(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US02/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO03/ (13) B1 (51) Int.Cl. C12Q 1/68 ( ) A61K 39/23 ( ) Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej (30) Pierwszeństwo: , US, 60/302, , US, 60/365, , US, 60/369,224 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 06/05 (73) Uprawniony z patentu: Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc, Emeryville, US (72) Twórca(y) wynalazku: SERGIO PICHUANTES, El Cerrito, US VENKATAKRISHNA SHYAMALA, Oakland, US (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/12 (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej. Wynalazek należy do dziedziny diagnostyki wirusów, a zwłaszcza odnosi się do testów opartych na kwasach nukleinowych do dokładnego diagnozowania infekcji parwowirusem B19 oraz starterów i sond do użycia w tych testach. Stan techniki Ludzki parwowirus B19 należy do rodziny Parvoviridae, gatunku Erythrovirus i jest małym 22-nm ikozahedralnym bezotoczkowym wirusem zawierającym liniową jednoniciową cząsteczkę DNA o wielkości około 5600 nukleotydów. Genom wirusa koduje trzy główne białka, VP1, VP2 i NS1. Patrz, Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: i fig. 1. Białka VP1 (83kDa) i VP2 (58 kda) są białkami strukturalnymi kapsydu. Oba białka kodowane są przez nakładające się ramki odczytu, odpowiednio przez nukleotydy od 2444 do 4789 i od 3125 do VP2 stanowi 95% kapsydu a większe białko VP1 tylko 5% kapsydu. Białko VP1 niezbędne jest dla osiągnięcia przez wirusa konformacji dojrzałej. Białko NS1 (77 kda), jest białkiem niestrukturalnym i jest obecne tylko we frakcji jądrowej zainfekowanych komórek, a nie występuje w cytoplazmie i w nienaruszonych wirionach w surowicy. Parwowirus B19 był pierwszym wirusem wykrytym w surowicy normalnych dawców krwi i jest jedynym przedstawicielem rodziny Parvoviridae, o którym wiadomo, że jest patogenem człowieka. Wirus ten powoduje występowanie różnych objawów chorobowych. Ludzki parwowirus B19 normalnie powoduje bezobjawowe lub słabe samoograniczające się infekcje u dzieci. U dorosłych, parwowirus B19 może powodować wysypkę, przejściowy, symetryczny ból stawów i zapalenie stawów. Parwowirusa B19 wiąże się z występowaniem przejściowego przełomu aplastycznego, (TAG) u pacjentów cierpiących na zaburzenia hemolityczne. U mających obniżoną odporność pacjentów chorych na ostre białaczki, wrodzone niedobory immunologiczne, AIDS i u pacjentów poddanych przeszczepowi szpiku obserwowano chroniczne infekcje parwowirusem B19 i przewlekłe anemie. Parwowirusa B19 wiąże się z występowaniem śmierci płodów u ciężarnych kobiet. W większości krajów, infekcje wirusem B19 występują głównie w wieku dziecięcym, a około 50% dzieci ma przeciwciała przeciw parwowirusowi B19 zanim osiągnie wiek 15 lat. Występowanie przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 może się nawet zwiększyć w czasie życia i mogą one występować u ponad 90% ludzi starych. W przypadku ludzkich infekcji parwowirusem B19, uważa się że początkowa replikacja wirusa następuje w drogach oddechowych. Następnie wirus przenosi się do komórek szpiku kostnego. Powoduje to masowe namnażanie się wirusa i stwierdza się wiremię od 10 2 do cząsteczek/ml, występującą 7-10 dni po zakażeniu, ale przed wystąpieniem objawów. Ustąpienie wiremii skorelowane jest z pojawieniem się specyficznych przeciwciał IgM, których poziom pozostaje podwyższony przez dwa do trzech miesięcy. Przeciwciała IgG przeciw parwowirusowi B19 wykrywa się kilka dni po pojawieniu się przeciwciał IgM i pozostają przez całe życie. Brak otoczki lipidowej i ograniczona zawartość DNA czyni parwowirusa B19 wyjątkowo opornym na inaktywację fizykochemiczną. Parwowirus B19, szczególnie w wyższych stężeniach może wytrzymać tradycyjne traktowanie ciepłem produktów krwiopochodnych. Udokumentowane jest przenoszenie parwowirusa B19 przez podawanie czynnika VII traktowanego rozpuszczalnikiem-detergentem i preparatów czynnika VIII i czynnika IX traktowanego parą lub suchym gorącem. Ludzki parwowirus B19 nie rośnie w tradycyjnych hodowlach komórkowych, co powoduje że jego wykrycie i wyizolowanie w laboratorium jest wyjątkowo trudne. Przez wiele lat jedynym źródłem zawierającym antygen była surowica pacjentów z wiremią. Żeby obejść te problemy wytwarzano także rekombinowane antygeny do użycia w testach serologicznych. Patrz, na przykład, Sisk i Berman, Biotechnology (1987) 5: ; Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr Immunoenzymatyczne testy wychwytu IgM były używane do wykrywania przeciwciał IgM przeciw parwowirusowi B19, a także do diagnozowania niedawnych infekcji parwowirusem. B19. Zdolności diagnostyczne wielu dostępnych w handlu testów, nie są jednakże homogenne. Ponadto, testy diagnostyczne oparte na przeciwciałach IgM nie są w stanie wykryć wirusa w czasie infekcji na poziomie wiremii, a jeżeli przeciwciała IgM zostaną zsyntetyzowane to pozostają w obiegu przez kilka miesięcy po zakończeniu wiremii. Duża prewalencja przeciwciał przeciw parwowirusowi B19 w normalnej populacji razem z faktem, że wysoka wiremia przeważnie trwa tylko jeden tydzień, czyni używanie testów opartych na sero-

3 PL B1 3 logii niepraktycznym. Ponadto, u pacjentów z obniżoną odpornością immunologiczną diagnozy oparte na serologii mogą być nie mało wiarygodne. Do wykrywania parwowirusa B19 używano testów opartych na hybrydyzacji kwasów nukleinowych, takich jak hybrydyzacja dot blot i hybrydyzacja in situ. Testy takie mają wykrywalność na poziomie 1 do 0,1 pg wirusowego DNA (~ cząsteczek wirusa). PCR ma większą czułość (~100 kopii genu). Jednakże techniki hybrydyzacji DNA są czasochłonne, a ich użycie jest ograniczone, a PCR nie nadaje się do badań przesiewowych dużej liczby próbek. W celu zapobieżenia przenoszeniu wirusa przez pochodne krwi lub surowicy lub przez bliski kontakt osobisty istnieje więc potrzeba rozwinięcia wiarygodnych prób diagnostycznych do wykrywania parwowirusa B19 w próbkach z wiremią. Podsumowanie wynalazku Sposób według wynalazku oparty jest na odkryciu unikatowych starterów i sond, których można użyć w próbach opartych na kwasach nukleinowych, a także na opracowaniu czułego i wiarygodnego testu diagnostycznego opartego na kwasach nukleinowych do wykrywania DNA parwowirusa B19 w próbkach biologicznych od potencjalnie zakażonych osobników. Przedmiotem wynalazku jest zatem, sposób wykrywania ludzkiego parwowirusa B19 w próbce biologicznej przy zastosowaniu próby Taqman polegający na tym, że: (a) izoluje się kwasy nukleinowe z próbki biologicznej przeznaczonej do określania ludzkiego parwowirusa B19 przez kontaktowanie magnetycznych kulek podłoża zawierających związane z nimi wychwytujące kwasy nukleinowe z próbką biologiczną w warunkach hybrydyzacji, przy czym nici docelowego kwasu nukleinowego ludzkiego parwowirusa B19 jeśli są obecne w próbce biologicznej, hybrydyzują z wychwytującymi kwasami nukleinowymi, przy czym związane, kwasy nukleinowe zawierają jeden lub więcej oligonukleotydów wybranych z grupy składającej się z SEQ ID nr i oddziela się kulki magnetyczne od tej próbki; (b) amplifikuje się izolowane kwasy nukleinowe i wewnętrzną sekwencję kontrolną stosując próbę Taqman z sensownym i antysensownym starterem, przy czym każdy ze starterów jest nie większy niż długość 60 nukleotydów i jest wystarczająco komplementarny do części nici sensownych i antysensownych docelowego kwasu nukleinowego dla hybrydyzacji z nim, przy czym starter sensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 60 i starter antysensowny składa się z sekwencji SEQ ID nr 59; przy czym wewnętrzna sekwencja kontrolna zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 90, i (c) wykrywa się obecność amplifikowanych kwasów nukleinowych ludzkiego parwowirusa B19 stosując sondę nie większą niż 50 nukleotydów długości, która zawiera sekwencję nukleotydową SEQ ID nr 61 jako wskazanie obecności ludzkiego parwowirusa B19 w próbce; i (d) wykrywa się obecność amplifikowanej wewnętrznej sekwencji kontrolnej stosując sondę Taqman. W sposobie według wynalazku korzystnie wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji SEQ ID nr 55 i jeden lub więcej oligonukleotydów o sekwencji SEQ ID nr Bardziej korzystnie, wychwytujące kwasy nukleinowe zawierają oligonukleotydy o sekwencji SEQ ID nr 49, 52, 53 i 55. Opisana tu technika wykorzystuje wyekstrahowaną próbkę DNA jako matrycę do amplifikacji konserwowanych regionów sekwencji DNA parwowirusa B19 przy użyciu metody amplifikacji wspomaganej przez transkrypcję, a także testu 5'-nukleazy, takiej jak technika TaqMan. Sposób według wynalazku pozwala na wykrycie DNA parwowirusa B19 w próbkach od pacjentów z wiremią mających miano wirusa na poziomie 10 3 cząsteczek/ml. Podobnie zainfekowane próbki można wykryć i wykluczyć z transfuzji, a także z przygotowywania preparatów krwiopochodnych. Sondy i startery opisane w wynalazku są także użyteczne na przykład w standardowych metodach hybrydyzacji, a także technikach opartych na PCR, amplifikacji w oparciu o sekwencję kwasów nukleinowych (NASBA) i w próbach wykorzystujących rozgałęzione cząsteczki DNA. W jednym przykładzie wykonania, sposób według wynalazku obejmuje metodę wykrywania infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. Metoda taka obejmuje: (a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19, przy czym taki kwas nukleinowy zawiera sekwencję docelową RNA; (b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z pierwszym oligonukleotydem, który zawiera pierwszy starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części docelowej sekwencji RNA, żeby utworzyć z nią kompleks, przy czym pierwszy starter zawiera także promotor dla zależnej od DNA polimerazy 5' RNA

4 4 PL B1 połączony funkcjonalnie z sekwencją kompleksującą, tak że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA. (c) wydłużenie pierwszego startera w reakcji wydłużania przy użyciu docelowej sekwencji RNA jako matrycy i otrzymanie pierwszego produktu wydłużania startera DNA komplementarnego do docelowej sekwencji RNA; (d) oddzielenie pierwszego produktu wydłużania startera DNA od docelowej sekwencji RNA przy użyciu enzymu, który selektywnie degraduje docelową sekwencję RNA; (e) traktowanie produktu wydłużania startera DNA drugim oligonukleotydem, który zawiera drugi starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części produktu wydłużania startera DNA, żeby utworzyć z nią kompleks w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA; (f) wydłużenie 3'-końca drugiego startera w reakcji wydłużania DNA i otrzymanie drugiego produktu wydłużania startera DNA, otrzymując w ten sposób matrycę dla zależnej od DNA polimerazy RNA; (g) użycie tej matrycy do wytworzenia wielu kopii RNA sekwencji docelowej przy użyciu zależnej od DNA polimerazy RNA rozpoznającej sekwencję promotorową; i (h) użycie kopii RNA otrzymanych w etapie (g) do autokatalitycznego powtarzania etapów (b) do (g) w celu namnożenia sekwencji docelowej. W pewnych przykładach wykonania, sposób według wynalazku obejmuje także etap: (i) dodania znakowanej sondy oligonukleotydowej do produktu otrzymanego w etapie (h), tak że taka sonda oligonukleotydowa jest komplementarna do części sekwencji docelowej w warunkach, które umożliwiają hybrydyzację sondy z sekwencją docelową i utworzenie kompleksu sonda:sekwencja docelowa; i (j) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej. W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku, znacznikiem jest ester akrydynowy. W jeszcze innych przykładach wykonania sposobu według wynalazku, pierwszy i drugi primer i sondy używane sposobem według wynalazku pochodzą z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, takiego jak sekwencja polinukleotydowa pokazana na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z. W innym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, wykrywanie infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych obejmuje: (a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19 tak, że taki kwas nukleinowy zawiera RNA sekwencji docelowej; (b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z pierwszym oligonukleotydem, który zawiera pierwszy starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części docelowej sekwencji RNA, żeby utworzyć z nią kompleks, przy czym pierwszy starter zawiera także promotor dla zależnej od DNA polimerazy 5' RNA połączony funkcjonalnie z sekwencją kompleksującą, oraz przy czym pierwszy starter zawiera sekwencję pochodzącą od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i tym, że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA. (c) wydłużenie pierwszego startera w reakcji wydłużania przy użyciu docelowej sekwencji RNA jako matrycy i otrzymanie pierwszego produktu wydłużania startera DNA komplementarnego do docelowej sekwencji RNA; (d) oddzielenie pierwszego produktu wydłużania startera DNA od docelowej sekwencji RNA przy użyciu enzymu, który selektywnie degraduje docelową sekwencję RNA; (e) traktowanie produktu wydłużania startera DNA drugim oligonukleotydem, który zawiera drugi starter, który zawiera sekwencję kompleksującą wystarczająco komplementarną do 3'-końcowej części produktu wydłużania startera DNA, żeby utworzyć z nią kompleks, a ten drugi starter pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i traktowanie przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd- /sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA;

5 PL B1 5 (f) wydłużenie 3'-końca drugiego startera w reakcji wydłużania DNA i otrzymanie drugiego produktu wydłużania startera DNA, otrzymując w ten sposób matrycę dla zależnej od DNA polimerazy RNA; (g) użycie tej matrycy do wytworzenia wielu kopii RNA sekwencji docelowej przy użyciu zależnej od DNA polimerazy RNA rozpoznającej sekwencję promotorową; i (h) użycie kopii RNA otrzymanych w etapie (g) do autokatalitycznego powtarzania etapów (b) do (g) w celu namnożenia sekwencji docelowej. (i) dodania znakowanej estrem akrydynowym sondy oligonukleotydowej do produktu otrzymanego w etapie (h) w warunkach, które umożliwiają hybrydyzację sondy z sekwencją docelową i utworzenie kompleksu sonda:sekwencja docelowa, przy czym taka sonda oligonukleotydowa jest komplementarna do części sekwencji docelowej i sonda pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z; i (j) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej. Wynalazek opisuje też metodę namnażania docelowej sekwencji nukleotydowej parwowirusa B19. Metoda taka obejmuje: (a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19, przy czym taki kwas nukleinowy zawiera sekwencję docelową RNA; (b) dodanie jednego lub więcej starterów zdolnych do hybrydyzacji z sekwencją docelową RNA, przy czym jeden lub więcej starterów pochodzi od sekwencji polinukleotydowej pokazanej na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z; (c) dodanie sondy oligonukleotydowej zdolnej do hybrydyzacji z 3' sekwencją docelową RNA pokrewną jednemu lub więcej starterom; (d) wydłużenie jednego lub więcej starterów przy użyciu polimerazy. W pewnych przykładach wykonania sposobu według wynalazku, sekwencja docelowa RNA z etapu (a) jest odwrotnie transkrybowana w celu otrzymania cdna i sposób obejmuje także namnożenie cdna przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) lub reakcji łańcuchowej ligazy z asymetrycznym wypełnieniem przerw DNA (RT-AGLCR). W innych przykładach wykonania sposobu według wynalazku polimerazą jest polimeraza termostabilna, taka jak na przykład ale bez ograniczania polimeraza Taq lub polimeraza Vent. W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku polimerazą jest polimeraza I DNA E. coli, fragment Klenowa polimerazy I DNA E. coli i/lub polimeraza DNA faga T4. W pewnych przykładach wykonania różnych sposobów według wynalazku zapewnia się wewnętrzną kontrolę. Kontrola wewnętrzna może pochodzić z sekwencji pokazanej na fig. 12 (SEQ ID NO: 92). W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku kontrola wewnętrzna obejmuje sekwencję SEQ ID NO: 90. W dodatkowych przykładach wykonania sposobu według wynalazku przedmiotem wynalazku jest metoda wykrywania infekcji ludzkim parwowirusem B19 w próbkach biologicznych. Metoda taka obejmuje: (a) wyizolowanie kwasu nukleinowego z próbki biologicznej podejrzanej o zawieranie DNA ludzkiego parwowirusa B19, znamienne tym, że taki kwas nukleinowy zawiera RNA sekwencji docelowej; (b) doprowadzenie do reakcji wyizolowanego kwasu nukleinowego parwowirusa B19 z możliwą do wykrycia znakowaną sondą wystarczająco komplementarną i zdolną do hybrydyzacji z sekwencją docelową, przy czym sonda pochodzi od sekwencji polinukleotydowych pokazanych na jednej z figur 2A - 2U lub figur 11A - 11Z i tym, że taka reakcja przebiega w warunkach umożliwiających utworzenie się kompleksu oligonukleotyd/sekwencja docelowa i rozpoczęcie syntezy DNA. (c) wykrycie obecności lub braku znacznika jako wskazania obecności lub braku sekwencji docelowej. W wynalazku opisuje się także polinukleotyd zawierający sekwencję nukleotydową zawierającą jedną z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z. Powyższy polinukleotyd charakteryzuje się tym, że sekwencję nukleotydową stanowi sekwencja nukleotydowa pokazana na fig. 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F, 2G, 2H, 2I, 2J, 2K, 2L, 2M, 2N, 20, 2P, 2Q, 2R, 2S, 2T, 2U, 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G, 11H, 11I, 11J, 11K, 11L, 11M, 11N, 11O, 11P, 11Q, 11R, 11Z, 11T, 11U, 11V, 11W, 11X, 11Y lub fig. 11Z.

6 6 PL B1 Polinukleotyd zawiera także sekwencję nukleotydową zawierającą jedną z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 3A - 30 lub fig. 4A - 4C. Powyższy polinukleotyd może też mieć sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja nukleotydowa pokazana na fig. 3A-3C lub fig. 4A-4C. Wynalazek przedstawia także starter polinukleotydowy zawierający region promotorowy rozpoznawany przez zależną od DNA polimerazę RNA funkcjonalnie połączony z sekwencją o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19. W pewnych przykładach wykonania wynalazku, region promotorowy jest promotorem faga T7 a polimeraza jest polimerazą RNA faga T7. Ponadto, sekwencje specyficzne do ludzkiego parwowirusa B19 mogą pochodzić z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, tak jak sekwencje polinukleotydowe pokazane na jednej z fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z. W jeszcze innych przykładach wykonania wynalazku starter polinukleotydowy zawiera region promotorowy faga T7 funkcjonalnie połączony z sekwencją o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19, przy czym sekwencja kompleksująca specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 pochodzi od jednej z sekwencji polinukleotydowych pokazanych na fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z. W jeszcze innych przykładach wykonania wynalazku sonda oligonukleotydowa zawiera sekwencję o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 połączoną z estrem akrydynowym jako znacznikiem. Sekwencja kompleksująca specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 może pochodzić z regionu VP1 genomu ludzkiego parwowirusa B19, tak jak sekwencje polinukleotydowe pokazane na jednej z fig. 2A - 2U lub fig. 11A - 11Z. W oparciu o sposób wykrywania według wynalazku można utworzyć diagnostyczny zestaw testowy zawierający jeden lub więcej opisanych tu starterów oligonukleotydowych i instrukcję prowadzenia testów diagnostycznych. Taki zestaw testowy zawiera także sondę oligonukleotydową zawierającą sekwencję o wielkości około 10 do około 75 nukleotydów kompleksującą specyficznie ludzkiego parwowirusa B19 połączoną z estrem akrydynowym jako znacznikiem. Wynalazek jest zilustrowany w załączonych rysunkach na których poszczególne figury oznaczają: Figura 1 jest diagramem prezentującym genom ludzkiego parwowirusa B19, pokazującym różne regiony kodujące wirusa. Pokazane są trzy fragmenty, jeden o wielkości około 700 par zasad, odpowiadający pozycjom nukleotydowym genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: ; jeden o wielkości około 370 par zasad we fragmencie o wielkości 700 par zasad, odpowiadający pozycjom nukleotydowym genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: i jeden o wielkości około 214 par zasad odpowiadający pozycjom nukleotydowym genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: Figury 2A do 2U (SEQ ID NO: 1-21) pokazują sekwencje DNA różnych izolatów parwowirusa B19, które obejmują odpowiadające pozycjom nukleotydowym genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: (fragment o wielkości 700 par zasad pokazany na fig. 1). Figura 2A (SEQ ID NO:1) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH47-26; fig. 2B (SEQ ID NO:2) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH48-29; fig. 2C (SEQ ID NO:3) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-2; fig. 2D (SEQ ID NO:4) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-3; fig. 2E (SEQ ID NO:5) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH33-4; fig. 2F (SEQ ID NO:6) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-7; fig. 2G (SEQ ID NO:7) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-18; fig. 2H (SEQ ID NO:8) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH42-19; fig. 21 (SEQ ID NO:9) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH46-23; fig. 2J (SEQ ID NO: 10) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH1-1; fig. 2K (SEQ ED NO:11) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH1-6; fig. 2L (SEQ ID NO: 12) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-8; fig. 2M (SEQ ID NO: 13) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-10; fig. 2N (SEQ ED NO: 14) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH2-11C; fig. 20 (SEQ ID NO: 15) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CHS-13; fig. 2P (SEQ ID NO: 16) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH7-22; fig. 2Q (SEQ ID NO: 17) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH13-27; fig. 2R (SEQ ID NO: 18) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH14-33; fig. 2S (SEQ ED NO: 19) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH62-2; fig. 2T (SEQ ID NO:20) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH64-2; i fig. 2U (SEQ ID NO:21) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH67-2. Figury 3A - 3C (SEQ ID NO: 22) pokazują sekwencję fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad pokazanego na fig. 1 pochodzącą z klonu 2-B1 parwowirusa B19. Sekwencja jest frag-

7 PL B1 7 mentem o wielkości 4677 nukleotydów i odpowiada pozycjom nukleotydowym opisanym w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: Pokazane sekwencje obejmują pełnej długości ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 3' sekwencje nie ulegające translacji. Figury 4A - 4C (SEQ ID NO: 23) pokazują sekwencję fragmentu PCR o wielkości około 4,7 kilopar zasad pokazanego na fig. 1 pochodzącą z klonu 2-B6 parwowirusa B19. Sekwencja jest fragmentem o wielkości 4677 nukleotydów i odpowiada pozycjom nukleotydowym opisanym w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: Pokazane sekwencje obejmują pełnej długości ramkę odczytu parwowirusa B19, która koduje NS1, VP1 i VP2, oraz dodatkowe 5' i 3' sekwencje nie ulegające translacji. Figury 5A (SEQ ED NO:24) i 5B (SEQ ED NO:25) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową NS1 klonu 2-B1 parwowirusa B19 Figury 6A (SEQ ID NO: 26) i 6B (SEQ ID NO: 27) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP1 klonu 2-B1 parwowirusa B19. Figury 7A (SEQ ID NO: 28) i 7B (SEQ ID NO: 29) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP2 klonu 2-B1 parwowirusa B19. Figury 8A (SEQ ED NO: 30) i 8B (SEQ ED NO: 31) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową NS1 klonu 2-B6 parwowirusa B19. Figury 6A (SEQ ID NO: 32) i 6B (SEQ ID NO: 33) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP1 klonu 2-B6 parwowirusa B19. Figury 7A (SEQ ID NO: 34) i 7B (SEQ ID NO: 35) pokazują odpowiednio sekwencję nukleotydową i proteinową VP2 klonu 2-B6 parwowirusa B19. Figury 11A do 11Z (SEQ ID NO: 62-87) pokazują sekwencje DNA różnych izolatów parwowirusa B19, które obejmują odpowiadające pozycjom nukleotydowym genomu parwowirusa B19 opisanego w Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: (fragment o wielkości 700 par zasad pokazany na fig. 1). Figura 11A (SEQ ID NO:62) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH80-1; fig. 11B (SEQ ID NO:63) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu CH81-3; fig. 11C (SEQ ID NO:64) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCLI-4; fig. 11D (SEQ ID NO:65) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL2-1; fig. 11E (SEQ ID NO:66) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL3-1; fig. 11F (SEQ ID NO:67) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL4-3; fig. 11G (SEQ ID NO:68) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL5-2; fig. 11H (SEQ ID NO:69) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL6-2; fig. 11I (SEQ ID NO:70) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL7-3; fig. 11J (SEQ ID NO:71) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL8-2; fig. 11K (SEQ ID NO:72) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL9-1; fig. 11L (SEQ ID NO:73) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL9-9; fig. 11M (SEQ ID NO:74) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL10-2; fig. 11N (SEQ ID NO:75) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL11-1; fig. 11O (SEQ ID NO:76) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL12-1; fig. 11P (SEQ ID NO:77) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SGL13-3; fig. 11Q (SEQ ID NO:78) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL14-1; fig. 11R (SEQ ID NO:79) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL15-3; fig. 11S (SEQ ID NO:80) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL16-2; fig. 11T (SEQ ID NO:81) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL17-1; fig. 11U (SEQ ID NO:82) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL18-1; fig. 11V (SEQ ID NO:83) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL19-1; fig. 11W (SEQ ID NO:84) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL20-3; fig. 11X (SEQ ID NO:85) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL21-3; fig. 11Y (SEQ ID NO:86) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL22-11; fig. 11Z (SEQ ID NO:87) pokazuje odpowiednią sekwencję z izolatu B19SCL2-14. Figura 12 (SEQ ID NO:92) pokazuje przykładową sekwencję, z której można otrzymać kontrolę wewnętrzną (IC) do wychwytu sekwencji docelowych i ich namnażania. Szczegółowy opis sposobu według wynalazku W praktycznym wykonaniu sposobu według wynalazku wykorzystuje się, jeśli nie wyszczególniono inaczej, tradycyjne metody chemiczne, biochemiczne, techniki rekombinacji DNA i wirologii, znane biegłym w sztuce. Techniki takie wyjaśnione są całkowicie w literaturze. Patrz, na przykład. Fundamental Virology, Wydanie 2, Tom I i II (edytorzy B.N. Fields i D.M. Knipe); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., ostatnie wydanie); Sambrook i wsp.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Wydanie 2, 1989); Methods In Enzymology (edytorzy S. Colowick i N. Kaplan, Academic

8 8 PL B1 Press, Inc.); Oligonukleotyd Synthesis (edytor N. Gait, 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984). W tym tekście używa się następujących skrótów aminokwasów. Alanina: Ala (A) Arginina: Arg Asparagina: Asn (N) Kwas asparaginowy: Asp (D) Cysteina: Cys (C) Glutamina: Gln (Q) Kwas glutaminowy: Glu (E) Glicyna: Gly (G) Histydyna: His (H) Izoleucyna: Ile (I) Leucyna: Leu (L) Lizyna: Lys (K) Metionina: Met (M) Fenyloalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Seryna: Ser (S) Treonina: Thr (T) Tryptofan: Trp (W) Tyrozyna: Tyr (Y) Walina: Val (V) 1. Definicje W opisie sposobu według wynalazku użyto następujących terminów, których definicje są podane poniżej. Terminy "polipeptyd", "proteina" i "białko" oznaczają polimer reszt aminokwasowych i nie są ograniczone przez minimalną wielkość produktu. Definicja ta obejmuje peptydy, oligopeptydy, dimery, multimery. Definicja ta obejmuje zarówno białka pełnej długości jak i ich fragmenty. Termin obejmuje także modyfikacje polipeptydu po jego ekspresji, na przykład, glikozylację, acetylację, fosforylację. Ponadto, do celów sposobu według wynalazku termin "polipeptyd" oznacza białko, które w stosunku do sekwencji natywnej posiada modyfikacje, takie jak delecje, addycje lub podstawienia (w naturze przeważnie konserwowane), tak długo jak białko takie zachowuje pożądaną aktywność. Takie modyfikacje można robić umyślnie, na przykład metodą mutagenezy ukierunkowanej miejscowo, lub przypadkowo, na przykład w wyniku mutacji szczepu gospodarza wytwarzającego białko lub błędów w czasie amplifikacji metodą PCR. Polipeptyd parwowirusa B19 jest polipeptydem, tak jak zdefiniowano powyżej, pochodzącym od białka kodowanego przez genom B19, takiego jak białka niestrukturalne, NS1 i NS2, a także od białek tworzących kapsyd wirusa, VP1 (około 781 aminokwasów długości) lub VP2 (około 554 aminokwasów długości). Reprezentatywne sekwencje NS1, VP1 i VP2 pokazane są na fig Polipeptyd nie musi fizycznie pochodzić z parwowirusa B19, ale może być stworzony syntetycznie lub metodami rekombinacji. Ponadto, polipeptyd może pochodzić z każdego z różnych szczepów i izolatów parwowirusa B19. Wśród tych szczepów i izolatów znanych jest kilka konserwowanych i zmiennych regionów i jeżeli porównuje się dwie sekwencje, sekwencje aminokwasowe, na przykład epitopów, pochodzących z tych regionów wykazują one duży stopień homologii sekwencji, na przykład homologię sekwencji aminokwasowej większą niż 30%, korzystnie większą niż 40%. Tak więc, na przykład polipeptyd określony terminem "VP1" oznacza natywną formę VP1 każdego z różnych szczepów i izolatów parwowirusa B19. Kompletne genotypy i sekwencje powyższych protein wielu szczepów i izolatów parwowirusa B19 są znane. Patrz, na przykład. Shade i wsp., J. Virol. (1986) 58: ; Gallinella i wsp., J. Virol. Methods (1993) 41: Ponadto, znane są także epitopy pochodzące z tych regionów parwowirusa B19. Patrz, na przykład. Dokument Patentowy Stanów Zjednoczonych Nr ; i Międzynarodowa Publikacja Patentowa Nr WO 91/ Termin "analog" i "muteina" oznacza biologicznie aktywne pochodne cząsteczki odniesienia, lub fragmenty takich pochodnych, które zachowują pożądaną aktywność, taką jak immunoreaktywność w testach diagnostycznych. Ogólnie, termin "analog" oznacza związek mający sekwencję i strukturę natywnego polipeptydu i mający w stosunku do natywnej cząsteczki jeden lub dwa aminokwasy dodane, podstawione (w naturze przeważnie konserwowane) i/lub usunięte, tak długo jak modyfikacje takie nie zniszczą jej aktywności immunogenicznej. Termin "muteina" oznacza peptydy, które mają jednego lub więcej peptydowych naśladowców ("peptoidy"), takie jak te opisane w Międzynarodowej Publikacji Patentowej Nr WO 91/ Korzystnie, analogi lub muteiny mają przynajmniej taką samą aktywność immunologiczną, jak natywne cząsteczki. Metody wytwarzania analogów polipeptydów i mutein są znane w sztuce i opisane poniżej. Szczególnie korzystne analogi obejmują podstawienia o charakterze konserwatywnym, to znaczy takie podstawienia, które zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów o zbliżonych łańcuchach bocznych. Szczegółowo, aminokwasy podzielone są na cztery rodziny: (1) kwasowe - asparaginian i glutaminian; (2) zasadowe - lizyna, arginina, histydyna; (3) niepolarne - alanina, walina, leucyna,

9 PL B1 9 izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan; i (4) nienaładowane polarne - glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalanina, tryptofan i tyrozyna są czasami klasyfikowane jako aminokwasy aromatyczne. Na przykład, można zasadnie przewidywać, że pojedyncze zastąpienie leucyny przez izoleucynę lub walinę, asparaginianu przez glutaminian, treoniny przez serynę lub podobne konserwatywne podstawienia aminokwasów przez strukturalnie zbliżone aminokwasy, nie będą miały wielkiego wpływu na aktywność biologiczną. Na przykład, interesujący polipeptyd może zawierać do około 5-10 konserwatywnych i niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych, lub nawet do około konserwatywnych i niekonserwatywnych podstawień aminokwasowych, lub każdą całkowitą pomiędzy 5-25, tak długo jak nienaruszona pozostaje pożądana funkcja cząsteczki. Biegli w sztuce łatwo mogą określić regiony interesującej cząsteczki, które tolerują zmiany poprzez odniesienie do dobrze znanych w sztuce rysunków Hopp/Woodsa i Kyte-Doolittle'a. "Wyizolowany" oznacza, w odniesieniu do polipeptydu, że wskazana cząsteczka jest wydzielona i oddzielona od całego organizmu, w którym znajduje się w naturze, lub występuje bez innych biologicznych makrocząsteczek tego samego typu. Termin "wyizolowany" w odniesieniu do polinukleotydu oznacza pochodną cząsteczki kwasu nukleinowego w całości lub część sekwencji normalnie powiązanych z nią w naturze lub sekwencję, która istnieje w naturze, ale ma heterogenne sekwencje ze sobą powiązane, lub cząsteczkę wydzieloną z chromosomu. Polinukleotyd "pochodzący od" lub "specyficzny dla" określonej sekwencji oznacza sekwencję polinukleotydową zawierającą ciągłą sekwencję o wielkości przynajmniej 6 nukleotydów, korzystnie o wielkości przynajmniej 8 nukleotydów, bardziej korzystnie o wielkości przynajmniej nukleotydów, jeszcze bardziej korzystnie o wielkości przynajmniej nukleotydów, odpowiadającą, to znaczy identyczną lub komplementarną do, regionowi określonej sekwencji polinukleotydowej. Polinukleotyd pochodzący od niej musi koniecznie fizycznie pochodzić od interesującej sekwencji nukleotydowej, ale można go wytworzyć każdym sposobem, włączając, ale bez ograniczania, syntezę chemiczną, replikację, odwrotną transkrypcję lub transkrypcję, które są oparte na informacji dostarczonej przez sekwencję zasad regionu, z którego pochodzi ten polinukleotyd. Może więc reprezentować orientację sensowną i antysensowną oryginalnego polinukleotydu. "Homología" oznacza procent podobieństwa pomiędzy dwoma polinukleotydami lub dwoma domenami polipeptydów. Dwa DNA lub dwie sekwencje polipeptydowe są "znacząco homologiczne" jedna do drugiej, jeżeli sekwencje takie wykazują przynajmniej około 50%, korzystnie przynajmniej około 75%, bardziej korzystnie przynajmniej około 80%-85%, korzystnie przynajmniej około 90%, i najbardziej korzystnie przynajmniej około 95%-98% podobieństwa sekwencji w obrębie zdefiniowanej długości cząsteczki. Użyty tu termin, znacząco homologiczne oznacza także sekwencje wykazujące całkowitą identyczność z określonym DNA lub sekwencją polipeptydową. Ogólnie, "identyczny" odnosi się dokładnie do relacji nukleotyd do nukleotydu lub aminokwas do aminokwasu w odniesieniu odpowiednio do sekwencji dwóch polinukleotydów lub polipeptydów. Procent identyczności określa się przez bezpośrednie porównanie informacji niesionych przez sekwencje obu cząsteczek przez dopasowanie sekwencji, policzenie dokładnej liczby tożsamości pomiędzy obydwoma dopasowanymi sekwencjami, podzielenie przez długość krótszej sekwencji i pomnożenie wyniku przez 100. Do analizy homologii i identyczności można użyć łatwo dostępnych programów komputerowych, takich jak ALIGN, Dayhoff, M.O. w Atlas of Protein Sequence and Structure, edytor M.O. Dayhoff., 5 Suplement 3: , National Biomedical Research Foundation, Washington, DC, w którym wykorzystano algorytm do wyznaczania homologii miejscowej autorstwa Smitha i Watermana Advances in Appl. Math. 2: , 1981 dla analizy peptydów. Programy umożliwiające określenie homologii sekwencji nukleotydowych dostępne są na przykład, jako Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 8 (dostępne od Genetics Computer Group, Madison, WI), programy BESTFIT, FASTA i GAP, które także wykorzystują algorytm Smitha i Watermana. Programów tych używa się bez problemów z wejściowymi nastawami parametrów zalecanymi przez producenta tak jak opisano we wspomnianym powyżej Wisconsin Sequence Analysis Package. Na przykład, procent homologii określonej sekwencji nukleotydowej w stosunku do sekwencji odniesienia określa się używając algorytmu homologii Smitha i Watermana z wejściową tablicą wyników i karą za przerwę w sześciu pozycjach nukleotydowych. Inną metodą określenia procentu homologii w kontekście sposobu według wynalazku jest użycie pakietu oprogramowania MPSRCH, do którego prawa autorskie ma Uniwersytet w Edynburgu,

10 10 PL B1 opracowanego przez Johna F. Collins i Shane S. Sturrok, i rozprowadzanego przez IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Ten pakiet oprogramowania umożliwia użycie algorytmu Smitha-Watermana z wejściowymi nastawami parametrów dla tablicy wyników (na przykład, kara za otwartą przerwę 12, kara za rozszerzoną przerwę jeden i przerwa wielkości sześć). Wśród otrzymanych wyników wartość "Match" oznacza "homologię sekwencji". Inne odpowiednie programy do obliczania procentu identyczności lub podobieństwa pomiędzy sekwencjami są dobrze znane w sztuce, na przykład, innym programem do dopasowywania sekwencji jest BLAST, używany z wejściowymi nastawami parametrów. Na przykład, programów BLASTN i BLASTP można używać stosując następujące wejściowe nastawy parametrów: kod genetyczny = standardowy; filtr = brak; łańcuch = oba; odcięcie = 60; spodziewane = 10; Matryca = BLOSUM62; Opis = 50 sekwencji; sortuj według = HIGH SCORE; Bazy danych = bez redundancji, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Szczegóły o tych programach można znaleźć pod następującym adresem internetowym: Ewentualnie, homologię można określić przez hybrydyzację polinukleotydów w warunkach, w których tworzą się stabilne dupleksy pomiędzy regionami homologii, a następnie trawienie nukleazą specyficzną do jednoniciowego kwasu nukleinowego, i określenie wielkości otrzymanych fragmentów. Sekwencje DNA wykazujące znaczącą homologię można zidentyfikować metodą hybrydyzacji Southerna, na przykład w ostrych warunkach, określonych dla konkretnych systemów. Biegli w sztuce mogą określić odpowiednie warunki hybrydyzacji. Patrz, na przykład, Sambrook i wsp., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. "Funkcjonalnie połączony" oznacza położenie elementów, znamienne tym, że opisane tak składniki są tak położone, że wypełniają swoje funkcje. Jeżeli określony promotor jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kwasu nukleinowego wpływa na transkrypcję, a w przypadku sekwencji kodującej, na ekspresję kodowanej sekwencji, jeżeli obecne są odpowiednie czynniki transkrypcyjne. Promotor nie musi przylegać do sekwencji kwasu nukleinowego, jeżeli zachowana jest jego zdolność do prowadzenia jej transkrypcji i/lub ekspresji. Sekwencja promotora wciąż uważana jest za "funkcjonalnie połączoną " z sekwencją kodującą, jeżeli pomiędzy sekwencją promotora i sekwencją kodującą występują, na przykład, rozdzielające sekwencje transkrybowane, ale nie ulegające translacji, a także transkrybowane introny. Użyty tu termin "rekombinowany" w odniesieniu do cząsteczki kwasu nukleinowego oznacza polinukleotyd genomowego DNA, cdna, wirusowego, półsyntetycznego lub syntetycznego pochodzenia który, w wyniku swojego pochodzenia lub obróbki nie jest związany z całym lub częścią polinukleotydu, z którym związany jest w naturze. Termin "rekombinowany" użyty w odniesieniu do proteiny lub polipeptydu oznacza polipeptyd wytworzony przez ekspresję rekombinowanego polinukleotydu. Ogólnie, interesujący gen klonuje się i eksprymuje w transformowanych organizmach, tak jak opisano poniżej. Organizm gospodarza eksprymuje obcy gen i wytwarza białko w warunkach odpowiednich do ekspresji. Termin "element kontrolny" oznacza sekwencję polinukleotydową, która wspomaga transkrypcję i/lub translację sekwencji nukleotydowej, z którą jest połączona. Termin obejmuje promotory, sekwencje terminacji transkrypcji, domeny regulatorowe powyżej sekwencji kodowanej, sygnały poliadenylacji, regiony nie ulegające translacji, włączając 5'-UTR i 3'-UTR u, i w odpowiednich przypadkach sekwencje wiodące i wzmacniające. Takie sekwencje razem zapewniają transkrypcję i translację sekwencji kodującej w komórkach gospodarza. Użyty tu termin promotor" oznacza region regulatorowy zdolny do wiązania polimerazy i rozpoczynania transkrypcji położonej poniżej (w kierunku 3') i funkcjonalnie z nim połączonej sekwencji nukleotydowej. Do celów sposobu według wynalazku sekwencja promotora obejmuje minimalną liczbę zasad lub elementów koniecznych do zapoczątkowania transkrypcji interesującej sekwencji na wykrywalnym poziomie powyżej tła. W obrębie sekwencji promotorowej znajduje się miejsce początku transkrypcji, a także domeny wiążące białka (sekwencje uzgodnione) odpowiedzialne za wiązanie polimerazy RNA lub DNA. Na przykład, promotorem może być sekwencja kwasu nukleinowego, która jest rozpoznawana przez zależną od DNA polimerazę RNA ("transkryptazę") jako sygnał do wiązania się z kwasem nukleinowym i rozpoczęcia w specyficznym miejscu transkrypcji RNA. Z reguły takie transkryptazy do wiązania wymagają DNA, który jest dwuniciowy w części zawierającej sekwencję promotorową i jej składniki; część matrycowa (sekwencja, która ma być transkrybowana) nie musi być dwuniciowa. Pojedyncza zależna od DNA polimeraza RNA rozpoznaje różne sekwencje promotorowe, które mogą się znacznie różnić wydajnością wspomagania transkrypcji. Kiedy polimeraza RNA wiąże

11 PL B1 11 się z sekwencją promotorową żeby rozpocząć transkrypcję, taka sekwencja promotorowa nie jest częścią transkrybowanej sekwencji. Wytworzony transkrypt RNA nie zawiera więc tej sekwencji. Sekwencja kontrolna "kieruje transkrypcją" sekwencji nukleotydowej, kiedy polimeraza RNA lub DNA zwiąże się z sekwencją promotorową i transkrybuje sąsiednią sekwencję. "Zależna od DNA polimeraza DNA" jest enzymem, który syntetyzuje komplementarną kopię DNA matrycy DNA. Przykładem są polimeraza I DNA E. coli i polimeraza DNA bakteriofaga T7. Wszystkie znane zależne od DNA polimerazy DNA wymagają komplementarnego startera do rozpoczęcia syntezy. W odpowiednich warunkach, zależna od DNA polimeraza DNA syntetyzuje także komplementarną kopię DNA matrycy RNA. " Zależna od DNA polimeraza RNA " lub "transkryptaza" jest enzymem, który syntetyzuje wiele kopi RNA z dwuniciowej lub częściowo dwuniciowej cząsteczki DNA mającej (z reguły dwuniciową) sekwencję promotorową. Synteza cząsteczek RNA ("transkryptów") rozpoczyna się od specyficznego miejsca poniżej promiotora i zachodzi w kierunku 5' do 3'. Przykładem transkryptazy są zależna od DNA polimeraza RNA E. coli i zależna od DNA polimeraza RNA bakteriofagów T7, T3 i SP6. "Zależna od RNA polimeraza DNA" lub "odwrotna transkryptaza" jest enzymem, który syntetyzuje komplementarną kopię DNA matrycy RNA. Wszystkie znane odwrotne transkryptazy mają także zdolność tworzenia komplementarnych kopii DNA na matrycy DNA; są więc one polimerazami DNA zależnymi zarówno od RNA jak i od DNA. Do rozpoczęcia syntezy na matrycy RNA i DNA niezbędny jest starter. "RNAza H" jest enzymem, który degraduje RNA w dupleksach RNA:DNA. Takie enzymy mogą być endonukleazami lub egzonukleazami. Większość odwrotnych transkryptaz, oprócz swojej aktywności polimerazowej, zwykle posiada aktywność RNAzy H. Jednakże dostępne są także inne źródła RNAzy H, która nie posiada aktywności polimerazowej. Degradacja powoduje oddzielenie RNA z dupleksów RNA:DNA. Ewentualnie, RNAza H może po prostu przecinać RNA w różnych miejscach, takich jak część RNA stopionego lub pozwalać enzymom rozwijać część RNA. Użyte tu terminy "polinukleotyd", "oligonukleotyd", "kwas nukleinowy" i "cząsteczka kwasu nukleinowego " obejmują polimeryczne formy nukleotydów każdej długości, zarówno rybonukleotydów jak i deoksyrybonukleotydów. Termin ten odnosi się tylko do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Termin ten obejmuje trzy-, dwu- i jednoniciowy DNA, a także trzy-, dwu- i jednoniciowy RNA. Termin ten obejmuje formy niezmodyfikowane polinukleotydu, a także modyfikacje, takie jak metylacja i/lub kap polinukleotydu. Bardziej szczegółowo, terminy "polinukleotyd", "oligonukleotyd", "kwas nukleinowy" i "cząsteczka kwasu nukleinowego" obejmuje polideoksyrybonukleotydy (zawierające 2-deoksy-D- -rybozę), polirybonukleotydy (zawierające D-rybozę), i inne typy polinukleotydów, takie jak N- lub C-glikozydy zasad purynowych lub pirymidynowych, i inne polimery zawierające szkielet nienukleotydowy, na przykład, polimery poliamidowe (na przykład, peptydowe kwasy nukleinowe (PNA)) i polimery polimorfolinowe (dostępne w handlu od Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregon, jako Neugene), i inne syntetyczne sekwencje polimerów kwasów nukleinowych, pod warunkiem, że polimery takie zawierają zasady nukleinowe w konfiguracji, która pozwala na parowanie zasad i oddziaływania warstwowe zasad, takie jak te, które stwierdza się w DNA i RNA. Nie zamierza się stosować żadnego rozróżnienia długości pomiędzy terminami polinukleotyd", "oligonukleotyd", "kwas nukleinowy" i "cząsteczka kwasu nukleinowego" i terminy te używane są wymiennie. Terminy te odnoszą się tylko do pierwszorzędowej struktury cząsteczki. Terminy te obejmują na przykład, 3'-deoksy-2', 5'-DNA, N3' P5' fosforynoamidy oligodeoksyrybonukleotydów, 2'-O-alkilo-podstawiony RNA, dwu i jednoniciowy DNA, taki jak także dwu- i jednoniciowy RNA, hybrydy DNA:RNA, hybryd pomiędzy PNA i DNA lub RNA. Terminy te obejmują także znane typy modyfikacji, na przykład znane w sztuce znaczniki, metylację, kapy", podstawienie jednego lub więcej występujących w naturze nukleotydów przez analogi, modyfikacje internukleotydowe, takie jak na przykład modyfikacje w postaci połączeń bez ładunku (na przykład, metylofosfonaty, fosfotriestery, fosforynoamidy, karbaminiany), w postaci połączeń naładowanych ujemnie (na przykład, fosforotionaty, fosforoditionaty), i w postaci połączeń naładowanych dodatnio (aminoalkilofosforynoamidy, aminoalkilofosfotriestery), oraz w postaci połączeń, które zawierają grupy boczne, takie jak na przykład, białka (włączając nukleazy, toksyny, przeciwciała, peptydy sygnałowe, poli-l-lizynę), takie, które zawierają interkalatory (na przykład, akrydynę, psoralen), takie, które zawierają chelatory (na przykład, metale radioaktywne metale, bor, metale utleniające), takie, które zawierają związki alkilujące, takie, które mają zmodyfikowane połączenia (na przykład, alfa anomeryczne kwasy nukleinowe), takie jak także niezmodyfikowane formy polinukleotydów lub oligonukleotydów. Szczególnie, DNA jest kwasem deoksyrybonukleinowym.

12 12 PL B1 Użyty tu termin "docelowy region kwasu nukleinowego" lub "docelowy kwas nukleinowy" oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą "docelową sekwencję", która ma być namnożona. Docelowy kwas nukleinowy może być zarówno jednoniciowy jak i dwuniciowy i może zawierać obok sekwencji docelowej także inne sekwencje, które nie muszą ulegać amplifikacji. Termin "sekwencja docelowa" oznacza określoną sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego, która ma być namnożona. Sekwencja docelowa może obejmować region hybrydyzujący z sondą, zawarty w cząsteczce docelowej, z którym sonda tworzy w odpowiednich warunkach stabilną hybrydę. "Sekwencja docelowa" może także obejmować sekwencje kompleksujące, z którymi łączą się startery oligonukleotydowe i mogą być wydłużane przy użyciu sekwencji docelowej jako matrycy. Jeżeli docelowy kwas nukleinowy jest oryginalnie jednoniciowy termin "sekwencja docelowa" odnosi się także do sekwencji komplementarnej do "sekwencji docelowej", takiej jak obecna w docelowym kwasie nukleinowym. Jeżeli "docelowy kwas nukleinowy" jest oryginalnie dwuniciowy termin "sekwencja docelowa" odnosi się zarówno do nici plus (+) i minus (-). Użyty tu termin "primer" lub starter" lub "oligonukleotyd starterowy" oznacza oligonukleotyd, którego działanie polega na rozpoczęciu syntezy komplementarnej nici DNA, jeżeli znajduje się w warunkach, w których może zachodzić synteza produktów wydłużania startera, to znaczy w obecności nukleotydów i związków wywołujących polimeryzację, takich jak polimeraza DNA lub RNA i odpowiednia temperatura, ph, stężenie jonów metalu, i stężenie soli. Dla osiągnięcia maksymalnej wydajności sposobem według wynalazku starter korzystnie jest jednoniciowy, ale ewentualnie może być dwuniciowy. Jeżeli starter jest dwuniciowy, starter taki najpierw traktuje się tak, żeby rozdzielić jego nici, tak jak potem używa się go do otrzymania produktów wydłużania. Taki etap denaturacji typowo osiąga się przez traktowanie ciepłem, ale ewentualnie można zastosować zasadę, i późniejszą neutralizację. "Starter" jest komplementarny do matrycy, i tworzy kompleksy dzięki wiązaniom wodorowym lub hybrydyzuje z matrycą tworząc kompleks starter/matryca, który rozpoczyna syntezę przez polimerazę, tak jak proces syntezy DNA rozprzestrzenia się przez dodawanie związanych kowalencyjnie zasad połączonych poprzez ich 3' końce komplementarnie do matrycy. Użyty tu termin "sonda" lub " sonda oligonukleotydowa" oznacza strukturę zawierającą polinukleotyd, taki jak zdefiniowano powyżej, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego komplementarną do sekwencji kwasu nukleinowego, obecnej w analizowanym docelowym kwasie nukleinowym. Regiony polinukleotydowe sond mogą być DNA i/lub RNA, i/lub syntetycznymi analogami nukleotydów. Jeżeli sonda nukleotydowa ma być użyta w teście 5' nukleazy, takim jak technika Taq-Man, sonda powinna zawierać przynajmniej jeden związek fluorescencyjny i przynajmniej jeden związek gaszący. Który jest trawiony przez aktywność 5' endonukleazową polimerazy użytej w reakcji, w celu wykrycia jakiejkolwiek namnożonej docelowej sekwencji oligonukleotydowej. W tym kontekście sonda oligonukleotydowa ma wystarczającą liczbę wiązań fosfodiestrowych przylegających do jej 5' końca, żeby zastosowana aktywność 5' do 3' nukleazy mogła wydajnie zdegradować związaną sondę do pojedynczych barwników fluorescencyjnych i wygaszaczy. Jeżeli sonda oligonukleotydowa używana jest zgodna z techniką TMA, należy ją odpowiednio wyznakować, tak jak jest to opisane poniżej. Przyjmuje się, że hybrydyzujące sekwencje nie muszą wykazywać całkowitej komplementarności, żeby tworzyć stabilne hybrydy. W wielu przypadkach, stabilne hybrydy tworzą się jeżeli mniej niż 10% zasad jest błędnie sparowanych, ignorując pętle wielkości czterech lub więcej nukleotydów. Użyty tu termin "komplementarny" oznacza, że oligonukleotyd tworzy stabilny dupleks ze swoim "odpowiednikiem w warunkach testowych, ogólnie jeżeli występuje około 90% lub więcej homologii. Terminy "hybrydyzuje" i "hybrydyzacja" oznacza tworzenie kompleksów pomiędzy sekwencjami nukleotydowymi, które są wystarczająco komplementarne, żeby tworzyć kompleksy, według zasad parowania zasad podanych przez Watsona i Cricka. Jeżeli primer "hybrydyzuje" z sekwencją docelową (matrycą), takie kompleksy (lub hybrydy) są wystarczająco stabilne, żeby pełnić funkcję starterów wymaganą, na przykład do rozpoczęcia syntezy DNA przez polimerazę DNA. Użyty tu termin "para wiążąca " oznacza pierwszą i drugą cząsteczkę, które specyficznie wiążą się ze sobą, tak jak komplementarne pary polinukleotydów zdolne do tworzenia dupleksów kwasów nukleinowych. "Specyficzne wiązanie " pierwszego składnika pary wiążącej z drugim składnikiem pary wiążącej w próbce jest uwidocznione przez wiązanie pierwszego składnika z drugim składnikiem, lub odwrotnie, z większym powinowactwem i specyficznością niż z innymi składnikami próbki. Wiązanie pomiędzy składnikami pary wiążącej typowo jest niekowalencyjne. Jeżeli nie wynika inaczej z kontekstu, użyte tu terminy cząsteczka powinowata" i "cząsteczka docelowa" odnoszą się odpowiednio, do pierwszego i drugiego składnika pary wiążącej.