(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/GB00/00248 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: ,PCT/GB00/00248 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO00/44918 PCT Gazette nr 31/00 (51) Int.Cl. C12N 15/82 ( ) C07K 14/415 ( ) C12Q 1/68 ( ) C12N 1/20 ( ) A01H 5/00 ( ) C07K 16/16 ( ) (54) Wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2, para starterów, sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego, sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN2, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób transformowania komórki gospodarza, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, część lub rozmnóżka rośliny, wyizolowany polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu oraz sposób zaburzania właściwości fizycznych roślin (30) Pierwszeństwo: ,GB, (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 16/02 (73) Uprawniony z patentu: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, Inc.,Johnston,US (72) Twórca(y) wynalazku: Caroline Dean,Norwich,GB Anthony Gendall,Norwich,GB (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/09 (74) Pełnomocnik: Danuta Stefani-Iwanow, Jan Wierzchoń & Partnerzy, Biuro Patentów i Znaków Towarowych S.c. (57) Wynalazek dotyczy wyizolowanego kwasu nukleinowego, uzyskanego z locus VRN2 rośliny, który koduje polipeptyd zdolny do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny, do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, gdzie właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich, jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia, jego alleli, fragmentów i pochodnych, polipeptydów kodowanych przez takie kwasy nukleinowe, przeciwciał do tych peptydów. PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2, para starterów, sposób wytwarzania kwasu nukleinowego, sposób identyfikowania, klonowania lub określania w genetycznie zmienionej roślinie obecności kwasu nukleinowego, sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN2, zrekombinowany wektor, komórka gospodarza, sposób transformowania komórki gospodarza, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, roślina transgeniczna, część lub rozmnóżka rośliny, wyizolowany polipeptyd, sposób wytwarzania polipeptydu oraz sposób zaburzania właściwości fizycznych rośliny. Wynalazek odnosi się zasadniczo do modyfikacji właściwości roślin, w szczególności odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liści i/lub odpowiedzi unikania cienia i powstał na bazie klonowania genu VRN2 oraz zmutowanych alleli z Arabidopsis thaliana, a także dzięki identyfikacji homologów w innych gatunkach. Wynalazek dostarcza możliwości manipulowania czasem kwitnienia i/lub innymi właściwościami roślin, np. dzięki zwiększonej i obniżonej regulacji ekspresji genu VRN2. Dostarcza także szerszego zakresu modyfikacji zmiany stosownej cechy rośliny dzięki zastosowaniu alleli genu, mutantów i wariantów. Rośliny muszą odpowiadać w sposób zintegrowany na szeroki zakres sygnałów ze środowiska w celu maksymalizacji sukcesu reprodukcji. Część spośród sposobów integracji musi wymagać percepcji pór roku, zarówno dla zapewnienia powstawania kwiatów podczas prawidłowej pory (do której jest zaadoptowany) oraz dla synchronizowania swojego kwitnienia z innymi przedstawicielami swojego gatunku, w celu szansy zapłodnienia krzyżowego. Arabidopsis thaliana stanowi dobry model roślinny, ze względu na to, ze wykazuje odpowiedzi na szeroki zakres bodźców środowiskowych, które obserwuje się u wielu gatunków. Kwitnienie u naturalnie występujących szczepów (ekotypów) Arabidopsis może być wywoływane zarówno długim dniem (zwiększony fotoperiod) lub wernalizacją, długie działanie niskiej temperatury przypominające chłody zimy. Podczas gdy zrozumiałe są liczne aspekty odpowiedzi na fotoperiod stosunkowo mniej wiadomo o drogach wernalizacji. Twórcy wynalazku użyli mutanta Arabidopsis o późnym kwitnieniu i odpowiedzi na wernalizację, mutant fca, jako tła do izolowania mutantów wykazujących zredukowaną odpowiedź na wernalizację, mutantów VRN. Wernalizacją jest procesem pobudzania kwitnienia przez niską temperaturę. Może także być uważana w aspekcie zimna sezonu zimowego, który obejmuje także zredukowaną długość dnia. Wiele gatunków roślin, które rosną w niższej temperaturze lub chłodnych klimatach charakteryzują się obligatoryjnym wymaganiem wernalizacji w celu uzyskania kwiatów. Rośliny takie zazwyczaj kiełkują jesienią, przechodzą zimę jako wegetatywne rośliny i kwitną w łagodnych warunkach wiosny. Wernalizacją działa zatem jako sygnał pozwalający roślinom na rozpoznawanie sezonów i określenie czasu kwitnienia dla zmaksymalizowania szansy sukcesu reprodukcyjnego. Gatunków, dla których kwitnienie jest istotne dla produkcji ziarna jest dużo, zasadniczo wszystkie zboża rosnące z nasion, wśród których ważnymi przykładami zbóż są jęczmień, ryż i kukurydza, prawdopodobnie bardziej ważna rolniczo w strefach o cieplejszym klimacie, oraz pszenica, jęczmień, owies czy żyto w większości klimatów. Ważnymi produktami pochodzącymi z nasion są rzepak z oleistymi nasionami, burak cukrowy, kukurydza, słonecznik, soja czy sorgo. Plony zbierane z uwagi na korzenie, oczywiście które rosną corocznie z nasion i wytwarzają nasiona, są wielu rodzajów i zależą od zdolności rośliny do kwitnienia, zapylania i wydawania nasion. Kontrola czasu kwitnienia jest ważna w ogrodnictwie. Rośliny ogrodnicze, których kwitnienie można kontrolować obejmują sałatę, endywię i warzywa z krzyżowych jak kapusta, brokuły czy kalafior oraz goździki i pelargonie. Arabidopsis thaliana jest rośliną fakultatywnie długiego dnia, kwitnącą wcześnie przy długim dniu i późno przy krótkim dniu. Ze względu na to, że jest mała, ma dobrze scharakteryzowany genom, można ją z łatwością transformować i regenerować oraz posiada szybki cykl wzrostu, Arabidopsis jest idealną rośliną modelową do badania kwitnienia i jego kontroli. Dodatkowo oprócz sklonowania genu VRN2, twórcy wynalazku niespodziewanie odkryli, że VRN2 jest czynnikiem transkrypcyjnym, co tym samym otwiera szereg emocjonujących dróg zastosowania niniejszego wynalazku. Bez związania z teorią lub jakimkolwiek ograniczeniem zasięgu niniejszego wynalazku, VRN2 może być wymagany dla prawidłowej odpowiedzi na wernalizację ponieważ działa on jako regulator genów, które ostatecznie prowadzą do przejścia od wzrostu wegetatywnego do stadium reprodukcji. W modelu takim, zimno, lub cząsteczki wymagane w odbieraniu zimna mogą regulować aktywność lub ekspresję białka VRN2, które z kolei może regulować ekspresję większej

3 PL B1 3 liczby genów, co ostatecznie prowadzi do kwitnienia. Ponadto fenotyp odpowiedzi unikania cienia jaki wykazuje mutant vrn2-1, co zademonstrowano eksperymentalnie poniżej, dostarcza wskazówki, że VRN2 odgrywa także rolę w regulacji kształtu liścia, w szczególności w odpowiedzi na zwiększenie promieniowania w dalekiej podczerwieni. Razem te dwa procesy, na które ma wpływ niedobór lub ograniczenie aktywności VRN2, prowadzą do szeregu badań o aspekcie rolniczym. Po pierwsze, wymuszona ekspresja VRN2 (przykładowo pod kontrolą silnego promotora, takiego jak promotor CaMV35S) w dzikim tle może być użyta do zmiany wymagań wernalizacji rośliny przez kwitnieniem. Ponieważ duża liczba handlowych kultywarów szeregu gatunków, włączając (diploidalne) pszenicę, jęczmień czy buraka cukrowego wymaga wernalizacji do kwitnienia, modyfikacja tego wymagania, poprzez zredukowanie czasu trwania wymaganej wernalizacji lub zmianę optymalnej temperatury czy zniesienie obu wymagań jest przydatne rolniczo. Przykładowo, ozimina, którą można zasiać i pozostawić w ziemi przez okres krótszy niż zwykle (tzn. zredukowany czas wernalizacji) korzystnie może mieć zmniejszone ryzyko uszkodzenia związanego z warunkami ostrej pogody zimowej jako, że zboże jest eksponowane na zimowe warunki przez krótszy czas. Po drugie, można zastosować obniżenie regulacji ekspresji VRN2, przykładowo za pomocą użycia antysensownego cdna VRN2 w celu szybkiego zajścia odpowiedzi unikania cienia obserwowanego w mutantach vrn2-1. Można to użyć w sytuacjach, gdzie problemem jest stłoczenie zboża. W oparciu o dowody doświadczalne tu dostarczane dla fenotypu mutantów vrn2, spodziewane jest, że rośliny takie wykazują niższą odpowiedź na takie warunki i wytwarzają zasadniczo normalne liście tzn. takie jakby nie rosły w zagęszczeniu lub warunkach stłoczenia. Prawidłowym fenotypem unikania cienia jest redukcja wielkości liścia, która redukuje cień w warunkach zatłoczenia; mutanty vrn2-1, defektywne w wytwarzaniu VRN2, wykazują mniejsze zredukowanie rozmiaru liścia w warunkach, które normalnie prowadziłyby do fenotypu unikania cienia. Efekt ten może być powielany przykładowo poprzez użycie antysensownego cdna VRN2 dla obniżenia regulacji ekspresji VRN, uniemożliwiającej lub redukującej odpowiedź uchylania liści nawet w warunkach zatłoczenia. Po trzecie, można wykorzystywać poszczególne wyizolowane domeny biała VRN2. Domenę wiążącą DNA z palca cynkowego VRN2 można użyć do bezpośredniej lub kontrolowanej ekspresji genu w precyzyjny sposób. Palec cynkowy VRN2 może rozpoznawać specyficzne sekwencje DNA, które reprezentują elementy w promotorach ich normalnych genów docelowych. Przez stworzenie fuzji białkowej, obejmującej domenę wiążącą DNA (palec cynkowy) z VRN2 oraz domenę aktywująca lub reprymującą z białka heterologicznego można kontrolować ekspresję genów docelowych dla VRN2. Pozwala to na precyzyjną kontrolę ekspresji tych genów, które są normalnymi genami docelowymi dla VRN2. Mając takie geny, pojedyncze lub w kombinacji, można zastosować ostateczną kontrolę przejścia do kwitnienia (zazwyczaj po wernalizacji), ich bezpośredniej ekspresji w innych warunkach w celu wywołania zmian w kwitnieniu i/lub w jednej lub większej liczbie innych cech rośliny. Ekspresja (normalnie w odpowiedzi na daleką podczerwień) genów docelowych jest także kontrolowana dzięki użyciu fuzji białkowych z VRN2 zawierających palec cynkowy z VRN2. Ponadto, użycie domeny palca cynkowego z VRN2 w tradycyjnych eksperymentach typu SELEX czy one-hybrid" można zastosować dla ujawnienia genów docelowych czy sekwencji DNA normalnie wiązanych przez VRN2. Kwaśną domenę aktywującą z VRN2 można użyć do regulowania aktywności fuzji białkowej, obejmującej białko wiążące DNA o znanej specyficzności oraz domenę aktywującą z VRN2. Pozwala to na regulację genów docelowych dla innych białek wiążących DNA wymaganych do kwitnienia lub genów docelowych w całkowicie nie spokrewnionych procesach. Twórcy wynalazku sklonowali, scharakteryzowali i zmienili genetycznie gen VRN2 z Arabidopsis thaliana, zarówno typu Columbia jak Landsberg erecta, a także zidentyfikowali alternatywne składanie RNA oraz znaleźli formy zmutowane jak również homologiczne w innych gatunkach. Zgodnie z wynalazkiem wyizolowany kwas nukleinowy do modyfikacji cech roślin przy użyciu genu wernalizacji VRN2 jest to kwas nukleinowy o sekwencji, która ma co najmniej 70% sekwencji identycznej z pełnej długości sekwencją nukleotydową SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 i która to sekwencja jest zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny, do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia. Korzystnie sekwencja jest w co najmniej 80% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7, korzystniej jest w co najmniej 90% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6

4 4 PL B1 lub SEK ID NR: 7, a najkorzystniej sekwencja jest w co najmniej 95% identyczna z pełnej długości sekwencją SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7. Korzystnie kwas nukleinowy według wynalazku jest zdolny do redukcji wernalizacji rośliny wymaganej do kwitnienia i korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 2, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 1. Kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie obejmuje też sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 5, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 4 oraz korzystnie obejmuje sekwencję nukleotydową VRN2 kodującą polipeptyd o SEK ID NR: 8, która to sekwencja nukleotydową VRN2 składa się z SEK ID NR: 7. Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie też obejmuje sekwencję nukleotydową z SEK ID NR: 3 lub SEK ID NR: 6, a ponadto obejmuje sekwencję posiadającą promotor i/lub funkcję regulacyjną. Wyizolowany kwas nukleinowy według wynalazku korzystnie obejmuje wariant sekwencji homologiczny do wariantu sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7, przy czym wariant sekwencji jest sekwencją VRN2 uzyskaną z rośliny innego gatunku niż Arabidopsis thaliana. Korzystnie też obejmuje sekwencję komplementarną do sekwencji określonych powyżej. Zgodna z wynalazkiem jest para starterów, z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy mający jako sekwencję kodującą sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów. Zgodną z wynalazkiem jest również para starterów z których każdy zawiera wyizolowany kwas nukleinowy używany jako sonda lub starter, mający sekwencję, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, przy czym kwas nukleinowy ma długość 15 do 40 nukleotydów. Korzystnie każdy izolowany kwas nukleinowy w parze starterów według wynalazku ma długość 19 do 28 nukleotydów i korzystnie para starterów według wynalazku jest wybrana z sekwencji ATA TCC CGA GGC AAC AGA GCT TG i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G; TCT ACT GGG ATG TTT CGC AGC TTT C i AAG AGT GGG CTA TGG CTG G; oraz GCC AAT CGG TGT TTT CGC AGC TTT C i AAG AAT AAG TTA CAA TCC GAT AAA TCG G. Sposób wytwarzania kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że wytwarza się pochodną sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7 przez dokonanie jednej lub większej liczby addycji, insercji, delecji lub substytucji w sekwencji nukleotydowej i gdzie sekwencja pochodna jest albo zdolna do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest wprowadzony, przy czym właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia lub odpowiedź unikania cienia albo posiada promotor i/lub funkcję regulacyjną, przy czym sposób zawiera etap modyfikacji każdej z sekwencji nukleotydowej SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3, SEK ID NR: 4, SEK ID NR: 6 lub SEK ID NR: 7. Zgodnie z wynalazkiem sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego zdefiniowanego powyżej, charakteryzuje się tym, że przeszukuje się bazę danych przy użyciu sekwencji nukleotydowej sondy lub startera lub wykorzystuje się sondę lub starter, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych albo wykorzystuje się parę starterów według wynalazku zdefiniowaną powyżej. Korzystnie sposób identyfikowania, klonowania lub określania obecności w genetycznie zmienionej roślinie kwasu nukleinowego według wynalazku zdefiniowanego powyżej przeprowadza się następująco: (a) dostarcza się preparat kwasu nukleinowego z komórki roślinnej,

5 PL B1 5 (b) dostarcza się cząsteczkę kwasu nukleinowego, która jest sondą, lub dostarcza się parę starterów cząstek kwasu nukleinowego odpowiednich do PCR, przy czym sondą lub co najmniej jednym ze starterów w parze starterów jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych, (c) kontaktuje się kwas nukleinowy w preparacie z sondą w warunkach odpowiednich dla hybrydyzacji lub ze starterami w warunkach odpowiednich do przeprowadzenia reakcji PCR oraz (d) identyfikuje się kwas nukleinowy według wynalazku, o ile jest obecny, poprzez jego hybrydyzację z sondą kwasu nukleinowego lub przeprowadza się reakcję PCR i określa się obecność lub brak zamplifikowanego produktu PCR. W omówionym sposobie korzystnie stosuje się parę starterów kwasu nukleinowego według wynalazku, określoną powyżej. Według wynalazku sposób selekcjonowania rośliny posiadającej żądany allel genu VRN, charakteryzuje się tym, że wykorzystuje się sondę lub starter, przy czym sondą lub starterem jest starter izolowanego kwasu nukleinowego, który ma długość 15 do 40 nukleotydów i zawiera sekwencję, która (i) koduje sekwencję aminokwasową, która jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy sekwencją VRN2 z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 i co najmniej jedną z innych sekwencji przedstawionych na fig. 8a lub 8b lub (ii) jest częściowo, zasadniczo lub całkowicie konserwowana pomiędzy dwoma lub więcej sekwencjami nukleotydowymi VRN2 z SEK ID NR: 1, 3, 4, 6 albo 7 lub do nich komplementarnych lub wykorzystuje się parę starterów według wynalazku. Zrekombinowany wektor według wynalazku charakteryzuje się tym, że obejmuje kwas nukleinowy według wynalazku, określony powyżej. Korzystnie kwas nukleinowy objęty wektorem jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w przejściu ze wzrostu wegetatywnego do stadium reprodukcji i/lub jest zdolny do regulowania jednym lub większą liczbą genów wymaganych w określaniu wielkości liścia i/lub kształtu. Korzystnie kwas nukleinowy w wektorze jest funkcjonalnie połączony z promotorem do transkrypcji w komórce gospodarza, przy czym promotor jest ewentualnie promotorem indukowanym, a zwłaszcza jest promotorem konstytutywnym. Wektor według wynalazku jest korzystnie wektorem roślinnym. Komórka gospodarza według wynalazku jest to komórka, która jest stransformowana kwasem nukleinowym według wynalazku określonym powyżej, przy czym jest to kwas heterologiczny w komórce. Korzystnie komórka gospodarza według wynalazku jest komórką roślinną, ewentualnie obecną w roślinie. Według wynalazku sposób transformowania komórki gospodarza, charakteryzuje się tym, że do komórki gospodarza wprowadza się wektor według wynalazku, określony powyżej. Według wynalazku sposób wytwarzania rośliny transgenicznej polega na tym, że transformuje się komórkę gospodarza, poprzez wprowadzenie do tej komórki wektora według wynalazku, określonego powyżej i następnie ze stransformowanej komórki gospodarza regeneruje się roślinę. Roślina transgeniczna według wynalazku otrzymywana tym sposobem jest klonem lub skrzyżowaną wsobnie lub potomstwem hybrydowym lub innym potomkiem rośliny transgenicznej i w każdym przypadku zawiera komórkę roślinną według wynalazku. Roślina ta korzystnie jest rośliną rolniczą lub ogrodniczą i szczególnie korzystnie jest wyselekcjonowana z następujących roślin: ryż, kukurydza, pszenica, jęczmień, owies, żyto, rzepak z oleistymi nasionami, burak cukrowy, słonecznik, soja, sorgo, sałata, endywia, kapusta, brokuły, kalafior, goździk, pelargonia, tytoń, bawełna, rzepak, pomidor, mango, brzoskwinia, jabłko, gruszka, truskawka, banan, melon, marchew, cebula, groch, seler, a zwłaszcza z następujących: tytoń, rzepak z oleistymi nasionami, ryż i pszenica. Zgodna z wynalazkiem jest również część lub rozmnóżka rośliny, która zawiera komórkę roślinną według wynalazku. Zgodny z wynalazkiem jest wyizolowany polipeptyd, charakteryzujący się tym, że składa się z sekwencji z SEK ID NR: 2, 5 lub 8 albo zawiera co najmniej 70% sekwencji aminokwasowej identycznej z sekwencją SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8, który to polipeptyd jest zdolny do zaburzania jednej lub większej liczby właściwości fizycznych rośliny do której kwas nukleinowy jest

6 6 PL B1 wprowadzony, gdzie właściwości fizyczne rośliny są wyselekcjonowane spośród takich jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia. Korzystnie polipeptyd według wynalazku zawiera sekwencję aminokwasową składającą się z sekwencji SEK ID NR: 2, SEK ID NR: 5 lub SEK ID NR: 8. Sposób wytwarzania tego polipeptydu charakteryzuje się według wynalazku tym, że w odpowiedniej komórce gospodarza wywołuje się lub umożliwia się wytwarzanie kwasu nukleinowego według wynalazku, określonego powyżej. Zgodnym z wynalazkiem jest sposób zaburzania właściwości fizycznych rośliny wyselekcjonowanych spośród takich cech jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, wielkość i/lub kształt liścia czy odpowiedź unikania cienia, charakteryzujący się tym, że (i) wywołuje się lub umożliwia się w roślinie transkrypcję z kwasu nukleinowego obejmującego sekwencję komplementarną do sekwencji wyizolowanego kwasu nukleinowego według wynalazku lub (ii) wywołuje się lub umożliwia się transkrypcję z kwasu nukleinowego według wynalazku i korzystnie redukuje się ekspresję VRN2 poprzez kosupresję. W wyniku prac eksperymentalnych twórców wynalazku otrzymano wyizolowany kwas nukleinowy kodujący polipeptyd obejmujący przedstawioną tu sekwencję aminokwasową (np. SEK ID NR: 2; SEK ID NR: 5) który zawiera sekwencję kodującą (np. SEK ID NR: 1; SEK ID NR: 4). Zidentyfikowano formy alleliczne lub formy alternatywnego składania RNA genu. Wytworzono peptydy oraz kodujący kwas nukleinowy (np. jak SEK ID NR: 8, kodowana przez SEK ID NR: 7) oraz polipeptydy i kwas nukleinowy obejmujący zidentyfikowane mutacje. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może posiadać sekwencję geny VRN2 z Arabidopsis thaliana jak pokazano na SEK ID NR: 1, SEK ID NR: 3 (sekwencja genomowa Landsberg erecta), SEK ID NR: 4 czy SEK ID NR: 6 (sekwencja genomowa Columbia). Może być mutantem lub wariantem, pochodną czy allelem lub homologiem dostarczanej sekwencji. Korzystnymi mutantami, wariantami, pochodnymi czy allelami to takie, które kodują białko, które ma zachowane właściwości funkcjonalne białka kodowanego przez gen dzikiego typu, w szczególności zdolność do zmiany odpowiedzi na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia. Mutant, wariant, pochodna, allel czy homolog wyizolowany kwasu nukleinowego według wynalazku może zatem wpływać na właściwości fizyczne rośliny w szczególności na odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia, jak omówiono. Polinukleotydy, które nie są w 100% identyczne z przedstawionymi tu sekwencjami można uzyskać różnymi sposobami. Warianty VRN2 (przykładowo formy alleliczne) genu można uzyskać przykładowo poprzez przeszukiwanie bibliotek cdna czy genomowego DNA zrobionych z roślin Arabidopsis thaliana lub innych komórek. Można też uzyskać homologi genu z innej rośliny jednoliściennej czy dwuliściennej, poprzez wytworzenie lub otrzymanie bibliotek cdna zrobionych z dzielących się komórek lub tkanek czy bibliotek genomowych z innych gatunków roślin oraz poprzez przeszukiwanie takich bibliotek sondami obejmującymi cały lub część kwasu nukleinowego według wynalazku, w warunkach o średniej do wysokiej siły jonowej (przykładowo hybrydyzacja na stałym nośniku (filtr) z inkubacją w 42 C, w roztworze zawierającym 50% formamid, 5 x SSC (750 mm NaCI, 75 mm cytrynian sodowy), 50 mm fosforan sodowy (ph 7,6), 5x roztwór Denhardfa, 10% siarczan dekstranu i 20 μg/ml DNA spermy łososia, a następnie płukanie 0,03 M chlorkiem sodowym i 0,03 M cytrynianem sodowym (tzn. 0,2 x SSC) w od około 50 C do około 60 C). Wyizolowany kwas nukleinowy hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową przedstawioną na figurach, w określonych powyżej warunkach hybrydyzacji i płukania. Taki kwas nukleinowy jest dogodny do użycia jako sonda do wykrywania genu VRN2 przykładowo techniką typu Southern. Alternatywnie polinukleotydy według wynalazku można uzyskać poprzez ukierunkowaną mutagenezę sekwencji przedstawionych na figurach lub ich allelicznych wariantów. Może to być przydatne tam gdzie przykładowo wymagane są ciche zmiany kodonu w sekwencjach dla uzyskania optymalnych kodonów dla określonej komórki gospodarza, w której sekwencja polinukleotydowa ulega ekspresji. Inne zmiany sekwencji mogą być pożądane w celu wprowadzenia miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne lub w celu zmienienia właściwości lub funkcji polipeptydów kodowanych przez polinukleotydy. Dalsze zmiany mogą być pożądane dla wprowadzenia szczególnych zmian w kodowaniu, które są wymagane dla dostarczenia, przykładowo, podstawień konserwatywnych.

7 PL B1 7 W odniesieniu do klonowania może być konieczne ligowanie jednego lub więcej fragmentów genu dla wytworzenia sekwencji kodującej o pełnej długości. Także, kiedy nie zostanie uzyskana cząsteczka kodującego kwasu nukleinowego o pełnej długości mniejsze cząsteczki reprezentujące część całej cząsteczki można użyć do uzyskania klonów o pełnej długości. Wstawki można wytwarzać z klonów częściowego cdna i używać do przeszukiwania bibliotek cdna. Wyizolowane klony pełnej długości można subklonować w wektorach ekspresyjnych a aktywność testować poprzez transfekcję do odpowiednich komórek gospodarza, np. z plazmidem reporterowym. Kwas nukleinowy według wynalazku może zawierać sekwencje kontrolujące transkrypcję genu VRN2. Takie sekwencje kontrolne będą znajdowane na końcu 5' w stosunku do otwartej ramki odczytu genu i są uzyskiwane poprzez przeszukiwanie biblioteki genomowego DNA kwasem nukleinowym według wynalazku, selekcjonowanie klonu, który hybrydyzuje w warunkach średniej do wysokiej siły jonowej oraz sekwencjonowanie klonu 5' w stosunku do otwartej ramki odczytu genu. Wówczas gdy jedynie niewielka część sekwencji obecna jest w regionie 5', może być ona użyta do ponownego przeszukiwania biblioteki w genomowym spacerze po dalsze sekwencje leżące powyżej. Analiza regionu położonego powyżej dostarczy regionów kontrolnych dla ekspresji genu włączając regiony kontrolne wspólne dla wielu genów (tzn. TATA i CAAT box) oraz inne regiony kontrolne, zazwyczaj położone od 1 do 10000, jak 1 do 1000 lub 50 do 500 nukleotydów powyżej startu transkrypcji. W celu potwierdzenia, że regiony te są regionami kontrolnymi genu można je podłączyć do genu reporterowego (takiego jak (β-galaktozydaza) i testować jak korzystniej in vitro lub in vivo. Przykładowo konstrukt z regionem kontrolnym (np. obejmującym 50 do 500 nukleotydów powyżej startu transkrypcji) i genem reporterowym można użyć do wytworzenia rośliny transgenicznej, a wzór ekspresji, zarówno przestrzenny jak i rozwojowy, można porównać z tym dla genu VRN2. Znalezienie zasadniczo podobnych wzorów ekspresji pokazuje, że konstrukt obejmuje zasadniczo region kontrolny genu dzikiego typu. SEK ID NR: 3 i SEK ID NR: 6 przedstawiają sekwencję nukleotydową genomowego regionu VRN2 obejmującego promotor, odpowiednio dla ekotypów Arabidopsis thaliana -Landsberg erecta i Columbia oraz elementów regulacyjnych z końca 3'. Region kontrolny można zmutować w celu zidentyfikowania specyficznych subregionów odpowiedzialnych za kontrolę transkrypcji. Można to osiągnąć różnymi technikami dobrze znanymi specjalistom, takimi jak testy protekcji przed DNAzą (tzw. odcisk stopy), w których region kontrolny jest kontaktowany z ekstraktem z komórki aktywnie eksprymującej gen VRN2 i określane są obszary regionu kontrolnego wiążące czynniki z tego ekstraktu. Wyizolowany kwas nukleinowy może zatem dzięki takiej metodzie obejmować regiony kontrole. Pomiędzy intronami genomowego DNA znaleziono sekwencje egzonowe, kodujące gen VRN2 w roślinie. Takie sekwencje egzonowe można uzyskać w sposób analogiczny do opisanego powyżej dla sekwencji kontrolujących transkrypcję, dzięki odpowiedniemu spacerowi po genomie prowadzonemu pomiędzy sekwencjami intronowymi. Położenie egzonów można określić poprzez porównanie sekwencji genomowych i cdna genu i zaobserwowanie gdzie sekwencje są ustawione w rzędzie a gdzie się różnią oraz szukając miejsc konsensusowych dla składania sekwencji, które definiują granice intron/egzon. Jak zauważono powyżej, zmiany sekwencji, w celu uzyskania mutanta, wariantu czy pochodnej mogą być jedną lub większą liczbą addycji, insercji, delecji czy substytucji jednego czy większej liczby nukleotydów w kwasie nukleinowym prowadzących do addycji, insercji, delecji czy substytucji jednego lub większej liczby aminokwasów w kodowanym polipeptydzie. Oczywiście włączone są zmiany w kwasie nukleinowym nie wprowadzające różnicy w kodowanej sekwencji aminokwasowej ("zdegenerowany odpowiednik"). Korzystne sekwencje kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku są tu przedstawione, przykładowo patrz SEK ID NR: 1 i SEK ID NR: 4, dla których odpowiednie przewidywane sekwencje kodujące aminokwasy peptydów według niniejszego wynalazku są przedstawione w SEK ID NR: 2 i SEK ID NR: 5. Sekwencja aminokwasową mutanta, allelu, wariantu czy pochodnej według niniejszego wynalazku może zawierać w sekwencji tu przedstawionej pojedynczą zmianę aminokwasową w stosunku do sekwencji przedstawionej w odpowiedniej SEK ID NR: lub na odpowiedniej figurze lub 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9 zmian, około 10, 15, 20, 30, 40 czy 50 zmian lub więcej niż około 50, 60, 70, 80 czy 90 zmian. Dodatkowo do jednej lub większej liczby zmian w sekwencji aminokwasowej przedstawionej na odpowiedniej figurze sekwencja aminokwasową mutanta, allelu, wariantu czy pochodnej może zawierać dodatkowe aminokwasy na końcu C i/lub na końcu N.

8 8 PL B1 Sekwencja pokrewna do sekwencji specyficznie tu ujawnianej ma homologię z tą sekwencją. Homologia ta może być na poziomie sekwencji nukleotydowej i/lub sekwencji aminokwasowej. Korzystnie, sekwencja nukleotydową i/lub aminokwasową ma homologię z sekwencją kodującą lub sekwencją kodowaną przez przedstawioną tu sekwencję nukleotydową, przykładowo, SEK ID NR: 2 czy SEK ID NR: 5, korzystnie na poziomie co najmniej około 50% lub 60% lub 70% lub 80% homologii, bardziej korzystnie co najmniej około 90%, 95%, 96%, 97%, 98% czy 99% homologii. Należy rozumieć, że homologia na poziomie aminokwasowym podawana jest zasadniczo w terminach podobieństwa lub identyczności aminokwasów. Podobieństwo pozwala na warianty konserwatywne", tzn. substytucję reszty hydrofobowej jak izoleucyny, waliny, leucyny czy metioniny na którąś z nich, lub substytucję polarnej reszty na inna polarną jak argininy za lizynę, kwas glutaminowy za asparaginowy czy glutaminę za asparaginę. Podobieństwo może być zdefiniowane i określone dzięki programowi TBLASTN według Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: , który jest standardowo używany przez specjalistów lub, i to może być korzystne, dowolny ze standardowych programów BestFit czy GAP, które są częścią pakietu Wisconsin Package, Version 8, wrzesień 1994, (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA, Wisconsin 53711). Program BestFit tworzy optymalne przyrównania najbardziej podobnych segmentów pomiędzy dwiema sekwencjami. Optymalne przyrównania znajdowane są dzięki wprowadzaniu przerw dla zmaksymalizowania liczby dopasowań przy zastosowaniu algorytmu miejscowej homologii według Smith'a i Waterman'a (Advances in Applied Mathematics (1981) 2, pp ). Program GAP stosuje algorytm Needleman'a i Wunsch'a dla przyrównania dwóch pełnych sekwencji, który maksymalizuje liczbę dopasowań i minimalizuje liczbę przerw. Zasadniczo, stosowane są parametry: kary za wprowadzenie przerwy = 12 oraz kary za wydłużenie przerwy = 4. Homologia rozciąga się zasadniczo na całej długości odpowiednio tu przedstawionej sekwencji, dopóki nie jest określone inaczej, lub może rozciągać się na ciągłej sekwencji od około lub powyżej niż około 20, 25, 30, 33, 40, 50, 67, 133, 167, 200, 233, 267, 300, 333, 400, 450, 500, 550, 600 lub na większej liczbie aminokwasów lub kodonów w porównaniu z odpowiednią sekwencją aminokwasową lub sekwencją nukleotydową, co może mieć miejsce. W bardzo korzystnych wykonaniach, cały procent homologii odnosi się do przedstawionego tu procentu identyczności sekwencji. W tym kontekście procent (%) identyczności sekwencji aminokwasowej z odpowiednią określoną sekwencją odniesienia jest zdefiniowany jako procent reszt aminokwasowych w kandydującej sekwencji, które są identyczne z resztami aminokwasowymi w sekwencji odniesienia po przyrównaniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, jeśli to konieczne, dla uzyskania maksymalnego procentu identyczności sekwencji i bez rozpatrywania żadnych konserwatywnych substytucji jako części identyczności sekwencji. Stosowany tu % identyczności można określić za pomocą WU-BLAST-2 według [Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: (1996); WU-BLAST-2 stosuje szereg parametrów badających, z których większość ma wartości domyślne. Ustawione parametry są zadane z następującymi wartościami: rozpiętość zakładki = 1, frakcja zakładki = 0,125, próg słowa (T) = 11. HSPS i HSPS2 są wartościami dynamicznymi i są ustalane przez sam program w zależności od kompozycji danej sekwencji oraz kompozycji danej bazy danych wobec której bada się interesującą sekwencję; jakkolwiek wartości mogą być ustawione w celu zwiększenia czułości. % identyczności sekwencji aminokwasowej jest określany na podstawie liczby pasujących identycznych reszt podzielonej przez całkowitą liczbę reszt z najdłuższej" sekwencji w przyrównywanym regionie. Najdłuższą" sekwencją jest ta, która posiada najbardziej istotne reszty w przyrównanym regionie (przerwy wprowadzone przez WU-Blast-2 w celu maksymalizacji przyrównania są ignorowane). W podobny sposób procent (%) identyczności sekwencji kwasu nukleinowego w stosunku do sekwencji nukleotydowej odniesienia określany jest jako procent reszt nukleotydowych w badanej sekwencji, które są identyczne z resztami nukleotydowymi sekwencji odniesienia. Wartości identyczności można określać za pomocą modułu BLASTN z WU-BLAST-2 stosując domyślne parametry dla rozpiętości zakładki oraz frakcji zakładki, stosownie 1 oraz 0,125. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może składać się zasadniczo lub całkowicie z omawianej sekwencji kodującej. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może zawierać promotor lub inną sekwencję regulatorową jak omówiono dalej i taka sekwencja regulatorowa może być heterologiczna do sekwencji kodującej, co znaczy, że nie jest w sposób naturalny funkcjonalnie z nią połączona. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może być cząsteczką cdna lub może nie posiadać jednego lub większej liczby intronów, które występują naturalnie lub może być

9 PL B1 9 w formie naturalnie nie występującej. Sekwencja kodująca według niniejszego wynalazku może być zawarta w większej cząsteczce kwasu nukleinowego mniejszej niż około nukleotydów, mniejszej niż około 5000 nukleotydów czy mniejszej niż około 2000 nukleotydów. W jednym aspekcie niniejszego wynalazku dostarczany jest także kwas nukleinowy zawierający lub składający się zasadniczo z sekwencji nukleotydów komplementarnych do sekwencji nukleotydowej, hybrydyzującej z dowolną dostarczaną tu sekwencją kodującą. Inaczej patrząc kwas nukleinowy według tego aspektu, hybrydyzuje z sekwencją nukleotydową komplementarną do dowolnej dostarczanej tu sekwencji kodującej. Oczywiście DNA jest zasadniczo dwuniciowy i często stosowane są takie techniki przenoszenia DNA jak w hybrydyzacji typu Southern po rozdzieleniu nici od siebie bez rozróżniania, która nić hybrydyzuje. Korzystnie hybrydyzujący kwas nukleinowy lub do niego komplementarny koduje produkt wpływający na właściwości fizyczne rośliny, w szczególności na takie cechy jak odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liści i/lub odpowiedź unikania cienia, np. w Arabidopsis thaliana. Korzystne warunki hybrydyzacji są znane specjalistom i zasadniczo są wystarczająco ostre dla pozytywnej hybrydyzacji pomiędzy interesującymi sekwencjami z wyłączeniem innych sekwencji. Kwas nukleinowy, który zawiera przykładowo DNA kodujący polipeptyd obejmujący sekwencję aminokwasową VRN2 lub inny ujawniony tu polipeptyd, w formie genomowej lub cdna, może występować w formie zrekombinowanej i korzystnie jako replikujący się wektor, przykładowo wektor plazmidowy, kosmidowy, fagowy lub binarny wektor Agrobacterium. Kwas nukleinowy może znajdować się pod kontrolą odpowiedniego promotora lub innych elementów regulacyjnych do ekspresji w komórce gospodarza takiej jak komórka mikroorganizmu, np. bakteryjna czy komórka roślinna. W przypadku genomowego DNA, może on zawierać swój własny promotor lub inne elementy regulacyjne a w przypadku cdna może znajdować się on pod kontrolą odpowiedniego promotora lub innych elementów regulacyjnych do ekspresji w komórce gospodarza. Wektor obejmujący kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku nie musi zawierać promotora czy innych sekwencji regulacyjnych, w szczególności jeśli wektor jest używany do wprowadzania kwasu nukleinowego do komórek w celu rekombinacji z genomem. Specjaliści potrafią skonstruować wektor i zaprojektować protokoły dla ekspresji zrekombinowanego genu. Odpowiednie wektory można wybrać lub skonstruować, tak aby zawierały odpowiednie sekwencje regulacyjne włączając sekwencje promotorowe, fragmenty terminatorowe, sekwencje poliadenylacji sekwencje wzmacniające, geny markerowe i inne odpowiednie sekwencje. Szczegóły patrz: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: wyd. 2-gie, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Wiele technik i protokołów manipulacji kwasem nukleinowym, przykładowo do wytwarzania konstruktów kwasów nukleinowych, mutagenezy, sekwencjonowana, wprowadzania DNA do komórek i ekspresji genu oraz do analizy białek szczegółowo opisano w Current Protocols in Molecular Biology, wyd. 2-gie, Ausubel et al. wyd., John Wiley & Sons, Ujawnione tu pozycje Sambrook et al. i Ausubel et al. są tu włączone na drodze odniesienia. Specyficzne procedury oraz wektory stosowane wcześniej z dużym powodzeniem u roślin opisane są przez Bevan (Nucl. Acids Res. 12, (1984)) oraz Guerineau i Mullineaux (1993) (Plant transformation and expression vectors. In: Plant Molecular Biology Labfax (Croy RRD ed) Oxford, BIOS Scientific Publishers, str ). Można stosować selekcyjne markery genetyczne składające się z genów chimerowych, które nadają selekcyjny fenotyp taki jak oporność na antybiotyki takie jak kanamycyna, higromycyna, fosfinotricyna, chlorosulfuron, metotreksat, gentamycyna, spektynomycyna, imidazolinony oraz glifosaty. Cząsteczki kwasów nukleinowych oraz wektory według niniejszego wynalazku mogą być dostarczone jako wyizolowane i/lub oczyszczone z ich naturalnego środowiska w formie zasadniczo czystej i homogennej lub jako wolny lub zasadniczo wolny kwas nukleinowy lub jako geny z innych interesujących gatunków czy być pochodzenia innego niż sekwencja kodująca polipeptyd z wymaganą funkcją. Kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku może obejmować cdna, RNA, genomowy DNA, i może być w całości lub częściowo syntetyczny. Termin izolat" obejmuje wszystkie te możliwości. Objęta jest określona sekwencja DNA, np. w odniesieniu do figury, dopóki kontekst nie wymaga odpowiednika RNA z U podstawionym za T. Przy wprowadzaniu wybranego konstruktu z genem do komórki należy wziąć pod uwagę pewne okoliczności dobrze znane specjalistom. Kwas nukleinowy, który ma zostać wprowadzony powinien być połączony w konstrukt, który zawiera działające elementy regulacyjne, które będą kierowały transkrypcją. Musi istnieć dostępna metoda transportu konstruktu do komórki. Kiedy konstrukt znajduje się w błonie komórkowej, integracja z endogennym materiałem chromosomowym będzie się pojawiała lub

10 10 PL B1 nie. Tak długo jak rozpatrywane są rośliny, typ komórki docelowej musi być taki, aby komórki te regenerowały w całą roślinę. Komórki DNA transformowane segmentem DNA zawierającym sekwencję można wytwarzać znanymi obecnie standardowymi technikami genetycznej manipulacji roślin. DNA można transformować do komórek roślinnych przy użyciu dowolnej dogodnej technologii takiej jak metoda oparta na rozbrojonym wektorze z plazmidem Ti, przenoszonym przez Agrobacterium, która wykorzystuje jego naturalną zdolność przenoszenia genu (EP-A , EP-A , NAR 12(22) ), bombardowanie cząsteczkami lub mikropociskami (US , EP-A , EP-A ) mikroinjekcja (WO 92/09696, WO 94/00583, EP , EP , Green et al. (1987) Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press), elektroporacja (EP , WO ), inne formy bezpośredniego pobierania DNA (DE , WO , US ), pobieranie DNA za pośrednictwem liposomów (np. Freeman et al. Plant Cell Physiol. 29: 1353 (1984)), czy metoda wytrząsania (np. Kindle, PNAS U.S.A. 87: 1228 (1990d) Physical methods for the transformation of plant cells are reviewed in Oard, 1991, Biotech. Adv. 9: Transformacja za pomocą Agrobacterium jest powszechnie stosowana przez specjalistów do transformacji gatunków dwuliściennych. Istnieją różne podejścia stosowane do rutynowego wytwarzania stabilnych, płodnych roślin transgenicznych prawie wszystkich roślin jednoliściennych posiadających znaczenie ekonomicznie (Toriyama, et al. (1988) Bio/Technology 6, ; Zhang, et al. (1988) Plant Cell Rep. 7, ; Zhang, et al. (1988) Theor Appl Genet 76, ; Shimamol-to, et al. (1989) Nature 338, ; Datta, et al. (1990) Bio/Technology 8, ; Christou, et al. (1991) Bio/Technology 9, ; Peng, et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Philippines ; Cao, et al. (1992) Plant Cell Rep. 11, ; Li, et al. (1993) Plant Cell Rep. 12, ; Rathore, et al. (1993) Plant Molecular Biology 21, ; Fromm, et al. (1990) Bio/Technology 8, ; Gordon-Kamm, et al. (1990) Plant Cell 2, ; D'Halluin, et al. (1992) Plant Cell 4, ; Walters, et al. (1992) Plant Molecular Biology 18, ; Koziel, et al. (1993) Biotechnology 11, ; Vasil, I. K. (1994) Plant Molecular Biology 25, ; Weeks, et al. (1993) Plant Physiology 102, ; Somers, et al. (1992) Bio/Technology 10, ; WO92/14828). W szczególności, transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wyłania się obecnie także jako wydajna alternatywna metoda transformacji jednoliściennych (Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6, ). Wytwarzanie płodnych roślin transgenicznych uzyskano dla zbóż takich jak ryż, kukurydza, pszenica, owies i jęczmień (praca przeglądowa Shimamoto, K. (1994) Current Opinion in Biotechnology 5, ; Vasil, et al. (1992) Bio/Technology 10, ; Vain et al., 1995, Biotechnology Advances 13 (4): ; Vasil, 1996, Nature Biotechnology 14 str. 702). Bombardowanie mikropociskami, elektroporacja oraz bezpośrednie pobieranie DNA są korzystne wówczas gdy zastosowanie Agrobacterium nie jest wydajne czy skuteczne. Alternatywnie można wykorzystać kombinację różnych technik dla zwiększenia wydajności procesu transformacji np. bombardowanie Agrobacterium opłaszczonym mikrocząsteczkami (EP-A ) lub bombardowanie mikropociskami dla zaindukowania rany a następnie hodowanie Agrobacterium (EP-A ). Po transformacji roślinę można regenerować np. z pojedynczych komórek, tkanki kallusa czy dysków liści według standardowych technik. Prawie każdą dowolną roślinę można w całości zregenerować z komórek, tkanek czy organów roślinnych. Dostępne techniki opisano w Vasil et al., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II i III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984, oraz Weissbach i Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, Wybór danej technologii transformacji będzie podyktowany wydajnością transformacji danego gatunku rośliny w tej technologii a także doświadczeniem i preferencją określonej metody osoby wykonującej doświadczenie według wynalazku. Dla specjalisty będzie oczywiste, że wybór określonego systemu transformacji dla wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórek roślinnych nie jest najważniejszy dla niniejszego wynalazku lub że jego nie ogranicza podobnie jak wybór techniki regeneracji rośliny. Gen VRN2 oraz jego zmodyfikowane wersje (allele, mutanty, warianty i ich pochodne) dostarczany tu oraz kwas nukleinowy, włączając homologi różnych gatunków, można użyć do modyfikowania odpowiedzi na wernalizację, czasu kwitnienia, kształtu liścia i/lub odpowiedzi unikania cienia w roślinach transgenicznych. Kwas nukleinowy tak jak wektor tu opisany można użyć do wytwarzania roślin transgenicznych. Rośliny takie mogą posiadać zmieniony fenotyp w szczególności jeśli chodzi o odpowiedź na wernalizację, czas kwitnienia, kształt liścia i/lub odpowiedź unikania cienia w porów-

11 PL B1 11 naniu z dzikim typem (o którym mówi się, że jest rośliną dzikiego typu pod względem VRN2 czy odpowiedniego jego homologa). Wynalazek dalej obejmuje komórkę gospodarza stransformowana kwasem nukleinowym lub wektorem według niniejszego wynalazku, w szczególności komórkę roślinną lub bakteryjną. Zatem, dostarczana jest komórka gospodarza, taka jak komórka roślinna, zawierająca heterologiczny kwas nukleinowy według niniejszego wynalazku. Wewnątrz komórki kwas nukleinowy może być wprowadzony do chromosomu. Na haploidalny genom może występować więcej niż jedna heterologiczna sekwencja nukleotydową. Także dostarczana jest komórka roślinna według niniejszego wynalazku posiadająca wprowadzony do genomu kwas nukleinowy, w szczególności heterologiczny kwas nukleinowy, jak wprowadzany według niniejszego wynalazku, znajdujący się pod kontrolą sekwencji regulacyjnych kontrolujących ekspresję. Sekwencja kodująca może być funkcjonalnie podłączona do jednej lub kilku sekwencji regulacyjnych, które mogą heterologiczne lub obce dla genu, jak te, które naturalnie nie są związane z genem, który ma być eksprymowany. Kwas nukleinowy według wynalazku może znajdować się pod kontrolą silnie indukowanego promotora genu co pozwala na kontrolowaną przez użytkownika ekspresję. Korzystnym indukowanym promotorem jest promotor genu GST-II-27, dla którego wykazano indukcję pod wpływem określonych związków chemicznych podawanych rosnącym roślinom. Promotor jest funkcjonalny zarówno w roślinach jednoliściennych jak i dwuliściennych. Może zatem być stosowany do kontroli ekspresji genu w różnych genetycznie zmodyfikowanych roślinach włączając rośliny uprawne takie jak rzepak, słonecznik, tytoń, burak cukrowy, bawełna; zboża takie jak pszenica, jęczmień, ryż, kukurydza, sorgo; owoce jak pomidory, mango, brzoskwinie, jabłka, gruszki, truskawki, banany i melony; warzywa takie jak marchew, sałata, kapusta i cebula. Promotor GST-ll-27 jest także przydatny do użycia w wielu tkankach, włączając korzenie, liście, łodygi oraz tkanki rozrodcze. Kolejny aspekt według niniejszego wynalazku dostarcza metodę wytwarzania komórki roślinnej do wprowadzania kwasu nukleinowego czy stosownego wektora zawierającego sekwencję nukleotydów dla komórki roślinnej i wywołującego czy pozwalającego na rekombinację pomiędzy wektorem a genomem komórki roślinnej celem wprowadzenia do genomu sekwencji nukleotydów. Wynalazek obejmuje komórki roślinne zawierające kwas nukleinowy według wynalazku w wyniku wprowadzenia kwasu nukleinowego do komórki przodka. Termin heterologiczny" można stosować dla podkreślenia, że gen/sekwencja nukleotydów o której mowa została wprowadzona do omawianych komórek rośliny lub ich przodków przy użyciu technik inżynierii genetycznej, tzn. za pośrednictwem człowieka. Dostarczona może być transgeniczna komórka roślinna, tzn. transgeniczna pod względem omawianego kwasu nukleinowego. Transgen może być w postaci ekstra-genomowego wektora lub wprowadzony, korzystnie stabilnie do genomu. Heterologiczny gen może podmieniać równoważny gen endogenny tzn. ten, który normalnie pełni tę samą lub podobną funkcję lub wprowadzone sekwencje mogą być dodatkowymi do genu endogennego czy innych sekwencji. Korzystne jest wprowadzenie heterologicznego genu pod kontrolę wybranego promotora co umożliwia wpływanie na ekspresję sekwencji zgodnie z potrzebami. Ponadto, w miejsce endogennego genu można stosować mutanty, warianty oraz pochodne genu dzikiego typu, np. o wyższej lub niższej aktywności niż dzikiego typu. Heterologiczny kwas nukleinowy, czy egzogenny lub obcy, dla komórki roślinnej może nie występować naturalnie w komórkach tego typu, odmianie czy gatunku. Zatem kwas nukleinowy może obejmować sekwencję kodującą lub pochodzącą z komórki roślinnej określonego typu lub gatunku czy odmiany roślinnej, wprowadzoną do komórki roślinnej różnego typu czy gatunku czy odmiany rośliny. Dalszą możliwością jest, że sekwencja kwasu nukleinowego która jest wprowadzana do komórki, w której naturalnie występuje ona sama lub jej sekwencja homologiczna, z tym, że sekwencja kwasu nukleinowego jest połączona i/lub przylega do kwasu nukleinowego, który nie występuje naturalnie w komórce czy komórkach tego typu czy gatunkach czy odmianach rośliny, jak funkcjonalnie połączona do jednej lub kilku sekwencji regulacyjnych takich jak sekwencja promotorowa kontrolująca ekspresję. Sekwencje w roślinie czy innych komórkach gospodarza można identyfikować jako heterologiczne, egzogenne lub obce. Dostarczane są także rośliny obejmujące komórkę roślinną według wynalazku oraz dowolne ich części czy rozmnóżki, nasiona, potomstwo wsobne lub hybrydowe oraz dalsze potomstwo. Roślina według niniejszego wynalazku może nie dziedziczyć prawidłowo jednej lub kilku cech. Odmiany rośliny mogą być wyłączone, w szczególności odmiany roślin zarejestrowanych w Plant Breeders' Rights. Należy zauważyć, że roślina nie musi być uważana za odmianę roślinną" tylko dlatego, że zawiera transgen stabilny w genomie, wprowadzony do komórki roślinnej lub jego przodka.