox z organizmów bardziej blisko spokrewnionych z wybranym organizmem, a najbardziej preferowanymi sondami są sekwencje proton z wybranego organizmu. Mapowanie genów protox w ten sposób jest rozważane jako szczególnie użyteczne w celach hodowli roślin. Przykładowo, poprzez znajomość pozycji na mapie genetycznej zmutowanego genu protox nadającego oporność na herbicyd można identyfikować flankujące markery DNA z referencyjnej mapy genetycznej (Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). Podczas introgresji cechy oporności na herbicydy do nowej linii hodowlanej markery te mogą być następnie wykorzystane do śledzenia zakresu DNA chromosomalnego flankującego protox, który jest jeszcze obecny w rekurencyjnym rodzicu po każdej rundzie krzyżówek wstecznych. Sondy do hybrydyzacji specyficzne dla protox mogą być też stosowane do określania ilościowo ilości mrna protox w organizmie stosując standardowe techniki jak analizę typu Northern. Ta technika może być stosowana jako oznaczenie diagnostyczne, aby wykiywać zmienione poziomy ekspresji protox, które mogą być związane z poszczególnymi niesprzyjającymi warunkami, takimi jak autosomalna dominująca choroba u człowieka, związana zarazem z objawami neuropsychiatrycznymi oraz uszkodzeniami skóry, które są związane z obniżonymi poziomami aktywności protox (Brenner i Bloomer, New Engl. J. Med. 302:765, (1980)). Cząsteczki DNA zawierające fragment DNA kodujący białko mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być wytwarzane, jak też izolowane z dowolnej rośliny, poprzez sposób obejmujący: a) przygotowanie sondy nukleotydowej zdolnej do specyficznej hybrydyzacji do roślinnego genu protox lub mrna, charakterystycznej tym, że wymieniona sonda zawiera ciągły fragment sekwencji kodującej białko protox rośliny o długości co najmniej 10 nukleotydów; b) poszukiwanie innych sekwencji kodujących protox w populacjach sklonowanych fragmentów genomowego DNA lub fragmentów cdna z wybranego organizmu z zastosowaniem sondy nukleotydowej przygotowanej zgodnie z etapem (a); oraz c) izolację i namnożenie cząsteczki DNA zawierającej fragment DNA kodujący białko mające aktywność enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox). Natomiast wytwarzanie zasadniczo czystej sekwencji DNA kodującej białko wykazujące aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox), prowadzi się w sposób następujący: a) przygotowanie biblioteki genomowej lub cdna z odpowiedniego organizmu wyjściowego stosując odpowiedni wektor do klonowania; b) hybrydyzację biblioteki z cząsteczką sondy; oraz c) określenie pozytywnych hybrydyzacji sondy do klonów DNA z biblioteki to znaczy klonów potencjalnie zawierających sekwencje odpowiadające sekwencji aminokwasów dla oksydazy protoporfirynogenu (protox). Ponadto, sposób wytwarzania zasadniczo czystej sekwencji DNA kodującej białko wykazujące aktywność enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje: a) przygotowanie całkowitego DNA z biblioteki genomowej lub cdna; b) zastosowanie DNA z etapu (a) jako matrycy do reakcji PCR z primerami przedstawiającymi części o niskim stopniu degeneracji sekwencji aminokwasów oksydazy protoporfirynogenu (protox).

11 Oznaczanie inhibitorów aktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje: a) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu; b) pomiar niezahamowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a); c) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem; d) pomiar hamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i e) porównanie hamowanej reaktywności do niehamowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox). Oznaczanie opornych na inhibitory mutantów oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmuje: a) inkubację pierwszej próbki oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej inhibitor enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox); b) pomiar niezmutowanej reaktywności oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (a); c) inkubację pierwszej próbki zmutowanego enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) i jej substratu w obecności drugiej próbki zawierającej związek będący inhibitorem oksydazy protoporfirynogenu (protox); d) pomiar zmutowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox) z etapu (c); i e) porównanie zmutowanej reaktywności do niezmutowanej reaktywności enzymu oksydazy protoporfirynogenu (protox). Dla wytworzenia enzymu w organizmie gospodarza, przy zastosowaniu technik rekombinacji DNA, sekwencja kodująca protox może być wstawiona do kasety ekspresyjnej zaprojektowanej dla wybranego gospodarza, zostać wprowadzona do tego gospodarza i następnie przez gospodarza wyrażana. Wybór specyficznych sekwencji regulatorowych takich jak promotor, sekwencja sygnałowa, sekwencje 5' i 3' nie ulegające translacji i enhancer jest w zakresie umiejętności osoby o przeciętnych umiejętnościach w dziedzinie. Powstała cząsteczka zawierająca poszczególne elementy połączone w odpowiedniej ramce odczytu może być wstawiona do wektora, który może być wtransformowany do komórki gospodarza. Odpowiednie wektory ekspresyjne i sposoby do produkcji zrekombinowanych białek są dobrze znane dla organizmów gospodarzy takich jak E. coli (Studier i Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113 (1986); Brosius, DNA : 759 (1989)), drożdży (Schneider i Guarente, Meth. Enzymol 194: 373 (1991)) i komórek owadów (Lucków i Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)). Specyficzne przykłady obejmują plazmidy takie jak pbluescript (Stratagene, La Jolla, CA), pflag (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), ptrchis (lnvitrogen, La Jolla, CA) i bakulowirusowe wektory ekspresyjne, np. pochodzące z genomu wirusa polihedruzy jądrowej Autograph i ca californica (AcMNPV). Korzystnym systemem bakulowirus/owad są komórki pvi 11392/Sf21 (lnvitrogen, La Jolla, CA). Wytwarzany za pomocą rekombinacji eukariotyczny enzym protox jest pożyteczny dla różnych celów, przykładowo, może być użyty do dostarczania aktywności protox in vitro. Może być też użyty jako oznaczenie in vitro do badań przesiewowych znanych związków herbicydowych, których cel nie jest znany aby sprawdzić czy hamują protox. Takie oznaczenie in vitro może też być stosowane jako bardziej ogólne badanie przesiewowe dla określenia związków chemicznych, które hamują aktywność protox, a zatem mogą być stosowane jako herbicydy. Produkowany za pomocą rekombinacji eukariotyczny enzym protox może też być zastosowany w oznaczeniu do identyfikacji mutantów protox opornych na inhibitory (międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr PCT/IB95/00452, zgłoszone 8 czerwca 1995 r., opublikowane 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/34659). Alternatywnie, enzym protox wytworzony za pomocą metod rekombinacji może być użyty dla dalszej charakteryzacji jego asocjacji ze znanymi inhibitorami, aby w racjonalny sposób planować nowe hamujące herbicydy jak i tolerujące herbicyd formy enzymu.

12 Sekwencje aminokwasów każdej roślinnej oksydazy protoporfirynogenu (protox) mogą być modyfikowane, aby uzyskać oporną na inhibitor formę tego enzymu. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) ma przy najmniej jedną modyfikację aminokwasu, dla nadawania oporności na inhibitor protox. Zmodyfikowane białko toleruje herbicyd w ilościach, które hamują eukariotyczne białko. Określenie hamują oznacza obniżenie aktywności enzymatycznej obserwowane w obecności danego herbicydu w porównaniu do poziomu aktywności obserwowanego w nieobecności danego herbicydu, gdzie korzystnie procent obniżenia jest przynajmniej 10%, bardziej korzystnie 50% a najbardziej korzystnie co najmniej 90%. Cząsteczka DNA kodująca zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox) zawierającą eukariotyczny protox (np. enzym protox pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu i sorgo), ma przynajmniej jedną modyfikację aminokwasu, charakterystyczną tym, że zmodyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Jak wyżej podano, wprowadzenie modyfikacji nadaje enzymowi protox cechę tolerancji na herbicyd, stosowany w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że cysteina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 159 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Cysteina jest zastąpiona przez fenyloalaninę lub lizynę, a zwłaszcza przez fenylolaninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że izoleucyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 419 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Izoleucyna jest zastąpiona przez treoninę, histydynę, glicynę lub asparaginę, a zwłaszcza przez treoninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 164 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę, leucynę lub walinę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że glicyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 165 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Glicyna jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę lub leucynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 370 SEKW. ID NR: 6 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez izoleucynę lub metioninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 356 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona przez leucynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że seryna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 421 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Seryna jest zastąpiona zwłaszcza przez prolinę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 502

13 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona zwłaszcza przez alaninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 211 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez walinę lub treoninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że glicyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 212 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Glicyna jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że izoleucyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 466 SEKW. ID NR: 10 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Izoleucyna jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że prolina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 369 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Prolina jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę lub histydynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że alanina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 226 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Alanina jest zastąpiona zwłaszcza przez treoninę lub leucynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że walina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 517 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Walina jest zastąpiona zwłaszcza przez alaninę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 432 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez leucynę lub izoleucynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że prolina występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 365 SEKW. ID NR: 12 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Prolina jest zastąpiona zwłaszcza przez serynę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 428 SEKW. ID NR: 16 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez cysteinę lub argininę. Zmodyfikowana oksydaza protoporfirynogenu (protox) zawierająca roślinny protox charakteryzuje się tym, że tyrozyna występująca w pozycji odpowiadającej aminokwasowi 449 SEKW. ID NR: 18 jest zastąpiona przez inny aminokwas, przy czym wymieniony modyfikowany protox toleruje herbicyd w ilościach, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tyrozyna jest zastąpiona zwłaszcza przez cysteinę, leucynę, izoleucynę, walinę lub metioninę.

14 Kasety ekspresyjne i wektory zrekombinowane zawierające wymienione kasety ekspresyjne i zawierające zasadniczo promotor, w szczególności promotor, który jest aktywny w roślinie, mogą być czynnie powiązane z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z organizmu eukariotycznego. Kaseta ekspresyjna może dodatkowo zawierać sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z wymienioną cząsteczką DNA, wyróżniającą się tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania wymienionego białka kodowanego przez wymienioną cząsteczkę DNA do chloroplastu lub mitochondriów. Gen hybrydowy, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą zasadniczo promotor, ale w szczególności promotor, który jest aktywny w roślinie, jest funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z organizmu eukariotycznego. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny, przykładowo z Arabidopsis, trzciny cukrowej, soi, jęczmienia, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, pszenicy, sorgo, żyta, owsa, traw darniowych i paszowych, prosa, paszy i ryżu. Gen hybrydowy zawiera zwłaszcza promotor czynny w roślinie połączony funkcjonalnie z heterologiczną cząsteczką DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox), przykładowo, z protox pszenicy zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 10, protox soi zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 12, protox bawełny zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 16, protox buraka cukrowego zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 18, protox rzepaku zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 20, protox ryżu zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 22 i protox sorgo zawierający sekwencję podaną w SEKW. ED NR: 24. Stosowane określenie protox-l oznacza protox z chloroplastów, zaś protox-2 oznacza protox z mitochondriów. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z gatunku Arabidopsis mające aktywność protox-l lub protox-2, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 2 lub SEKW. ID NR: 4. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z kukurydzy mające aktywność protox-l lub protox-2, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 6 lub SEKW. ID NR: 8. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z pszenicy mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 10. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z soi mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 12. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z bawełny mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 16. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z buraka cukrowego mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 18. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z rzepaku mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 20. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z ryżu mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 22. Gen hybrydowy charakteryzuje się tym, że cząsteczka DNA koduje białko z sorgo mające aktywność protox-l, przy czym wymienione białko zawiera sekwencję aminokwasów podaną w SEKW. ID NR: 24. Gen hybrydowy może być w postaci, która zawiera kasetę ekspresyjną, złożoną zasadniczo z promotora, w szczególności z promotora, który jest czynny w roślinie, funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox) z orga-

15 nizmu eukariotycznego, oporną na poziomy herbicydów, hamujące niezmodyfikowaną formę enzymu. Cząsteczka DNA może kodować oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny wybranej z grupy złożonej z Arabidopsis, trzciny cukrowej, soi, jęczmienia, bawełny, tytoniu, buraka cukrowego, rzepaku oleistego, kukurydzy, przenicy, sorgo, żyta, owsa, traw darniowych i paszowych, prosa, paszy i ryżu. Gen hybrydowy zawierający promotor, który jest aktywny w roślinie, może być funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą zmodyfikowaną oksydazę protoporfirynogenu (protox), mającego przy najmniej jedną modyfikację aminokwasu, która nadaje oporność na inhibitor protox. Gen hybrydowy może dodatkowo zawierać sekwencję sygnałową funkcjonalnie połączoną z wymienioną cząsteczką DNA, charakterystyczną tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do adresowania białka kodowanego przez wymienioną sekwencję DNA do chloroplastu lub do mitochondriów. Ponadto, gen hybrydowy może zawierać jeszcze sekwencję sygnałową, wyróżniającą się tym, że wymieniona sekwencja sygnałowa jest zdolna do kierowania wymienionego białka kodowanego przez wymienioną cząsteczkę DNA do mitochondriów. Zrekombinowane cząsteczki DNA zawierają roślinną oksydazę protoporfirynogenu lub jej funkcjonalnie równoważny odpowiednik. Zrekombinowany wektor DNA zawiera wymienioną zrekombinowaną cząsteczkę DNA. Zrekombinowany wektor zawierający hybrydowy gen, charakteryzuje się tym, że wymieniony wektor jest zdolny do stabilnej transformacji rośliny, nasion rośliny, tkanki roślinnej lub komórki roślinnej. Stabilnie transformowana wektorem roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującej oksydazę protoporfirynogenu (protox). Korzystny jest wektor zrekombinowany, charakteryzujący się tym, że roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna stabilnie transformowana wymienionym wektorem jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującej oksydazę protoporfirynogenu (protox) z rośliny, która jest oporna na herbicydy na poziomie, który hamuje odpowiednią niezmodyfikowaną wersję enzymu. Zrekombinowany wektor zawierający promotor aktywny w roślinie jest funkcjonalnie powiązany z heterologiczną cząsteczką DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox). Wektor zrekombinowany, charakteryzuje się tym, że roślina, nasiona rośliny, tkanka roślinna lub komórka roślinna, stabilnie transformowana wymienionym wektorem, jest zdolna do ekspresji cząsteczki DNA kodującą oksydazę protoporfirynogenu (protox), przykładowo, protox pszenicy zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 10, protox soi zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 12, protox bawełny zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 16, protox buraka cukrowego zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 18, protox rzepaku zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 20, protox ryżu zawierający sekwencję podaną w SEKW. ID NR: 22 oraz protox sorgo zawierający sekwencję podaną w SEKW. IDNR: 24. Komórka gospodarza stabilnie transformowana wektorem, charakteryzuje się tym, że wymieniony gospodarz jest zdolny do ekspresji wymienionej cząsteczki DNA. Komórka gospodarza może być wybrana z grupy złożonej z komórki roślinnej, komórki bakterii, komórki drożdży i komórki owadów. Wytworzone rośliny, ich potomstwo, tkanki roślinne i nasiona roślin, są tolerancyjne w stosunku do herbicydów, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Tolerancja na herbicyd jest nadana przez gen eksprymujący zmodyfikowany oporny na inhibitor enzym protox. Roślinami, które są poddawane działaniu herbicydów, są zwłaszcza rośliny o znaczeniu rolniczym, okrytonasienne i nagonasienne, takie jak Arabidopsis, trzcina cukrowa, soja, jęczmień, bawełna, tytoń, burak cukrowy, rzepak oleisty, kukurydza, pszenica, sorgo, żyto, owies, trawy darniowe i paszowe, proso, ryż, itp. Transgeniczna tkanka roślinna (obejmująca rośliny i ich potomstwo, nasiona, i hodowane tkanki), stabilnie transformowana przynajmniej jednym hybrydowym genem, zwłaszcza genem, który zawiera kasetę ekspresyjną zawierającą promotor (w szczególności promotor,

16 który jest czynny w roślinie, funkcjonalnie powiązany z cząsteczką DNA kodującą enzym oksydazę protoporfirynogenu (protox), jest oporna na herbicydy na poziomach, które hamują odpowiednią niezmodyfikowaną wersję enzymu w tkankach roślinnych. Zrekombinowana cząsteczka DNA według wynalazku może być wprowadzona do komórki roślinnej w szereg sposobów znanych w dziedzinie. Odpowiednie metody transformacji komórek roślinnych obejmują mikroinjekcję (Crossway i wsp., Bio Techniques 4: (1986)), elektroporację (Riggs i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: (1986), przenoszenie, w którym pośredniczy Agrobacterium (Hinchee i wsp., Biotechnology 6: (1988)), bezpośrednie przeniesienie genów (Paszkowski) Paszowski wsp., EMBO J. 3: (1984)), balistyczne przyspieszenie cząsteczek stosując urządzenia dostepne od Agracetus, Inc. Madison, Wisconsin i Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (np. Sanford i wsp., US ; i McCabe i wsp., Biotechnology 6: (1988)) i metody transformacji/regeneracji protoplastów (opis patentowy US wydany 27 września 1994 r. dla Ciba-Geigy Copr.). Ponadto, odpowiednie sposoby postępowania są ujawnione w publikacjach Weissinger i wsp., Annual Rev. Genet 22: (1988); Sanford i wsp., Particulate Science and Technology 5:27-27 (1987) (cebula); Christou i wsp., Plant Physiol. 87: (1988) (soja); McCabe i wsp., Bio/Technology 6: (1988) (soja); Datta i wsp., Bio/Technology 8: (1990) (ryż), Klein i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: (kukurydza); Klein i WSP., Bio/Technology 6: ) kukurydza); Klein i wsp., Plant Physiol. 91: (kukurydza); Fromm i wsp., Bio/Technology 8: (1990); i Gordon-Kamm i wsp., Paint Cell 2: (1990) (kukurydza). Rośliny transgeniczne, w szczególności rośliny transgeniczne transformowane za pomocą powyżej wymienionych sposobów i ich bezpłciowe i/lub płciowe potomstwo, są nadal oporne albo przynajmniej tolerują hamowanie przez herbicyd na poziomach, które są normalnie hamujące dla naturalnie występującej aktywności proton w roślinie. Rośliny potomne także obejmują rośliny z innym tłem genetycznym niż roślina rodzicielska, które to rośliny są wynikiem programu krzyżowania wstecznego wstecznego nadal zawierają w swoim genomie cechę oporności. Korzystne są rośliny hybrydowe, które SA oporne lub przynajmniej tolerancyjne na inhibicję przez herbicyd na poziomach, które są normalnie hamujące dla naturalnie występującej aktywności protox w roślinie. Transgeniczna roślina może być dwuliścienna lub jednoliścienna. Rośliny jednoliścienne z rodziny Graminaceae obejmujące rośliny Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale i Setaria. Wytwarzana jest zwłaszcza transgeniczna kukurydza, pszenica, owies, sorgo, żyto, trawy darniowe i paszowe, proso oraz ryż. Roślinami dwuliściennymi są Arabidopsis, soja, bawełna, burak cukrowy, trzcina cukrowa, rzepak oleisty, tytoń i słonecznik. Wytwarzana jest zwłaszcza transgeniczna soja, bawełna, tytoń, burak cukrowy i rzepak oleisty. Określenie potomstwo oznacza potomstwo roślin powstałe za równo w sposób bezpłciowy i płciowy. Ta definicja ma także obejmować wszystkie mutanty i warianty otrzymywane za pomocą znanych procedur jak na przykład fuzji komórek lub selekcji mutantów i które nadal wykazują charakterystyczne właściwości wyjściowej rośliny tranformowanej wraz z produktami krzyżowania i fuzji stransformowanego materiału roślinnego. To także obejmuje rośliny potomne powstałe w wyniku programu krzyżowania wstecznego, tak długo jak wymienione rośliny potomne nadal zawierają cechę oporności na herbicyd. Materiał proliferacyjny roślin transgenicznych oznacza każdy materiał roślinny, który może być namnażany płciowo lub bezpłciowo in vivo lub in vitro. Szczególnie preferowane są protoplast, komórki, kalusy, tkanki, narządy, nasiona, zarodki, pyłek, komórki jajowe, zygoty wraz z każdym innym materiałem do namnażania uzyskanym z roślin transgenicznych. Części roślin, takie jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie, pochodzące od roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, również zawierają, przynajmniej częściowo, komórki transgeniczne. Możliwe jest wytworzenie roślin, protoplastów, komórek, kalusów, tkanek, narządów, nasion, zarodków, pyłku, komórek jajowych, zygot wraz z dowolnym innym materiałem do namnażania, części roślin, takie jak na przykład kwiaty, łodygi, owoce, liście, korzenie, po-

17 chodzące od roślin transgenicznych lub ich potomstwa uprzednio transformowanych za pomocą sposobu według wynalazku, które więc wytworzyły oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego protox poprzez transformację rośliny, za pomocą DNA według wynalazku. Korzystny jest sposób produkcji komórki gospodarza zawierającej izolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmujący transformację wymienionego gospodarza za pomocą zrekombinowanej cząsteczki wektora. Ponadto, korzystna jest metoda wytworzenia komórki roślinnej zawierającej izolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta, mające aktywność oksydazy protoporfiry nogenu (protox) obejmująca transformację wymienionego gospodarza za pomocą zrekombinowanej cząsteczki wektora. Korzystny jest sposób produkujący transgeniczne potomstwo transgenicznej rośliny rodzicielskiej obejmujący wyizolowaną cząsteczkę DNA kodującą białko z eukarionta mające aktywność oksydazy protoporfirynogenu (protox) obejmujący transformację wymienionej rośliny rodzicielskiej zrekombinowaną cząsteczką wektora i przeniesienie cechy tolerancji na herbicyd na potomstwo wymienionej transgenicznej rośliny rodzicielskiej używając znanych technik hodowli roślin. Sposób wytwarzania roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, które produkują oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego protox, polega na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasiona roślin i części roślin są stabilnie stransformowane genem struktury kodującym oporny enzym protox. Sposób wytwarzania roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, polega zwłaszcza na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasiona roślin i części roślin są stablilnie stransformowane DNA. Sposób wytwarzania wymienionych roślin, tkanek roślinnych, nasion roślin i części roślin, które produkują oporną na inhibitor formę enzymu roślinnego protox, polega na tym, że rośliny, tkanki roślinne, nasion roślin i części roślin są przygotowane za pomocą technik bezpośredniej selekcji, dzięki czemu izolowane, scharakteryzowane i rozwijane linie są oporne na herbicydy. Właściwości genetyczne wprowadzone do transgenicznych nasion i roślin opisanych powyżej są przekazywane poprzez rozmnażanie płciowe lub wzrost wegetatywny i w ten sposób mogą być utrzymywane i propagowane w roślinach potomnych. A zatem, utrzymywanie i propagacja wykorzystują znane metody rolnicze opracowane dla spełnienia specyficznych celów, takich jak uprawianie, sianie lub zbieranie. Wyspecjalizowane procesy, takie jak hydroponika i technologie szklarniowe, też mogą być stosowane. Z uwagi na fakt, że rosnące rośliny są wrażliwe na atak i zniszczenia powodowane przez owady, na zakażenia, jak i na współzawodnictwo z chwastami, podejmuje się stosowne działania aby kontrolować chwasty, choroby roślin, owady, nicienie i inne niekorzystne warunki, tak aby polepszyć plony. Działania te obejmują mechaniczne sposoby, takie jak uprawianie gleby lub usuwanie chwastów i zakażonych roślin, oraz stosowanie agrochemikaliów takich jak herbicydy, fungicydy, środki nicieniobójcze, regulatory wzrostu, środki powodujące dojrzewanie i insektycydy. Specyficzne właściwości genetycznych roślin i nasion transgenicznych mogą być dalej wykorzystywane w hodowli roślin, mającej na celu opracowanie odmian roślin z polepszonymi właściwościami, takimi jak tolerancja na szkodniki, tolerancja na herbicydy, lub tolerancja na stres, lepsza wartość odżywcza, większa wydajność, lub ulepszona struktura powodująca mniejsze straty z wylęgania lub rozrywania. Te różne etapy hodowlane polegają na stosowaniu znanych sposobów, takich jak wybór linii do krzyżowania, kierowanie zapylania linii rodzicielskich, lub wybór odpowiednich roślin potomnych. W zależności od pożądanych właściwości stosowane są różne sposoby hodowlane. Odpowiednie techniki są dobrze znane w dziedzinie i obejmują ale nie ograniczają się do hybrydyzacji, chowu wsobnego, krzyżowania wstecznego, hodowania wieloliniowego, mieszania odmian, hybrydyzacji międzygatunkowej, techniki aneuploidów, itp. Techniki hybrydyzacji także obejmują sterylizację roślin aby uzyskać rośliny męsko- lub żeńskosterylne za pomocą sposobów mechanicznych, chemicznych lub biochemicznych. Zapłodnienie krzyżowe rośliny męskosterylnej pyłkiem innej linii zapewnia, że genom męskosterylnej ale żeńskopłodnej rośliny uzyska jednorodnie właściwości obu linii rodzicielskich. Zatem, transgeniczne nasiona i rośliny mogą być stosowane do hodowli ulepszonych linii roślin, które na przykład zwiększają skuteczność konwencjonalnych metod takich jak stosowanie herbicydów lub pestycydów i lub pozwalają na nie stosowanie wymienionych metod ze względu na

18 zmodyfikowane właściwości genetyczne. Alternatywnie, mogą być otrzymane nowe rośliny uprawne, z ulepszoną tolerancją na stres, które ze względu na zoptymalizowane genetyczne wyposażenie dają produkt do zbiorów o lepszej jakości niż produkty, które nie były zdolne do tolerancji porównywalnych niesprzyjających warunków rozwoju. W produkcji nasion jakość kiełkowania i jednorodność nasion są najważniejszymi cechami produktu, podczas gdy jakość kiełkowania i jednorodność nasion zbieranych i sprzedawanych przez rolnika nie jest ważna. Jako że jest trudno utrzymać roślinę uprawną wolną od nasion innych roślin uprawnych i chwastów, aby kontrolować choroby przenoszone przez nasiona i aby produkować nasiona o dobrym kiełkowaniu dość ekstensywne i dobrze określone praktyki produkcji nasion zostały opracowane przez producentów nasion, którzy są doświadczeni w dziedzinie hodowli, kondycjonowania i sprzedawania czystych nasion. Tak więc jest częstą praktyką rolnika kupowanie nasion atestowanych spełniających specyficzne standardy jakości, niż stosowanie nasion zebranych z własnych plonów. Materiał do propagacji do stosowania jako nasiona jest zwyczajowo traktowany ochronną wartwą zawierającą herbicydy, insektycydy, fungicydy, środki bakteriobójcze, środki nicieniobójcze, środki mięczakobójcze lub ich mieszaniny. Zwyczajowo stosowane związki ochronne obejmują związki takie jak kaptan, karboksyn, tiram (TMTD ), metalaksyl (Apron ) i pirimifor-metyl (Actelic ). Jeśli jest to pożądane, te związki są w formule z innymi nośnikami, związkami powierzchniowymi lub adiuwantami sprzyjającymi nakładaniu zwyczajowo stosowanych w formułowaniu, aby dostarczyć ochronę przed zniszczeniem powodowanym przez szkodniki bakteryjne, grzybowe lub zwierzęce. Ochronne powleczenia mogą być nakładane przez impregnowanie materiału do namnażania płynną formułą lub przez powleczenie ich łączoną formułą płynną lub suchą. Inne sposoby nakładania są także możliwe, tak jak procedury ukierunkowane na pąki lub owoce. Niniejszy wynalazek pozwala na wytwarzanie materiału do propagacji roślin dla roślin hodowlanych, ale szczególnie nasion roślin, które są traktowane przez powleczenie nasion zwyczajowo stosowane w traktowaniu nasion. Ponadto, niniejszy wynalazek pozwala na prowadzenie nowych metod rolniczych, takich jak metody podane powyżej, które charakteryzują się stosowaniem roślin transgenicznych, materiału z roślin transgenicznych lub nasion transgenicznych. W metodach tych jest stosowana transgeniczna roślina lub jej potomstwo zawierające hybrydowy gen według wynalazku, w ilości wystarczającej, aby wyrażać opome na herbicyd formy docelowych białek herbicydu w roślinie, dla nadania tolerancji na herbicyd. Aby hodować potomstwo z roślin transformowanych może być stosowany sposób taki jak podano poniżej: rośliny kukurydzy wytworzone tak jak podano w przykładach przedstawionych poniżej są hodowane w doniczkach w szklarni lub glebie jak wiadomo w dziedzinie, i pozwala się im na kwitnięcie. Z dojrzałej kitki uzyskuje się pyłek i stosuje do zapylenia kłosu tej samej rośliny, roślin siostrzanych lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Podobnie, kłosy rozwijające się na stransformowanej roślinie mogą być zapylone przez pyłek uzyskany z tej samej rośliny, rośliny siostrzanej lub dowolnej pożądanej rośliny kukurydzy. Transformowane potomstwo uzyskane za pomocą tej metody może zostać od różnione od nietransformowanego potomstwa przez obecność wprowadzonego genu (genów) i/lub towarzyszącego DNA (genotyp), lub przez uzyskany fenotyp. Stransformowane potomstwo może być krzyżowane ze sobą lub z innymi roślinami, jak normalnie się robi z rośliną niosącą pożądaną cechę. Podobnie tytoń lub inne transformowane rośliny produkowane tą metodą mogą być krzyżowane ze sobą lub krzyżowane jak znane jest w dziedzinie aby uzyskać potomstwo o pożądanych cechach. Podobnie inne transgeniczne organizmy wytworzone poprzez kombinację metod znanych w dziedzinie i tego wynalazku mogą być hodowane jak znane jest w dziedzinie aby produkować potomstwo o pożądanych cechach. Zmodyfikowane enzymy protox opome na inhibitory według niniejszego wynalazku posiadają przynajmniej jedno podstawienie aminokwasu, addycję lub delecję w stosunku do naturalnie występującego odpowiednika (tzn. form wrażliwych na inhibitor, które naturalnie występują w nie manipulowanej roślinie, albo bezpośrednio poprzez metodologie zrekombi-

19 nowanego DNA albo pośrednio poprzez hodowlę selekcyjną np. przez człowieka). Pozycje aminokwasów, które mogą być zmodyfikowane aby uzyskać oporną na inhibitor formę enzymu protox lub zwiększyć oporność na inhibitor są podane w sposób wytłuszczony w tabeli 1 dla roślinnych sekwencji protox-l z Arabidopsis, kukurydzy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu, sorgo i pszenicy. Spacjalista doceni, że ekwiwalentne zmiany mogą być wprowadzone do dowolnego genu protox mającego budowę dostatecznie podobną do pokazanych tu sekencji enzymu protox by pozwolić na porównanie i identyfikację tych aminokwasów, które są zmodyfikowane według wynalazku aby dać oporne na inhibitor formy enzymu. Takie dodatkowe geny roślinne protox mogą być uzyskane stosując standardowe techniki jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym Nr PCT/IB95/00452 zgłoszonym 8 czerwca 1995 r., opublikowanym 21 grudnia 1995 r. jako WO 95/ Cząsteczki DNA kodujące sekwencje protox oporne na herbicydy ujawnione w niniejszym wynalazku mogą być poddane inżynierii genetycznej aby uzyskać optymalną ekspresję w roślinie uprawnej. Może to obejmować zmianę sekwencji kodującej genu oporności dla optymalnej ekspresji w interesującej roślinie uprawnej. Sposoby modyfikowania sekwencji kodujących aby uzyskać optymalną ekspresję w danym gatunku uprawnym są dobrze znane (Perlak i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:324(1991); Kozieł i wsp., Bio/technol. 11:194(1993)). Inżynieria genetyczna sekwencji kodującej protox dla optymalnej ekspresji może także obejmować funkcjonalne powiązanie odpowiednich sekwencji regulatorowych (np. promotor, sekwencje sygnałowe, terminatory transkrypcji). Przykłady promotorów zdolnych do funkcjonowania w roślinach lub częściach roślin (np. zdolnych do sterowania ekspresją połączonych strukturalnych genów, takich jak protox w komórkach roślinnych obejmują promotory wirusa mozaiki kalafiora (CaMV) 19S lub 35S i podwójne promotory CaMV; promotory syntazy nopaliny, promotory białek związanych z patogenezą (PR), promotory małej podjednostki karboksylazy rybulozobisfosforanu (ssurubisco), promotor białka szoku cieplnego z Brassica z odniesieniem do EPA (promotor hsp80), promotor aktyny Arabidopsis i promotor SuperMas (WO 95/14098), itp. Korzystnymi promotorami są takie, które nadają wysoki poziom ekspresji konstytutywnej, lub bardziej korzystnie takie, które nadają specyficzny wysoki poziom ekspresji konstytutywnej w tkance wrażliwej na niszczenie przez herbicyd. Korzystnymi promotorami są promotor aktyny ryżu (McElroy i wsp., Mol. Gen. Genet. 231:150 (1991), promotor ubikwityny kukurydzy (EP ); Taylor i wsp., Plant Celi Rep., 12: 491 (1993) i promotor PR-1 z tytoniu, Arabidopsis lub kukurydzy (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numery EP oraz 08/181,271, dla Ryals i wsp.). Same promotory mogą być modyfikowane, aby manipulować mocą promotora zwiększyć ekspresję protox zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie. Korzystnym promotorem do stosowania z sekwencjami protox opornymi na inhibitor jest promotor związany z naturalnym genem protox (tzn. promotor protox, ujawniony we wspólnie zgłoszonym i wspólnie posiadanym Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym, numer rejestru PH/ /CGC1846, pt. Promotory genów oksydazy protoporfirynogenu ). Sekwencja promotora z genu protox-l Arabidopsis jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13, sekwencja promotora genu protox-l kukurydzy jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14, i sekwencja promotora genu protox-l buraka cukrowego przedstawiona w SEKW. ID NR: 26. Opisane modyfikacje mogą być przeprowadzone bezpośrednio na naturalnym genie protox obecnym w genomie rośliny bez konieczności konstrukcji genu hybrydowego z heterologicznymi sekwencjami regulatorowymi, ponieważ sam promotor protox jest odpowiedni dla ekspresji sekwencji kodujących protox-l opornych na inhibitor. Takie modyfikacje mogą być przeprowadzone za pomocą technik mutagenezy ukierunkowanej takich jak homologiczna rekombinacja i wybierane na powstałe fenotypy oporności na herbicyd (Paszkowski i wsp., EMBO J. 7: (1988) i US , kolumny i przykład 8). Dodatkową zaletą tego podejścia jest, że oprócz zawierania naturalnego promotora protox, powstały zmodyfikowany gen będzie też zawierał każdy inny element regulatorowy, taki jak sekwencje kodujące peptyd sygnałowy lub tranzytowy, które są częścią natywnego genu.

20 Peptydy sygnałowe lub tranzytowe mogą tworzyć fuzje z sekwencjami kodującymi protox w hybrydowych konstruktaćh DNA, aby kierować transportem wyrażanego enzymu protox do pożądanego miejsca działania. Przykłady peptydów sygnałowych obejmują te naturalnie połączone z białkami związanymi z patogenezę np. PR-1, PR-2, itp. (Payne i wsp., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988)). Przykłady peptydów tranzytowych obejmują peptydy tranzytowe chloroplastu takie jak opisali Von Heijne i wsp., Plant Mol. Biol. Rep. 9: (1991); Mazur i wsp., Plant Physiol. 85:1110 (1987); Vorst i wsp., Gene 65: 59 (1988) i mitochondrialne peptydy tranzytowe, takie jak opisali Boultry i wsp., Nature 328: (1987). Uważa się chloroplastowe i mitochondrialne peptydy tranzytowe za szczególnie korzystne w obecnym wynalazku jako że aktywność protox występuje typowo w mitochondriach i chloroplastach. Najbardziej korzystne do stosowania są peptydy tranzytowe chloroplastów jako że hamowanie aktywności protox w chloroplastach jest uważane za pierwszorzędną podstawę działania herbicydów hamujących protox (Witkowski i Haling, Plant Physiol 87: 632(1988); Lehnen i wsp., Pestic. Biochem. Physiol. 37:329 (1990); Duke i wsp., Weed Sei. 39:465 (1991)). Także włączone są sekwencje, które powodują lokalizację kodowanego białka do różnych kompartymentów komórkowych takich jak wakuola (Neuhaus i wsp., Proc. Natl. Acad Sei. USA 88: (1991) i Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: (1991)). Hybrydowe konstrukt(y) DNA mogą zawierać wielokrotne kopie promotora lub wielokrotne kopie genów struktury protox. Dodatkowo, konstrukt(y) mogą zawierać kodujące sekwencje dla markerów i kodujące sekwencje dla innych peptydów takich jak peptydy sygnałowe lub tranzytowe, każdy we właściwej ramce odczytu w stosunku do innych funkcjonalnych elementów w cząsteczce DNA. Przygotowanie takich konstruktów jest w zakresie normalnego poziomu umiejętności w dziedzinie. Użyteczne markery obejmują peptydy nadające oporność na herbicydy, antybiotyki lub leki, takie jak na przykład oporność na hygromycynę, kanamycynę, G418, gentamycynę, linkomycynę, metotreksat, glifosat, fosfotricynę lub tym podobne. Te markery mogą być użyte do selekcji komórek transformowanych hybrydowymi konstruktami DNA spośród niestransformowanych komórek. Innymi użytecznymi markerami są peptydowe enzymy, które mogą być łatwo wykryte za pomocą widzialnej reakcji, takiej jak na przykład reakcja barwna, na przykład lucyferaza, ß-glukuronidaza lub ß-galaktozydaza. Sposób pozytywnej selekcji komórek stransformowanych genetycznie, do których może być włączona pożądana sekwencja nukleotydów dająca komórkom przewagę selekcyjną, jest podany w WO 94/ Ekspresja piasty do wa, w której geny są wprowadzane za pomocą homologicznej rekombinacji do wszystkich kilku tysięcy kopii kolistego genomu chloroplastowego obecnego w każdej komórce roślinnej, wykorzystuje ogromną zaletę liczby kopii ponad genami wyrażanymi w jądrze, aby pozwolić na poziomy ekspresji, które mogą przekroczyć 10% całkowitego rozpuszczalnego białka rośliny. Ponadto, ekspresja w plastydach jest pożądana, ponieważ cechy wyrażane w plastydach nie są przenoszone przez pyłek, tak więc potencjalne niebezpieczeństwo mimowolnej ucieczki transgenu do dzikich krewnych roślin transgenicznych jest wy kluczone. Technologia transformacji plastydów jest szczegółowo ujawniona w opisach w US , i , w zgłoszeniu PCT o numerze publikacji WO 95/16783, oraz w publikacji McBride i wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: (1994). Podstawowa technika dla transformacji chloroplastów tytoniu została opracowana i udoskonalona w laboratorium Dr Pal Maliga w Rutgers University (Piscattaway, New Jersey). Technika ta obejmuje bombardowanie cząsteczkami tkanki liści z regionami plastydowego DNA otaczającymi selekcj ono walny marker oporności na antybiotyk. Obszary flankujące 1 do 1,5 kb określone jako sekwencje naprowadzające, ułatwiają rekombinację homologiczną z genomem piasty du i w ten sposób pozwalają na zastępowanie lub modyfikację specyficznych obszarów plastomu 156 kb tytoniu. Początkowo stosowano mutacje punktowe w chloroplastowym 16S rrna i genach rpsl2 nadające oporność na spektynomycynę i/lub streptomycynę jako markery do selekcji do transformacji (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., i Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: ; Staub, J.M. i Maliga, P. (1992) Plant Celi 4: To dało stabilne homoplazmatyczne tranformanty z częstością około jednego na 100 bombardowań docelo-

21 wych liści. Obecność miejsc klonowania między tymi markerami pozwoliła na stworzenie plastydowego wektora naprowadzającego dla wprowadzania obcych genów (Staub, J.M. i Maliga, P. EMBO J. 12: (1993)). Znaczny wzrost w częstości transformacji uzyskano przez zastąpienie recesywnych genów rrna lub białek r oporności na antybiotyki przez dominujący marker selekcyjny, gen bakteryjny aada, kodujący detoksykujący enzym adenylotransferazę 3'-aminoglikozydową spektynomycyny (Svab Z. i Maliga P. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: ). Uprzednio ten marker stosowano z powodzeniem dla transformacji o wysokiej częstości genomu plastydowego zielonego glonu Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucleic Acids Res. 19, ). Gen hybrydowy może zawierać roślinny promotor plastydowy funkcjonalnie połączony z izolowaną cząsteczka DNA, która albo koduje naturalny enzym protox albo zmodyfikowany enzym protox, taką jak cząsteczka DNA, która koduje naturalny lub zmodyfikowany enzym protox pszenicy, soi, bawełny, buraka cukrowego, rzepaku, ryżu lub sorgo. Gen hybrydowy korzystnie dalej zawiera sekwencję 5' nie ulegającą translacji (51UTR) z promotora plastydowego i sekwencję 3 nie ulegającą translacji (3' UTR) funkcjonalnie powiązaną z wyizolowaną cząsteczką DNA. Korzystnie 3' UTR jest nie ulegającą translacji 3' sekwencją genu plastydowego rps16. Wektor do tranformacji piastydów zawierający hybrydowy gen, opisany powyżej bezpośrednio, jak i plastyd roślinny stransformowany takim wektorem do transformacji plastydu, charakteryzuje się tym, że wymieniony zmodyfikowany enzym protox jest wyrażany w wymienionym plastydzie. Roślina lub komórka roślinna, wraz z ich potomstwem, zawierająca ten plastyd roślinny, przy czym zmodyfikowany roślinny enzym protox jest wyrażany w roślinie i nadaje roślinie tolerancję na herbicyd w ilościach, które hamują normalnie występującą aktywność protox. Gdy oporny na herbicyd allel protox jest uzyskany przez ukierunkowaną mutację na tywnego genu w roślinie użytkowej lub hodowli komórek roślinnych, z których może być regenerowana roślina użytkowa, może być przeniesione do handlowych odmian przez stosowanie tradycyjnych technik hodowlanych, aby uzyskać roślinę użytkową tolerującą herbicyd bez potrzeby przeprowadzania inżynierii genetycznej na zmodyfikowanej sekwencji kodującej i transformowaniu jej do rośliny, Alternatywnie, gen oporny na herbicyd może być izolowany, poddany inżynierii genetycznej dla optymalizacji ekspresji i następnie wtransformowany do pożądanej odmiany. Geny kodujące zmienione protox, oporne na inhibitor protox, mogą też być stosowane jako markery selekcyjne w metodach transformacji komórek roślinnych. Przykładowo, rośliny, tkanki roślinne lub komórki roślinne transformowane transgenem mogą być także transformowane genem kodującym zmieniony protox, zdolnym do ekspresji w roślinie. Tak stransformowane komórki są przenoszone do pożywki zawierającej inhibitor protox, w którym mogą przeżyć tylko rośliny stransformowane. Inhibitory protox, uważane za szczególnie pożyteczne jako czynniki selekcyjne to: difenyloetery (np. acyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy]-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-trifluorobenzen), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo]-5-(1,1dimetyloetylo)-1,3,4-oksydiazol-2-(3H)-on), cykliczne imidy (np. S-23142, N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargliloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroftalim, N-(4-chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2-[1-(2,3,4-trichlorofenylo)-4-nitropirazolilo-5-oksy] propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydyny (np. LS ) i fenopilan i jego O-fenylopirrolidono- i piperydynokarbaminianowe analogi i dwucykliczne triazolony, jak podano w WO 92/04827; EP ). Sposób może być stosowany do dowolnej komórki roślinnej zdolnej do bycia transformowaną zmienionym genem protox, i może być stosowany z dowolnym interesującym transgenem. Ekspresja transgenu oraz genu protox może być sterowana przez ten sam promotor funkcjonalny w komórkach roślinnych lub przez oddzielne promotory. Zmodyfikowane oporne na inhibitory enzymy niniejszego wynalazku są oporne na herbicydy, które hamują naturalnie występującą aktywność protox. Herbicydy, które hamują protox obejmują wiele strukturalnych klas cząsteczek (Duke i wsp., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandi-

22 halli i wsp., Pesticide Biochem Physiol. 43: 193 (1992); Matringe i wsp., FEBS Lett. 245: 35 (1989), Yanase i Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989) w tym etery difenylowe (np. aćyfluorofen, kwas 5-[2-chloro-4-(trifluorometylo)fenoksy)-2-nitrobenzoesowy; jego ester metylowy; lub oksyfluorofen, 2-chloro-1-(3-etoksy-4-nitrofenoksy)-4-(trifluorobenzen)), oksydazole (np. oksydiazon, 3-[2,4-dichloro-5-(1-metyloetoksy)fenylo]-5-(1,1-dimetyloetylo)-1,3,4-okśadiazol-2(3H)-on), cykliczne imidy (np. S N-(4-chloro-2-fluoro-5-propargliloksyfenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid; chloroflalim, N-(chlorofenylo)-3,4,5,6-tetrahydroftalimid), pirazole fenylu (np. TNPP-etyl, 2 - [1-(2,3,4--trichlorofenylo)-4-nitropirazolil-5-oksy)propionian etylu; M&B 39279), pochodne pirydynowe (np. LS ), fenopilan i jego analogi O-fenylopirrolidonowe- i piperydynokarbaminianowe. Difenyloeterami o szczególnym znaczeniu są związki o wzorze ogólnym 1, gdzie R oznacza -COONa (wzór II), -CONHSO2CH3 (wzór III) lub -COOCH2COOC2H5 (wzór IV, Maigrot i wsp., Brighton Crop Protection Conference - Weeds: (1989)). Difenyloeterami są również związki, w których R jest przedstawione wzorem IVa (wzór IVa, Hayasji i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: (1989)). Difenyloeterem jest zwłaszcza związek o wzorze IVb (wzór IVb; bifenoks, Dest i wsp., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27:31 (1973)). Dalszym interesującym difenyloeterem jest związek o wzorze lvc (wzór IVc, oksyfluorofen, Yih i Swithenbank, J. Agric. Food Chem, 23:592 (1975)). Jeszcze innym interesującym difenyloeterem jest związek o wzorze IVd (wzór IVd, lak tofen, str. 623 The Pesticide Manual wydanie 10, red. C. Tomlin, British Crop Protection Council, Surrey, (1994)). Znaczenie ma też klasa herbicydów znanych jako imidy, o wzorze ogólnym V, gdzie Q jest wyrażone wzorami VI lub VII lub VIII lub IX lub IXa lub IXb (Hemper i wsp. (1995) w Proceedings of the Eigth International Congress of Pesticide Chemistry, Ragdale i wsp., Amer. Chem. Soc. Washington, D.C. str (1994); i R1oznacza H, Cl lub F, R2 oznacza Cl, zaś R3 jest ewentualnie podstawionym eterem, tioeterem, estrem, grupą aminową lub alkilową. Alternatywnie, R2 i R3 razem mogą tworzyć 5 lub 6 członowy pierścień heterocykliczny. Przykładem szczególnie interesujących imidowych herbicydów są związki o wzorze Vila (wzór Vila; flutiacetometyl, Miyazawa i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str (1993)), o wzorze X (wzór X sulfentrazon, Van Saun i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str (1991)), o wzorze XI oraz wzorze XII (Miura i wsp Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str (1993)), o wzorze XIII, wzorze XIV, wzorze XV oraz wzorze XVI. Aktywność chwastobójcza powyższych związków jest opisana w Proceedings of the 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzory X i XVI), Proceedings of the 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (wzory XII i XIII), Patent US Nr 4,746,352 (wzór XI) i Abstracts of the Weed Science Society of America, t. 33, str. 9 (1993) (wzór XIV). Najbardziej korzystnymi herbicydami są te, które są klasyfikowane jako arylouracyle i mają wzór ogólny XVII, w którym R oznacza grupę (C2-5-alkenyloksy-C1-4-alkylową) jak ujawniono w opisie US Także znaczące są herbidycy o wzorze ogólnym XVIII przedstawiającym tiadiaziminę (Weller i wsp., Brighton Crop Protection Conference-Weeds, str (1993)), o wzorze XIX przedstawiającym karfentrazon (Van Saun i wsp., Brighton Crop Protection Conference- -Weeds, str (1993)). N-podstawione pirazole są zilustrowane wzorem ogólnym XX, w którym R1jest C 1-C4 alkilem, dowolnie podstawionym przez jeden lub więcej atomów halogenu; R2 jest wodorem lub C 1-C4 alkoksy, każdy z nich jest dowolnie podstawiony przez jeden lub więcej atomów halogenu, lub R1i R2 razem z grupy -(CH2)n-X-, gdzie X jest związany w R2, R3 jest wodorem lub halogenem, R4 jest wodorem lub C 1-C4 alkilem, R5 jest wodorem, nitro-, cyjano lub grupą -COOR6 lub CONR7R6 i

23 R6 jest wodorem, C 1-C6 alkilem, C2-C6 alkenylem lub C2-C6 alkinylem; (międzynarodowe publikacje patentowe WO 94/08999, WO 93/10100 i US , Schering): N-fenylopirazole, jak związek o wzorze XXI, nipyraklofen (str. 621 The Pesticide Manual wyd. 9, CR Worthing, red. British Ceop Protection Council, Surrey, (1991)) oraz 3- -podstawione-2-arylo-4,5,6,7-tetrahydroindazole (Lyga i wsp., Pesticide Sci (1994)) (wzór XXIa, BAY 340). Znaczenie m ają także fenylopirazole opisane w WO 96/01254 i WO 97/00246 (wzór XXH). Poziomy herbicydu, które normalnie są hamujące dla aktywności protox, obejmują dawki aplikacji znanych dziedzinie, i które częściowo zależą od czynników zewnętrznych takich jak środowisko, czas i sposób nanoszenia. Na przykład w przypadku herbidyców imi dowych reprezentowanych przez wzory V do IX a bardziej szczególnie reprezentowanych przez wzory X do XVII dawki stosowane wahają się od 0,0001 do 10 kg/ha, korzystnie od 0,005 do 2 kg/ha. Tempo dawkowania lub stężenie herbicydu mogą być inne, w zależności od pożądanego działania i szczególnego związku, który był stosowany, i mogą być określone przez sposoby znane w dziedzinie. Przykłady Użyte tutaj standardowe techniki klonowania i rekombinacji DNA są dobrze znane i opisane przez T. Maniatis, E.F.Fritsch i J.Sambrook, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory', Cold Spring Harbor, NY (1989) i przez T.J.Silhavy, M.L.Berman, i L.W.Enauist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1994). Dział A: Izolacja i charakteryzacja genów roślinnej oksydazy protoporfirynogenu (Protox) Przykład 1. Izolacja cdna Protox-1 z pszenicy na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy. Całkowite RNA wyizolowane z Triticucum aestivum (cv Kanzler) zostało przekazane firmie Clontech do konstrukcji biblioteki cdna na wektorze Lambda Uni-Zap. Około pfu (jednostki tworzące łysinki) cdna z biblioteki zostało wysiane z gęstością około pfu na 10 cm szalkę Petriego i wykonano kopię na filtrze nitrocelulozowym. Łysinki były hybrydyzowane z sondą cdna Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR 5; patrz przykład 2 międzynarodowego zgłoszenia patentowego numer PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaPO4 ph 7,0; 1mM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984) włączony tu w całości w formie odniesienia). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy cdna Protox-1 pszenicy uzyskany w czasie pierwszych prób przeszukiwania banku nazwany Protox-1 pszenicy miał długość 1489 bp. Protox-1 pszenicy nie posiada sekwencji kodującej dla peptydu liderowego i około 126 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej opartej na porównaniu z innymi znanymi roślinnymi sekwencjami białek protox. W celu uzyskania dłuższego cdna protox z pszenicy nowa biblioteka cdna Triticum aestivum (cv Kanzler) została wykonana na miejscu przy użyciu wektora lambda Uni-Zap. Około pfu biblioteki cdna przeszukano jak wyżej oprócz tego, że jako sondy użyto cdna Protox-1 pszenicy, a hybrydyzację i płukania przeprowadzano w temperaturze 65 C a nie 50 C. Najdłuższy cdna pszenicy uzyskany z tego przeszukiwania, nazwany Protox-1a pszenicy miał 1811 bp długości. Sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 9 i 10. W oparciu o porównanie z innymi znanymi sekwencjami białek protox u roślin i odpowiednimi sekwencjami genomowymi, to cdna jest albo pełnej długości albo brakuje mu jedynie kilku kodonów peptydu liderowego (tabela 1). Ta sekwencja białka pszenicy jest w 91% identyczna (podobna w 95%) do sekwencji białka Protox 1 kukurydzy. pszenicy na wektorze pbluescript SK został zdeponowany 19 marca 1996 roku jako pwdc-13 (NRRL #B21545).

24 Przykład 2. Izolacja cdna Protox-1 z soi na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis. W firmie Stratagene zakupiono bibliotekę cdna soi (v Williams 82, epikotyl) na wektorze Lambda Uni-Zap. Około pfu biblioteki wysiano w gęstości około pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR 1; patrz przykład 1 międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr PCT/IB95/00452, złożonego 8 czerwca 1995, opublikowanego 21 grudnia 1995 jako WO 95/34659) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP0 4 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cdna soi nazwany Protox-l soi jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 soi ma 1847 bp długości i koduje białko o wielkości 58,8 kda. Sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio Nr 11 i 12. Białko soi jest w 78% identyczne (w 87% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis. Protox-l soi na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 15 grudnia 1995r. jako pwdc-12 (NRRL#B-21516). Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID NR: 2, 6, 10, 12, 15, 17, 19, 21, 23 zamieszczono poniżej w tabeli 1. Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów odpowiednich białek kodowanych przez sekwencje przedstawione jako SEKW. ID NR 4 i 8 zamieszczono poniżej w tabeli 2. Tabela 1 Porównanie sekwencji aminokwasowych białka Protox-1 z Arabidopsis ( Arabpt-1 ; SEKW. ID NR 2), kukurydzy ( Mzpt-1 ; SEKW. ID NR: 6), pszenicy ( Wtpt-1 ; SEKW. ID NR: 10), soi ( Soybeanpt-1 ; SEKW. ID NR: 12), bawełny Cottonpt-1, SEKW. ID NR: 16), buraka cukrowego( Sugpt-1, SEKW. ID NR: 18), rzepaku ( Rapept-1, SEKW. ID NR: 20), ryżu ( Ricept-1, SEKW. ID NR: 22), sorgo ( sorghumpt-1 ; SEKW. ID NR: 24) Porównanie wykonano przy użyciu programu PileUp (pakiet GCG, Uniwersytet Wi sconsin, Madison, WI). Pozycje, które mogą podlegać modyfikacji, zgodnie z zamieszczonymi tutaj założeniami, w celu nadania lub zahamowania oporności na inhibitor zaznaczono grubą czcionką.

25 R a p e p t-1... MDLS LLR P.. QPFLSPFSNP FPRSRPYKPL A r a tp t MELSLLRPIT QSLLPSESKP NLRLNVYKPL Sarghump t M z p t-1... W tp t-1...m ATATVAAASP LR R VIGRPH R ic e p t-1... Co t t onp t MTAL IDLSLIRSSP SVSPFSIH H QHPPRFRKPF Soy b e a n p t-1...mv SVFN E TFPP NQTLLRPSLH SPTSFFTSPT RKFPRSRPNP S ugpt-1 MKSM ALSNCI PQTQCMPLRS SGHYRGNCIM LSIPCSLIGR RGYYSHKKRR R apept-1 NLRCSVSGGS W GSSTTE G G GGGKTVTAADC VIVGGGISGL CIAQALVTKH Arabp t- 1 RLRCSVAGGP TM3SSKIEGG GGT.TTTTDC VIVGGGISGL CIAQALATKH Sorghump t M z p t-1...dc W GGGISGL CTAQALATRH W tpt-1 RVRPRCATAS SATETPAAPG VPL...SAEC VIVGAGISGL CTAQALATRY R ic e p t G ottan p t-1 KLROSLAEGP TISSSKI GG ESS...IA D C VIVGGGSGL CIAQALATKH Soybeanpt-1 ILRCSIAEES TASPPKIR.. DSA...PVDC VVVGGGVSGL CIAQALATKH S u g p t-s VEMSCSŒSSG SKSAVKEAGS GSGAGLLDC VTVGGGISGL CIAQALCIKH

26 R ap ep t-1 PDA...AKNVM VIEAKDRMGG N IIT..REQ GFLWEEGPNS FQPSDEMLTM A rak p t-1 PDA...APNLI VIFAKDRVGG N IIT..REEN GFIWEEGPENS FQPSDEMLIM S org h u m p t siverpee GYLWEEGENS EQPSDPVLSM M zpt-1..g..wgm L VIEARARPGG NTTIVERPEE GYLWEETSNS FQPSDPVLIM Wt p t - 1..G..VSDLL VIEARERPGG NITTVERPDE GYLWEG P NS F QPSDPVLTM R ice p t Cot t onp t- 1 RDV..ASNVI VIEARDRVGG NITIVER..D GYLWEEGPNS FQPSDPILTM Soybeanpt-1..A..NANV VIEARCRWGG N I T I M ER,.D GYLWEEGPNS FQPSDFMLTM S ugpt-1 SSSSLSENFI VIFAKDRVGG NIVIVE..AD GYIEEGPPNS FQPSDAVLI M R ap ep t-1 WDSGLKDDL VLG DPTAPRF VLWSCKLRPV PSKLTDLEFF DLMSIGKIR A c a tp t-1 W DSCXKL VLGDETAPRF VLWNGKP V PSKLTDLEFF LMSIGGKIR So g h u np t- 1 AVDSGLKDDL VFGDPNAPRF VLWEEKLRPV PSKPADLPFF DUMSIPGKLR M zpt-1 AVDSGLKDDL VPGPENAP RF VLWEGKLREV PSKEADLPFF DLMSIPGKLR W tpt-1 AVDSGLKLDL VFD PNAPRF VLWEG3KLRPEV PSKPGDLPFF SLMSIPGKLR R ic e p t-1... Co t t on p t- 1 AVDSGLKDDL VLGDENAPRF VLWEGKLRPV PSKPIDLPFF DIMSIAGKLR Sc yb eanpt-1 WDSGLKDEL VLGDEOAERF VLWNRKLRPV PGKLHDLPFF DLMSIGGKER S ugpt-1 AVDSGLKDEL VLGDPNAPRF VLWNCKLBEV PSSLTDLPFF DLMTIPGKIR R ap ep t-1 -AGFAIGIRP SPPGREESVE EFVRRNLGDE VFERIIEPFC SGVYAGDPAK Arabp t- 1 AGFGALGIRP SPPGREESVE EFVRRNTLGDE VFERLIEEPFC SGVYAGDPSK Sorghunp t- 1 AGLGALGIRP PAPREESVE EFVRRNLGAE VEERLIEPFC SGVYAG PSK M zpt-1.aglgalgirp PPPG EESVE EFVRRNLGAE VFERLIEPFC SGVYA DPSK W tpt-1 AGLGALGIRP PPPGREESVE EFVRRNLCRE WFERLIEPFC SGVYAGDPSK R icept-1... Cot t onp t - 1 AGFGALGIRP PPPGŒESVE EFVRRNILGAE VEERFIEPPC: SGVYAG PSK Soybe a r p t - 1 AGFGALGIRP PPPGHEESVE EFVRRNLGDE VFERLlKPFC SGVYAGDPSK S ugpt-1 AALGAGFRP SPPPHEESVE HFVRRNLGDE VFERLIEPFC SGVYAGDPSK

27 R apept-1 LSWAAPGKV WKLEENGGSI I GGAFKAIQA KNKAPKTIKD 300 ERLPKPKGQT Arabp t- 1 LSMKAAFGKV WKLEQNGGSI IGGTKFKAIQE RKNAPKAERD PRLPKPQGQT Sorghum p t- 1 LSMAAFGKV WRLEFAGGSI IGGTKTIQE RGKNPKPPRD PRLPKPKGQ T M zpt-1 LSMKAAFGKV WRLEETGGSI IGGTIKTQE RSKNPKPPRD ARLPKPKQT W tpt-1 LSMKAAFGKV WRTFKTGGSI IGGITKAIQD KGKNPKPFRD FRLPAPKQOT R ic e p t-1 RALKAAFGKV WRLEDIGGS I IGGTIKTQE RGKNPKPPRD PRLPTPKGHGQT Co t t on p t- 1 LSMKAAFGRV WKLEEIGGSI IGGTFKQE RNKIPKPPRD ERLPKPKGQ T Sc y b ean p t-1 LMSKAAFGKV WKLEKNGGSI IGGTFKAIQE RNGASKPPRD PRLPKPKGQT S u g pt-1 LS MAAFGKV WKLEQKGGSI IGGILKAIQE RGSNPKPERD QRLPKPKGQT 301 R apept-1 VGSF RKGLTM LPEAISARLG EKVKVSWKLS SITKLASGEY 350 SLTYETPEGI A ra tp t-1 VGSFRKGLKM LPEAISARLG SKVKLSWKLS GTTKLESGGY NLTYETEDGL Sorgu n p t- 1 VASFRKGLAM LP SNAITSSLG SKVKLSWKLT SMIKSDGKGY VLEYETPEGV M zpt-1 VASFRKG IM LPNAITSSLG SKVKLSWKLT SITKSEDKGY VLEYETPEGV W tpt-1 VASFRKGCIM LFNAIASRLG SKVKLSWKKT SITKADNQGY VLGYEIPEEL R iœ p t- 1 VASERKGLTM LEDATISRLG SKVKLSWKLT SITKSENKGY ALVYEIPEGV C b ttc rp t- 1 VGSFRKGLI M LPFAIANSLG SNVKLSWKLS STIKLGNGGY NLTFETPEGM S oybeanpt-1 VGSFRKGLIM LPDAISARLG NKVKLSWKLS SISKLASGEY SLTYETPEGV S u gp t-1 VGSFRKGLVM LPTAISARLG SRVKLSWILS SIVKSLNGE SETYDTFDGL 351 R ap ep t-1 VIVQSKAVVM TVPSHVASSL LRPLSSAAE ALSKLYYPPV 400 AAVSISYAKE Arabpt-IVSVQSKSVWI TVPSHVAG L LRPLSESAAN ALSKLYYPPV AAVSISYPKE S arghump t- 1 VLVQSKSVIM TTPSYVASDI LRPLSGDAAD VLSRFYYPPV AAVIVSYPKE M zpt-1 VSVQAKSVIM TIPSYVASNI LRPTLSAAD ALSRFYYPFV AAVIVSYPKE W tpt-1 VSVQAKSSVIM TTPSYVASDI LRELSIDAAD ALSKFYYPPV AAVIVSYPKE R ic e p t-1 VSVQAKIWM TTPSYVASDI LRPLSSDAAD ALSIFYYPPV AAVIVSYPKE Co t t onp t - 1 VSLQSRSVVM TTPSHVASNL LHPLSAAAAD ALSQFYYPPV ASVIVSYPKE Scybe a np t - 1 VSLQCKIVVL TIPSYVASIL LRPLSAAAAD ALSKFYYPPV AAVSISYPKE

28 S u g p t-1 VSVRTKSWM TVPSYVASRL LRELSDSAAD SLSKFYYPEV AAVSLSYPKE 401 R apept-1 AIRSBGLIDG ELKGFGQLHP RIQKVETLGT IYSSSLFTNR 450 APPGRVLLLN Arabp t- 1 AIRIECLIDG ELQGBGQLHP RTKGFGQLHP IYSSSLFENR APPGRVLLLN Sorghumpt.-1 AI RKECLIGTT ELQGBGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APAGRVLLLN Mzp t - 1 AIRKECLIDG ELGGFGQLHP RSQGVETLGT I YSSSLFPNR APGRVLLLN W tpt-1 ALRKECLIDG ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APAGRVLLIN Rice p t - 1 ALRKECLIG ELQGFGQLHP RSQGVELTGT IYSSSLFPNR APAGRVLLIN Cotto n p t-1 AIRKECLIG ELQGFGQLHP RSQGIETLGT IYSSSLFPNR APSGRVLLLN Soybeanp t - 1 AIRSECLIDG ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APPGRVLLIN S u g p t-1 AIRSECLING ELQGFGQLHP RSQGVETLGT IYSSSLFPNR APPGRILILS R apept-1 YIGGATNIGT LSKSEGELVE AVDRDLRKML IKPSSIDPLV LGVKLWPQAI Arabp t- 1 YIGGSINIGI LSKSEEELVE AVDRDLRKML IKPNSTDPLK IGVRVWPQAI Sorghum pt-1 YIGGATNIGI VSKTESELVE AVDRDLRKML INPTAVDPLV IGVRVWPQAI M zpt-1 YIGGATNIGI VSKIESELVE AVDRDLRML INSTAVDPLV LGVRVWPQAI W tpt-1 YIGGSINIGI VSKTESDLVG AVDRDLRKML INPRAVDPLV LGVRVWPQAI R ic e p t-1 YIGGSINIGI VSKTESELVE AVCRDLRKML INPRAVDPLV IGVRVWPQAI Co ttanp t - 1 YIGGATNOGI LSKTEGELVE AVDRDLRKML INPRAVDPLV IGVRVWPKAI So ybeanp t - 1 YIGGATNIGI LSKTDSELVE TVDRDLRKIIL INPNAQDPFV VGVRLWPQAI S u g p t-1 YIGGATNI GI INKSKDELAK TVDKDLKRML INEDAKLFRV IGWWWPQAI R apept-1 PQFLIGHIDL VDAAKASLSS AGHEGLFLGG NYVAGVALGR CVEGAYETAT Arabp t- 1 PQFLIGHFDI LDTAKSSLTS SGYEGLFLGG NYVAGVALGR CVEGAYETAI Sorghump t- 1 PQFLVGHLDL LEAAKSALDQ GGYNGLFLGG NYVAGVALGR CIEGAYESAA M zpt-1 PQFLVGHLDL LEAAKAALDR GGYDGLFLGG NYVAGVALGR CVEGAYESAS W tpt-1 PQFLIGHLDR LAAAKSALGQ GGYNGLFLGG KYVAGVALGR CVEGAYESAS R ic e p t-1 PQFLIGHLDH LEAAKSALGK GGYNGLFLGG NYVAGVALGR CVEGAYESAS Co ttan p t - 1 PQFLVGHLDL LDSAKMALRD SGFHGLFIGG NYVSGVALGR CVEGAYEVAA

29 S oybeanpt-1 PQFLVGHLDL LDVAKASIRN TGFEGLFLGG NYVSGVALGR CVEGAYEVAA. S ugpt-1 PQFSIGHFDL LDAAKAALTD TGVKGLFLGG NYVSGVALGR CIEGAYESAA R apept-1 QVNDFMSRYA A rabp t- 1 EVNNFMSRYA. Sorghump t- 1 QIYDFLTKYA Mzpt - 1 QISDFLTKYA. W tpt-1 QI SDELIKYA. YK* YK* YK* YK* YK* R ic e p t-1 QISDYLTKYA. YK* Cot t on p t-1 EVKEFLSQYA YK* S oybeanpt-1 EVNDFLT R V S ugpt-1 EWDFLSQYS YK* DK* Tabela 2 Porównanie sekwencji aminokwasowych białek Protex-2 z Arabidopsis i kukurydzy. Takie same reszty są oznaczone przez pionową linię między dwoma sekwencjami. Porównanie wykonano używając programu GAP opisanego przez Devaraux i wsp., Nucleic Acids Res. 12: (1984). Procent podobieństwa: 75,889 Procent identyczności: 57,905 Protox-2. Pep x Mzprotox-2.Pep 1... MASGAVAD.HQIEAVSGKRVAV 21 1 MLALTASASSASSHPYRHASAHTRRPRLRAVLAMAGSDDPRAAPARSVAV VGAGVSGLAAAYKLKSRGLNVTVFEADGRVGGKLRSVMQNGLIWDEGANT VGAGVSGLAAAYRLRQSGVNVTVFEAADRAGGKIRTNSEGGFVWDEGANT MTEAEPEVGSLLDDLGLREKQQFPISQKKRYIVRNGVPVMLPTNPIELVT MTEGEWEASRLIDDLGLQDKQQYPNSQHKRYIVKDGAPALIPSDPISLMK SSVLSTQSKFQILLEPFLWKK...KSSKVSDASAEESVSEFFQRHFGQE SSVLSTKSKIALFFEPFLYKKANTRNSGKVSEEHLSESVGSFCERHFGRE WDYLIDPFVGGTSAADPDSLSMKHSFPDLWNVEKSFGSIIVGAIRTKFA WDYFVDPFVAGTSAGDPESLSIRHAFPALWNLERKYGSVIVGAILSKLA AKGGKSRDTKSSPGTKKGSRGSFSFKGGMQILPDTLCKSLSHDEINLDSK 2S7 251 AKGDPVKTRHDSSGKRRNRRVSFSFHGGMQSLINALHNEVGDDNVKLGTE 300

30 VLSLS..YNSGSRQENWSLSCVSHNETQRQ...NPHYDAVIMTAPLCNVK VLSLACTFDGVPALGRWSISVDSKDSGDKDLASNQTFDAVIMTAPLSNVR EMKVMKGGQPFQLNFLPEINYMPLSVLITTFTKEKVKRPLEGFGVLIPSK RMKFTKGGAV V L DFLPKMDYLPLSLMVTAFKKDDVKKPLEGFGVLIPYK E.QKHGFKTLGTLFSSMMFPDRSPSDVHLYTTFXGGSRNQELAKASTDEL EQQKHGLKTLGTLPSSMMFPDRAPDDQYLYTTFVGGSHNRDLAGAPTSIL KQWTSDLQRLLGVEGEPVSVNHYYWRKAFPLYDSSYDSVMEAIDKMEND KQLVTSDLKKLLGVEGQPTFVKHVYWGNAFPLYGHDYSSVLEAIEKMEKN LPGFFYAGNHRGGLSVGKSIASGCKAADLVIS YLESCSNDKKPNDSL * LPGFFYAGNSKDGLAVGSVIASGSKAADLAISYLESHTKHNNSH* Przykład 3: Izolacja cdna Protox-1 z bawełny na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-l u kukurydzy. Bibliotekę cdna na wektorze Lambda Uni-Zap utworzona z Gossypium hirsutum L. (72 godz. liścienie hodowane w ciemności) otrzymano od dr Dicka Trelease, Dept. Of Botany, Arizona State University (Ni W. i Trelease R.N., Arch. Biochem. Biophys. 289: (1991)). Około pfu biblioteki wysiano w gęstości około pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Bio-systems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cdna bawełny nazwany Protox-1 bawełny jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-l bawełny ma 1826 bp długości i koduje białko o wielkości 58,2 kda. Sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID NR: 13 i 14. Białko bawełny jest w 77% identyczne (w 86% podobne) do białka Protox-l kukurydzy. Protox-l bawełny na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 1 lipca 1996 r. jako pwdc-15 (NRRL#B-21595). Przykład 4. Izolacja cdna Protox-1 z buraka cukrowego na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis. Bibliotekę cdna Beta vulgaris na wektorze Lambda Uni-Zap otrzymano od dr Philipa Rea, Dept. of Botany, Plant Science Institute, Philadelphia, PA (Yongcheol Kim, Eugene J. Kim i Philip A. Rea, Plant Physiol. 106: (1994)). Około pfu biblioteki wysiano w gęstości około pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach Colony /Plaąue Screen (NEN Dupont). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-l Arabidopsis (Sekw. ID NR: 1) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzyma-

31 ny cdna buraka cukrowego nazwany Protox-1 buraka cukrowego jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 buraka cukrowego ma 1910 bp długości i koduje białko o wielkości 60 kda. Sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 15 i 16. Białko buraka cukrowego jest w 73% identyczne (w 82% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis. Protox-1 buraka cukrowego na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 29 lipca 1996r. jako pwdc-16 (NRRL#B-21595N). Przykład 5. Izolacja cdna Protox-1 rzepaku na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u Arabidopsis. Bibliotekę cdna Brassica napus (3-4 wk. dojrzałe zielone liście) na wektorze Lambda Uni-Zap II otrzymano od dr Guenthera Ochs, Instituí Fuer Allemeine Botanik, Johannes Gutenberg-Universitaet Mainz, Germany (Gunter Ochs, Gerald Schock i Aloysiius Wild, Plant Physiol. 103: (1993)). Około pfu biblioteki wysiano w gęstości około pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-l Arabidopsis (SEKW. ID NR: 1) znakowaną 32P-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). Najdłuższy otrzymany cdna rzepaku nazwany Protox-1 rzepaku jest, na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1) klonem pełnej długości. Protox-1 rzepaku ma 1784 bp długości i koduje białko o wielkości 57,3 kda. Sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 17 i 18. Białko rzepaku jest w 87% identyczne (w 92% podobne) do białka Protox-1 Arabidopsis. Protox-1 rzepaku na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 23 sierpnia 1996 r. jako pwdc-17 (NRRL#B-21615). Przykład 6. Izolacja cdna Protox-l ryżu na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy. Bibliotekę cdna Oryza sativa (5 dni etiolowane pędy) na wektorze Lambda gt 11 zakupiono w firmie Clontech. Około pfu biblioteki wysiano w gąstości około pfu na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) znakowaną 32PdCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i DNA lambda zostało obrobione przy użyciu Wizard Lambda-Prep kit (Promega). Wstawka cdna została zsubklonowana na wektorze pblu-escript przy użyciu standardowych technik. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). w najdłuższym otrzymanym cdna ryżu nazwanym Protox-1 ryżu brakuje peptydu i około 172 aminokwasów dojrzałej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio nr 19 i 20. Protox-1 ryżu na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pwdc-18 (NRRL#B-21648). Przykład 7. Izolacja cdna Protox-l sorgo na podstawie homologii do sekwencji kodującej Protox-1 u kukurydzy. Bibliotekę cdna Sorghum bicolor (3-6 dni zielone sadzonki) na wektorze Lambda Uni- Zap II otrzymano od dr Klaus Pfizenmaier Institute of Cell Biology and Immunology, University of Stuttgart, Germany (Harald Wajant, Karl-Wolfgang Mundiy i Klaus Pfizenmaiet, Plant Mol. Biol. 26: (1994)). Około pfu biblioteki wysiano w gęstości około pfu

32 na 10 cm szklę Petriego i wykonano kopie na filtrach nitrocelulozowych (Schleicher and Schuell). Łysinki hybrydyzowano z sondą cdna Protox-l kukurydzy (SEKW. ID NR:5) znakowaną 32p.-dCTP metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji: 7% SDS; 0,5 M. NaP04 ph 7,0; ImM EDTA; temperatura 50 C. Warunki płukania: 2x SSC, 1% SDS, temperatura 50 C (Church i Gilbert, 1984). Łysinki hybryzujące zostały oczyszczone i wprowadzone in vivo do plazmidów pbluescript. Sekwencje wstawek cdna zostały ustalone metodą terminacji łańcucha z użyciem dideoksy nukleotydów znakowanych fluorescencyjnie (Applied Biosystems, Inc.). w najdłuższym otrzymanym cdna sorgo nazwanym Protox-l sorgo brakuje peptydu liderowego i około 44 aminokwasów pełnej sekwencji kodującej na podstawie homologii z innymi roślinnymi sekwencjami białek protox (tabela 1). Niepełna sekwencja nukleotydowa tego cdna i sekwencja aminokwasową przez nią kodowana są zamieszczone poniżej jako SEKW. ID odpowiednio NR 21 i 22. Protox-l sorgo na wektorze Bluescript SK zostało zdeponowane 6 grudnia 1996 r. jako pwdc-19 (NRRL#B-21649). Przykład 8. Wykazanie wrażliwości klonów protox z roślin na herbicydy hamujące białka protox w układzie bakteryjnym. Płynne hodowle Protox-1/SASX3 8, Protox-2/SASX38 i pblu-escript/xl-1blue prowadzono w pożywce L amp100 Sto mikrolitrów każdej hodowli wysiewano na podłoża L amp100 zawierające różne stężenia (l,0nm-10mm) aryluracylowego herbicydu formuły XVII hamującego protox. Podwójne zestawy szalek inkubowano przez 18 godzin w 37 C. Szczep E. coli XL1-Blue protox+ nie wykazał wrażliwości na herbicyd w żadnym stężeniu zgodnie ze znaną naturalną opornością enzymów własnych bakterii na podobne herbicydy. Protox-l/SASX38 był wyraźnie wrażliwy z murawą bakterii prawie całkowicie usuniętą przy stężeniu inhibitora wynoszącym jedynie 10nM. Protox-2/SASX38 był również wrażliwy ale tylko w wyższych stężeniach herbicydu (10μM). Herbicyd działał nawet wtedy gdy szalki trzymano w prawie całkowitej ciemności. Efekt toksyczny herbicydu można było prawie całkowicie wyeliminować przez dodanie hematyny do pożywki w stężeniu 20μg/ml. Różnice w tolerancji na herbicyd między dwoma szczepami zawierającymi roślinne białko protox są raczej wynikiem różnej ekspresji z tych dwóch plazmidów niż jakiejś właściwej różnicy we wrażliwości enzymów. Protox-1/SASX38 rośnie znacznie wolniej niż Protox-2/SASX38 na wszystkich pożywkach nie zawierających hemu. Poza tym, szczep MzProtox-2/SASX38, którego szybkość wzrostu jest bardzo podobna do szczepu ArabProtox-1/SASX38 jest także bardzo wrażliwy na herbicyd w niższych (10-100nM) stężeniach. Dział B: Identyfikacja i charakteryzacja roślinnych genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox. Przykład 9. Selekcja genów protox wrażliwych na herbicydy hamujące protox w systemie ekspresyjnym E. Coli. Biblioteka cdna Arabidopsis taliana (Landsberg) na wektorze plazmidowym pfl61 (Minet i wsp., Plant J. 2: (1992) została namnożona. Mutant E. coli hemg SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)) był hodowany na pożywce zawierającej hematynę (United States Biochemicals) w stężeniu 20 fag/ml. Biblioteką stransformowano SASX38 techniką elektroporacji używając Bio-Rad Gene Pulser w warunkach zalecanych przez producenta. Stransformowane komórki o gęstości około transformantów/10 cm szalkę wysiano na pożywkę L zawierającą ampicylinę w stężeniu 100 μg/ml. Komórki inkubowano w temperaturze 37 C przez 40 godzin przy ograniczonym dostępie światła i następnie poddano selekcji na zdolność wzrostu bez uzupełnienia pożywki hemem. Prototrofy hemowe były uzyskiwane z biblioteki pfl61 z częstością 400/10. Analiza sekwencji 21 komplementujących klonów wykazała, że 9 z nich należy do typu Protox-1 a wiec genów protox, wynikiem ekspresji których są enzymy protox chloroplastów. Biblioteka pfl61 jest biblioteką ekspresyjną w drożdżach z cdna Arabidopsis wstawionym w obu kierunkach. Te cdna mogą również być eksprymowane w bakteriach. CDNA protox zaczyna się kodonem ATG w ramce na końcu 3' drożdżowej sekwencji PGK około 10 aminokwasów od miejsca cięcia dla enzymu Notl (miejsce wklonowania wstawki) na wekto-

33 rze i może ulegać ekspresji spod promotora LacZ znajdującego się 300 bp przed ramką odczytu, lub też z nieustalonego kryptycznego promotora bakteryjnego. Ponieważ cdna Protox-1 zawierające sekwencje kierujące do chloroplastów hamowały wzrost szczepu E. coli SASX38, do eksperymentów z mutagenezą i selekcją szczepów opornych na herbicydy wybrano klon z najkrótszą chloroplastową sekwencją liderową. Klon ten, pslv19, zawiera tylko 17 aminokwasów domniemanego chloroplastowego peptydu liderowego z sekwencją DNA zaczynającą się od nukleotydu 151 cdna Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR: 1) Plazmidem pslv19 transformowano szczep podlegający losowej mutagenezie XL1- Red (Stratagene, La Jolla, CA). Transformanty wysiewano na podłoże L zawierające ampicylinę w stężeniu 50 μg/ml i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37 C. Murawę transformantów zdrapano z szalki i wyizolowano plazmidowe DNA przy użyciu Wizard Megaprep kit (Promega, Madison, WI). Plazmidowe DNA wyizolowane ze szczepu mutatorowego powinno zawierać około jednej przypadkowej zmiany zasady na 2000 nukleotydów (patrz Greenner i wsp., Strategies 7(2): (1994)) Zmutowanym plazmidowym DNA stransformowano mutanta hemg SASX38 (Sasarman i wsp., J. Gen. Microbiol. 113:297 (1979)) i wysiano na pożywkę L zawierającą różne stężenia herbicydu hamującego protox. Szalki były inkubowane przez 2 dni w temperaturze 37 C. DNA plazmidowy został wyizolowany ze wszystkich kolonii, które rosły w obecności takiego stężenia herbicydu, które zabijało szczep dziki. Wyizolowane DNA był następnie użyty do transformacji szczepu SASX38 i ponownie wysiany na pożywkę z herbicydem w celu upewnienia się, że zaobserwowana oporność jest zależna od plazmidu. Sekwencja kodująca protox z plazmidów, która przeszła selekcję była wycinana enzymem Notl, wklonowana w niezmutowany wektor i ponownie testowana na zdolność do nadania szczepowi tolerancji na herbicyd. Sekwencję cdna protox, która miała zdolność nadawania szczepowi oporności na herbicyd została następnie ustalona. Poprzez porównanie z dziką sekwencją Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR:1) ustalono miejsca mutacji. Z pierwszego eksperymentu z mutagenezą otrzymano pojedynczego mutanta posiadającego mutację w sekwencji kodującej. Ten mutant powoduje wzmocnioną oporność na herbicyd tylko poprzez podwyższenie tempa wzrostu. Zawiera mutację C w a w nukleotydzie 197 (SEKW. ID NR:1) w skróconej chloroplastowej sekwencji liderowej w plazmidzie pslv19, zmieniając kodon ACG dla treoniny w kodon AAG dla lizyny w pozycji 56 białka (SEKW. ID NR:2) i powoduje lepszą komplementację mutanta bakteryjnego. Plazmid zawiera także mutację milczącą w sekwencji kodującej w nukleotydzie 1059 powodującą zmianę kodonu AGT (Ser) w AGC (Ser). Plazmid ten został nazwany pmut-1. Plazmid pmut-1 użyto następnie do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia letalne dla niezmutowanego genu protox pmut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37 C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna pokazała, że geny oporne tworzą dwie klasy. Jedna mutacja powodująca oporność została zidentyfikowana jako zmiana C w T w nukleotydzie 689 sekwencji Ptotox-1 Arabidopsis zamieszczonej poniżej jako SEKW. ID NR:1. Mutacja ta zmienia kodon GCT dla alaniny aminokwasie 220 sekwencji SEKW. ID NR:2 w kodon GTT dla waliny i została nazwana parac-1 Val. Mutant drugiej klasy zawiera zmianę a w G w nukleotydzie 1307 sekwencji Protox-1 Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu TAC dla tyrozyny w aminokwasie 426 w kodon TGC dla cysteiny i została nazwana parac-2cys. Trzeci mutant zawiera zmianę G w a w nukleotydzie 691 sekwencji Protox-l Arabidopsis, powoduje to zmianę kodonu GGT dla glicyny w aminokwasie 221 w kodon AGT dla seryny. Plazmid został nazwany parac-3ser. Oporny mutant parac-2cys w plazmidzie pmut-1 został zdeponowany 14 listopada 1994 pod nazwą pwdc-7 w Agricultural Research Culture Collection i nadano mu numer depozytu NRRL#21339N. Przykład 10. Dodatkowe herbicydoopome podstawienia kodonów w pozycjach zidentyfikowanych w czasie losowego przeszukiwania.

34 Aminokwasy zidentyfikowane jako miejsca oporności przy losowym przeszukiwaniu są podstawiane przez inne aminokwasy i testowane na funkcję i tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym. Mutageneza sterowana przez oligonukleotydy sekwencji Protox-1 Arabidopsis jest przeprowadzana przy użyciu Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit (Clontech, Palo Alto, CA). Po potwierdzeniu zmian aminokwasów przez analizę sekwencyjną, zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i wysiewane na pożywkę L amp100 w celu sprawdzenia funkcji i na różne stężenia herbicydu hamującego protox w celu sprawdzenia tolerancji. Ta procedura jest stosowana dla kodonu alaninowego tworzonego przez nukleotydy i kodonu tyrozynowego tworzonego przez nukleotydy sekwencji Protox-l Arabidopsis (SEKW. ID NR:1). Rezultaty pokazują, że kodon alaninowy (nukleotydy ) może zostać zamieniony na kodon dla waliny, treoniny, leucyny, cysteiny lub izoleucyny by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji. Później, rezultaty pokazują, że kodon tyrozynowy (nukleotydy ) może być zmieniony na kodon dla cysteiny, izoleucyny, leucyny treoniny, metioniny, waliny lub alaniny, by spowodować, że herbicydoopomy enzym protox pozostał przy swej funkcji. Przykład 11. Izolacja dodatkowych mutacji, które zwiększają funkcję enzymatyczną i/lub tolerancję na herbicyd pierwotnie zidentyfikowanych mutantów opornych Plazmidy zawierające oporny na herbicyd gen protox są transformowane do szczepu mutatorowego XL1-Red i zmutowany DNA jest izolowany jak opisano wyżej. Zmutowane plazmidy są transformowane do SASX38 i transformanty są przeszukiwane na stężeniach herbicydu wystarczających by zahamować wzrost oryginalnego opornego mutanta. Kolonie wykazujące tolerancję są izolowane i fenotyp silnej tolerancji jest weryfikowany jakby był zależny od sekwencji jak opisano wyżej. Ustala się sekwencję tych mutantów i identyfikuje mutacje przez porównanie z sekwencją wyjściową. Ta procedura miała zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie parac-lval. Wyniki pokazują, że kodon serynowy aminokwasu 305 (SEKW. ID NR:2) może być zamieniony na kodon dla leucyny by uzyskać enzym z wyższą^ niż pojedynczy mutant parac-lval tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC305Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu treoninowego w aminokwasie 249 zmianę na izoleucynę lub alaninę prowadzącą do enzymu ze zwiększoną tolerancją. Te zmiany są nazwane odpowiednio AraC24911e i AraC249Ala. Ta procedura miała także zastosowanie przy opisanym wyżej mutancie parac-2cys. Wyniki pokazują, że kodon prolinowy aminokwasu 118 (SEKW. ID NR:2) może być zamieniony na kodon dla leucyny by uzyskać enzym z wyższą, niż pojedynczy mutant parac-2cys tolerancją na herbicydy hamujące protox. To drugie miejsce jest nazwane AraC118Leu. Te same wyniki pokazują dla kodonu serynowego w aminokwasie zmianę na leucynę prowadzącą do enzymu parac-2cys ze zwiększoną tolerancją. Ta zmiana została także wyizolowana z mutantem parac-1 Val jak opisano powyżej i została nazwana AraC305Leu. Dodatkowe mutacje zwiększające oporność na herbicyd mutanta parac-2cys zawierały zmianę asparaginy aminokwasie serynę w aminokwasie 425, nazwaną AraC425Ser i tyrozyny w cysteinę cysternę aminokwasie 498 nazwaną AraC498Cys. Te zmiany są określane jako mutacje drugiej pozycji ponieważ nie są one wystarczające do nadania tolerancji na herbicyd, ale raczej wzmacniają funkcję i/lub tolerancję na herbicyd już zmutowanego enzymu. To nie przekreśla możliwości, że inne podstawienia aminokwasów w tych pozycjach mogłyby wystarczyć do wyprodukowania enzymu posiadającego tolerancję na herbicyd dopóki wszystkie możliwe podstawienia nie zostaną gruntownie przetestowane. Przykład 12. Łączenie zidentyfikowanych mutacji oporności ze zidentyfikowanymi mutacjami drugiej pozycji w celu stworzenia wysoce funkcjonalnych/wysoce tolerancyjnych enzymów protox Opisana wyżej mutacja AraC305Leu wzmacnia funkcję/oporność na herbicyd zarówno zmutowanego plazmidu AraC-lVal jak i AraC-2Cys. W drodze do przetestowania użyteczności tej mutacji drugiej pozycji, została ona połączona z mutacjami AraC-2Leu, AraC-2Val, i AraC-2Ile

35 i testowana na tolerancję na herbicyd. W każdym z przypadków zmiana AraC30SLeu znacząco zwiększyła tempo wzrostu opornego mutanta protox na herbicyd hamujący protox. Połączenia mutanta opornego AraC-2fle zarówno z mutantem drugiej pozycji AraC249Ile jak i AraCl 18Leu także doprowadziło do powstania zmutowanych enzymów protox o wyższej tolerancji. Mutacja AraC249Ile pokazuje, że mutacje drugiego miejsca zidentyfikowane jako wzmacniające mutanty AraC-1 mogą także zwiększać oporność mutantów AraC-2. Wykazano, że plazmid z trzema mutacjami zawierającymi AraC-2Ile, AraC305Leu i AraC249Ile produkuje wysoce funkcjonalny, wysoce tolerancyjny na herbicyd enzym protox-l. Przykład 13. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l kukurydzy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd. Opisany powyżej plazmid pmut-1 Arabidopsis Protox-l jest bardzo wydajny w eksperymentach z mutagenezą i przeszukiwaniem, w których daje wysoką częstość prawdziwych mutantów sekwencji kodującej, w opozycji do częstych mutantów zwiększających siłę promotora, które są izolowane przy użyciu innych plazmidów, w celu stworzenia wydajnego systemu przeszukiwania opartego o plazmid dla Protox-l kukurydzy, cdna kukurydzy został włączony do wektora pmut-1 w możliwie takim samym kontekście sekwencyjnym jak cdna Arabidopsis. Używając standardowych metod łączenia zachodzących na siebie produktów PCR, koniec 5' klonu pmut-1 Arabidopsis (zawierający 17 aminokwasów chloroplastowego peptydu liderowego z mutacją typu zmiany sensu opisaną powyżej) został połączony do cdna Protox-l kukurydzy zaczynającego się od aminokwasu numer 14 (SEKW. ID NR:6) sekwencji kukurydzy. Koniec 3' cdna kukurydzy nie był zmieniony. Miejsca cięcia dla enzymu Notl zostały umieszczone na obu końcach utworzonej fuzji, i gen hybrydowy został wklonowany do plazmidu pfl61 będącego protoplastą pmut-1. Analiza sekwencyjna wykazała jedno nukleotydową milczącą mutację wprowadzoną przez PCR, która zmienia kodon ACG (nukleotydy ) (SEKW. ID NR:5) w kodon ACT, oba kodujące treoninę. Ten hybrydowy plazmid Protox-l Arab-kukurydza został nazwany pmut-3. Plazmid pmut-3 użyto do transformacji szczepu mutatorowego XL1-Red jak opisano powyżej i zmutowane DNA było izolowane i wysiewane na pożywki zawierające stężenia łetalne dla niezmutowanego genu protox pmut-1. Kolonie oporne na herbicyd były izolowane po dwóch dniach w 37 C i analizowane jak opisano powyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 5 pojedynczych zmian zasad, które prowadzą do enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Trzy z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis powodowały tolerancję. Dwie z trzech to pmzc-lval i pmzc-ithr, zmieniające alaninę (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6) w walinę (GAT) lub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom parac-1. Trzecia analogiczna zmiana wymienia glicynę (GGT) w pozycji 165 w serynę (AGT) co odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-3Ser. Te wyniki służą potwierdzeniu oczekiwania, że mutacje herbicydoopome zidentyfikowane w jednym roślinnym genie protox mogą również nadawać oporność na herbicyd odpowiadającym roślinnym genom protox z innych gatunków. Dwie z mutacji wyizolowanych z przeszukiwania Protox-l kukurydzy doprowadziły do zmian aminokwasów w zasadach wcześniej niezidentyfikowanych jako miejsca oporności. Jedna zmiana powoduje wymianę cysteiny (TGC) w fenyloalaninę (TTC) w aminokwasie 159 sekwencji Protox-l kukurydzy (SEKW. ID NR:6). Druga zamienia izoleucynę (ATA) na treoninę (ACA) w aminokwasie 419. Dodatkowe podstawienia aminokwasów zostały zrobione i przetestowane dla trzech miejsc mutacji u kukurydzy. Wykazano tolerancję kiedy glicyna 165 była zamieniona na leucynę lub kiedy cysteina 159 była zamieniona na leucynę lub lizynę. Enzymy wykazujące tolerancję zostały także stworzone przez zamianą izoleucyny 419 whistydynę, glicynę lub asparaginę. Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l kukurydzy przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (GCT) w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6) w leucynę (CTT) prowadziła do utworzenia

36 enzymu wykazującego silną tolerancję. Nie wyizolowano dla kukurydzy mutacji analogicznej do mutacji AraC-2 u Arabidopsis. Jednakże, zmiana tego miejsca, tyrozyny 370 w enzymie kukurydzy (SEKW. ID NR:6) w izoleucynę lub metioninę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Przykład 14. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l pszenicy, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd. Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cdna pszenicy zostało wprowadzone do wektora pmut-1 jak to opisano powyżej dla cdna kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-pszenica został nazwany pmut-4. DNA pmut-4 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 7 pojedynczych zmian zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Cztery z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis/.kukurydzy powodowały tolerancję. Dwie zmieniają alaninę (GCT) w aminokwasie 211 (SEKW. ID NR: 10) w walinę (GAT) lub treoninę (ACT). Ta pozycja odpowiada opisanym wyżej mutacjom parac-1. Trzecia analogiczna mutacja zmienia glicynę (GGT) w aminokwasie 212 wserynę (AGT) odpowiadając opisanej powyżej mutacji AraC-3Ser. Czwarta zmienia izoleucynę (ATA) na treoninę (ACA) w aminokwasie 466 odpowiadając mutantowi Mz419Thr. Trzy z wyizolowanych mutacji z przeszukiwania Protox-l pszenicy doprowadziło do znalezienia zmian aminokwasów wcześniej nie zidentyfikowanych. Jedna mutacja zmienia walinę (GTT) w leucynę (CTT) w aminokwasie 356 sekwencji Protox-l pszenicy (SEKW. ID NR: 10). Druga zmienia serynę (TCT) w prolinę aminokwasie aminokwasie 421. Trzecia zmienia walinę (GTT) w alaninę (GCT) w aminokwasie 502. Przykład 15. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l soi, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd. Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l pszenicy, cdna soi zostało wprowadzone do wektora pmut-1 jak to opisano powyżej dla cdna kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-soja został nazwany pmut-5. DNA pmut-5 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 4 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują utworzenie enzymu Protox-l kukurydzy wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa z tych mutantów odpowiadają zmianom aminokwasów, które jak wcześniej wykazano, w homologicznych pozycjach w genie Protox-l Arabidopsis/pszenicy powodowały tolerancję. Jedna zmienia alaninę (GCA) w aminokwasie 226 (SEKW. ID NR: 12) treoninę (ACA). Ta pozycja odpowiada opisanej wyżej mutacji parac-ithr. Druga analogiczna mutacja zmienia walinę (GTT) w aminokwasie 517 w alaninę (GCT) odpowiadając opisanej powyżej mutacji Wht502Val u pszenicy. Dwie z wyizolowanych w czasie przeszukiwania Protox-l pszenicy mutacji powodowały wcześniej nie zidentyfikowane zmiany aminokwasów. Jedna mutacja zmienia prolinę (CCT) w serynę (TCT) w aminokwasie 369 sekwencji Protox-l soi (SEKW. ID NR: 12). Druga zmienia tę samą prolinę 369 w histydynę (CAT). Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-l Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana alaniny (GCT) w aminokwasie 226 (SEKW. ID NR: 12) w leucynę prowadziła do utworzenia enzymu wykazującego silną tolerancję. Zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 432 (SEKW. ID NR: 12) w leucynę lub izoleucynę prowadziła do powstania enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Przykład 16. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l buraka cukrowego, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd. Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l buraka cukrowego, cdna buraka cukrowego zostało wprowadzone do wektora pmut-1 jak to opisano

37 powyżej dla cdna kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid Arab-burak cukrowy został nazwany pmut-6. DNA pmut-6 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała pojedynczą zmianę zasady, która powoduje powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Ta mutacja zmienia tyrozynę (TAC) w aminokwasie 449 w cysteinę (TGC) i odpowiada opisanej wyżej mutacji AraC-2 u Arabidopsis. Pojedyncze zmiany aminokwasów, które powodowały powstanie wysoce tolerancyjnych na herbicyd enzymów Protox-1 Arabidopsis były wprowadzone do genu Protox-l soi przez mutagenezę ukierunkowaną jak opisano powyżej. Testy w bakteriach wykazały, że zmiana tyrozyny (TAC) w aminokwasie 449 w leucynę, izoleucynę, walinę lub metioninę prowadziła do utworzenie enzymu buraka cukrowego wykazującego silną tolerancję na herbicyd. Przykład 17. Identyfikacja miejsc w genie Protox-l bawełny, których mutacje mogą prowadzić do tolerancji na herbicyd. Aby stworzyć wydajny system przeszukiwania oparty na plazmidach dla Protox-l bawełny, cdna bawełny zostało wprowadzone do wektora pmut-1 jak to opisano powyżej dla cdna kukurydzy. Ten hybrydowy plazmid został nazwany pmut-7. DNA pmut-7 zostało zmutowane i przeszukane na oporność na herbicyd jak opisano wyżej. Wiele plazmidów zawierało oporne na herbicyd sekwencje protox. Analiza sekwencyjna wykazała 3 pojedyncze zmiany zasad, które samodzielnie powodują powstanie enzymu wykazującego tolerancję na herbicyd. Dwa mutanty zmieniają tyrozynę (TAC) w aminokwasie 428 (SEKW. ID NR: 16) odpowiednio w cysteinę (TGC) i argininę (CGC). Arginina jest nowym podstawieniem dającym tolerancję na herbicyd w tej wcześniej zidentyfikowanej pozycji AraC-2. Trzecia mutacja zmienia prolinę (CCC) w serynę (TCC) w aminokwasie 365. Ta zmiana odpowiada mutantowi Soy369Ser soi. Przykład 18. Wykazanie krzyżowej tolerancji mutacji oporności na różne czynniki hamujące protox Zmutowane oporne plazmidy oryginalnie zidentyfikowane w oparciu o oporność na jeden herbicyd hamujący protox były testowane wieloma innymi czynnikami hamującymi protox. Do tego testu szczep SASX38 zawierający dziki plazmid jest wysiewany na szeregu rozcieńczeń każdego czynnika aby ustalić letalne stężenie dla każdego z nich. Zmutowane plazmidy oporne w SASX38 są wysiewane i zliczane na zdolność przetrwania na stężeniu każdego czynnika przynajmniej 10 razy większym niż stężenie, które jest śmiertelne dla szczepu SASX38 zawierającego dziki plazmid. Wyniki bakteryjnego testu krzyżowego, pokazane w tabelach 3A i 3B poniżej, wskazują, ze każda ze zidentyfikowanych mutacji niesie tolerancję na wiele czynników hamujących protox. Tabela 3A Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów protox na różne inhibitory proton Wzór AraC-1 AraC-2 Cys AraC-1 Thr AraC-3Thr MzC-1 Val XVII VIIa IV XV XI XVI XII XIV *X + = tolerancja 10x wyższa niż szczepu dzikiego ++ = tolerancja 10x wyższa niz szczepu dzikiego - = brak tolerancji krzyżowej * = ten czynnik był testowany lecz nie uzyskano żadnych informacji

38 Tabela 3B Tolerancja krzyżowa roślinnych mutantów protox na różne inhibitory proton AraC-2Ile AraClLeu AraClLeu+ AraC- 2Met AraClLeu+ AraC- 2Leu AraC- 2Ile+ AraC3-05Leu AraC- 2Cys+Ara C42 5 Ser AraC- 2Leu+ AraC42 5 Ser AraC- 2Met+ AraC42 5 Ser XVII Vila IV XV XI XVI XII XIV 4-= Dział C: Ekspresja herbicydoopomych genów protox w roślinach transgenicznych Przykład 19. Tworzenie roślin opornych na herbicydy hamujące protox metodą rekombinacji homologicznej lub konwersji genów. Ponieważ opisane mutanty sekwencji kodującej wydajnie nadają tolerancje na herbicyd gdy ulegają ekspresji spod naturalnego promotora protox, ukierunkowane zmiany sekwencji kodującej protox w jej naturalnej lokalizacji chromosomowej stanowią alternatywę dla stworzenia opornych na herbicyd roślin i komórek roślinnych. Fragment DNA protox zawierający żądane mutacje, lecz nie posiadający własnych sygnałów ekspresji (promotora lub regionu 3' nie podlegającego translacji) może zostać wprowadzony jedną z kilku dobrze znanych metod (na przykład transformacja Agrobacterium, bezpośredni transfer genów do protoplastów, bombardowanie mikropociskami) i można selekcjonować transformanty wykazujące tolerancje na herbicyd. Wprowadzane fragmenty DNA zawierają także diagnostyczne miejsce restrykcyjne lub inny polimorfizm sekwencyjny, który jest wprowadzany przez ukierunkowaną mutagenezę in vitro bez zmieniania kodowanej sekwencji aminokwasowej (na przykład mutacja milcząca), z wcześniejszych doniesień dla wielu markerów selekcyjnych i genów oporności na herbicydy (patrz na przykład Paszkowski iwsp., EMBO J. 7: (1988); Lee i wsp., Plant Celi 2: (1990); Risseeuw iwsp., Plant J. 7: (1995)) wynika, że niektóre znalezione transformanty są wynikiem integracji homologicznej zmutowanego DNA w locus chromosomalne protox, lub konwersji naturalnej sekwencji chromosomalnej protox we wprowadzaną sekwencję mutanta. Te transformanty są rozpoznawane dzięki kombinacji fenotypu tolerancji na herbicyd i obecności diagnostycznego miejsca restrykcyjnego w ich chromosomalnym locus protox. Przykład 20. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin Liczne wektory do transformacji są osiągalne do transformacji roślin i geny mogą być używane w połączeniu z każdym z takich wektorów. Selekcja używanego wektora będzie zależała od preferowanej techniki transformacji i gatunku biorcy. Dla różnych biorców mają zastosowanie różne antybiotykowe lub herbicydowe markery selekcyjne. Markery selekcyjne rutynowo stosowane w transformacji to: gen nptll, który nadaje odporność na kanamycynę i podobne antybiotyki (Messing i Vierra, Gene 19: (1982)), gen bar nadający oporność na herbicyd fosfinotrycynę (White i wsp., Nuci Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer i wsp., Theor Appl Genet 79: (1990), gen hph nadający oporność na antybiotyk hygromycynę (Blochinger

39 i Diggelmann, Mol Celi Biol 4: (1983)) i gen dhfr, który niesie oporność na metotreksat (Bourouis i wsp., EMBO J. 2(7): (1983)). I. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji Agrobacterium Istnieje wiele wektorów odpowiednich do transformacji przy użyciu Agrobacterium tumefaciens. Mają one przeważnie przynajmniej jedną sekwencję graniczną T-DNA i zawierają wektory takie jak pbin19 (Bevan, Nuci. Acids Res. (1984)) i pxyz. Konstrukcja dwóch typowych wektorów jest opisana poniżej. Konstrukcja pcib200 ipcib2001: Wektory bifunkcjonalne pcib200 ipcib2001 są używane do konstrukcji zrekombinowanych wektorów do użytku z Agrobacterium i zostały skonstruowane w następujący sposób. ptjs75kan został stworzony przez strawienie enzymem Narl ptjs75 (Schmidhauser i Helinskl, J Bacteriol 164: (1985)) co pozwoliło na wycięcie genu oporności na tetracyklinę, następnie wstawiono fragment AccI z puc4k niosący NPTII (Messing i Vierra, Gene 19: (1982); Bevan i wsp., Nature 304: (1983); McBride i wsp., Plant Molecular Biology 14: (1990)). Doligowano adaptory Xhol do fragmentu EcoRV pcib7, który zawierał lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA, roślinny hybrydowy gen selekcyjny nos/nptll i polilinker puc (Rothstein i wsp., Gene 53: (1987)) i fragment strawiony enzymem Xhol został wklonowany w strawiony enzymem Sa/7 ptjs75kan by utworzyć pcib200 (patrz także EP , przykład 19). pcib200 zawiera następujące pojedyncze miejsca trawienia w polilinkerze: EcoRI, Sstl, KpnI, Bgll, Xbal i Sali. pcib2001 pochodzi od pcib200 i stworzony został przez wstawienie do polilinkera dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Pojedynczymi miejscami trawienia w polilinkerze pcib2001 są EcoRI, Sstl, KpnI, Bgll, Xbal Sali, Mlul, Bell, Avril, Apal, Hpal, i Stul. Oprócz posiadania dodatkowych pojedynczych miejsc trawienia pcib2001 posiada bakteryjną i roślinną selekcję na kanamycynę, prawą i lewą sekwencję graniczną T-DNA do transformacji przy użyciu Agrobacterium, Funkcję trfa pochodzącą z RK2 umożliwiającą przemieszczanie się między E. coli i innymi gospodarzami oraz OriT i OriV także z RK2. Polilinker pcib2001 jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających własne sygnały regulacyjne. Konstrukcja pciblo i jego pochodnych z selekcją nahygromycynę: Bifunkcjonalny wektor pcib10 zawiera gen kodujący oporność na kanamycynę do selekcji w roślinach, lewą i prawą sekwencję graniczną T-DNA i posiada sekwencje z plazmidu prk252 zdolnego do działania w wielu gospodarzach umożliwiające replikację zarówno w E. coli jak i Agrobacterium. Jego konstrukcja jest opisana przez Rothstein i wsp., Gene 53: (1987). Liczne pochodne zawierające gen fosfotransferazy hygromycyny B pciblo zostały stworzone i opisane przez Gritz i wsp., Gene 25: (1983). Te pochodne umożliwiają selekcję transgenicznych komórek roślinnych na hygromycynie (pcib743) lub hygromycynie i kanamycynie (pcib715, pcib717). II. Konstrukcja wektorów odpowiednich do transformacji bez użycia Agrobacterium. Transformacja bez użycia. Agrobacterium tumefaciens pozwala na obejście konieczności posiadania przez wybrany wektor sekwencji T-DNA i konsekwentnie wektory nie posiadające tych sekwencji mogą być używane równocześnie z wektorami takimi jak opisane wyżej zawierającymi sekwencje T-DNA. Technikami transformacji, które nie opierają się na, Agrobacterium są: transformacja przez bombardowanie cząsteczkami, pobieranie przez protoplasty (na przykład PEG i elektroporacja) i mikroinjekcja. Wybór wektorów w dużym stopniu zależy od preferowanego rodzaju selekcji dla transformowanego gatunku. Poniżej opisano konstrukcję kilku typowych wektorów Konstrukcja pcib3064: pcib3064 jest wektorem pochodzącym od wektora puc odpowiednim do technik bezpośredniego transferu genów w kombinacji z selekcją na herbicyd basta (lub fosfinotrycynę). Plazmid pcib246 obejmuje promotor CaMV 35S w funkcjonalnej fuzji z genem GUS E. coli i terminator transkrypcji CaMV 35S i jest opisany w opublikowanym przez PCT zgłoszeniu patentowym WO 93/ Promotor 35S tego wektora zawiera dwie sekwencje ATG w kierunku 5' od startu. Te pozycje zostały zmutowane przy użyciu standardowych metod PCR w taki sposób by usunąć oba ATG i wprowadzić miejsce trawienia dla enzymu Sspl i PvuII. Nowe miejsca restrykcyjne były położone 96 i 37 od pojedynczego

40 jedynczego miejsca trawienia Sall i 101 i 42 bp od rzeczywistego miejsca startu. Uzyskany plazmid wywodzący się z pcib246 został nazwany pcib3025. Następnie gen GUS został wycięty z pcib3025 przez trawienie enzymami Sall i Sacl, końce zostały strawione na tępo i ponownie zligowane by utworzyć plazmid pcib3060. Plazmid pjit82 otrzymano z John Innes Centre, Norwich i fragment Smal o wielkości 400 bp zawierający gen bar ze Streptomyces viridochromogenes został z niego wycięty i wstawiony w miejsce Hpal plazmidu pcib3060 (Thompson i wsp. EMBO J 6: (1987)). Tak utworzony pcib3064, który zawiera gen selekcji na herbicyd bar pod kontrolą promotora i terminatora CaMV 35S, gen oporności na ampicylinę (do selekcji w E. coli) i polilinker z pojedynczymi miejscami trawienia dla enzymów SphI, PstI, HindII i BamHI. Ten wektor jest odpowiedni do klonowania roślinnych kaset ekspresyjnych zawierających swoje własne sygnały regulatorowe. Konstrukcja psog19 i psog35: psog35 jest wektorem do transformacji, który używa gen reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) E. coli jako markera selekcyjnego nadającego oporność na methotrexate. Użyto PCR do namnożenia promotora 35S (~800bp), 6 intronu genu Adhl kukurydzy (~550bp) i 18 bp nie podlegającej translacji sekwencji liderowej GUS z psog10. Fragment o długości 250bp kodujący gen reduktazy dihydrofolanowej typu drugiego E. coli został również namnożony techniką PCR i te dwa fragmenty zostały połączone fragmentem Sacl-Pstl zpbi221 (Clontech), który zawiera szkielet wektora puc19 i terminator syntazy nopalinowej. Połączenie tych fragmentów utworzyło psog19, który zawiera promotor 35S w fuzji z sekwencją intronu 6, lider GUS, gen DHFR i terminator syntazy nopalinowej. Zastąpienie lidera GUS w psog19 liderem sekwencji z Wirusem Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV) utworzyło wektor psog35. PSOG19 i psog35 niosą gen oporności na ampicylinę z puc i mają miejsca trawienia dla HindIII, SphI, Pstl, i EcoRI, które można zastosować do klonowania obcych sekwencji. Przykład 21: Konstrukcja roślinnych kaset ekspresyjnych Sekwencje genów, przeznaczone do ekspresji w roślinach transgenicznych są wpierw włączane do kaset ekspresyjnych za odpowiednim promotorem i przed odpowiednim terminatorem transkrypcji. Takie kasety ekspresyjne mogą być łatwo przenoszone do roślinnych wektorów do transformacji opisanych wyżej w przykładzie 20. I Wybór promotora Wybór promotora użytego w kasetach ekspresyjnych będzie miał wpływ na przestrzenny i czasowy wzór ekspresji transgenu w roślinie transgenicznej. Wybrane promotory będą eksprymować transgeny w specyficznych typach komórek (jak komórki epidermy liści, komórki mezofilu, komórki kory korzenia) lub w specyficznych narządach lub tkankach (na przykład korzeń, liście lub kwiaty) i ten wybór będzie odbiciem żądanej lokalizacji ekspresji transgenu. Wybrany promotor może również powodować ekspresję genu spod słabo indukowalnego lub podlegającego regulacji czasowej promotora. Późniejszą alternatywą jest wybór promotora regulowanego chemicznie. To umożliwi ekspresję transgenu tylko na żądanie, wtedy gdy zostanie potraktowany induktorem chemicznym. II Terminatory transkrypcji Jest wiele terminatorów transkrypcji dostępnych do użycia w kasetach ekspresyjnych. Są one odpowiedzialne za terminację transkrypcji za transgenem i jego prawidłową poliadenylację. Odpowiednie są takie terminatory transkrypcji, o których wiadomo, że działają w roślinach i zawierają terminator 35S CaMV, terminator tml, terminator syntazy nopalinowej, terminator rbcs E9 grochu jak również terminatory naturalnie związane z roślinnymi genami protox (na przykład terminatory protox ). Mogą być one używane zarówno w roślinach jedno-jak i dwuliściennych. III. Sekwencje wzmacniające lub regulujące ekspresję Znaleziono liczne sekwencje wzmacniające ekspresję genów wewnątrz jednostki transkrypcyjnej i te sekwencje mogą być użyte w połączeniu z genami do zwiększenia ich ekspresji w roślinach transgenicznych. Wykazano, że różne sekwencje intronów wzmacniają ekspresję, szczególnie w komórkach roślin jednoliściennych. Na przykład introny genu Adhl kukurydzy znacząco wzmacniają ekspresję dzikiego genu pod jego własnym promotorem, gdy zostanie wprowadzony do komórek kukurydzy. Stwierdzono, że intron 1 jest szczególnie wydajny i wzmacnia ekspresję

41 w konstrukcji będącym fuzją z genem acetylotransferazy chloramfenikolu (Callis i wsp. Genes Develop. 1: (1987)). W tym samym systemie eksperymentalnym, intron genu bronzel miał podobny efekt wzmacniający ekspresję (Callis i wsp., to samo). Sekwencje intronów były rutynowo włączane do wektorów służących do transformacji roślin, przeważnie wewnątrz nie ulegającego translacji lidera. Znanych jest również wiele nie ulegających translacji sekwencji liderowych pochodzących z wirusów, które wzmacniają ekspresję i są one szczególnie wydajne w komórkach roślin dwuliściennych. Wykazano, że szczególnie sekwencje liderowe Wirusa Mozaiki Tytoniowej (TMV, sekwencja-w ), Wirusa Chlorotycznej Plamistości Kukurydzy (MCMV), Wirus Mozaiki Lucerny (AMV) są wydajne we wzmacnianiu ekspresji (na przykład Gallie i wsp. Nuci. Acids Res. 15: (1987); Skuzeski i wsp. Plant Molec. Biol. 15: (1990)). IV. Kierowanie produktu genu w obrębie komórki Znane są różne mechanizmy kierowania produktów genów u roślin i sekwencje kontrolujące funkcjonowanie tych mechanizmów zostały dość szczegółowo scharakteryzowane. Na przykład kierowanie produktów genów do chloroplastów jest kontrolowane przez sekwencję sygnałową, która jest spotykana na N-końcu różnych białek i która jest odszczepiana podczas importu do chloroplastów dając dojrzałe białko (np. Comal i wsp., J. Biol. Chem. 263: (1988)). Te sekwencje sygnałowe mogą być połączone z heterologicznymi produktami genów aby przeprowadzić importowanie heterologicznych produktów do chloroplastu (van den Broeck i wsp. Nature 313: ). DNA kodujący odpowiednie sekwencje sygnałowe może być izolowany z 5' końca cdna kodujących białko RUBISCO, białko CAB, enzym syntazę EPSP, białko GS2 i wiele innych białek, o których wiadomo, że są zlokalizowane w chloroplaście. Inne produkty genów są zlokalizowane w innych organellach takich jak mitochondrium i peroksysom (np. Unger i wsp. Plant Molec. Biol. 13: (1989)). cdna kodujący te produkty może też być manipulowany aby uzyskać efekt kierowania heterologicznych produków genów do tych organelli. Przykładami takich sekwencji są kodowane w jądrze ATPazy i specyficzne dla mitochondriów aminotransferazy asparaginianowe. Kierowanie do organelli komórkowych opisali Rogers i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: (1985)). Dodatkowo scharakteryzowano sekwencje, które powodują kierowanie produktów genów do innych kompartymentów komórki. N-końcowe sekwencje są odpowiedzialne za kierowanie do ER, apoplastu, i zewnątrzkomórkowego wydzielania z komórek aleuronu (Koehler & Ho, Plant Celi 2: (1990)). Dodatkowo, N-końcowe sekwencje w połączeniu z C-końcowymi sekwencjami są odpowiedzialne za kierowanie produktów genu do wakuoli (Shinsi i wsp., Plant Molec. Biol. 14: (1990)). Przez fuzję odpowiednich sekwencji kierujących opisanych powyżej z sekwencjami interesującego transgenu jest możliwe kierowanie produktu transgenu do dowolnej organelli lub kompartymentu komórki. Dla kierowania do chloroplastów, na przykład, sekwencja sygnałowa z genu RUBISCO, genu CAB, genu syntazy EPSP lub genu GS2 jest połączona w ramce odczytu z N-końcowym ATG transgenu. Wybrana sekwencja sygnałowa powinna obejmować znane miejsce cięcia i skonstruowana fuzja powinna uwzględniać dowolne aminokwasy po miejscu cięcia, które są wymagane do cięcia, w niektórych przypadkach to wymaganie może być spełnione przez dodanie niewielkiej ilości aminokwasów między miejscem cięcia i ATG transgenu lub alternatywnie zastąpienie niektórych aminokwasów sekwencją transgenu. Fuzje skonstruowane dla importu do chloroplastów mogą być testowane pod kątem skuteczności pobierania do chloroplastów przez translację in vitro konstruktów transkrybowanych in vivo a następnie przez pobieranie in vitro do chloroplastów stosując techniki molekularne opisane przez (Bartlett i wsp. W: Edelmann i wsp. (red.) Methods in chloroplast molecular biology, Elsevier str (1982); Wasmann i wsp. Mol. Gen. Genet., 205: (1986)). Te techniki konstrukcji są dobrze znane w dziedzinie i są w tym samym stopniu stosowalne do mitochondriów i peroksysomów. Wybór kierowania, które może być wymagane dla ekspresji transgenów będzie zależał od komórkowej lokalizacji prekursora wymaganego jako punktu wyjścia dla danego szlaku. Będzie ona na ogół cytosoliczna lub chloroplastowa, choć może

42 w niektórych przypadkach być mitochondrialna lub peroksysomalna. Produkty ekspresji transgenu nie będą normalnie wymagały kierowania do ER, apoplastu lub wodniczki. Powyżej opisane mechanizmy nakierowywania w komórce mogą być wykorzystane nie tylko w połączeniu ze swymi odpowiednimi promotorami ale także w połączeniu z heterologicznymi promotorami tak by osiąnąć specyficzny cel kierowania pod regulacją transkrypcyjną promotora inną niż ten, z którego pochodzi sygnał kierowania. Przykład 22. Transformacja dwuliściennych Techniki transformacji dla dwuliściennych są dobrze znane w dziedzinie i obejmują techniki oparte o Agrobacterium i techniki, które nie wymagają Agrobacterium. Techniki nie wymagające Agrobacterium obejmują pobranie egzogennego materiału bezpośrednio przez protoplasty lub komórki. Może to być uzyskane przez pobieranie, w którym pośredniczy PEG lub elektroporacja, bombardowanie cząsteczkami lub mikroiniekcję. Przykłady tych technik opisali Paszkowski i wsp., EMBO J. 3: (1984), Potrykus i wsp., Mol. Gen. Genet. 199: (1985), Reich i wsp., Biotechnology 4: (1986) i Klein i wsp., Naturę 327, (1987). w każdym przypadku transformowane komórki są regenerowane do całych roślin stosując standardowe techniki znane w dziedzinie. Transformacja, w której pośredniczy Agrobacterium jest preferowaną techniką transformacji dwuliściennych ze względu na swoją wysoką wydajność transformacji i szeroką stosowalność do wielu różnych gatunków. Wiele gatunków roślin uprawnych, które można rutynowo transformować Agrobacterium obejmuje tytoń, pomidory, słonecznik, bawełnę, rzepak oleisty, ziemniak, soję, lucernę i topolę (EP (bawełna), EP (pomidor, dla Calgene), WO 87/07299 (Brassica, dla Calgene), US 4,795,855 (topola). Transformacja docelowego gatunku roślin przez zrekombinowany Agrobacterium na ogół obejmuje kokultywację Agrobacterium z eksplantami z rośliny i zachodzi według protokołów dobrze znanych w dziedzinie. Tkanka stransformowana jest regenerowana na pożywce selekcyjnej zawierającej marker oporności na antybiotyk lub herbicyd obecny między granicami dwuskładnikowego plazmidu T. Przykład 23. Transformacja jednoliściennych Transformacja większości gatunków jednoliściennych jest obecnie rutynowa. Preferowane techniki obejmują bezpośredni transfer genów do protoplastów z zastosowaniem PEG lub technik elektroporacji, i bombardowanie cząsteczkami tkanki kalusa. Transformacje mogą być przeprowadzane pojedynczym rodzajem DNA lub wieloma rodzajami DNA (np. kotransformacja) i obie te techniki są odpowiednie do stosowania z niniejszym wynalazkiem. Kotransformacja może mieć zaletę unikania konstrukcji złożonych wektorów i generowania roślin transgenicznych z niesprzężonymi loci dla interesującego genu i markera selekcyjnego pozwalając na usunięcie markera w kolejnych pokoleniach, o ile to jest uważane za pożądane. Jednak wadą stosowania kotransformacji jest mniejsza niż 100% częstość, z którą oddzielne rodzaje DNA są wintegrowywane do genomu (Schocher i wsp., Biotechnology 4: (1986). Zgłoszenia patentowe EP (dla Ciba Geigy), EP (dla Ciba Geigy) i WO 93/07278 (dla Ciba-Geigy) opisują techniki przygotowania kalusów i protoplastów z elitarnej linii wsobnej kukurydzy, transformację protoplastów z zastosowaniem PEG lub elektroporacji i regenerację roślin kukurydzy ze stransformowanych protoplastów. Gordon- Kamm i wsp., Plant Celi 2: (1990)) i Fromm i wsp., Biotechnology 8: (1990) opublikowali techniki transformacji linii kukurydzy pochodzącej od A l88 stosując bombardowanie cząsteczkami. Dodatkowo, zgłoszenie WO 93/07278 (dla Ciba-Geigy) i Kozieł i wsp., Biotechnology 11: (1993) opisują techniki dla transformacji elitarnych wsobnych linii kukurydzy za pomocą bombardowania cząsteczkami. Technika ta stosuje niedojrzałe zarodki kukurydzy o długości 1,5-2 mm wycięte z kłosa kukurydzy dni po zapyleniu i urządzenie biolistyczne PDS-lOOOHe do bombardowania. Transformacja ryżu może też być przeprowadzona za pomocą technik bezpośredniego przenoszenia genów stosując protoplasty lub bombardowanie cząsteczkami. Transformacja w której pośredniczą protoplasty była opisany dla typów Japonica i typów Indica (Zhang i wsp., Plant Celi Rep. 7: (1988); Shimamoto i wsp., Naturę 336: (1989); Datta i wsp.,

43 Biotechnology 8: (1990)). Oba typy także mogą być rutynowo transformowane stosując bombardowanie cząsteczkami (Christou i wsp., Biotechnology 9: (1991). Zgłoszenie patentowe EP (dla Ciba-Geigy) opisuje techniki dla generacji, transformacji i regeneracji protoplastów Pooideae. Techniki te pozwalają na transformację Dactylis i pszenicy. Dodatkowo, transformacja pszenicy, którą opisali Vasil i wsp., Biotechnology 10: (1992)) stosując bombardowanie cząsteczkami kalusa długoterminowego typu C, a także Vasil i wsp., Biotechnology 11: (1993)) i Weeks i wsp., Plant Physiol. 102: (1993) stosując bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i kalusa pochodzącego od niedojrzałych zarodków. Korzystna technika transformacji pszenicy obejmuje jednak transformację pszenicy przez bombardowanie cząsteczkami niedojrzałych zarodków i obejmuje etap albo z wysoką sukrozą albo wysoką maltozą przed podaniem genu. Przed bombardowaniem dowolna ilość zarodków (0,75-1 mm długości) jest wysiewana na pożywkę MS z 3% sukrozą (Murashige i Skoog, Physiologia Plantarum 15: (1962)) i 3 mg/ml 2,4-D dla indukcji somatycznych zarodków, która zachodzi w ciemności, w wybranym dniu bombardowania zarodki są usuwane z pożywki indukcyjnej i umieszczane w osmoticum (tzn. pożywce indukcyjnej z dodaną sukrozą lub maltozą w pożądanym stężeniu, typowo 15%). Następnie pozwala się na zajście plazmolizy u zarodków przez 2-3 godziny i poddaje się je bombardowaniu. Dwadzieścia zarodków na płytce jest typowe, choć nie jest krytyczne. Odpowiedni plazmid niosący gen (taki jak pcib3064 lub psg35) jest strącany na cząsteczki złota o wielkości mikrometra stosując standardowe procedury. Do każdej płytki z zarodkami strzela się z urządzenia DuPont Biolistics- hel stosując ciśnienie strzału ok psi i standardowy ekran o sieci 80. Po bombardowaniu zarodki umieszcza się ponownie w ciemności by doszły do siebie przez około 24 godz (nadal na osmoticum). Po 24 godz. zarodki usuwane są z osmoticum i umieszczane ponownie na pożywce indukcyjnej, na której pozostają przez miesiąc przed regeneracją. Około jeden miesiąc później eksplanty zarodków z rozwijającym się embriogennym kalusem są przenoszone na pożywkę regeneracyjną (MS + 1 mg/litr NAA, 5 mg/litr GA) dodatkowo zawierającą odpowiedni czynnik selekcyjny (10 mg/l basta dla pcib3064v i 2 mg/l metotreksatu dla psog35). Po około miesiącu rozwinięte pędy przenosi się do większych sterylnych pojemników znanych jako GA7 które zawierają MS protoplastów połowie stężenia, 2% sukrozę i to samo stężenie czynnika selekcyjnego. Zgłoszenie patentowe WO 94/13822 opisuje sposoby transformacji pszenicy i jest tu włączone w formie odniesienia. Przykład 24. Izolacja sekwencji promotora protox-1 Arabidopsis thaliana Bibliotekę genomową z Arabidopsis thaliana (Columbia, cała roślina) w lambda Zap II nabyto od Stratagene. Około fagów wysiano z gęstością pfu na 15 cm szalkę Petriego i sporządzono duplikaty na membrany Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cdna Protox-1 Arabidopsis (SEKW. ID NR:1 wyznakowana za pomocą 32-P dctp metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65 C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984). Dodatnie hybrydyzujące łysinki oczyszczano i in vivo wycinano do plazmidów pbluescript. Sekwencje z wstawek genomowego DNA określano za pomocą metody terminacji łańcucha stosując terminatory dideoksy wyznaczone stosując barwniki fluoryzujące (Applied Biosystems, Inc.). Stwierdzono, że jeden klon, AraPTIPro, zawiera 580 bp sekwencji Arabidopsis przed inicjującą metioniną (ATG) sekwencji kodującej białka Protox-l. Klon ten także zawiera sekwencje kodujące i introny które sięgają do 1241 bp sekwencji cdna Protox-l. 580 bp 5' nie kodującego fragmentu stanowi przypuszczalny promotor Protox-l Arabidopsis, i sekwencja jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 13. AraPTIPro zdeponowano 15 grudnia, 1995 jako pwdc-11 (NRRL #B-21515). Przykład 25. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmieniony gen Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1. cdna pełnej długości odpowiedniego zmienionego cdna Protox-1 Arabidopsis wyizolowano jako częściowy produkt trawienia EcoRI-XhoI i sklonowano w roślinnym wektorze ekspresyjnym pcgn1761enx (patrz Przykład 9 międzyn. zgłoszenia patentowego Nr PCT/IB95/00452 zgłoszonego 8 czerwca, 1995 i opublikowanego 21 grudnia, 1995 jako WO 95/34659). Plazmid ten strawiono Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony

44 z całkowitego cdna Protox-l plus terminator transkrypcji z nie ulegającej translacji 3' sekwencji genu tmi Agrobacterium tumefaciens. Plazmid AraPTIPro opisany powyżej został strawiony Ncol i BamHI aby wyprodukować fragment złożony z pbluescript i 580 bp przypuszczalnego promotora Protox-1 Arabidopsis. Ligacja tych dwóch fragmentów wytworzyła fuzję zmienionego cdna protox do naturalnego promotora protox. Kaseta ekspresyjna zawierająca fuzję promotor Protox-1/cDNA Protox-1/ terminator tml została wycięta za pomocą trawienia KpnI i sklonowana w wektorze dwuskładnikowym pcib200. Plazmidem dwuskładnikowym transformowano przez elektroporację do Agrobacterium i następnie do Arabidopsis stosując technikę nasączania w próżni (Bechtold i wsp., C.R. Acad. Sci. Paris 316: (1993). Transformanty wyrażające zmienione geny protox wybierano na kanamycynie lub na różnych stężeniach herbicydu hamującego protox. Przykład 26. Produkcja roślin tolerancyjnych w stosunku do herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor protox-1/zmieniony protox-1. Stosując procedurę opisaną powyżej, cdna Protox-l Arabidopsis zawierający zmianę TAC na ATG (tyrozyna na metioninę) w nukleotydach w sekwencji Protox-1 (SEKW. ID NR:1) połączono z fragmentem naturalnego Protox-1 i wtransformowano do Arabidopsis thaliana. Wykazano, że ten zmieniony enzym Protox-1 (AraC-2Met) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na różne herbicydy hamujące protox niż naturalnie występujący enzym gdy jest testowany w uprzednio opisanym bakteryjnym systemie ekspresji. Nasiona z naczyń nasączonych pod próżnią zbierano i wysiewano na zakresie (10,0 nm-1.0 um) hamującego protox herbicydu arylouracylowego o wzorze XVII. Wielokrotne doświadczenia z dzikim Aradbidopsis wykazały, że 10,0 nm stężenie tego związku wystarcza by zapobiec normalnemu kiełkowaniu siewek. Transgeniczne nasiona wyrażające zmieniony enzym AraC- 2Met w formie fuzji z naturalnym promotorem Protox-l produkowały normalne siewki Arabidopsis przy stężeniach herbicydu do 500 nm, wykazując przynajmniej 50-krotnie większą oporność na herbicyd w porównaniu z dzikim Arabidopsis. Ta fuzja promotor/zmieniony enzym protox działa więc jako skuteczny seklekcyjny marker do transformacji roślin. Kilka z roślin, które wykiełkowały ma 100,0 nm herbicydzie hamującym protox transplantowano do gleby, hodowano 2-3 tygodnie i testowano w oznaczeniu sprajowym z różnymi stężeniami herbicydu hamującego protox. Gdy porównano z transformacją kontrolami złożonymi z samego wektora, transgeniki AraPTPro/AraC-2Met były 10 razy bardziej tolerancyjne na spray herbicydu. Przykład 27. Wykazanie tolerancji krzyżowej mutacji opornych na różne związki hamujące protox w oznaczeniu kiełkowania Arabidopsis. Stosując procedurę opisaną powyżej cdna protox-l Arabidopsis zawierający zarówno zmianę TAC na ATC (tyrozyna na izoleucynę) w nukleotydach i zmianę TCA na TTA (seryna na leucynę) w nukleotydach w sekwencji Protox-1 (SEKW. ID NR:1) został podłączony do naturalnego fragmentu promotora Protox-1 i wtransformowany do Arabidopsis thaliana. Stwierdzono, że ten zmieniony enzym Protox-1 (AraC-2Ile + AraC305Leu) jest >10 razy bardziej tolerancyjny na hamujący protox herbicyd arylouraculowy o wzorze XVII niż naturalny enzym badany w systemie bakteryjnym (p. Przykłady 8-12). Homozygotyczne linie Arabidopsis zawierające tę fuzję generowano z transformantów, które wykazywały wysoką tolerancję na herbicyd hamujący protox w oznaczeniu kiełkowania siewek jak opisano powyżej. Nasiona z jednej linii przetestowano na oporność krzyżową na różne związki hamujące protox przez powtórzenie testu kiełkowania na stężeniach związków, dla których pokazano, że hamują kiełkowanie w dzikim Arabidopsis. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono w Tabeli 4. Tabela 4 Tolerancja krzyżowa na różne inhibitory protox w teście kiełkowania nasion. wzór nazwa zwyczajowa tolerancja acifluorofen +

45 Ciąg dalszy tabeli III fomasafen + IV fluoroglykofen ± IVb bifenoks + IVc oksyfluorofen + IVd laktofen ± Vila flutiacet-metyl ++ X sulfentrazone + XI flupropazyl ++ XIV ftumiklorak + XVI flumioksazyn +++ XVII ++ XXIa BAY XXII ++ ± <10 x bardziej tolerancyjny niż dziki + >10 x bardziej tolerancyjny niż dziki ++ > 100 x bardziej tolerancyjny niż dziki +++ > 100 x bardziej tolerancyjny niż dziki Przykład 28. Izolacja sekwencji promotora Protox-1 kukurydzy Bibliotekę genomową DNA z Zea mays (Missouri 17, linia wsobna, etiolowane siewki) w lambda FIX II nabyto od Stratagene. Około pfu biblioteki wysiano w gęstości fagów na 15 cm szalkę Petriego i sprządzono duplikaty na membrany Colony/Plaque Screen (NEN Dupont). Odbicia płytek na filtrach sondowano cdna Protox-1 kukurydzy (SEKW. ID NR:5) wyznakowanej za pomocą 32-P dctp metodą losowych primerów (Life Technologies). Warunki hybrydyzacji i płukania były w 65 C jak opisali Church i Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: (1984). DNA fagów lambda izolowano z trzech dodatnio hybrydyzująch fagów stosując Wizard Lambda Preps Purification System (Promega). Analiza za pomocą trawienia restryjcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 3,5 kb genomowego DNA kukurydzy położonego 5' przed sekwencją kodującą Protox-1 kukurydzy uprzednio wyizolowaną jako klon cdna. Fragment ten także zawiera promotor Protox-l kukurydzy. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. ID NR: 14. Od nukleotydu 1 do 3532 sekwencja ta składa się z sekwencji 5 nie kodującej. Od nukleotydu 3533 do 3848 sekwencja ta koduje 5' koniec białka Protox-l kukurydzy. Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR: 14 w postaci fuzji z resztą sekwencji kodującej Protox-l kukurydzy zdeponowano 19 marca, 1996 jako pwdc-14 (NRRL # ). Przykład 29. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Protox-1 za naturalnym promotorem Protox-1 kukurydzy. Fragment genomowy kukurydzy o długości 3848 bp (SEKW. ID NR: 14) wycięto z wyizolowanego klonu bakteriofaga lambda jako częściowy produkt trawienia Sall-KpnI i zligowano z fagmentem KpnI-Notl pochodzącym ze zmienionego cdna Protox-1 kukurydzy, który zawierał zmianę alaniny na leucynę w aminokwasie 164 (SEKW. ID NR:6). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-l kukurydzy z cdna pełnej długości, który, jak wykazano,

46 nadawał tolerancję na herbicyd w układzie bakteryjnym (Przykłady 8-13). Fuzję tę wklonowano do wektora pochodzącego od puc18 zawierającego sekwencję terminatora CaMV 35S, aby stworzyć kasetę promotor protox/zmieniony cdna protox/terminator. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pwco-1. Drugi konstrukt do transformacji kukurydzy stworzono przez wprowadzenie pierwszego intronu obecnego w sekwencji kodującej genomowego klonu kukurydzy z powrotem do cdna kukurydzy. Insercję wprowadzono stosując standardowe techniki fuzji zachodzących na siebie fragmentów PGR. Intron (SEKW. ED NR:25) miał 93 bp długości i został wprowadzony między nukleotydami 203 i 204 SEKW. ID NR:6, dokładnie tak jak występuje w naturalnym klonie lambda opisanym w przykładzie 26. Ta zawierająca intron wersja kasety ekspresyjnej została nazwana pwco-2. Przykład 30. Wykazanie aktywności promotora Protox-1 kukurydzy w roślinach transgenicznych. Rośliny kukurydzy transformowane fuzjami promotor protox kukurydzy/zmieniony protox identyfikowano stosując analizę za pomocą PCR z primerami specyficznymi dla transgenu. Całkowity RNA izolowano z roślin dodatnich w teście PCR i przeprowadzano odwrotną transkrypcję stosując Superscript M-MLV (Life Technologies) w zalecanych warunkach. Dwa mikrolitry odwrotnej transkryptazy stosowano w reakcji PCR zaplanowanej aby była specyficzna w stosunku do zmienionej sekwencji protox. Podczas gdy nietransformowane kontrole nie dawały produktu w tej reakcji, około 85% roślin transformowanych pwco-1 dawało dodatni wynik, wskazując na obecność mrna pochodzącego z transgenu. Wykazuje to pewien poziom aktywności promotora protox kukurydzy. RNA z transgenicznych roślin kukurydzy także poddawano standardowej analizie typu Northern stosując radioaktywnie wyznakowany fragment cdna protox kukurydzy z SEKW. ID NR:6 jako sondę. Poziomy mrna Protox-l znacząco wyższe od nietransformowanych kontroli wykryto w niektórych roślinach transgenicznych. Przypuszcza się, że ten podwyższony poziom mrna może być wynikiem ekspresji zmienionego protox-1 mrna ze sklonowanego promotora kukurydzy. Przykład 31. Izolacja sekwencji promotora Protox-1 buraka cukrowego Biblioteką genomową buraka cukrowego przygotował Stratagene w wektorze Lambda FIX II. Około pfu biblioteki wysiano i sondowano cdna Protox-1 buraka cukrowego (SEKW. ID NR: 17) jak opisano dla kukurydzy w Przykładzie 28. Analiza za pomocą trawienia restrykcyjnego, wzorów hybrydyzacji i analizy sekwencji DNA pozwoliły na identyfikację klonu lambda zawierającego około 7 kb genomowego DNA buraka cukrowego położonego 5' przed sekwencją kodującą Protox-1 buraka cukrowego uprzednio wyizolowaną jako klon cdna. Fragment Pstl-Sall o wielkości 2606 kb subklonowano z klonu lambda do wektora pblu-escript. Fragment ten zawiera 2068 bp sekwencji nie kodującej 5' i zawiera sekwencję promotora protox-l buraka cukrowego. Zawiera też pierwsze 453 bp sekwencji kodującej protox-l i pierwszy intron 85 bp zawarty w sekwencji kodującej. Sekwencja tego fragmentu jest przedstawiona w SEKW. ID NR:26. Plazmid zawierający sekwencję SEKW. ID NR:26 zdeponowano 6 grudnia 1996 jako pwdc-20 (NRRL # ). Przykład 32. Konstrukcja wektorów do transformacji roślin wyrażających zmienione geny Protox-1 buraka cukrowego za naturalnym promotorem Protox-1 buraka cukrowego. Fragment genomowy buraka cukrowego (SEKW. ID NR:26) wycięto z genomowego subklonu opisanego w Przykładzie 31 jako fragment SacI-BsrGl, który zawiera 2068 bp sekwencji 5' nie kodującej i pierwsze 300 bp sekwencji kodującej Protox-1 buraka cukrowego. Fragment ten zligowano z fagmentem BsrGI-Notl pochodzącym ze zmienionego cdna Protox-l buraka cukrowego, który zawierał zmianę tyrozyny na metioninę w aminokwasie 449 (SEKW. ID NR: 18). Dało to fuzję naturalnego promotora Protox-l buraka cukrowego z cdna pełnej długości, który, jak wykazano, nadawał tolerancję herbicydu w układzie bakteryjnym (Przykłady 8-13). Fuzję tę wklonowano do wektora pochodzącego od puc18 zawierającego sekwencję terminatora CaMV 35S aby stworzyć kasetę promotor protox/zmieniony cdna protox/terminator. Plazmid zawierający tę kasetę określono jako pwco-3.

47 Przykład 33. Produkcja roślin tolerancyjnych dla herbicydu przez ekspresję fuzji naturalny promotor Protox-1 buraka cukrowego/zmieniony protox-1 buraka cukrowego Kasetę ekspresyjną z pwco-3 wtrans.formowano do buraka cukrowego stosując dowolną z metod transformacji używanych do roślin dwuliściennych, w tym techniki z Agrobacterium, protoplastami i biolistyczne. Transgeniczne rośliny wyrażające zmieniony enzym protox identyfikowano stosując analizę za pomocą RNA-PCR i badano u nich tolerancję dla herbicydów hamujących protox w stężeniach zabójczych dla nietransformowanych buraków cukrowych. Część D : Ekspresja genów protox w piasty dach roślin Przykład 34. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu piastydowego cipp i naturalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji cipp w formie fuzji z genem reporterowym GUS i 3' nieulegające translacji sekwencje genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji piastydu. I. Amplifikacja produktu promotora genu plastydu tytoniu cipp i całej 5' nie ulegającej translacji (5'UTR) części RNA Całkowity DNA z N. tabacum c.v. Xanthi NC stosowano jako matrycę dla PGR z primerem nici górnej od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne EcoRI w pozycji -197 w stosunku do kodonu start ATG konstytutywnie wyrażanego genu plastydowego cipp (primer Pclp_Pla: 5"-gcggaattcatatacttatttatcattagaaag-3' (SEKW. ID NR:27); miejsce restrykcyjne EcoRI podkreślone), i primer nici dolnej prawa do lewej homologiczny do regionu -21 do -1 względem kodonu start ATG promotora cipp, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne na starcie translacji (primer PcIp_P2b: 5 -gcgccatggtaaatgaaagaaagaactaaa-3" (SEKW. ID NR:28); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone). Tą reakcję PCR przeprowadzono za pomocą termostabilnej polimerazy DNA Pfu (Stratagene, La Jolla CA) w Perkin Elmer Thermal Cycler 480 zgodnie z zaleceniami producenta (Perkin Elmer/Roche, Branchburg, NJ) w sposób następujący: 7 min 95 C, a następnie 4 cykle 1 min 95 C/2 min 43 C/1 min 72 C, potem 25 cykli 1 min 95 C/2 min 55 C/1 min 72 C. Produkt amplifikacji 213 bp zawierający promotor i obszar 5' nie ulegający translacji genu cipp zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Ncol na ich prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów do sekwencji plastydowego DNA N.tabacum (Shinozaki iwsp., EMBO J. 5: (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono EcoRI i Ncol (wszystkie enzymy restrykcyjne nabyto od New England Biolabs, Beverly, MA). II. Amplifikacja 3' nie ulegającej translacji sekwencji RNA (3'UTR) genu rps 16 z plastydu tytoniu Całkowity DNA z N. tabacum c.v. Xanthi NC stosowano jako matrycę dla PCR z jak opisano powyżej z primerem nici górnej od lewej do prawej zawierającym wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal zaraz za kodonem stop TAA genu plastydowego rps 16 kodującego białko rybosomalne S16 (primer rps 16P la (5 -GCGTCTAGATCAACCGAAATTCAATTAAGG-3' (SEKW. ID NR:30); miejsce restrykcyjne Xbal podkreślone), i primer nici dolnej prawa do lewej homologiczny do regionu +134 do +151 względem kodonu stop TAA rps 16, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne HindIII na 3' końcu UTR rps 16 (primer rps 16P1 -b (5'-CGCAAGCTTCAATGGAAGCAATGATAA-3' (SEKW. ID NR:31); miejsce restrykcyjne HindIII podkreślone). Produkt amplifikacji 169 bp zawierający obszar 3' nie ulegający translacji genu rps 16 zawierający miejsce Xbal na lewym końcu i miejsce HindIII na prawym końcu i odpowiadający sekwencji nukleotydów 4943 do 5093 sekwencji DNA plastydu N. tabacum (Shinozaki i wsp., (1986)) oczyszczano na żelu stosując standardowe procedury i strawiono Xbal i HindIII. III. Ligacja fragmentu genu reporterowego GUS do promotora genu cipp i 5' i 3' UTR Za pomocą trawienia Ncol i Xbal uzyskano fragment 1864 bp genu reporterowego P* galakturonidazy (GUS) pochodzący z praj275 (Clontech) zawierający miejsce restrykcyjne Ncol wkodonie start ATG i miejsce Xbal za naturalnym 3' UTR. Ten fragment ligowano

48 w czteroskładnikowej reakcji z fragmentem 201 bp EcoRI/Ncol promotora cipp, fragmentem 157 bp XbaI/HindIII rps 16 3'UTR i fragmentem 3148 bp EcoRI/HindIII z wektora do klonowania pgem3zf(-) (Promega, Madison, WI), aby skonstruować plazmid pph138. Wektor do transformacji plastydów pph140 skonstruowano przez strawienie plazmidu pprv111a (Zoubenko i wsp., 1994) EcoRI i HindIII i ligację powstałego fragmentu 7287 bp z fragmentem 2222 bp EcoRI/HindIII pph138. Przykład 35. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu piasty do wego tytoniu cipp plus minimalną sekwencję 5' nie ulegającą translacji genu psba z plastydu tytoniu w formie fuzji z genem reporterowym GUS i 3' nie ulegają translacji sekwencją genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji plastydu. Amplifikacja produktu promotora genu plastydu tytoniu clpp i całkowitej 5' sekwencji nie ulegającej translacji (5'UTR). Całkowity DNA zn.tabacum c.v. Xanthi NC stosowano jako matrycę dla PCR z primerem nici górnej od lewej do prawej PcIp Pla (SEKW. ID NR:27) i primerem nici dolnej prawa do lewej homologicznym do regionu -34 do -11 względem kodonu start ATC promotora clpp, który zawiera wprowadzone miejsce restrykcyjne Xbal w 5' UTR clpp w pozycji -11 (primer PcIp_Plb: 5'-gcgtctagaaagaactaaatactactatatttcac-3' (SEKW. ID nr:29); miejsce restrykcyjne Xnal podkreślone). Produkt amplifikacji 202 bp zawierający promotor i ucięty 5' UTR genu clpp zawierający miejsce EcoRI na lewym końcu i miejsce Xbal na prawym końcu oczyszczano na żelu i strawiono Xbal. Miejsce Xbal następnie wypełniono polimerazą DNA Klenowa (New Engleand Biolabs) i stawiono fragment EcoRI. Następnie fragment ten wligowano w reakcji 5-składnikowej do dwuniciowego fragmentu DNA odpowiadającego ostatnim 38 nukleotydom i kodonowi strat ATG 5' UTR genu plastydowego psba tytoniu (z jednoniciowym miejscem restrykcyjnym Ncol ( overhang ) wprowadzonym do kodonu start ATG), który został stworzony przez hybrydyzację syntetycznego oligonukleotydu minpsb_u (górna nić: 5 -gggagtccctgatgattaaataaaccaagattttac-3' (SEKW. ID NR:32)) oraz minpsb L (dolna nić: 5 -catggtaaaatcttggtttatttaatcatcagggactccc-3' (SEKW. ID NR:33); podkreślone jednoniciowe miejsce 5' Ncol), fragmentu genu reporterowego GUS Nco- I/Xbal opisanego powyżej, fragmentu XbaI/HindIII rps 10 3'UTR opisanego powyżej i fragmentu EcoRI/Hindlll pgemzf(-) opisanego powyżej aby skonstruować plazmid pph139. Wektor do transformacji plastydów pph144 skonstruowano przez trawienie plazmidu pr V llla (Zoubenko i wsp., Nuci Acids Res. 22: (1994) EcoRI i HindIII i ligację powstałego fragmentu 7827 bp do fragmentu 2251 EcoRI/HindIII pph139. Przykład 36. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego tytoniu i całkowitą nie ulegającą translacji sekwencję 5' w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu plastydowego rps 16 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu. Minipreparat DNA z plazmidu AraC-2Met zawierającego wstawkę Notl, która zawiera sekwencję cdna z genu oksydazy protoporfirogenu IX ( PROTOX ) kodującej fragment N- końcowego plastydowego peptydu sygnałowego, cdna pełnej długości i część nie ulegającej translacji obszaru 3' zastosowano jako matrycę do PCR jak opisano powyżej stosując primer nici górnej od lewej do prawej (z homologią do nukleotydów +172 do +194 wzglądem kodonu start ATG białka prekursora o pełnej długości) zawierający wprowadzone miejsce restrykcyjne Ncol i nowy kodon start ATG na wydedukowanym miejscu startu dojrzałego białka PROTOX (primer APRTXP1 a: 5'-GGGACCATGGATTGTGTGATTGTCGGCGGAGG-3' (SEKW. ID NR:34); miejsce restrykcyjne Ncol podkreślone), i primer nici dolnej prawa do lewej homologiczny do regionu +917 do +940 wzglądem naturalnego kodonu start ATG białka prekursorowego PROTOX (primer APRTXP1b: 5'-CTCCGCTCTCCAGCTTAGTGATAC-3' (SEKW. ID NR:35)). Produkt amplifikacji 778 bp trawiono Ncol i SfuI i powstały fragment 682 bp ligowano do fragmentu 844 bp Sfu- I/Notl z AraC-2Met zawierającym 3' część sekwencji kodującej PROTOX i fragment 2978 bp Ncol/Notl wektora do klonowania pgemzf(+) (Promega, Madison, WI), aby skonstruować

49 plazmid pph141. Wektor do transformacji plastydów pph143 zawierający promotor cipp sterujący genem oporności na 276'854 SVl-Met PROTOX z 3' UTR rps 16 skonstruowano przez trawienie pph141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego pełną sekwencję kodującą PROTOX, trawienie produktów PGR rps 1 6 la i rps 16P 1b opisanych powyżej HindIII i ligację z fragmentem 7436 bp Ncol/HindIII pph140. Przykład 37. Przygotowanie hybrydowego genu zawierającego promotor genu plastydowego cipp tytoniu plus minimalną nie ulegającą translacji 5' sekwencję genu psba w formie fuzji z sekwencją kodującą Protox-1 Arabidopsis thaliana i 3' nie ulegającą translacji sekwencją genu piasty do wego rps 16 w wektorze do transformacji plastydów tytoniu Wektor do transformacji plastydów pph145 zawierający fuzję promotor cipp/5'utr psba sterujący genem oporności na 276'854 PROTOX SVl-Met z 3'UTR rps 16 skonstruowano przez strawienie pph141 Ncol i Sspl i izolację fragmentu 1491 bp zawierającego kompletną sekwencję kodującą PROTOX, strawienie produktów PCR rpsl6p_la i rps 16P 1b opisanych powyżej HindIII i ligację ich do fragmentu EcoRI/HindIII 7465 bp pph144. Przykład 38: Biolistyczna transformacja genomu plastydowego tytoniu Nasiona Nicotiana tabacum c.v. Xanthi nc kiełkowano siedem na płytkę w 1 calowym kolistym ustawieniu na pożywce T z agarem i bombardowano dni po zasianiu 1 mm wolframowymi cząsteczkami (M10, Biorad, Hercules, CA) powleczonymi DNA z plazmidów pph143 i pph145 zasadniczo jak opisano (Svab, zim aliga, P. ('1993) PNAS ). Bombardowane siewki inkubowano na pożywce T przez dwa dni, po czym liście odcinano i umieszczaną stroną odosiową w górę w jasnym świetle ( mmol fotonów/m2/sek) na płytkach z pożywką RMOP (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. i Maliga, P. (1990) PNAS 87: ) zawierającym 500 mg/ml chlorowodorku spektynomycyny (Sigma, St. Louis, Mo.). Oporne pędy pojawiające się poniżej wyblakłych liści trzy do ośmiu tygodni po bombardowaniu subklonowano na tę samą pożywkę selekcyjną, pozwalano im wytworzyć kalus, i izolowano i subklonowano pędy drugorzędowe. Całkowitą segregację kopii stransformowanych genomow plastydowych (homoplazmatyczność) w niezależnych subklonach oceniano standardowymi technikami Southerna (Sambrook i wsp., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor). Trawiony BamHI/EcoRI całkowity DNA komórkowy (Mettler I. K. (1987) Plant Mol Biol Reporter 5: ) oddzielano na 1% żelach agarozowych w 1% Tris-boranie (TBE), przenoszono na nylonowe membrany (Amersham) i sondowano znakowaną metodą losowych primerów 32P sekwencją DNA odpowiadającą fragmentowi 0.7 kb BamHI/HindIII z pc8 zawierającym część sekwencji kierującej do plastydu rps7/12. Homoplazmatyczne siewki ukorzeniano aseptycznie na pożywce MS/IBA zawierającej spektynomycynę (McBride K.E. i wsp. (1994) PNAS 91, ) i przenoszono do szklarni. Różne modyfikacje stosowanych tu metod będą ewidentne dla osoby specjalisty. Takie modyfikacje leżą w zakresie załączonych zastrzeżeń. Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE: (i) ZGŁASZAJĄCY: Sandra Volrath Marie Johnson Sharon Potter Eric Ward Peter Heifetz (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Cząsteczki DNA kodujące roślinną oksydazę protoporfirynogenu i jej oporne na inhibitory mutanty (iii) LICZBA SEKWENCJI: 35 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY: (A) ADRESAT: Novartis Corporation (B) ULICA: 520 White Plains Road, P.O. Box 2005 (C) MIASTO: Tarrytown (D) STAN: NY (E) PAŃSTWO: USA

50 (F) KOD POCZTOWY (ZIP): (V) SPOSÓB ZAPISU KOMPUTEROWEGO: (A) ŚRODOWISKO: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (vi) OBOWIĄZUJĄCE DANE ZGŁOSZENIA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: (B) DATA ZGŁOSZENIA: (C) KLASYFIKACJA: (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/012,705 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LUT-1996 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/013,612 (B) DATA ZGŁOSZEŃ 1A: 28-LUT-1996 (vii) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA: (A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 60/020,003 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-LIP-1996 (viii) INFORMACJE DOT. AGENTA/PEŁNOMOCNIKA: (A) NAZWISKO: Timothy J. Meigs (B) NR REJ.: 38,241 (C) REFERENCJE/NUMER: CGC 1847 (ix) INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE: (A) TELEFON: (919) (B) TELEFAX: (919) (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 1: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1719 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-2 (NRRL B-21238) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= Protox-1 arabidopsis (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR:1:

51 ACG ACT CAA TCG CTT CTT CCG TCG TTT TCG AAG CCC AAT CTC CGA TTA Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu AAT GTT TAT AAG CCT CTT AGA CTC CGT TGT TCA GTG GCC GGT GGA CCA Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro ACC GTC Thr Val ACG GAT Thr Asp CAG GCG Gln Ala GGA TCT TCA AAA ATC GAA GGC GGA GGA GGC ACC ACC ATC ACG Gly Ser Ser Lys lie Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr lie Thr TGT GTG ATT GTC GGC GGA GGT ATT AGT GGT CTT TGC ATC GCT Cys Val Ile Val Gly Gly Gly lie Ser Gly Leu Cys lie Ala CTT GCT ACT AAG CAT CCT GAT GCT GCT CCG AAT TTA ATT GTG Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu lie Val ACC GAG GCT AAG GAT CGT GTT GGA GGC AAC ATT ATC ACT CGT GAA GAG Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile lie Thr Arg Glu Glu AAT GGT TTT CTC TGG GAA GAA GGT CCC AAT AGT TTT CAA CCG TCT GAT Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp CCT ATG Pro Met TTG GGA Leu Gly AGG CCG Arg Pro CTC ACT ATG GTG GTA GAT AGT GGT TTG AAG GAT GAT TTG GTG Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val GAT CCT ACT GCG CCA AGG TTT GTG TTG TGG AAT GGG AAA TTG Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu GTT CCA TCG AAG CTA ACA GAC TTA CCG TTC TTT GAT TTG ATG Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met AGT ATT GGT GGG AAG ATT AGA GCT GGT TTT GGT GCA CTT GGC ATT CGA Ser Ile Gly Gly Lys lie Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly lie Arg CCG TCA CCT CCA GGT CGT GAA GAA TCT GTG GAG GAG TTT GTA CGG CGT Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg AAC CTC Asn Leu GGT GTT Gly Val GGT GAT GAG GTT TTT GAG CGC CTG ATT GAA CCG TTT TGT TCA Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu lie Glu Pro Phe Cys Ser TAT GCT GGT GAT CCT TCA AAA CTG AGC ATG AAA GCA GCG TTT Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe

52 GGG AAG Gly Lys GTT TGG AAA CTA GAG CAA AAT GGT GGA AGC ATA ATA GGT GGT Val Trp Lys Leu Glu Gln Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly ACT TTT AAG GCA ATT CAG GAG AGG AAA AAC GCT CCC AAG GCA GAA CGA Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg GAC CCG CGC CTG CCA AAA CCA CAG GGC CAA ACA GTT GGT TCT TTC AGG Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg AAG GGA Lys Gly AAA GTT Lys Val GGA GGA Gly Gly CTT CGA ATG TTG CCA GAA GCA ATA TCT GCA AGA TTA GGT AGC Leu Arg Met Leu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser AAG TTG TCT TGG AAG CTC TCA GGT ATC ACT AAG CTG GAG AGC Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Gly Ile Thr Lys Leu Glu Ser TAC AAC TTA ACA TAT GAG ACT CCA GAT GGT TTA GTT TCC GTG Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val CAG AGC AAA AGT GTT GTA ATG ACG GTG CCA TCT CAT GTT GCA AGT GGT Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly CTC TTG CGC CCT CTT TCT GAA TCT GCT GCA AAT GCA CTC TCA AAA CTA Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu TAT TAC Tyr Tyr ATC CGA Ile Arg TTG CAT Leu His CCA CCA GTT GCA GCA GTA TCT ATC TCG TAC CCG AAA GAA GCA Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala ACA GAA TGT TTG ATA GAT GGT GAA CTA AAG GGT TTT GGG CAA Thr Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln CCA CGC ACG CAA GGA GTT GAA ACA TTA GGA ACT ATC TAC AGC Pro Arg Thr Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGC GCA CCG CCC GGA AGA ATT TTG CTG TTG Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu AAC TAC ATT GGC GGG TCT ACA AAC ACC GGA ATT CTG TCC AAG TCT GAA Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu GGT GAG Gly Glu TTA GTG GAA GCA GTT GAC AGA GAT TTG AGG AAA ATG CTA ATT Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile

53 AAG CCT AAT TCG ACC GAT CCA CTT AAA TTA GGA GTT AGG GTA TGG CCT Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro CAA GCC ATT CCT CAG TTT CTA GTT GGT CAC TTT GAT ATC CTT GAC ACG Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr GCT AAA TCA TCT CTA ACG TCT TCG GGC TAC GAA GGG CTA TTT TTG GGT Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly GGC AAT TAC GTC GCT GGT GTA GCC TTA GGC CGG TGT GTA GAA GGC GCA Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala TAT GAA ACC GCG ATT GAG GTC AAC AAC TTC ATG TCA CGG TAC GCT TAC Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr AAG TAAATGTAAA ACATTAAATC TCCCAGCTTG CGTGAGTTTT ATTAAATATT Lys TTGAGATATC CAAAAAAAAA AAAAAAAA (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 2: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 537 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 1: Met Glu Leu Ser Leu Leu Arg Pro Thr Thr Gln Ser Leu Leu Pro Ser Phe Ser Lys Pro Asn Leu Arg Leu Asn Val Tyr Lys Pro Leu Arg Leu Arg Cys Ser Val Ala Gly Gly Pro Thr Val Gly Ser Ser Lys Ile Glu Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ile Thr Thr Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Pro Asn Leu Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Asn Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly

54 Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys lie Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly lie Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu lie Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln Asn Gly Gly Ser Ile lie Gly Gly Thr Phe Lys Ala lie Gln Glu Arg Lys Asn Ala Pro Lys Ala Glu Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Gln Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Arg Met Leu Pro Glu Ala lie Ser Ala Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Gly lie Thr Lys Leu Glu Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Gly Leu Leu Arg Pro Leu Ser Glu Ser Ala Ala Asn Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser lie Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lie Arg Thr Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala

55 Pro Pro Gly Arg Ile Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Asn Ser Thr Asp Pro Leu Lys Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Phe Asp Ile Leu Asp Thr Ala Lys Ser Ser Leu Thr Ser Ser Gly Tyr Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Ile Glu Val Asn Asn Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 3: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1738 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-2 (NRRL B-21237) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= Protox-1 arabidopsis

56 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 3: TTTTTTACTT ATTTCCGTCA CTGCTTTCGA CTGGTCAGAG ATTTTGACTC TGAATTGTTG CAGATAGCA ATG GCG TCT GGA GCA GTA GCA GAT CAT CAA ATT GAA GCG Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala GTT TCA GGA AAA AGA GTC GCA GTC GTA GGT GCA GGT GTA AGT GGA CTT Val Ser Gly Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu GCG GCG GCT TAC AAG TTG AAA TCG AGG GGT TTG AAT GTG ACT GTG TTT Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe GAA GCT Glu Ala GGT TTG Gly Leu GAA GTT Glu Val GAT GGA AGA GTA GGT GGG AAG TTG AGA AGT GTT ATG CAA AAT Asp Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gln Asn ATT TGG GAT GAA GGA GCA AAC ACC ATG ACT GAG GCT GAG CCA Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro GGG AGT TTA CTT GAT GAT CTT GGG CTT CGT GAG AAA CAA CAA Gly Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln TTT CCA ATT TCA CAG AAA AAG CGG TAT ATT GTG CGG AAT GGT GTA CCT Phe Pro Ile Ser Gln Lys Lys Arg Tyr Ile Val Arg Asn Gly Val Pro GTG ATG CTA CCT ACC AAT CCC ATA GAG CTG GTC ACA AGT AGT GTG CTC Val Met Leu Pro Thr Asn Pro Ile Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu TCT ACC Ser Thr AAA AAG Lys Lys GAG TTC Glu Phe CAA TCT AAG TTT CAA ATC TTG TTG GAA CCA TTT TTA TGG AAG Gln Ser Lys Phe Gln Ile Leu Leu Glu Pro Phe Leu Trp Lys TCC TCA AAA GTC TCA GAT GCA TCT GCT GAA GAA AGT GTA AGC Ser Ser Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala Glu Glu Ser Val Ser TTT CAA CGC CAT TTT GGA CAA GAG GTT GTT GAC TAT CTC ATC Phe Gln Arg His Phe Gly Gln Glu Val Val Asp Tyr Leu Ile GAC CCT TTT GTT GGT GGA ACA AGT GCT GCG GAC CCT GAT TCC CTT TCA Asp Pro Phe Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser ATG AAG CAT TCT TTC CCA GAT CTC TGG AAT GTA GAG AAA AGT TTT GGC 684 Met Lys His Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly

57 TCT ATT Ser lie ATA GTC GGT GCA ATC AGA ACA AAG TTT GCT GCT AAA GGT GGT lie Val Gly Ala lie Arg Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly AAA AGT Lys Ser GGG TCA Gly Ser TGC AAA Cys Lys 255 AGA GAC Arg Asp 225 TTC TCT Phe Ser 240 AGT CTC Ser Leu ACA AAG Thr Lys TTT AAG Phe Lys TCA CAT Ser His AGT TCT Ser Ser GGG GGA Gly Gly 245 GAT GAG Asp Glu 260 CCT GGC Pro Gly 230 ATG CAG Met Gln ATC AAT lie Asn ACA AAA Thr Lys ATT CTT lie Leu TTA GAC Leu Asp 265 AAG GGT Lys Gly 235 CCT GAT Pro Asp 250 TCC AAG Ser Lys TCG CGT Ser Arg ACG TTG Thr Leu GTA CTC Val Leu TCT TTG TCT TAC AAT TCT GGA TCA AGA CAG GAG AAC TGG TCA TTA TCT Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Ser Arg Gln Glu Asn Trp Ser Leu Ser TGT GTT Cys Val GTA ATT Val lie AAA GGA Lys Gly TCG CAT AAT GAA ACG CAG AGA CAA AAC CCC CAT TAT GAT GCT Ser His Asn Glu Thr Gln Arg Gln Asn Pro His Tyr Asp Ala ATG ACG GCT CCT CTG TGC AAT GTG AAG GAG ATG AAG GTT ATG Met Thr Ala Pro Leu Cys Asn Val Lys Glu Met Lys Val Met GGA CAA CCC TTT CAG CTA AAC TTT CTC CCC GAG ATT AAT TAC Gly Gln Pro Phe Gln Leu Asn Phe Leu Pro Glu lie Asn Tyr ATG CCC CTC TCG GTT TTA ATC ACC ACA TTC ACA AAG GAG A AA GTA AAG Met Pro Leu Ser Val Leu lie Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys AGA CCT CTT GAA GGC TTT GGG GTA CTC ATT CCA TCT AAG GAG CAA AAG Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu lie Pro Ser Lys Glu Gln Lys CAT GGT His Gly GAT CGT Asp Arg AGT AGG Ser Arg TTC AAA ACT CTA GGT ACA CTT TTT TCA TCA ATG ATG TTT CCA Phe Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro TCC CCT AGT GAC GTT CAT CTA TAT ACA ACT TTT ATT GGT GGG Ser Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe lie Gly Gly AAC CAG GAA CTA GCC AAA GCT TCC ACT GAC GAA TTA AAA CAA Asn Gln Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gln GTT GTG ACT TCT GAC CTT CAG CGA CTG TTG GGG GTT GAA GGT GAA CCC 1356 Val Val Thr Ser Asp Leu Gln Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro

58 GTG TCT GTC AAC CAT TAC TAT TGG AGG AAA GCA TTC CCG TTG TAT GAC 1404 Val Ser Val Asn His Tyr Tyr Trp Arg Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp AGC AGC TAT GAC TCA GTC ATG GAA GCA ATT GAC AAG ATG GAG AAT GAT 1452 Ser Ser Tyr Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp CTA CCT GGG TTC TTC TAT GCA GGT AAT CAT CGA GGG GGG CTC TCT GTT 1500 Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val GGG AAA TCA ATA GCA TCA GGT TGC AAA GCA GCT GAC CTT GTG ATC TCA Giy Lys Ser Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser TAC CTG GAG TCT TGC TCA AAT GAC AAG AAA CCA AAT GAC AGC TTA TAACATTGTC 1603 Tyr Leu Glu Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu AAGGTTCGTC CCTTTTTATC ACTTACTTTG TAAACTTGTA AAATGCAACA AGCCGCCGTG 1663 CGATTAGCCA ACAACTCAGC AAAACCCAGA TTCTCATAAG GCTCACTAAT TCCAGAATAA 1723 ACTATTTATG TAAAA 1738 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 4: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 508 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 4: Met Ala Ser Gly Ala Val Ala Asp His Gln Ile Glu Ala Val Ser Gly Lys Arg Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Lys Leu Lys Ser Arg Gly Leu Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Asp Gly Arg Val Gly Gly Lys Leu Arg Ser Val Met Gln Asn Gly Leu Ile Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val Gly Ser Leu Leu Asp Asp Leu Gly Leu Arg Glu Lys Gln Gln Phe Pro Ile

59 Ser Gln Lys Lys Arg Tyr lie Val Arg Asn Gly Val Pro Val Met Leu Pro Thr Asn Pro lie Glu Leu Val Thr Ser Ser Val Leu Ser Thr Gln Ser Lys Phe Gln lie Leu Leu Glu Pro Phe Leu Trp Lys Lys Lys Ser Ser Lys Val Ser Asp Ala Ser Ala Glu Glu Ser Val Ser Glu Phe Phe Gln Arg His Phe Gly Gln Glu Val Val Asp Tyr Leu lie Asp Pro Phe Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Asp Pro Asp Ser Leu Ser Met Lys His Ser Phe Pro Asp Leu Trp Asn Val Glu Lys Ser Phe Gly Ser Ile lie Val Gly Ala lie Arg Thr Lys Phe Ala Ala Lys Gly Gly Lys Ser Arg Asp Thr Lys Ser Ser Pro Gly Thr Lys Lys Gly Ser Arg Gly Ser Phe Ser Phe Lys Gly Gly Met Gln lie Leu Pro Asp Thr Leu Cys Lys Ser Leu Ser His Asp Glu lie Asn Leu Asp Ser Lys Val Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Ser Gly Ser Arg Gln Glu Asn Trp Ser Leu Ser Cys Val Ser His Asn Glu Thr Gln Arg Gln Asn Pro His Tyr Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Cys Asn Val Lys Glu Met Lys Val Met Lys Gly Gly Gln Pro Phe Gln Leu Asn Phe Leu Pro Glu lie Asn Tyr Met Pro Leu Ser Val Leu lie Thr Thr Phe Thr Lys Glu Lys Val Lys Arg Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu lie Pro Ser Lys Glu Gln Lys His Gly Phe Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ser Pro Ser Asp Val His Leu Tyr Thr Thr Phe lie Gly Gly Ser Arg Asn

60 Gln Glu Leu Ala Lys Ala Ser Thr Asp Glu Leu Lys Gln Val Val Thr Ser Asp Leu Gln Arg Leu Leu Gly Val Glu Gly Glu Pro Val Ser Val Asn His Tyr Tyr Trp Arg Lys Ala Phe Pro Leu Tyr Asp Ser Ser Tyr Asp Ser Val Met Glu Ala Ile Asp Lys Met Glu Asn Asp Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn His Arg Gly Gly Leu Ser Val Gly Lys Ser Ile Ala Ser Gly Cys Lys Ala Ala Asp Leu Val Ile Ser Tyr Leu Glu Ser Cys Ser Asn Asp Lys Lys Pro Asn Asp Ser Leu (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 5: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1691 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-4 (NRRL B-21260) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= Protox-1 maize cdna (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 5: GCG GAC TGC GTC GTG GTG GGC GGA GGC ATC AGT GGC CTC TGC ACC GCG 48 Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala CAG GCG CTG GCC ACG CGG CAC GGC GTC GGG GAC GTG CTT GTC ACG GAG 96 Gln Ala Leu Ala Thr Arg His Gly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu

61 GCC CGC Ala Arg GAA GGG Glu Gly 50 CCC GTT Pro Val 65 TTT GGG Phe Gly AGG CCC Arg Pro AGC ATC Ser lie CCG CCT Pro Pro 130 AAC CTC Asn Leu 145 GGT GTC Gly Val GGG AAG Gly Lys ACC ATC Thr lie GAT GCC Asp Ala 210 AAG GGT Lys Gly 225 AAA GTC Lys Val GCC CGC Ala Arg 35 TAC CTC Tyr Leu CTC ACC Leu Thr GAC CCA Asp Pro GTG CCA Val Pro 100 CCA GGG Pro Gly 115 CCT CCA Pro Pro GGT GCT Gly Ala TAT GCT Tyr Ala GTT TGG Val Trp 180 AAG ACA Lys Thr 195 CGC CTT Arg Leu CTT GCC Leu Ala AAA CTA Lys Leu CCC GGC Pro Gly TGG GAG Trp Glu ATG GCC Met Ala 70 AAC GCG Asn Ala 85 TCC AAG Ser Lys AAG CTC Lys Leu GGC CGC Gly Arg GAG GTC Glu Val 150 GGT GAT Gly Asp 165 CGG TTG Arg Leu ATT CAG lie Gln CCG AAG Pro Lys ATG CTT Met Leu 230 TCA TGG Ser Trp 245 GGC AAC Gly Asn 40 GAG GGT Glu Gly 55 GTG GAC Val Asp CCG CGT Pro Arg CCC GCC Pro Ala AGG GCC Arg Ala 120 GAA GAG Glu Glu 135 TTT GAG Phe Glu CCT TCT Pro Ser GAA GAA Glu Glu GAG AGG Glu Arg 200 CCA AAA Pro Lys 215 CCA AAT Pro Asn AAA CTC Lys Leu ATT ACC lie Thr CCC AAC Pro Asn AGC GGA Ser Gly TTC GTG Phe Val 90 GAC CTC Asp Leu 105 GGT CTA Gly Leu TCA GTG Ser Val CGC CTC Arg Leu AAG CTC Lys Leu 170 ACT GGA Thr Gly 185 AGC AAG Ser Lys GGG CAG Gly Gln GCC ATT Ala lie ACG AGC Thr Ser 250 ACC GTC Thr Val AGC TTC Ser Phe 60 CTG AAG Leu Lys 75 CTG TGG Leu Trp CCG TTC Pro Phe GGC GCG Gly Ala GAG GAG Glu Glu 140 ATT GAG lie Glu 155 AGC ATG Ser Met GGT AGT Gly Ser AAT CCA Asn Pro ACA GTT Thr Val 220 ACA TCC Thr Ser 235 ATT ACA lie Thr GAG CGC Glu Arg 45 CAG CCC Gln Pro GAT GAC Asp Asp GAG GGG Glu Gly TTC GAT Phe Asp 110 CTT GGC Leu Gly 125 TTC GTG Phe Val CCT TTC Pro Phe AAG GCT Lys Ala ATT ATT Ile lie 190 AAA CCA Lys Pro 205 GCA TCT Ala Ser AGC TTG Ser Leu AAA TCA Lys Ser CCC GAG Pro Glu TCC GAC Ser Asp TTG GTT Leu Val 80 AAG CTG Lys Leu 95 CTC ATG Leu Met ATC CGC Ile Arg CGC CGC Arg Arg TGC TCA Cys Ser 160 GCA TTT Ala Phe 175 GGT GGA Gly Gly CCG AGG Pro Arg TTC AGG Phe Arg GGT AGT Gly Ser 240 GAT GAC Asp Asp

62 AAG GGA TAT GTT TTG GAG TAT GAA ACG CCA GAA GGG GTT GTT TCG GTG Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACT ATT CCA TCA TAT GTT GCT AGC AAC Gin Ala Lys Ser Val lie Met Thr lie Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asn ATT TTG CGT CCA CTT TCA AGC GAT GCT GCA GAT GCT CTA TCA AGA TTC lie Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Arg Phe TAT TAT CCA CCG GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCG TAT CCA AAG GAA GCA Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala ATT AGA AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAA CTC CAG GGC ITT GGC CAG lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin TTG CAT CCA CGT AGT CAA GGA GTT GAG ACA TTA GGA ACA ATA TAC AGT Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser TCC TCA CTC TTT CCA AAT CGT GCT CCT GAC GGT AGG GTG TTA CTT CTA Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Asp Gly Arg Val Leu Leu Leu AAC TAC ATA GGA GGT GCT ACA AAC ACA GGA ATT GTT TCC AAG ACT GAA Asn Tyr lie Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lie Val Ser Lys Thr Glu AGT GAG CTG GTC GAA GCA GTT GAC CGT GAC CTC CGA AAA ATG CTT ATA Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu lie AAT TCT ACA GCA GTG GAC CCT TTA GTC CTT GGT GTT CGA GTT TGG CCA Asn Ser Thr Ala Val Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro CAA GCC ATA CCT CAG TTC CTG GTA GGA CAT CTT GAT CTT CTG GAA GCC Gin Ala lie Pro Gin Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Glu Ala GCA AAA GCT GCC CTG GAC CGA GGT GGC TAC GAT GGG CTG TTC CTA GGA Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly GGG AAC TAT GTT GCA GGA GTT GCC CTG GGC AGA TGC GTT GAG GGC GCG Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala TAT GAA AGT GCC TCG CAA ATA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC Tyr Glu Ser Ala Ser Gin lie Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr AAG TGATGAAAGA AGTGGAGCGC TACTTGTTAA TCGTTTATGT TGCATAGATG Lys

63 AGGTGCCTCC GGGGAAAAAA AAGCTTGAAT AGTATTTTTT ATTCTTATTT TGTAAATTGC 1553 ATTTCTGTTC TTTTTTCTAT CAGTAATTAG TTATATTTTA GTTCTGTAGG AGATTGTTCT 1613 GTTCACTGCC CTTCAAAAGA AATTTTATTT TTCATTCTTT TATGAGAGCT GTGCTACTTA 1673 AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1691 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 6: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 481 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 6: Ala Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala Gln Ala Leu Ala Thr Arg His Gly Val Gly Asp Val Leu Val Thr Glu Ala Arg Ala Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly

64 Thr Ile Lys Thr Ile Gln Glu Arg Ser Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Ala Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala lie Thr Ser Ser Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser lie Thr Lys Ser Asp Asp Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val Gln Ala Lys Ser Val Ile Met Thr lie Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asn lie Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Arg Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Asp Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr lie Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lie Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Ser Thr Ala Val Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala lie Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Glu Ala Ala Lys Ala Ala Leu Asp Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gln lie Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys

65 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 7: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 2061 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Zea mays (maize) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-3 (NRRL B-21259) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= Protox-2 maize (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 7: CTCTCCTACC TCCACCTCCA CGACAACAAG CAAATCCCCA TCCAGTTCCA AACCCTAACT CAA ATG CTC GCT TTG ACT GCC TCA GCC TCA TCC GCT TCG TCC CAT CCT Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro TAT CGC CAC GCC TCC GCG CAC ACT CGT CGC CCC CGC CTA CGT GCG GTC Tyr Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val CTC GCG ATG GCG GGC TCC GAC GAC CCC CGT GCA GCG CCC GCC AGA TCG Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser GTC GCC GTC GTC GGC GCC GGG GTC AGC GGG CTC GCG GCG GCG TAC AGG Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg CTC AGA CAG AGC GGC GTG AAC GTA ACG GTG TTC GAA GCG GCC GAC AGG Leu Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg GCG GGA GGA AAG ATA CGG ACC AAT TCC GAG GGC GGG TTT GTC TGG GAT 34 8 Ala Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp

66 GAA GGA Glu Gly ATT GAT Ile Asp CAC AAG His Lys GCT AAC ACC ATG ACA GAA GGT GAA TGG GAG GCC AGT AGA CTG Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu n o GAT CTT GGT CTA CAA GAC AAA CAG CAG TAT CCT AAC TCC CAA Asp Leu Gly Leu Gln Asp Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln CGT TAC ATT GTC AAA GAT GGA GCA CCA GCA CTG ATT CCT TCG Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Ala Leu Ile Pro Ser GAT CCC ATT TCG CTA ATG AAA AGC AGT GTT CTT TCG ACA AAA TCA AAG Asp Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys ATT GCG TTA TTT TTT GAA CCA TTT CTC TAC AAG AAA GCT AAC ACA AGA Ile Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg AAC TCT Asn Ser TTC TGT Phe Cys CCA TTT Pro Phe GGA AAA GTG TCT GAG GAG CAC TTG AGT GAG AGT GTT GGG AGC Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser GAA CGC CAC TTT GGA AGA GAA GTT GTT GAC TAT TTT GTT GAT Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp GTA GCT GGA ACA AGT GCA GGA GAT CCA GAG TCA CTA TCT ATT Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser Ile CGT CAT GCA TTC CCA GCA TTG TGG AAT TTG GAA AGA AAG TAT GGT TCA Arg His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser GTT ATT GTT GGT GCC ATC TTG TCT AAG CTA GCA GCT AAA GGT GAT CCA Val Ile Val Gly Ala Ile Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro GTA AAG Val Lys TCG TTT Ser Phe AAT GAA Asn Glu ACA AGA CAT GAT TCA TCA GGG AAA AGA AGG AAT AGA CGA GTG Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val TCA TTT CAT GGT GGA ATG CAG TCA CTA ATA AAT GCA CTT CAC Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser Leu Ile Asn Ala Leu His GTT GGA GAT GAT AAT GTG AAG CTT GGT ACA GAA GTG TTG TCA Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser TTG GCA TGT ACA TTT GAT GGA GTT CCT GCA CTA GGC AGG TGG TCA ATT Leu Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser Ile

67 TCT GTT GAT TCG AAG GAT AGC GGT GAC AAG GAC CTT GCT AGT AAC CAA Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln ACC TTT Thr Phe ATG AAG Met Lys AAG ATG Lys Met GAT GCT GTT ATA ATG ACA GCT CCA TTG TCA AAT GTC CGG AGG Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg TTC ACC AAA GGT GGA GCT CCG GTT GTT CTT GAC TTT CTT CCT Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro GAT TAT CTA CCA CTA TCT CTC ATG GTG ACT GCT TTT AAG AAG Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys GAT GAT GTC AAG AAA CCT CTG GAA GGA TTT GGG GTC TTA ATA CCT TAC Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu Ile Pro Tyr AAG GAA CAG CAA AAA CAT GGT CTG AAA ACC CTT GGG ACT CTC TTT TCC Lys Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser TCA ATG Ser Met ACA TTT Thr Phe TCT ATT Ser lie ATG TTC CCA GAT CGA GCT CCT GAT GAC CAA TAT TTA TAT ACA Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr GTT GGG GGT AGC CAC AAT AGA GAT CTT GCT GGA GCT CCA ACG Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr CTG AAA CAA CTT GTG ACC TCT GAC CTT AAA AAA CTC TTG GGC Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly GTA GAG GGG CAA CCA ACT TTT GTC AAG CAT GTA TAC TGG GGA AAT GCT Val Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Gly Asn Ala TTT CCT TTG TAT GGC CAT GAT TAT AGT TCT GTA TTG GAA GCT ATA GAA Phe Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Ala lie Glu AAG ATG Lys Met GAT GGG Asp Gly GAC CTT Asp Leu GAG AAA AAC CTT CCA GGG TTC TTC TAC GCA GGA AAT AGC AAG Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Asn Ser Lys CTT GCT GTT GGA AGT GTT ATA GCT TCA GGA AGC AAG GCT GCT Leu Ala Val Gly Ser Val lie Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala GCA ATC TCA TAT CTT GAA TCT CAC ACC AAG CAT AAT AAT TCA Ala lie Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser

68 CAT TGAAAGTGTC TGACCTATCC TCTAGCAGTT GTCGACAAAT TTCTCCAGTT 1745 His 545 CATGTACAGT AGAAACCGAT GCGTTGCAGT TTCAGAACAT CTTCACTTCT TCAGATATTA 1805 ACCCTTCGTT GAACATCCAC CAGAAAGGTA GTCACATGTG TAAGTGGGAA AATGAGGTTA 1865 AAAACTATTA TGGCGGCCGA AATGTTCCTT TTTGTTTTCC TCACAAGTGG CCTACGACAC 1925 TTGATGTTGG AAATACATTT AAATTTGTTG AATTGTTTGA GAACACATGC GTGACGTGTA 1985 ATATTTGCCT ATTGTGATTT TAGCAGTAGT CTTGGCCAGA TTATGCTTTA CGCCTTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 2061 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 8: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 544 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 8: Met Leu Ala Leu Thr Ala Ser Ala Ser Ser Ala Ser Ser His Pro Tyr Arg His Ala Ser Ala His Thr Arg Arg Pro Arg Leu Arg Ala Val Leu Ala Met Ala Gly Ser Asp Asp Pro Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ser Val Ala Val Val Gly Ala Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Tyr Arg Leu Arg Gln Ser Gly Val Asn Val Thr Val Phe Glu Ala Ala Asp Arg Ala Gly Gly Lys Ile Arg Thr Asn Ser Glu Gly Gly Phe Val Trp Asp Glu Gly Ala Asn Thr Met Thr Glu Gly Glu Trp Glu Ala Ser Arg Leu Ile Asp Asp Leu Gly Leu Gln Asp Lys Gln Gln Tyr Pro Asn Ser Gln His Lys Arg Tyr Ile Val Lys Asp Gly Ala Pro Ala Leu Ile Pro Ser Asp Pro Ile Ser Leu Met Lys Ser Ser Val Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ile

69 Ala Leu Phe Phe Glu Pro Phe Leu Tyr Lys Lys Ala Asn Thr Arg Asn Ser Gly Lys Val Ser Glu Glu His Leu Ser Glu Ser Val Gly Ser Phe Cys Glu Arg His Phe Gly Arg Glu Val Val Asp Tyr Phe Val Asp Pro Phe Val Ala Gly Thr Ser Ala Gly Asp Pro Glu Ser Leu Ser lie Arg His Ala Phe Pro Ala Leu Trp Asn Leu Glu Arg Lys Tyr Gly Ser Val lie Val Gly Ala lie Leu Ser Lys Leu Ala Ala Lys Gly Asp Pro Val Lys Thr Arg His Asp Ser Ser Gly Lys Arg Arg Asn Arg Arg Val Ser Phe Ser Phe His Gly Gly Met Gln Ser Leu lie Asn Ala Leu His Asn Glu Val Gly Asp Asp Asn Val Lys Leu Gly Thr Glu Val Leu Ser Leu Ala Cys Thr Phe Asp Gly Val Pro Ala Leu Gly Arg Trp Ser lie Ser Val Asp Ser Lys Asp Ser Gly Asp Lys Asp Leu Ala Ser Asn Gln Thr Phe Asp Ala Val Ile Met Thr Ala Pro Leu Ser Asn Val Arg Arg Met Lys Phe Thr Lys Gly Gly Ala Pro Val Val Leu Asp Phe Leu Pro Lys Met Asp Tyr Leu Pro Leu Ser Leu Met Val Thr Ala Phe Lys Lys Asp Asp Val Lys Lys Pro Leu Glu Gly Phe Gly Val Leu lie Pro Tyr Lys Glu Gln Gln Lys His Gly Leu Lys Thr Leu Gly Thr Leu Phe Ser Ser Met Met Phe Pro Asp Arg Ala Pro Asp Asp Gln Tyr Leu Tyr Thr Thr Phe Val Gly Gly Ser His Asn Arg Asp Leu Ala Gly Ala Pro Thr Ser lie Leu Lys Gln Leu Val Thr Ser Asp Leu Lys Lys Leu Leu Gly Val

70 Glu Gly Gln Pro Thr Phe Val Lys His Val Tyr Trp Ala Gly Phe Asn Pro Leu Tyr Gly His Asp Tyr Ser Ser Val Leu Glu Glu Ala Lys Ile Met Glu Lys Asn Leu Pro Gly Phe Phe Tyr Ala Gly Lys Asn AspSer Gly Leu Ala Val Gly Ser Val Ile Ala Ser Gly Ser Lys Ala Ala Asp Leu Ala Ile Ser Tyr Leu Glu Ser His Thr Lys His Asn Asn Ser His (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 9: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1811 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Triticum aestivum (wheat) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-13 (NRRL B-21545) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= Protox-1 wheat (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 9: GC GCA ACA ATG GCC ACC GCC ACC GTC GCG GCC GCG TCG CCG CTC CGC Ala Thr Met Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Pro Leu Arg GGC AGG GTC ACC GGG CGC CCA CAC CGC GTC CGC CCG CGT TGC GCT ACC Gly Arg Val Thr Gly Arg Pro His Arg Val Arg Pro Arg Cys Ala Thr GCG AGC AGC GCG ACC GAG ACT CCG GCG GCG CCC GGC GTG CGG CTG TCC Ala Ser Ser Ala 35 Thr Glu Thr Pro Ala 40 Ala Pro Gly Val Arg 45 Leu Ser GCG GAA TGC GTC ATT GTG GGC GCC GGC ATC AGC GGC CTC TGC ACC GCG 191 Ala Glu Cys Val Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala

71 CAG GCG CTG GCC ACC CGA TAC GGC GTC AGC GAC CTG CTC GTC ACG GAG Gln Ala Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Ser Asp Leu Leu Val Thr Glu GCC CGC GAC CGC CCG GGC GGC AAC ATC ACC ACC GTC GAG CGT CCC GAC Ala Arg Asp Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Asp GAG GGG TAC Glu Gly Tyr CCG GTC CTC Pro Val Leu CTG TGG GAG GAG GGA CCC AAC AGC TTC CAG CCC TCC GAC Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp ACC ATG GCC GTG GAC AGC GGG CTC AAG GAT GAC TTG GTG Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val TTC GGG GAC CCC AAC GCG CCC CGG TTC GTG CTG TGG GAG GGG AAG CTG Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu AGG CCG GTG CCG TCG AAG CCA GGC GAC CTG CCT TTC TTC AGC CTC ATG Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met AGT ATC CCT GGG AAG CTC AGG GCC GGC CTT GGC GCG CTC GGC ATT CGC Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg CCA CCT CCT Pro Pro Pro AAC CTC GGT Asn Leu Gly CCA GGG CGC GAG GAG TCG GTG GAG GAG TTT GTG CGC CGC Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg GCC GAG GTC TTT GAG CGC CTC ATC GAG CCT TTC TGC TCA Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu lie Glu Pro Phe Cys Ser GGT GTA TAT GCT GGT GAT CCT TCG AAG CTT AGT ATG AAG GCT GCA TTT Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe GGG AAG GTC TGG AGG TTG GAG GAG ATT GGA GGT AGT ATT ATT GGT GGA Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu lie Gly Gly Ser Ile lie Gly Gly ACC ATC AAG GCG ATT CAG GAT AAA GGG AAG AAC CCC AAA CCG CCA AGG Thr lie Lys Ala lie Gln Asp Lys Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg GAT CCC CGA Asp Pro Arg AAG GGT CTA Lys Gly Leu CTT CCG GCA CCA AAG GGA CAG ACG GTG GCA TCT TTC AGG Leu Pro Ala Pro Lys Gly Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg GCC ATG CTC CCG AAT GCC ATC GCA TCT AGG CTG GGT AGT Ala Met Leu Pro Asn Ala lie Ala Ser Arg Leu Gly Ser

72 AAA GTC Lys Val AAG CTG TCA TGG AAG CTT ACG AGC ATT ACA AAG GCG GAC AAC Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser lie Thr Lys Ala Asp Asn CAA GGA TAT GTA TTA GGT TAT GAA ACA CCA GAA GGA CTT GTT TCA GTG Gin Gly Tyr Val Leu Gly Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Leu Val Ser Val CAG GCT AAA AGT GTT ATC ATG ACC ATC CCG TCA TAT GTT GCT AGT GAT Gin Ala Lys Ser Val lie Met Thr lie Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp ATC TTG lie Leu TAT TAT Tyr Tyr ATT AGA lie Arg CGC CCA CTT TCA ATT GAT GCA GCA GAT GCA CTC TCA AAA TTC Arg Pro Leu Ser lie Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe CCG CCA GTT GCT GCT GTA ACT GTT TCA TAT CCA AAA GAA GCT Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala AAA GAA TGC TTA ATT GAT GGG GAG CTC CAG GGT TTC GGC CAG Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Gin Gly Phe Gly Gin TTG CAT CCA CGT AGC CAA GGA GTC GAG ACT TTA GGG ACA ATA TAT AGC Leu His Pro Arg Ser Gin Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser TCT TCT CTC TTT CCT AAT CGT GCT CCT GCT GGA AGA GTG TTA CTT CTG Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu AAC TAT Asn Tyr AGT GAC Ser Asp AAC CCT Asn Pro ATC GGG GGT TCT ACA AAT ACA GGG ATC GTC TCC AAG ACT GAG lie Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly lie Val Ser Lys Thr Glu TTA GTA GGA GCC GTT GAC CGT GAC CTC AGA AAA ATG TTG ATA Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu lie AGA GCA GCA GAC CCT TTA GCA TTA GGG GTT CGA GTG TGG CCA Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro CAA GCA ATA CCA CAG TTT TTG ATT GGG CAC CTT GAT CGC CTT GCT GCT Gin Ala lie Pro Gin Phe Leu lie Gly His Leu Asp Arg Leu Ala Ala GCA AAA TCT GCA CTG GGC CAA GGC GGC TAC GAC GGG TTG TTC CTA GGA Ala Lys Ser Ala Leu Gly Gin Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly GGA AAC Gly Asn TAC GTC GCA GGA GTT GCC TTG GGC CGA TGC ATC GAG GGT GCG Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys lie Glu Gly Ala

73 TAC GAG AGT GCC TCA CAA GTA TCT GAC TTC TTG ACC AAG TAT GCC TAC 1583 Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr AAG TGA TGGAAGTAGT GCATCTCTTC ATTTTGTTGC ATATACGAGG TGAGGCTAGG Lys ATCGGTAAAA CATCATGAGA TTCTGTAGTG TTTCTTTAAT TGAAAAAACA AATTTTAGTG 1699 ATGCAATATG TGCTCTTTCC TGTAGTTCGA GCATGTACAT CGGTATGGGA TAAAGTAGAA 1759 TAAGCTATTC TGCAAAAGCA GTGATTTTTT TTGAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 1811 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 10: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 528 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 10: Ala Thr Met Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala Ala Ser Pro Leu Arg Gly Arg Val Thr Gly Arg Pro His Arg Val Arg Pro Arg Cys Ala Thr Ala Ser Ser Ala Thr Glu Thr Pro Ala Ala Pro Gly Val Arg Leu Ser Ala Glu Cys Val Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly Leu Cys Thr Ala Gln Ala Leu Ala Thr Arg Tyr Gly Val Ser Asp Leu Leu Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Pro Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Pro Asp Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Gly Asp Leu Pro Phe Phe Ser Leu Met Ser

74 Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ile Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Ala Ile Gln Asp Lys Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Ala Pro Lys Gly Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Ala Ser Arg Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Ile Thr Lys Ala Asp Asn Gln Gly Tyr Val Leu Gly Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Leu Val Ser Val Gln Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Ile Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Asp Leu Val Gly Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Arg Ala Ala Asp Pro Leu Ala Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln

75 Ala H e Pro Gln Phe Leu Ile Gly His Leu Asp Arg Leu Ala Lys Ser Ala Leu Gly Gln Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Ala Ala 480 Gly Gly 495 Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys lie Ala Tyr Glu Gly Glu Ser Ala Ser Gln Val Ser Asp Phe Leu Thr Lys Tyr Lys Tyr Ala (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 11: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1847 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: soybean (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-12 (NRRL B-21516) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= protox-1 soybean (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 11: CTTTAGCACA GTGTTGAAGA TAACGAACGA ATAGTGCCAT TACTGTAACC AACC ATG 57 Met 1 GTT TCC GTC TTC AAC GAG ATC CTA TTC CCG CCG AAC CAA ACC CTT CTT 105 Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu Leu CGC CCC TCC CTC CAT TCC CCA ACC TCT TTC TTC ACC TCT CCC ACT CGA 153 Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr Arg AAA TTC CCT CGC TCT CGC CCT AAC CCT ATT CTA CGC TGC TCC ATT GCG 2 01 Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile Ala

76 GAG GAA Glu Glu 50 GAC TGC Asp Cys GCC CTC Ala Leu TCC ACC Ser Thr GTC GTC Val Val GCC ACC Ala Thr 85 GCG TCT Ala Ser 55 GTC GGC Val Gly 70 AAA CAC Lys His CCG CCC Pro Pro GGA GGC Gly Gly GCC AAT Ala Asn AAA ACC Lys Thr GTC AGC Val Ser 75 GCC AAC Ala Asn 90 AGA GAC Arg Asp 60 GGC CTC Gly Leu GTC GTC Val Val TCC GCC Ser Ala TGC ATC Cys Ile GTC ACG Val Thr 95 CCC GTG Pro Val 65 GCC CAG Ala Gln 80 GAG GCC Glu Ala CGA GAC Arg Asp CGC GTC GGC GGC AAC ATC ACC ACG ATG GAG AGG GAC GGA TAC Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly Tyr CTC TGG GAA GAA GGC CCC AAC AGC TTC CAG CCT TCT GAT CCA ATG CTC Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu ACC ATG GTG GTG GAC AGT GGT TTA AAG GAT GAG CTT GTT TTG GGG GAT Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly Asp CCT GAT Pro Asp CCC GGG Pro Gly GGC AAA Gly Lys GCA CCT CGG TTT GTG TTG TGG AAC AGG AAG TTG AGG CCG GTG Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro Val AAG CTG ACT GAT TTG CCT TTC TTT GAC TTG ATG AGC ATT GGT Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser lie Gly ATC AGG GCT GGC TTT GGT GCG CTT GGA ATT CGG CCT CCT CCT lie Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly lie Arg Pro Pro Pro CCA GGT CAT GAG GAA TCG GTT GAA GAG TTT GTT CGT CGG AAC CTT GGT Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly GAT GAG GTT TTT GAA CGG TTG ATA GAG CCT TTT TGT TCA GGG GTC TAT Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu lie Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr GCA GGC Ala Gly TGG AAG Trp Lys GAT CCT TCA AAA TTA AGT ATG AAA GCA GCA TTC GGG AAA GTT Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val CTG GAA AAA AAT GGT GGT AGC ATT ATT GGT GGA ACT TTC AAA Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys GCA ATA CAA GAG AGA AAT GGA GCT TCA AAA CCA CCT CGA GAT CCG CGT Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg

77 CTG CCA AAA CCA AAA GGT CAG ACT GTT GGA TCT TTC CGG AAG GGA CTT Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu ACC ATG TTG CCT GAT GCA ATT TCT GCC AGA CTA GGC AAC AAA GTA AAG Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val Lys TTA TCT Leu Ser AGT TTG Ser Leu ACT GTT Thr Val TGG AAG CTT TCA AGT ATT AGT AAA CTG GAT AGT GGA GAG TAC Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu Tyr ACA TAT GAA ACA CCA GAA GGA GTG GTT TCT TTG CAG TGC AAA Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys Lys GTC CTG ACC ATT CCT TCC TAT GTT GCT AGT ACA TTG CTG CGT Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu Arg CCT CTG TCT GCT GCT GCT GCA GAT GCA CTT TCA AAG TTT TAT TAC CCT Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro CCA GTT GCT GCA GTT TCC ATA TCC TAT CCA AAA GAA GCT ATT AGA TCA Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Ser GAA TGC Glu Cys CGT AGC Arg Ser TTC CCC Phe Pro TTG ATA GAT GGT GAG TTG AAG GGG TTT GGT CAA TTG CAT CCA Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro CAA GGA GTG GAA ACA TTA GGA ACT ATA TAC AGC TCA TCA CTA Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu AAC CGA GCA CCA CCT GGA AGG GTT CTA CTC TTG AAT TAC ATT Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile GGA GGA GCA ACT AAT ACT GGA ATT TTA TCG AAG ACG GAC AGT GAA CTT Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu Leu GTG GAA ACA GTT GAT CGA GAT TTG AGG AAA ATC CTT ATA AAC CCA AAT Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro Asn GCC CAG Ala Gln CCA CAG Pro Gln GAT CCA TTT GTA GTG GGG GTG AGA CTG TGG CCT CAA GCT ATT Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala Ile TTC TTA GTT GGC CAT CTT GAT CTT CTA GAT GTT GCT AAA GCT Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys Ala

78 TCT ATC AGA AAT ACT GGG TTT GAA GGG CTC TTC CTT GGG GGT AAT TAT 1593 Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr GTG TCT GGT GTT GCC TTG GGA CGA TGC GTT GAG GGA GCC TAT GAG GTA 1641 Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Val GCA GCT GAA GTA AAC GAT TTT CTC ACA AAT AGA GTG TAC AAA 1683 Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys TAGTAGCAGT TTTTGTTTTT GTGGTGGAAT GGGTGATGGG ACTCTCGTGT TCCATTGAAT 1743 TATAATAATG TGAAAGTTTC TCAAATTCGT TCGATAGGTT TTTGGCGGCT TCTATTGCTG 1803 ATAATGTAAA ATCCTCTTTA AGTTTGAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1847 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 12: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 543 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 12: Met Val Ser Val Phe Asn Glu Ile Leu Phe Pro Pro Asn Gln Thr Leu Leu Arg Pro Ser Leu His Ser Pro Thr Ser Phe Phe Thr Ser Pro Thr Arg Lys Phe Pro Arg Ser Arg Pro Asn Pro Ile Leu Arg Cys Ser Ile Ala Glu Glu Ser Thr Ala Ser Pro Pro Lys Thr Arg Asp Ser Ala Pro Val Asp Cys Val Val Val Gly Gly Gly Val Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Ala Asn Ala Asn Val Val Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Met Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly

79 Asp Pro Asp Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Arg Lys Leu Arg Pro Val Pro Gly Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Phe Lys Ala Ile Gln Glu Arg Asn Gly Ala Ser Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asn Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Ser Lys Leu Asp Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Leu Gln Cys Lys Thr Val Val Leu Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Thr Leu Leu Arg Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Thr Asp Ser Glu

80 Leu Val Glu Thr Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Ile Leu Ile Asn Pro Asn Ala Gln Asp Pro Phe Val Val Gly Val Arg Leu Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Val Gly His Leu Asp Leu Leu Asp Val Ala Lys Ala Ser Ile Arg Asn Thr Gly Phe Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Val Ala Ala Glu Val Asn Asp Phe Leu Thr Asn Arg Val Tyr Lys (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 13: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 583 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /funkcja= promotor protox-1 arabidopsis (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 13: GAATTCCGAT CGAATTATAT AATTATCATA AATTTGAATA AGCATGTTGC CTTTTATTAA 60 AGAGGTTTAA TAAAGTTTGG TAATAATGGA CTTTGACTTC AAACTCGATT CTCATGTAAT TAATTAATAT TTACATCAAA ATTTGGTCAC TAATATTACC AAATTAATAT ACTAAAATGT 180 TAATTCGCAA ATAAAACACT AATTCCAAAT AAAGGGTCAT TATGATAAAC ACGTATTGAA 240 CTTGATAAAG CAAAGCAAAA ATAATGGGTT TCAAGGTTTG GGTTATATAT GACAAAAAAA 300 AAAAAAGGTT TGGTTATATA TCTATTGGGC CTATAACCAT GTTATACAAA TTTGGGCCTA 360 ACTAAAATAA TAAAATAAAC GTAATGGTCC TTTTTATATT TGGGTCAAAC CCAACTCTAA 420 ACCCAAACCA AAGAAAAAGT ATACGGTACG GTACACAGAC TTATGGTGTG TGTGATTGCA 480 GGTGAATATT TCTCGTCGTC TTCTCCTTTC TTCTGAAGAA GATTACCCAA TCTGAAAAAA 540 ACCAAGAAGC TGACAAAATT CCGAATTCTC TGCGATTTCC ATG 583

81 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 14: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 3848 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: promotor (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE:/funkcja= promotor protox-1 maize" (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 14: TCGATCTTTC TAGGCTGATC CCCAAATCTT CCTCCGAAGC CCCTGGCGCC TCTGCCCCTT 60 GGAGCTGGTG GCCTGAAAGA GCTTTGCTGT TGCCCCGAAG ATTGTGAGGT ATATTGTGAC CTCTGAGACT GACTTCCTTT GTCGTCACTT TGAGTGGAGT TATGGATTGA CCTGACGTGC 180 CTCAGATGGA TTCTTCCTCC GAAGCCCCTG GTCATTTCGG AGAATCTGTA ATCTTATTCC 240 CTTCTTTGGC GAAAATCTGT CAGCTTGGAT GTACTCATCC ATCTTCTGAA GCAGCTTCTC 300 CAGAGTTTGT GGAGGCTTCC TGGCGAAATA TTGGGCTGTA GGTCCTGGAC GAAGACCCTT 360 GATCATGGCC TCAATGACAA TCTCATTGGG CACCGTAGGC GCTTGTGCCC TCAATCGCAA 420 GAACCTTCGT ACATATGCCT GAAGGTATTC TTCGTGATCT TGTGTGCATT GGAACAGAGC 480 CTGAGCTGTG ACCGACTTCG TTTGAAAGCC TTGGAAGCTA GTAACCAACA TGTGCTTAAG 540 CTTCTGCCAC GACGTGATAG TCCCTGGCCG AAGAGAAGAA TACCATGTTT GGGCTACATT 600 CCGGACTGCC ATGACGAAGG ACTTCGCCAT GACTACAGTG TTGACCCCAT ACGAAGATAT 660 AGTTGCTTCG TAGCTCATCA GAAACTGCTT TGGATCTGAG TGCCCATCAT ACATGGGGAG 720 CTGAGGTGGC TTGTATGATG GGGGCCATGG GGTAGCCTGC AGTTCTGCTG CCAAGGGAGA 780 AGCATCATCA AAAGTAAAGG CATCATGATT AAAATCATCA TACCATCCAT CCTCGTTGAA 840 TAAGCCTTCT TGACGAAGCT CCCTGTGTTG GGGCCTTCGA TCTTGTTCAT CTTGAACAAG 900 ATGACGCACT TCTTCAGTGG CTTCGTCGAT CTTTCTTTGG AGATCAGCCA GTCGCACCAT 960 CTTCTCCTTC TTTCTTTGTA CTTGTTGATG GATGATCTCC ATGTCCCTGA TCTCTTGGTC CAACTCCTCC TCTTGGAGTG TCAGACTGGT GGCTTTCCTC TTCTGGCTTC GAGCCTCTCG 1080 AAGAGAAAGA GTTTCTTGAT TTGGGTCCAG CGGCTGCAGT GCAGTGGTCC CTGGTGCTGA 1140

82 AGCTTTCTTC GGTGGCATGA CAAAGGTCAG TGCTTGCCGA AGGTGGTCGA AAAGGGTTCA 1200 CTAGAGGTGG GAGCCAATGT TGGGGACTTC TCAAGTGCTA TGAGTTAAGA ACAAGGCAAC 1260 ACAAAATGTT AAATATTAAT AGCTTTCATC TTTCGAAGCA TTATTTCCCT TTGGGTATAA 1320 TGATCTTCAG ACGAAAGAGT CCTTCATCAT TGCGATATAT GTTAATAGAA GGAGGAGCAT 1380 ATGAAATGTA AGAGACAACA TGAACAATCG TGTAGCATTG TTAATTCATC ATCATTTTAT 1440 TATTATGGAA AAATAGAAAC AATATTGAAT TACAAATGTA CCTTTGGCTT GACAGAAGAT 1500 AAAAGTACAA GCTTGACGCA CGAGCAAGTA CAAGTCAGTG TGAACAGTAC GGGGGTACTG 1560 TTCATCTATT TATAGGCACA GGACACAGCC TGTGAGAAAT TACAGTCATG CCCTTTACAT 1620 TTACTATTGA CTTATAGAAA AATCTATGAG GACTGGATAG CCTTTTCCCC TTTAAGTCGG 1680 TGCCTTTTTC CGCGATTAAG CCGAATCTCC CTTGCGCATA GCTTCGGAGC ATCGGCAACC 1740 TTCGTCACGA TCATGCCCTT CTCATTGTGT ATGCTTTTAA TCCTGAATTC GAAGGTACCT 1800 GTCCATAAAC CATACTTGGA AGACATTGTT AAATTATGTT TTTGAGGACC TTCGGAGGAC 1860 GAAGGCCCCC AACAGTCGTG TTTTTGAGGA CCTTCGGAAG ATGAAGGCCC CCAACAAGAC 1920 CTATCCATAA AACCAACCTA TCCACAAAAC CGACCCCATT CACCCTTCAT TTGCCTCACC 1980 AACAACCCTA ATTAGGTTGT TGGTTTAAAT TTTTTAGGGT CAATTTGGTC ATCACCATCC 2040 ACTGTCACTC CACAAACTCA ATATCAATAA ACAGACTCAA TCACCCAAAC TGACCATACC 2100 CATAAAACCG CCCCACCCTT CTAGCGCCTC GCCAGAAACC AGAAACCCTG ATTCAGAGTT 2160 CAAACTTAAA ACGACCATAA C m C A C C T T GGAACTCGAA TCAGGTCCAT TTTTTTCCAA 2220 ATCACACAAA ATTAAATTTC GCATCCGATA ATCAAGCCAT CTCTTCACTA TGGTTTTAAG 2280 TGTTGCTCAC ACTAGTGTAT TTATGGACTA ATCACCTGTG TATCTCATAC AATAACATAT 2340 CAGTACATCT AAGTTGTTAC TCAATTACCA AAACCGAATT ATAGCCTTCG AAAAAGGTTA 2400 TCGACTAGTC ACTCAATTAC CAAAACTAAA CTTTAGACTT TCATGTATGA CATCCAACAT 2460 GACACTGTAC TGGACTAAAC CACCTTTCAA GCTACACAAG GAGCAAAAAT AACTAATTTT 2520 CGTAGTTGTA GGAGCTAAAG TATATGTCCA CAACAATAGT TAAGGGAAGC CCCCAAGGAC 2580 TTAAAAGTCC TTTTACCTCT TGAAACTTTT GTCGTGGTCT ACTTTTTCAC TTTAAACTTC 2640 AAAATTTGAC ATTTTATCAC CCCTTAACTC TTAAAACCAT TTAAATTACA TTCTTACTAG 2700 ATTATAGATG ATTTTGTTGT GAAAAGTTTT TAAGACATGT TTACACATTG ATTAAAATCA 2760 TTTGTTCAAT TTCCTAGAGT TAAATCTAAT CTTATTAAAA CTATTAGAGA TACTTTCACG 2820 AGCTCTAAAT ATTTTTATTT TTTCATTATG GAATTTTGTT AGAATTCTTA TAGACCTTTT 2880

83 TTTGTGGTTT AAAAGCCTTG CCATGTTTTT AACAAGTTTT TTTTCTATTT TTTGAAATTT 2940 TCTTGGAAAC CACTTCTAAC CCGGTAGAAG ATTTATTTTG CTACACTTAT ATCTACAACA 3000 AAATCAACTT ATGAAATTGT CTTGGAAACT ACCTCTAACC CGGTAGAATG AATTTGAATG 3060 AAAATTAAAC CAACTTACGG AATCGCCCAA CATATGTCGA TTAAAGTGGA TATGGATACA 3120 TATGAAGAAG CCCTAGAGAT AATCTAAATG GTTTCAGAAT TGAGGGTTAT TTTTTGAAGT 3180 TTGATGGGAA GATAAGACCA TAACGGTAGT TCACAGAGAT AAAAGGGTTA TTTTTTTCAG 3240 AAATATTTGT GCTGCAATTG ATCCTGTGCC TCAAATTCAG CCTGCAACCA AGGCCAGGTT 3300 CTAGAGCGAA CAAGGCCCAC GTCACCCGTG GCCCGTCAGG CGAAGCAGGT CTTGTGCAGA 3360 CTTTGAGAGG GATTGGATAT CAACGGAACC AATCACGCAC GGCAATGCGA TTCCCAGCCC 3420 ACCTGTAACG TTCCAGTGGG CCATCCTTAA CTCCAAGCCC AACGGCCCTA CCCCATCTCG 3480 TCGTGTCATC CACTCCGCCG CACAGGCGCT CAGCTCCGCA ACGCCGCCGG AAATGGTCGC 3540 CGCCACAGCC ACCGCCATGG CCACCGCTGC ATCGCCGCTA CTCAACGGGA CCCGAATACC 3600 TGCGCGGCTC CGCCATCGAG GACTCAGCGT GCGCTGCGCT GCTGTGGCGG GCGGCGCGGC 3660 CGAGGCACCG GCATCCACCG GCGCGCGGCT GTCCGCGGAC TGCGTTGTGG TGGGCGGAGG 3720 CATCAGTGGC CTCTGCACCG CGCAGGCGCT GGCCACGCGG CACGGCGTCG GGGACGTGCT 3780 TGTCACGGAG GCCCGCGCCC GCCCCGGCGG CAACATTACC ACCGTCGAGC GCCCCGAGGA 3840 AGGGTACC 3848 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 15: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1826 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Gossypium hirsutum (bawełna) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-15 (NRRL B-21594) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature

84 (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= obszar kodujący protox-1 bawełny (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 15: CCTCTCGCTC GCCTGGCCCC ACCACCAATC ATGACGGCTC TAATCGACCT TTCTCTTCTC 60 CGTTCCTCGC CCTCCGTTTC CCCTTTCTCC ATACCCCACC ACCAGCATCC GCCCCGCTTT CGTAAACCTT TCAAGCTCCG ATGCTCCCTC GCCGAGGGTC CCACGATTTC CTCATCTAAA 180 ATCGACGGGG GAGAATCATC CATCGCGGAT TGCGTCATCG TTGGAGGTGG TATCAGTGGA 240 CTTTGCATTG CTCAAGCTCT CGCCACCAAG CAC CGTGACG TCGCTTCCAA TGTGATTGTG 300 ACGGAGGCCA GAGACCGTGT TGGTGGCAAC ATCACTACCG TTGAGAGAGA TGGATATCTG 360 TGGGAAGAAG GCCCCAACAG TTTTCAGCCC TCCGATCCTA TTCTAACCAT GGCCGTGGAT 420 AGTGGATTGA AGGACGATTT GGTTTTAGGT GACCCTAATG CACCGCGATT TGTACTATGG 480 GAGGGAAAAC TAAGGCCTGT GCCCTCCAAG CCAACCGACT TGCCGTTTTT TGATTTGATG 540 AGCATTGCTG GAAAACTTAG GGCTGGGTTC GGGGCTATTG GCATTCGGCC TCCCCCTCCG 600 GGTTATGAAG AATCGGTGGA GGAGTTTGTG CGCCGTAATC TTGGTGCTGA GGTTTTTGAA 660 CGCTTTATTG AACCATTTTG TTCAGGTGTT TATGCAGGGG ATCCTTCAAA ATTAAGCATG 720 AAAGCAGCAT TTGGAAGAGT ATGGAAGCTA GAAGAGATTG GTGGCAGCAT CATTGGTGGC 780 ACTTTCAAGA CAATCCAGGA GAGAAATAAG ACACCTAAGC CACCCAGAGA CCCGCGTCTG 840 CCAAAACCGA AGGGCCAAAC AGTTGGATCT TTTAGGAAGG GACTTACCAT GCTGCCTGAG 900 GCAATTGCTA ACAGTTTGGG TAGCAATGTA AAATTATCTT GGAAGCTTTC CAGTATTACC 960 AAATTGGGCA ATGGAGGGTA TAACTTGACA TTTGAAACAC CTGAAGGAAT GGTATCTCTT CAGAGTAGAA GTGTTGTAAT GACCATTCCA TCCCATGTTG CCAGTAACTT GTTGCATCCT 1080 CTCTCGGCTG CTGCTGCAGA TGCATTATCC CAATTTTATT ATCCTCCAGT TGCATCAGTC 1140 ACAGTCTCCT ATCCAAAAGA AGCCATTCGA AAAGAATGTT TGATTGATGG TGAACTTAAG GGGTTTGGCC AGTTGCACCC ACGCAGCCAA GGAATTGAAA CTTTAGGGAC GATATACAGT 1260 TCATCACTTT TCCCCAATCG AGCTCCATCT GGCAGGGTGT TGCTCTTGAA CTACATAGGA 1320 GGAGCTACCA ACACTGGAAT TTTGTCCAAG ACTGAAGGGG AACTTGTAGA AGCAGTTGAT 1380 CGTGATTTGA GAAAAATGCT TATAAATCCT AATGCAAAGG ATCCTCTTGT TTTGGGTGTA 1440 AGAGTATGGC CAAAAGCCAT TCCACAGTTC TTGGTTGGTC ATTTGGATCT CCTTGATAGT 1500 GCAAAAATGG CTCTCAGGGA TTCTGGGTTT CATGGACTGT TTCTTGGGGG CAACTATGTA 1560

85 TCTGGTGTGG CATTAGGACG GTGTGTGGAA GGTGCTTACG AGGTTGCAGC TGAAGTGAAG 1620 GAATTCCTGT CACAATATGC ATACAAATAA TATTGAAATT CTTGTCAGGC TGCAAATGTA 1680 GAAGTCAGTT ATTGGATAGT ATCTCTTTAG CTAAAAAATT GGGTAGGGTT TTTTTTGTTA 1740 GTTCCTTGAC CACTTTTTGG GGTTTTCATT AGAACTTCAT ATTTGTATAT CATGTTGCAA 1800 TATCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1826 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 16: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 539 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 16: Met Thr Ala Leu Ile Asp Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ser Pro Ser Val Ser Pro Phe Ser Ile Pro His His Gln His Pro Pro Arg Phe Arg Lys Pro Phe Lys Leu Arg Cys Ser Leu Ala Glu Gly Pro Thr Ile Ser Ser Ser Lys Ile Asp Gly Gly Glu Ser Ser Ile Ala Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Ala Thr Lys His Arg Asp Val Ala Ser Asn Val Ile Val Thr Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Thr Thr Val Glu Arg Asp Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Ile Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Ala Gly Lys Leu

86 Arg Ala Gly Phe Gly Ala Ile Gly lie Arg Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Phe lie Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Arg Val Trp Lys Leu Glu Glu lie Gly Gly Ser Ile lie Gly Gly Thr Phe Lys Thr lie Gln Glu Arg Asn Lys Thr Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Glu Ala lie Ala Asn Ser Leu Gly Ser Asn Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Ser Ser lie Thr Lys Leu Gly Asn Gly Gly Tyr Asn Leu Thr Phe Glu Thr Pro Glu Gly Met Val Ser Leu Gln Ser Arg Ser Val Val Met Thr lie Pro Ser His Val Ala Ser Asn Leu Leu His Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu Ser Gln Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ser Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly lie Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ser Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr lie Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly lie Leu Ser Lys Thr Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Asn Ala Lys Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Lys Ala lie Pro Gln Phe

87 Leu Val Gly His Leu 485 Asp Leu Leu Asp Ser 490 Ala Lys Met Ala Leu 495 Arg Asp Ser Gly Phe 500 His Gly Leu Phe Leu 505 Gly Gly Asn Tyr Val 510 Ser Gly Val Ala Leu 515 Gly Arg Cys Val Glu 520 Gly Ala Tyr Glu Val 525 Ala Ala Glu Val Lys Glu Phe Leu Ser Gln Tyr Ala Tyr Lys (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 17: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1910 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-16 (NRRL B-21595N) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: miscjeature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= obszar kodujący protox-1 buraka cukrowego (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 17: ATGAAATCAA TGGCGTTATC AAACTGCATT CCACAGACAC AGTGCATGCC ATTGCGCAGC 60 AGCGGGCATT ACAGGGGTAA TTGTATCATG TTGTCAATTC CATGTAGTTT AATTGGAAGA CGAGGTTATT ATTCACATAA GAAGAGGAGG ATGAGCATGA GTTGCAGCAC AAGCTCAGGC 180 TCAAAGTCAG CGGTTAAAGA AGCAGGATCA GGATCAGGTG CAGGAGGATT GCTAGACTGC 240 GTAATCGTTG GAGGTGGAAT TAGCGGGCTT TGCATCGCGC AGGCTCTTTG TACAAAACAC 300 TCCTCTTCCT CTTTATCCCC AAATTTTATA GTTACAGAGG CCAAAGACAG AGTTGGCGGC 360 AACATCGTCA CTGTGGAGGC CGATGGCTAT ATCTGGGAGG AGGGACCCAA TAGCTTCCAG 420 CCTTCCGACG CGGTGCTCAC CATGGCGGTC GACAGTGGCT TGAAAGATGA GTTGGTGCTC 480

88 GGAGATCCCA ATGCTCCTCG CTTTGTGCTA TGGAATGACA AATTAAGGCC CGTACCTTCC 540 AGTCTCACCG ACCTCCCTTT CTTCGACCTC ATGACCATTC CGGGCAAGAT TAGGGCTGCT 600 CTTGGTGCTC TCGGATTTCG CCCTTCTCCT CCACCTCATG AGGAATCTGT TGAACACTTT 660 GTGCGTCGTA ATCTCGGAGA TGAGGTCTTT GAACGCTTGA TTGAACCCTT TTGTTCAGGT 720 GTGTATGCCG GTGATCCTGC CAAGCTGAGT ATGAAAGCTG CTTTTGGGAA GGTCTGGAAG 780 TTGGAGCAAA AGGGTGGCAG CATAATTGGT GGCACT CTCA AAGCTATACA GGAAAGAGGG 840 AGTAATCCTA AGCCGCCCCG TGACCAGCGC CTCCCTAAAC CAAAGGGTCA GACTGTTGGA 900 TCCTTTAGAA AGGGACTCGT TATGTTGCCT ACCGCCATTT CTGCTCGACT TGGCAGTAGA 960 GTGAAACTAT CTTGGACCCT TTCTAGTATC GTAAAGTCAC TCAATGGAGA ATATAGTCTG ACTTATGATA CCCCAGATGG CTTGGTTTCT GTAAGAACCA AAAGTGTTGT GATGACTGTT 1080 CCATCATATG TTG CAAGTAG GCTTCTTCGT CCACTTTCAG ACTCTGCTGC AGATTCTCTT 1140 TCAAAATTTT ACTATCCACC AGTTGCAGCA GTGTCACTTT CCTATCCTAA AGAAGCGATC AGATCAGAAT GCTTGATTAA TGGTGAACTT CAAGGTTTCG GGCAACTACA TCCCCGCAGT 1260 CAGGGTGTGG AAACCTTGGG AACAATTTAT AGTTCGTCTC TTTTCCCTGG TCGAGCACCA 1320 CCTGGTAGGA TCTTGATCTT GAGCTACATC GGAGGTGCTA AAAATCCTGG CATATTAAAC 1380 AAGTCGAAAG ATGAACTTGC CAAGACAGTT GACAAGGACC TGAGAAGAAT GCTTATAAAT 1440 CCTGATGCAA AACTTCCTCG TGTACTGGGT GTGAGAGTAT GGCCTCAAGC AATACCCCAG 1500 TTTTCTATTG GGCACTTTGA TCTGCTCGAT GCTGCAAAAG CTGCTCTGAC AGATACAGGG 1560 GTCAAAGGAC TGTTTCTTGG TGGCAACTAT GTTTCAGGTG TTGCCTTGGG GCGGTGTATA 1620 GAGGGTGCTT ATGAGTCTGC AGCTGAGGTA GTAGATTTCC TCTCACAGTA CTCAGACAAA 1680 TAGAGCTTCA GCATCCTGTG TAATTCAACA CAGGCCTTTT TGTATCTGTT GTGCGCGCAT 1740 GTAGTCTGGT CGTGGTGCTA GGATTGATTA GTTGCTCTGC TGTGTGATCC ACAAGAATTT 1800 TGATGGAATT TTTCCAGATG TGGGCATTAT ATGTTGCTGT CTTATAAATC CTTAATTTGT 1860 ACGTTTAGTG AATTACAC CG CATTTGATGA CTAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1910 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 18: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 560 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany

89 (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 18: Met Lys Ser Met Ala Leu Ser Asn Cys Ile Pro Gln Thr Gln Cys Met Pro Leu Arg Ser Ser Gly His Tyr Arg Gly Asn Cys Ile Met Leu Ser Ile Pro Cys Ser Leu Ile Gly Arg Arg Gly Tyr Tyr Ser His Lys Lys Arg Arg Met Ser Met Ser Cys Ser Thr Ser Ser Gly Ser Lys Ser Ala Val Lys Glu Ala Gly Ser Gly Ser Gly Ala Gly Gly Leu Leu Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Cys Thr Lys His Ser Ser Ser Ser Leu Ser Pro Asn Phe Ile Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly Asn Ile Val Thr Val Glu Ala Asp Gly Tyr Ile Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Ala Val Leu Thr Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Glu Leu Val Leu Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Asp Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Ser Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Thr Ile Pro Gly Lys Ile Arg Ala Ala Leu Gly Ala Leu Gly Phe Arg Pro Ser Pro Pro Pro His Glu Glu Ser Val Glu His Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Gln Lys Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Leu Lys Ala Ile Gln Glu Arg Gly Ser Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp

90 Gln Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Val Met Leu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Ser Arg Val Lys Leu Ser Trp Thr Leu Ser Ser Ile Val Lys Ser Leu Asn Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Asp Thr Pro Asp Gly Leu Val Ser Val Arg Thr Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser Tyr Val Ala Ser Arg Leu Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala Ala Asp Ser Leu Ser Lys Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Leu Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asn Gly Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Gly Arg Ala Pro Pro Gly Arg Ile Leu Ile Leu Ser Tyr Ile Gly Gly Ala Lys Asn Pro Gly Ile Leu Asn Lys Ser Lys Asp Glu Leu Ala Lys Thr Val Asp Lys Asp Leu Arg Arg Met Leu Ile Asn Pro Asp Ala Lys Leu Pro Arg Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Ser Ile Gly His Phe Asp Leu Leu Asp Ala Ala Lys Ala Ala Leu Thr Asp Thr Gly Val Lys Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ser Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Ile Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ala Glu Val Val Asp Phe Leu Ser Gln Tyr Ser Asp Lys (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 19: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1784 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

91 (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Brasica napus (rzepak) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-17 (NRRL B-21615) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= obszar kodujący protox-1 rzepaku (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 19: GGGCCCCCCC CAAAATTGAG GATTCTCCTT CTCGCGGGCG ATCGCCATGG ATTTATCTCT 60 TCTCCGTCCG CAGCCATTCC TATCGCCATT CTCAAATCCA TTTCCTCGGT CGCGTCCCTA CAAGCCTCTC AACCTCCGTT GCTCCGTATC CGGTGGATCC GTCGTCGGCT CTTCTACAAT 180 CGAAGGCGGA GGAGGAGGTA AAACCGTCAC GGCGGACTGC GTGATCGTCG GCGGAGGAAT 240 CAGCGGCCTG TGCATTGCGC AAGCGCTCGT GACGAAGCAC CCAGACGCTG CAAAGAATGT 300 GATGGTGACG GAGGCGAAGG ACCGTGTGGG AGGGAATATC ATCACGCGAG AGGAGCAAGG 360 GTTTCTATGG GAAGAAGGTC CCAATAGCTT TCAGCCGTCT GATCCTATGC TCACTATGGT 420 GGTAGATAGT GGTTTGAAAG ATGATCTAGT C TTGGGAG AT CCTACTGCTC CGAGGTTTGT 480 GTTGTGGAAT GGGAAGCTGA GGCCGGTTCC GTCGAAGCTA ACTGACTTGC CTTTCTTTGA 540 CTTGATGAGT ATTGGAGGGA AGATTAGAGC TGGGTTTGGT GCCATTGGTA TTCGACCTTC 600 ACCTCCGGGT CGTGAGGAAT CAGTGGAAGA GTTTGTAAGG CGTAATCTTG GTGATGAGGT 660 TTTTGAGCGC TTGATTGAAC CCTTTTGCTC AGGTGTTTAT GCGGGAGATC CTGCGAAACT 720 GAGTATGAAA GCAGCTTTTG GGAAGGTTTG GAAGCTAGAG GAGAATGGTG GGAGCATCAT 780 TGGTGGTGCT TTTAAGGCAA TTCAAGCGAA AAATAAAGCT CCCAAGACAA CCCGAGATCC 840 GCGTCTGCCA AAGCCAAAGG GCCAAACTGT TGGTTCTTTC AGGAAAGGAC TCACAATGCT 900 GCCAGAGGCA ATCTCCGCAA GGTTGGGTGA CAAGGTGAAA GTTTCTTGGA AGCTCTCAAG 960 TATCACTAAG CTGGCCAGCG GAGAATATAG CTTAACTTAC GAAACTCCGG AGGGTATAGT 1020

92 CACTGTACAG AGCAAAAGTG TAGTGATGAC TGTGCCATCT CATGTTGCTA GTAGTCTCTT 1080 GCGCCCTCTC TCTGATTCTG CAGCTGAAGC GCTCTCAAAA CTCTACTATC CGCCAGTTGC 1140 AGCCGTATCC ATCTCATACG CGAAAGAAGC AATCCGAAGC GAATGCTTAA TAGATGGTGA ACTAAAAGGG TTCGGCCAGT TGCATCCACG CACGCAAAAA GTGGAAACTC TTGGAACAAT 1260 ATACAGTTCA TCGCTCTTTC CCAACCGAGC ACCGCCTGGA AGAGTATTGC TATTGAACTA 1320 CATCGGTGGA GCTACCAACA CTGGGATCTT ATCAAAGTCG GAAGGTGAGT TAGTGGAAGC 1380 AGTAGATAGA GACTTGAGGA AGATGCTGAT AAAGCCAAGC TCGACCGATC CACTTGTACT 1440 TGGAGTAAAA TTATGGCCTC AAGCCATTCC TCAGTTTCTG ATAGGTCACA TTGATTTGGT 1500 AGACGCAGCG AAAGCATCGC TCTCGTCATC TGGTCATGAG GGCTTATTCT TGGGTGGAAA 1560 TTACGTTGCC GGTGTAGCAT TGGGTCGGTG TGTGGAAGGT GCTTATGAAA CTGCAACCCA 1620 AGTGAATGAT TTCATGTCAA GGTATGCTTA CAAGTAATGT AACGCAGCAA CGATTTGATA 1680 CTAAGTAGTA GATTTTGCAG TTTTGACTTT AAGAACACTC TGTTTGTGAA AAATTCAAGT 1740 CTGTGATTGA GTAAATTTAT GTATTATTAC TAAAAAAAAA AAAA 1784 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 20: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 536 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 20: Met Asp Leu Ser Leu Leu Arg Pro Gln Pro Phe Leu Ser Pro Phe Ser Asn Pro Phe Pro Arg Ser Arg Pro Tyr Lys Pro Leu Asn Leu Arg Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Val Val Gly Ser Ser Thr Ile Glu Gly Gly Gly Gly Gly Lys Thr Val Thr Ala Asp Cys Val Ile Val Gly Gly Gly Ile Ser Gly Leu Cys Ile Ala Gln Ala Leu Val Thr Lys His Pro Asp Ala Ala Lys Asn Val Met Val Thr Glu Ala Lys Asp Arg Val Gly Gly

93 Asn Ile Ile Thr Arg Glu Glu Gln Gly Phe Leu Trp Glu Glu Gly Pro n o Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Met Leu Thr Met Val Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Leu Gly Asp Pro Thr Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Asn Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Leu Thr Asp Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Gly Gly Lys Ile Arg Ala Gly Phe Gly Ala Ile Gly Ile Arg Pro Ser Pro Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Asp Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ala Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Lys Leu Glu Glu Asn Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Ala Phe Lys Ala Ile Gln Ala Lys Asn Lys Ala Pro Lys Thr Thr Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Gly Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Arg Leu Gly Asp Lys Val Lys Val Ser Trp Lys Leu Ser Ser Ile Thr Lys Leu Ala Ser Gly Glu Tyr Ser Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Ile Val Thr Val Gln Ser Lys Ser Val Val Met Thr Val Pro Ser His Val Ala Ser Ser Leu Leu Arg Pro Leu Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ala Leu Ser Lys Leu Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Ser Ile Ser Tyr Ala Lys Glu Ala Ile Arg Ser Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Lys Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Thr Gln Lys Val Glu

94 Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Pro Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Leu Ser Lys Ser Glu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Lys Pro Ser Ser Thr Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Lys Leu Trp Pro Gln Ala Ile Pro Gln Phe Leu Ile Gly His Ile Asp Leu Val Asp Ala Ala Lys Ala Ser Leu Ser Ser Ser Gly His Glu Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Thr Ala Thr Gln Val Asn Asp Phe Met Ser Arg Tyr Ala Tyr Lys (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 21: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1224 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Oryza sative (ryż) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-18 (NRRL B-21648) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= część obszaru kodującego protox-1 ryżu

95 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 21: CGGGCTTTGA AGGCTGCATT TGGGAAGGTG TGGAGGCTGG AGGATACTGG AGGTAGCATT 60 ATTGGTGGAA CCATCAAGAC AATCCAGGAG AGGGGGAAAA ACCCCAAACC GCCGAGGGAT CCCCGCCTTC CAACGCCAAA GGGGCAGACA GTTGCATCTT TCAGGAAGGG TCTGACTATG 180 CTCCCGGATG CTATTACATC TAGGTTGGGT AGCAAAGTCA AACTTTCATG GAAGTTGACA 240 AGCATTACAA AGTCAGACAA CAAAGGATAT GCATTAGTGT ATGAAACACC AGAAGGGGTG 300 GTCTCGGTGC AAGCTAAAAC TGTTGTCATG ACCATCCCAT CATATGTTGC TAGTGATATC 360 TTGCGGCCAC TTTCAAGTGA TGCAGCAGAT GCTCTGTCAA TATTCTATTA TCCACCAGTT 420 GCTGCTGTAA CTGTTTCATA TCCAAAAGAA GCAATTAGAA AAGAATGCTT AATTGACGGA 480 GAGCTCCAGG GTTTCGGCCA GCTGCATCCG CGTAGTCAGG GAGTTGAGAC TTTAGGAACA 540 ATATATAGCT CATCACTCTT TCCAAATCGT GCTCCAGCTG GAAGGGTGTT ACTTCTGAAC 600 TACATAGGAG GTTCTACAAA TACAGGGATT GTTTCCAAGA CTGAAAGTGA GCTGGTAGAA 660 GCAGTTGACC GTGACCTCAG GAAGATGCTG ATAAATCCTA GAGCAGTGGA CCCTTTGGTC 720 CTTGGCGTCC GGGTATGGCC ACAAGCCATA CCACAGTTCC TCATTGGCCA TCTTGATCAT 780 CTTGAGGCTG CAAAATCTGC CCTGGGCAAA GGTGGGTATG ATGGATTGTT CCTCGGAGGG 840 AACTATGTTG CAGGAGTTGC CCTGGGCCGA TGCGTTGAAG GTGCATATGA GAGTGCCTCA 900 CAAATATCTG ACTACTTGAC CAAGTACGCC TACAAGTGAT CAAAGTTGGC CTGCTCCTTT 960 TGGCACATAG ATGTGAGGCT TCTAGCAGCA AAAATTTCAT GGGCATCTTT TTATCCTGAT TCTAATTAGT TAGAATTTAG AATTGTAGAG GAATGTTCCA TTTGCAGTTC ATAATAGTTG 1080 TTCAGATTTC AGCCATTCAA TTTGTGCAGC CATTTACTAT ATGTAGTATG ATCTTGTAAG 1140 TACTACTAAG AACAAATCAA TTATATTTTC CTGCAAGTGA CATCTTAATC GTCAGCAAAT CCAGTTACTA GTAAAAAAAA AAAA 1224 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 22: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 312 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko

96 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 22: Arg Ala Leu Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Asp Thr Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Thr Ile Gln Glu Arg Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Thr Pro Lys Gly Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Thr Met Leu Pro Asp Ala Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Leu Val Tyr Glu Thr Ser Ile Thr Lys Ser Asp Asn Lys Gly Tyr Ala Leu Val Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Ser Val Gln Ala Lys Thr Val Val Met Thr lie Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp lie Leu Arg Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ala Asp Ala Leu Ser lie Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala lie Arg Lys Glu Cys Leu lie Asp Gly Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr lie Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr lie Gly Gly Ser Thr Asn Thr Gly lie Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Arg Ala Val Asp Pro Leu Val Leu Gly Val Arg Val Trp Pro Gln Ala lie Pro Gln Phe Leu lie Gly His Leu Asp His Leu Glu Ala Ala Lys Ser Ala Leu Gly Lys Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Phe Leu Gly Gly Asn Tyr Val Ala Gly Val Ala Leu

97 Gly Arg Cys Val Glu Gly Ala Tyr Glu Ser Ala Ser Gln Ile Ser Asp Tyr Leu Thr Lys Tyr Ala Tyr Lys 305 3io (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 23: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 1590 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: cdna (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Sorghum bicolor (sorgo) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-19 (NRRL B-21649) (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /produkt= część obszaru kodującego protox-1 sorgo (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 23: TCCACCGTCG AGCGCCCCGA GGAAGGGTAC CTCTGGGAGG AGGGTCCCAA CAGCTTCCAG 60 CCATCCGACC CCGTTCTCTC CATGGCCGTG GACAGCGGGC TGAAGGATGA CCTGGTTTTT GGGGACCCCA ACGCGCCACG GTTCGTGCTG TGGGAGGGGA AGCTGAGGCC CGTGCCATCC 180 AAGCCCGCCG ACCTCCCGTT CTTCGATCTC ATGAGCATCC CTGGCAAGCT CAGGGCCGGT 240 CTCGGCGCGC TTGGCATCCG CCCGCCTGCT CCAGGCCGCG AGGAGTCAGT GGAGGAGTTT 300 GTGCGCCGCA ACCTCGGTGC TGAGGTCTTT GAGCGCCTAA TTGAGCCTTT CTGCTCAGGT 360 GTCTATGCTG GCGATCCTTC CAAGCTCAGT ATGAAGGCTG CATTTGGGAA GGTGTGGCGG 420 TTAGAAGAAG CTGGAGGTAG TATTATTGGT GGAACCATCA AGACGATTCA GGAGAGGGGC 480 AAGAATCCAA AACCACCGAG GGATCCCCGC CTTCCGAAGC CAAAAGGGCA GACAGTTGCA 540 TCTTTCAGGA AGGGTCTTGC CATGCTTCCA AATGCCATCA CATCCAGCTT GGGTAGTAAA 600 GTCAAACTAT CATGGAAACT CACGAGCATG ACAAAA.TCAG ATGGCAAGGG GTATGTTTTG 660

98 GAGTATGAAA CACCAGAAGG GGTTGTTTTG GTGCAGGCTA AAAGTGTTAT CATGACCATT 720 CCATCATATG TTGCTAGCGA CATTTTGCGT CCACTTTCAG GTGATGCTGC AGATGTTCTA 780 TCAAGATTCT ATTATCCACC AGTTGCTGCT GTAACGGTTT CGTATCCAAA GGAAGCAATT 840 AGAAAAGAAT GCTTAATTGA TGGGGAACTC CAGGGTTTTG GCCAGTTGCA TCCACGTAGT 900 CAAGGAGTTG AGACATTAGG AACAATATAC AGCTCATCAC TCTTTCCAAA TCGTGCTCCT 960 GCTGGTAGGG TGTTACTTCT AAACTACATA GGAGGTGCTA CAAACACAGG AATTGTTTCC AAGACTGAAA GTGAGCTGGT AGAAGCAGTT GACCGTGACC TCCGAAAAAT GCTTATAAAT 1080 CCTACAGCAG TGGACCCTTT AGTCCTTGGT GTCCGAGTTT GGCCACAAGC CATACCTCAG 1140 TTCCTGGTAG GACATCTTGA TCTTCTGGAG GCCGCAAAAT CTGCCCTGGA CCAAGGTGGC TATAATGGGC TGTTCCTAGG AGGGAACTAT GTTGCAGGAG TTGCCCTGGG CAGATGCATT 1260 GAGGGCGCAT ATGAGAGTGC CGCGCAAATA TATGACTTCT TGACCAAGTA CGCCTACAAG 1320 TGATGGAAGA AGTGGAGCGC TGCTTGTTAA TTGTTATGTT GCATAGATGA GGTGAGACCA 1380 GGAGTAGTAA AAGGCGTCAC GAGTATTTTT CATTCTTATT TTGTAAATTG CACTTCTGTT 1440 t t t t t t t c c t GTCAGTAATT AGTTAGATTT TAGTTATGTA GGAGATTGTT GTGTTCACTG 1500 CCCTACAAAA GAATTTTTAT TTTGCATTCG TTTATGAGAG CTGTGCAGAC TTATGTAACG 1560 TTTTACTGTA AGTATCAACA AAATCAAATA 1590 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 24: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 440 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) SPLOT: nie związany (D) TOPOLOGIA: nie związany (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 24: Ser Thr Val Glu Arg Pro Glu Glu Gly Tyr Leu Trp Glu Glu Gly Pro Asn Ser Phe Gln Pro Ser Asp Pro Val Leu Ser Met Ala Val Asp Ser Gly Leu Lys Asp Asp Leu Val Phe Gly Asp Pro Asn Ala Pro Arg Phe Val Leu Trp Glu Gly Lys Leu Arg Pro Val Pro Ser Lys Pro Ala As

99 Leu Pro Phe Phe Asp Leu Met Ser Ile Pro Gly Lys Leu Arg Ala Gly Leu Gly Ala Leu Gly Ile Arg Pro Pro Ala Pro Gly Arg Glu Glu Ser Val Glu Glu Phe Val Arg Arg Asn Leu Gly Ala Glu Val Phe Glu Arg Leu Ile Glu Pro Phe Cys Ser Gly Val Tyr Ala Gly Asp Pro Ser Lys Leu Ser Met Lys Ala Ala Phe Gly Lys Val Trp Arg Leu Glu Glu Ala Gly Gly Ser Ile Ile Gly Gly Thr Ile Lys Thr Ile Gln Glu Arg Gly Lys Asn Pro Lys Pro Pro Arg Asp Pro Arg Leu Pro Lys Pro Lys Gly Gln Thr Val Ala Ser Phe Arg Lys Gly Leu Ala Met Leu Pro Asn Ala Ile Thr Ser Ser Leu Gly Ser Lys Val Lys Leu Ser Trp Lys Leu Thr Ser Met Thr Lys Ser Asp Gly Lys Gly Tyr Val Leu Glu Tyr Glu Thr Pro Glu Gly Val Val Leu Val Gln Ala Lys Ser Val Ile Met Thr Ile Pro Ser Tyr Val Ala Ser Asp Ile Leu Arg Pro Leu Ser Gly Asp Ala Ala Asp Val Leu Ser Arg Phe Tyr Tyr Pro Pro Val Ala Ala Val Thr Val Ser Tyr Pro Lys Glu Ala Ile Arg Lys Glu Cys Leu Ile Asp Gly Glu Leu Gln Gly Phe Gly Gln Leu His Pro Arg Ser Gln Gly Val Glu Thr Leu Gly Thr Ile Tyr Ser Ser Ser Leu Phe Pro Asn Arg Ala Pro Ala Gly Arg Val Leu Leu Leu Asn Tyr Ile Gly Gly Ala Thr Asn Thr Gly Ile Val Ser Lys Thr Glu Ser Glu Leu Val Glu Ala Val Asp Arg Asp Leu Arg Lys Met Leu Ile Asn Pro Thr Ala Val Asp Pro Leu Val

100 Leu Gly 370 Val Arg Val Trp Pro Gln 375 Ala Ile Pro Gln 380 Phe Leu Val Gly His Leu 385 Asp Leu Leu Glu 390 Ala Ala Lys Ser Ala Leu 395 Asp Gln Gly Gly 400 Tyr Asn Gly Leu Phe Leu 405 Gly Gly Asn Tyr 410 Val Ala Gly Val Ala Leu 415 Gly Arg Cys Ile 420 Glu Gly Ala Tyr Glu Ser 425 Ala Ala Gln Ile 430 Tyr Asp Phe Leu Thr Lys 435 Tyr Ala Tyr Lys 440 (2) INFORMACJE Dl_A SEKW. ID NR: 25: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 93 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = sekwencja intronu protox-1 kukurydzy (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 25: GTACGCTCCT CGCTGGCGCC GCAGCGTCTT CTTCTCAGAC TCATGCGCAG CCATGGAATT 60 GAGATGCTGA ATGGATTTTA TACGCGCGCG CAG 93 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 26: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 2606 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: DNA (genomowy) (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (vi) PIERWOTNE ŹRÓDŁO: (A) ORGANIZM: Beta vulgaris (burak cukrowy) (vii) BEZPOŚREDNIE ŹRÓDŁO: (A) KLON: pwdc-20 (NRRL B-21650)

101 (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 1..6 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla Sali" (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: komplementarna (1..538) (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= część cdna protox-1 buraka cukrowego w kierunku 3-5 (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= obszar promotora protox-1 buraka cukrowego przedstawiony w kierunku 3-5 (częściowa sekwencja fragmentu 3 kb Pstl-Sa1l subklonowanego z pwdc-20) (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 26: GTCGACCTAC GCACATGCCA CATTCCACAT TCCACGTTAG GAATTGAATT GAATTGAATT 60 ATGATTATGA ATAATGAAGA GACAGAATTA CCGCCATGGT GAGCACCGCG TCGGAAGGCT GGAAGCTATT GGGTCCCTCC TCCCAGATAT AGCCATCGGC CTCCACAGTG ACGATGTTGC 180 CGCCAACTCT GTCTTTGGCC TCTGTCACTA TAAAATTTGG GGATAAAGAG GACTGTTTTG 240 TACAAAGAGC CTGCGCGATG CAAAGCCCGC TAATTCCACC TCCAACGATT ACGCAGTCTA 300 GCAATCCTCC TGCTCCTGAT CCTGATCCTG ATCCTGCTTC TTTAACCGCT GACTTTGAGC 360 CTGAGCTTGT GCTGCAACTC ATGCTCATCC TCCTCTTCTT ATGTGAATAA TAACCTCGTC 420 TTCCAATTAA ACTACATGGA ATTGACAACA TGATACAATT GCCCCTGTAA TGCCCGCTGC 480 TGTGCAATGG CATGCACTGT GTCTGTGGAA TGCAGTTTGA TAACGCCATT GATTTCATCT 540 CTCTCTCGCT CTCTCGCCCT CCTTATCCTC TATATCCCCT TCTTGCTTGC TCGGGAATTC 600 TAATTAACCT TATATCAAAA TGAAACAACT GTTTCTAGTT AAAAAGTTTT TTATAAATAG 660 TACTCTAAAT AAACGATTAC ATGTATCTTC TAACCATACT TGTTTGGTGG AGGTGGTGCG 720 TAACCGGTAA CTTACCTTTG TAACTCACCT CAATACCTAC TTATGCTTAA GGATACGGAT 780 TCTTTTAAAC TCTCAGGCAT TGACCTATGT AGCTGGACTG ACTAACATCT GAATTTGTTT 840 CTCTGGTTAT ATATGCAATT TTAACTGAAT CGAAATTTCT CTGGATGCTA AAAATGT CTT 900 TAACGGGGTT TATGAGGACT AAATTATCTC CTTCAATGAG GAGGTTCTTG ATTTGCATGT 960 ATGAGCGTGA AAATGCATTC TTAACGGCTA TAGATTCAGT AATAAGTGGT GTTAAAAGTA

102 AAAAGTACTT GGAAAAATGA TTAAGCGACT TAATTTTTTT TATTTGTTTG AAAGTTGCCT 1080 TTTCTTGGCT ATCTTAACAT GTATTTATCA AACACCTTTT TTAATTACAT GGAAATCGAA 1140 AAGTTTGAAA AAAAAAAATC ATACTCACTA ACCGCCTTAA AATATAAGCT GAAGATGTCT 1200 CACTAACAGA GTGCATGTGA AGCACCCCCA AAGCAATTAT AACACAACAT CTCCGCCTCT 1260 TCAAAATTCC TACAAATACA TCTAATAAAC TTGTTGAAAC AATCAAAGTA ACATGGTGT 1320 TCAATTGCGG ATGCTTCTCA TTCCAGACTT TATATAGTGA TTTTGTTTAA TCCATAGTCA 1380 ACAACTCACA TAATGGTACC CAAAGAATAC CCAAATTTTT TGCTCAAAAT CCCTAAACAT 1440 TGTAGCTGTG TAAGTTTGAC TAACATGTTT CAGCATGCTT GCCATGGGTA AATAAGACT1500 AGGGGCAAAT CTCGAATCCA CAAACTCATC ATTGGTTTTA GTTTGTCTCC AACGTAAAAC 1560 AATGATGTGA AATACACCAC AAAATTCATA CAATCTCGTT ATCTTGGAAG CTTGAAAGCC 1620 ATAATCTTGT TTGTACTTTC ACTACGTCGA GAAGACAAAA TTACAACTAA GAAGAGGTC1680 TTGCTCAGTG TCGTGTACTA CTTATCTTTC AACTCATAGA AACAAGCAAA CCAATTGTCA 1740 CCTATATACT GTACTTCTCC ATCATATACT TCCAACTTGC CTTAAACTCA ATACTATCAT 1800 AAAAACCACA AAGACATTTC ATAAAAGCAT AATAAAAATG TGTCATCACT CTTCAAAGTT 1860 CCAAAGTGAT TCTAACTACA TTCTAATGAA AATGACATTG GTGTAAACCT AATCCTTGTG 1920 TTATAAAACA CCTACATACC ACGATTATGT TAGAAATATA TTTATGAATG CAGTACCTAC 1980 ATAAAGCCAT TAAATAACCA GTTTTATGTT ATTTCGTGAC CAACATAGTT CCTAAAGATT 2040 ACGAAGTAAT TTATAGTCAT TTTGTGGCCA CTTAATTCAT TTAATACCCA GTATATTTAT 2100 AAGTTACCAG CTTAAGTAGT TTTGTGACCA TCTCTACATA CTTCCTCCGG TCCATAATAA 2160 GGGGGCGTTT GGTTGCAACG GGGTAAAGGG AATGGAATCA A G A A A G G G A A G G A G A G G A 2220 AGGAAAAGAA AACCCTTAGA TTTAGAGTGG TGTTTGGTTA AGATAATGTT AATTCTCTT2280 CTTCCTCTTT CTTACCCTTC GCACCACCAC TCCTCCCTCT GTTACTATTC 2340 TCCACGCCGC CTCTCCCTAC CCCAGTAACA CCACCTTGTC GGCCCCCCGG TCTTCCCCTT 2400 CCCGCGACGG TTCCCCCCTC CCCTGCGCCG TCACGTCGTC CCCCTCACCT CCCTGCACC2460 TCGAGTTATC CCCCTCCCCT GCGCGTCGCG TTCTCCCCTC CCTCACCATC GCGTTCTCC2520 CTCCCTCACC GTCGCGTTCT CCCCTCCCTC ACCGTCGCGG TCTCCCCTCC CTCACCGTC2580 CGGTCTCTCT TTCCCTCCCC CTGCAG 2606

103 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 27: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Pc1p_P1a primer do PCR dla górnej nici promotora genu plastydowego cipp (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla EcoRI (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 27: GCGGAATTCA TACTTATTTA TCATTAGAAA G 31 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 28: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Pc1p_P1b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego cipp (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla Xbal (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 28: GCGTCTAGAA AGAACTAAAT ACTATATTTC AC 32

104 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 29: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Pc1 p_p2b primer do PCR dla dolnej nici promotora genu plastydowego cipp (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla Ncol (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 29: GCGCCATGGT AAATGAAAGA AAGAACTAAA 30 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 30: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Trps16_P1a primer do PCR dla górnej nici obszaru 3 nie ulegającego translacji Xbal/HindIII genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc f eature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla Xbal

105 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 30: GCGTCTAGAT CAACCGAAAT TCAATTAAGG 3 0 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 31: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = Trps16_P1b primer do PCR dla dolnej nici obszaru 3 nie ulegającego translacji Xbal/HindIII genu plastydowego rps16 (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: 4..9 (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla HindIII (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 31: CGCAAGCTTC AATGGAAGCA ATGATAA 27 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 32: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = minpsb_u primer dla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/ncol) obejmującego ATG z 5 nie ulegającej translacji części genu plastydowego psba (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 32: GGGAGTCCCT GATGATTAAA TAAACCAAGA TTTTAC 36

106 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 33: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = minpsb_l primer dla górnej nici obszaru 38 nt (tępe/ncol) obejmującego ATG z 5 nie ulegającej translacji części genu plastydowego psba (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 33: CATGGTAAAA TCTTGGTTTA TTTAATCATC AGGGACTCCC 40 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 34: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = APRTXP1a primer do PCR dla górnej nici do amplifikacji części 5 zmutowanego genu protox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (ix) CECHY: (A) NAZWA/KLUCZ: misc_feature (B) POZYCJA: (A) INNE INFORMACJE: /uwaga= miejsce dla Ncol/kodon inicjacyjny ATG (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34: GGGACCATGG ATTGTGTGAT TGTCGGCGGA GG 32 (2) INFORMACJE DLA SEKW. ID NR: 35: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad

107 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) SPLOT: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ MOLEKUŁY: inny kwas nukleinowy (A) OPIS: /desc = APRTXP1b primer do PCR dla dolnej nici do amplifikacji części 5 zmutowanego genu protox Arabidopsis (iii) HIPOTETYCZNA: NIE (iv) ANTYSENSOWNA: NIE (xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. ID NR: 34: CTCCGCTCTC CAGCTTAGTG ATAC 24

108