Podstawy ekotoksykologii

Transkrypt

1 Podstawy ekotoksykologii Miary toksyczności Biomarkery Ogólna teoria stresu Wpływ substancji toksycznych na populacje Prof. dr hab. Ryszard Laskowski Instytut Nauk o Środowisku UJ Ul. Gronostajowa 7, Kraków pok

2 Toksykologia a ekotoksykologia Toksykologia: wypracowana metodyka (obserwacja pojedynczych organizmów lub komórek) jasne miary toksyczności (dawka letalna i LD 5, stężenie letalne i LC 5, etc.) Ekotoksykologia: czy można stosować metody stosowane w toksykologii?

3 Pamiętajmy:...wyższe poziomy organizacji niż pojedynczy osobnik... populacja to nie to samo co organizm! Osobniki różnią się tolerancją na warunki środowiskowe rozkład cech w populacji można z reguły opisać tzw. krzywą Gaussa (rozkład normalny) Gęstość prawdopodobieństwa Wartość cechy

4 W ekotoksykologii na ogół interesuje nas rozkład wrażliwości na stężenia substancji toksycznych w populacji 5 5 Częstość Stężenie substancji chemicznej Logarytm stężenia substancji chemicznej Rozkład log-normalny: brak wartości poniżej zera, prawo-skośny Ten sam rozkład po zlogarytmowaniu osi odciętych

5 Krzywa skumulowanego rozkładu (dystrybuanta) lognormalnego jako podstawa jednej z najważniejszych technik w (eko)toksykologii: wyznaczanie LC 5 -stężenia powodującego 5% śmiertelność w populacji Skumulowane prawdopodobieństwo reakcji 1..5 EC 1 LC 5 (LD 5) Logarytm stężenia (dawki) LC 5 - bardzo dobra miara w toksykologii: duża dokładność dobre podstawy statystyczne Czy równie przydatna w ekotoksykologii?

6 W poszukiwaniu dobrych miar toksyczności Analiza wariancji (ANOVA) zalety: dość jasne wyniki wady: nic nie wiadomo o zależności dawka-reakcja Analiza regresji z porównaniem nachyleń możliwość porównania toksyczności różnych substancji oraz wyznaczenia wartości LC 5 1 Wartość cechy Śmiertelność 5 y = b 1 x + b 2 B A y = a 1 x + a 2 A B C Substancja chemiczna LC 5 (B) LC 5 (A) Stężenie substancji chemicznej

7 To samo w ekotoksykologii... NOEC No Observed Effect Concentration LOEC Lowest Observed Effect Concentration 1.2 Kontrola nie ma sensu! Kontrola Wartość cechy NOEC LOEC Wartość cechy NOEC LOEC Stężenie (dawka) Stężenie (dawka)

8 Wyniki uzyskane przy pomocy sześciu różnych testów a posteriori, zastosowanych do porównania średnich z dziesięciu prób pobranych losowo z dwóch populacji: X o średniej µx=9 oraz Y o średniej µy=1 i równych odchyleniach standardowych sx=sy=1; n=1, α=.5, β=.11. Ta sama litera w kolumnie oznacza brak istotnej różnicy przy założonym poziomie ufności 95%. Próba Średnia Metoda Tukeya LSD Scheffégo Bonferroniego Newmana Duncana -Keulsa X A A A A A A X A B A A A B A B A B X A B A A A B A B A B X A B A B A A B A B A B C X A B A B C A A B A B A B C D Y A B B C A A B A B B C D Y A B B C A A B B C D Y A B B C A A B B C D Y B C A B B D Y B C A B B D

9 Przykłady świadczące o nieadekwatności kryteriów NOEC i LOEC Gatunek Cognettia sphagnetorum Paramametr (subst. toks.) LOEC [mg/kg] EC 5 [mg/kg] Przyrost masy (Cu) 1 8 Folsomia candida Reprodukcja (Cu) Folsomia candida Reprodukcja (LAS) 4 91 Platynothrus peltifer Reprodukcja (LAS) Eisenia fetida Liczba kokonów (LAS) Eisenia fetida Liczba kokonów (DMT) 1 5,3 Eisenia fetida Liczba potomstwa (DMT) 1 7,1

10 Na problemach statystycznych niestety nie koniec: czas 1.. lat 1. lat 1. lat 1. lat 1 lat 1 lat 1 rok 1 dzień 1 godzina 1 sekunda ekosystemy populacje osobnik tkanki, narządy struktury subkomórkowe 1m 1mm 1m 1km 1. km 1. km biomy przestrzeń

11 Zacznijmy od rzeczy najprostszych : od osobnika Podział zasobów energetycznych na wszelkie potrzeby osobnika NORMALNE WARUNKI ŚRODOWISKOWE STRES (niska temperatura) produkcja 3% termoregulacja 3% produkcja 1% inne koszty utrzymania 2% termoregulacja 5% inne koszty utrzymania 2% lokomocja 2% lokomocja 2%

12 Co powodują substancje toksyczne? Toksyczność (głównie blokada enzymów) Konieczność metabolizowania (detoksykacji) i wydalania, ew. gromadzenia WNIKANIE WNIKANIE WNIKANIE MIEJSCA DZIAŁANIA MIEJSCA METABOLIZOWANIA WNIKANIE MIEJSCA GROMADZENIA USUWANIE

13 Budżet energetyczny organizmu Normalne warunki środowiskowe Stres (substancja toksyczna) Produkcja 1% Produkcja 3% Detoksykacja 2% Inne koszty utrzymania 68% Detoksykacja 22% Inne koszty utrzymania 68%

14 Budżet energetyczny jest ograniczony: tempa metabolizmu nie można zwiększać w nieskończoność metabolizm maksymalny: ssaki ok. 5-8 BMR ptaki ok BMR zwierzęta zmiennocieplne są ograniczone temperaturą ciała

15 Ogólna teoria stresu Prawdopodobieństwo śmierci A B Teoretyczna trajektoria wyznaczająca zależność prawdopodobieństwa śmierci organizmu od wielkości inwestycji w produkcję Tempo produkcji

16 Koszty powstają na wielu etapach. Jaka gospodarka jest w tych warunkach optymalna? Ekskrecja Pożywienie Pula aktywna Pula pasywna Aktywna detoksykacja (nakłady energetyczne) Ekskrecja

17 Gospodarowanie energią Respiracja R(w) Asymilacja A(w) Ciało o masie w Produkcja P(w) Przełącznik up(w) 2 Reprodukcja Wzrost u 1 P(w) up(w) 3 up(w) 4 Immobilizacja Dekontaminacja

18 Historia życia organizmu Prawdopodobieństwo przeżycia Środowisko nieskażone Wielkość size 4 3 growth krzywa curve wzrostu age Wiek Wiek wzrost reprodukcja imobilizacja dekontaminacja

19 W skażonym środowisku część energii trzeba przeznaczyć na detoksykację Prawdopodobieństwo przeżycia Niska toksyczność puli pasywnej concentration size 2 1 concentration of metal stężenie metalu active pool passive pool growth curve krzywa wzrostu age Wielkość Stężenie p. pasywna p. aktywna Wiek wzrost reprodukcja imobilizacja dekontaminacja Wiek

20 Gdy substancja jest silnie toksyczna koszty detoksykacji mogą być wysokie Prawdopodobieństwo przeżycia Stężenie w pożywieniu = 4. jednostki stężenie substancji toksycznej Wiek Stężenie Wielkość pula pasywna pula akytwna krzywa wzrostu Wiek wzrost reprodukcja imobilizacja dekontaminacja

21 Czy detoksykacja jest faktycznie kosztowna? Na poziomie subkomórkowym u osobników eksponowanych na substancje toksyczne obserwuje się spadek zawartości nukleotydów adenylowych oraz tzw. ładunku energetycznego nukleotydów (AEC). nukleotydy adenylowe ( M. -1 m g masy ciała) nukleotydy * * F. polyctena F. aquilonia AEC = ATP + ADP 2 ATP + ADP + AMP AEC F. polyctena F. aquilonia kontrola Cd 1,,9,8,7,6,5 AEC

22 Czy energetyczne koszty detoksykacji są znaczące dla organizmu? -1 tempo respiracji ( m l CO 2 h ) Tempo respiracji u wijów (Lithobius mutabilis) poddanych działaniu pestycydu (dimetoat) -1 stężenie dimetoatu w glebie (mg kg ) Przesłanki wskazują, że koszty detoksykacji mogą być istotne i mogą decydować o przeżywalności organizmów.

23 W skażonym środowisku może też być mniej dostępnej energii Wyniki doświadczenia nad ślimakami Helix aspersa karmionymi pożywieniem skażonym metalami ciężkimi -1 Konsumpcja (mg dzień ) Cynk Stężenie w pożywce (mg kg ) -1-1 Konsumpcja (mg dzień ) Miedź Stężenie w pożywce (mg kg ) -1-1 Konsumpcja (mg dzień ) Ołów Stężenie w pożywce (mg kg )

24 Życie wymaga kompromisów; także przy decyzji, jak wiele energii przeznaczać na detoksykację 1 1 Produkcja r MAX Prawdopodobieństwo przeżycia Inwestycje w detoksykację 1

25 Biomarkery zatrucia organizmu Biomarker: każda odpowiedź biologiczna na obecność substancji toksycznej w środowisku, na poziomie osobnika lub niższym, wykazująca odchylenie od normy Rodzaje biomarkerów: biochemiczne fizjologiczne histologiczne morfologiczne behawioralne

26 Przykłady biomarkerów Poziom organizacji Biochemia Fizjologia Tkanki Osobnik Przykłady biomarkerów hamowanie AChE; indukcja monooksygenaz; indukcja metalotionein; indukcja hsp; AEC zmniejszenie grubości skorupy jaja; maskulinizacja ( imposex ); feminizacja embrionów patologiczne zmiany w tkankach (nerkach, wątrobie i in.) Morfologia: asymetria fluktuująca; tempo wzrostu Behawior: spadek konsumpcji; utrata orientacji; wzrost lub spadek aktywności lokomotorycznej

27 Związek biomarkerów z cechami historii życiowej Ładunek energetyczny adenylatów (AEC),75,74,73,72,71,7 2 R = Śmiertelność AEC koreluje ujemnie ze śmiertelnością larw much domowej (Musca domestica)

28 Przykład zmian histopatologicznych pod wpływem kadmu: wątroba szczura Wątroba szczura kontrolnego (x3) Brzóska i in. 23. Liver and kidney functions and histology in rats exposed to cadmium and ethanol. Alcohol and Alcoholism, 38: 2-1. Wątroba szczura eksponowanego na kadm (x3); cytoplazma gąbczasta, wypełniona wakuolami, chromatyna jądrowa bardziej zwarta, nekrozy pojedynczych hepatocytów

29 Wpływ substancji na jakie cechy powinniśmy zatem mierzyć? To zależy od pytania: jeśli zależy nam na wykryciu efektów za wszelką cenę najwrażliwsze cechy historii życiowej lub biomarkery jeśli zależy nam na precyzyjnej ocenie skutków na poziomie populacji miary dynamiki populacji (r, λ, K) jeśli celem jest ochrona populacji przed wyginięciem prawdopodobieństwo ekstynkcji i czas do ekstynkcji

30 Które cechy historii życia lub biomarkery są najwrażliwsze na substancje toksyczne? Gatunek LC 5 (14 dni) EC 5 (prod. kokonów) mg Zn kg -1 EC 5 (NRR) Eisenia fetida >2 Lumbricus terrestris Lumbricus rubellus Aporrectodea caliginosa Spurgeon i in. 2. Relative sensitivity of life-cycle and biomarker responses in four earthworm species exposed to zinc. Environmental Toxicology and Chemistry, 19:

31 Wpływ Keponu na poszczególne cechy historii życiowej Eurytemora affinis przy wzrastających stężeniach substancji w wodzie; w wierszach opisano zmiany wartości cech dla kolejnych stężeń w stosunku do ich wartości przy poprzednim stężeniu, np. przy podwyższeniu stężenia z do 5 µg dm -3, z 5 do 1 µg dm -3 itd. (wg Allana i Danielsa, 1982). Wartości LC 5 na podstawie testu 48 h, parametry populacyjne 21 dni. Wzrost stężenia (µg dm -3 ) % LC 5 Przeżywalność Wpływ na r Wiek reprodukcyjny Wielkość miotu Liczba miotów , ,5 5 62,5 brak brak redukcja niewielka redukcja redukcja brak niewielkie opóźnienie opóźnienie opóźnienie brak brak znaczna redukcja brak znaczna redukcja brak brak brak znaczna redukcja znaczna redukcja znaczna redukcja

32 Gdy chcemy dowiedzieć się o wpływie zanieczyszczeń na populację, lepiej stosować miary dynamiki populacji R n = l m 1 = e rx l m x x x x x= r i = N ln N t t λ - dominująca wartość własna macierzy Lesliego K pojemność środowiskowa

33 Wpływ substancji toksycznych na populacje: wzrost wykładniczy (zmiana r)

34 Wpływ substancji toksycznych na populacje: wzrost logistyczny (zmiana K) K (tox)

35 Opanowane terminy: LD 5 Lethal Dose for 5% individuals = dawka śmiertelna dla 5% osobników; LC 5 Lethal Concentration for 5% individuals = stężenie śmiertelne dla 5% osobników; EC 5 5% Effect Concentration = stężenie powodujące 5% efekt w mierzonej zmiennej (np. spadek płodności lub długości życia o 5% itp.); NOEC No Observed Effect Concentration = najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się istotnych efektów działania substancji toksycznej; LOEC Lowest Observed Effect Concentration = najniższe stężenie, przy którym pojawia się istotny efekt działania substancji toksycznej.