Ocena przydatnoœci chromogennego pod³o a CandiSelect 4 (BioRad) do izolacji i wstêpnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida

Transkrypt

1 Prace oryginalne / Original papers Mikologia Lekarska 2005, 12 (4): Copyright 2005 Cornetis ISSN X Ocena przydatnoœci chromogennego pod³o a (BioRad) do izolacji i wstêpnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida Evaluation of (BioRad) a chromogenic medium for yeasts differentiation Urszula Nawrot 1, Katarzyna W³odarczyk 1, Jacek Ska³a 2, Anna Przondo-Mordarska 1, Nicole Nolard 3 1 Katedra i Zak³ad Mikrobiologii AM we Wroc³awiu 2 Zak³ad Genetyki, Instytut Mikrobiologii UW 3 Instytut Zdrowia Publicznego, Sekcja Mikologiczna, Bruksela Streszczenie Abstract Wprowadzenie: (BioRad, Francja) jest nowym pod³o em chromogennym przeznaczonym do hodowli grzybów, bezpoœredniej identyfikacji Candida albicans oraz wstêpnej identyfikacji gatunków C. glabrata, C. krusei oraz C. tropicalis. Cel pracy: Ocena przydatnoœci do hodowli i identyfikacji grzybów. Na badania sk³ada³y siê kontrola selektywnoœci pod³o a, ocena morfologii 16 gatunków grzybów dro d opodobnych na pod³o u oraz hodowla, a nastêpnie identyfikacja grzybów z 88 materia³ów klinicznych. Materia³ i metody: Badano ³¹cznie 204 szczepy, w tym 57 C. albicans, 43 C. glabrata, 18 C. krusei, 13 C. tropicalis, 23 C. parapsilosis, 6 C. kefyr, 6 C. guilliermondii, 4 C. dubliniensis, 7 C. inconspicua, 2 C. rugosa, 1 C. norvegensis, 1 C. lusitaniae, 1 C. lipolytica, 19 S. cerevisiae, 2 C. neoformans, 1 P. anomala. Hodowle grzybów na inkubowano przez 72 godz., kolor i intensywnoœæ zabarwienia kolonii opisywano co 24 godz. Materia³y kliniczne (mocz 32, plwocina 30, ka³ 26) wysiewano jednoczeœnie na pod³o e oraz pod³o e Sabourauda. Wstêpn¹ identyfikacjê na porównywano z wynikami testów asymilacyjnych i RFLP. Wyniki: Z wyj¹tkiem jednego szczepu C. albicans, wszystkie szczepy (wzorcowe i kliniczne) z gatunków C. albicans, C. glabrata, C. krusei i C. tropicalis wykazywa³y typow¹ morfologiê i kolor. Trudnoœci w identyfikacji dotyczy³y szczepów C. dubliniensis, które sklasyfikowano jako C. albicans oraz niektórych szczepów C. parapsilosis (14 szczepów), C. inconspicua (1 szczep) i S. cerevisiae (2 szczepy), które oznaczono jako C. glabrata. Czu³oœæ i specyficznoœæ identyfikacji za pomoc¹ pod³o a wynosi³a 98% i 87% dla C. albicans, 100% i 98,4% dla C. tropicalis, 100% i 90% dla C. glabrata oraz 100% i 100% dla C. krusei. W wyniku posiewu materia³ów klinicznych uzyskano 49 izolatów, które na podstawie wzrostu na pod³o u Candi-Select 4 sklasyfikowano jako C. albicans (31 szczepów), C. tropicalis (1 szczep) i C. spp (17 szczepów). Weryfikacja identyfikacji testami metabolicznymi i genetycznymi potwierdzi³a jej prawid³owoœæ w stosunku do szczepów C. albicans i C. tropicalis. W grupie Candida spp. znalaz³y siê 2 szczepy C. krusei oraz 1 C. tropicalis. Podsumowanie: Uzyskane przez nas wyniki potwierdzi³y przydatnoœæ pod³o a do hodowli i wstêpnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida, w³¹czaj¹c gatunki oporne na flukonazol. S³owa kluczowe: identyfikacja Candida, pod³o a chromogenne, Introduction: (BioRad) is a new chromogenic medium recommended for selective isolation of yeasts, direct identification of Candida albicans and presumptive identification of C. glabrata, C. tropicalis and C. krusei. Aim: The aim of this study was to evaluate the performance of for the culture and identification of yeasts. The study included the obser vation of colony morphology of 16 yeast-like species as well as the culture and identification of yeast from 88 clinical samples. Material and methods: A total number of 204 strains included 57 C. albicans, 43 C. glabrata, 18 C. krusei, 13 C. tropicalis, 23 C. parapsilosis, 6 C. kefyr, 6 C. guilliermondii, 4 C. dubliniensis, 7 C. inconspicua, 2 C. rugosa, 1 C. norvegensis, 1 C. lusitaniae, 1 C. lipolytica, 19 S. cerevisiae, 2 C. neoformans, and 1 P. anomala. The yeasts cultures on medium were incubated for 72 hours, the colony morphology and pigmentation were read visually after every 24 hours. Results: With exception of one C. albicans strain, all strains of C. albicans, C. tropicalis, C. krusei and C. glabrata formed typical colonies and were classified correctly. C. dubliniensis was misidentify as C. albicans and some strains of C. parapsilosis, C. inconspicua, S. cerevisiae were classified as C. glabrata. The sensitivity and specificity values for C. albicans were 98% and 87%, for C. tropicalis 100% and 98.4%, for C. krusei 100% and 100%, and for C. glabrata 100% and 90%. The 49 strains, isolated from clinical materials, were classified according to the morphology on medium as C. albicans (31 isolates), C. tropicalis (1 isolate), and Candida spp. (17 isolates). The comparison with the results of biochemical tests and RFLP reveals correct identification of C. albicans and C. tropicalis strain, whereas among the strains classified as C. spp. 2 isolates of C. krusei and 1 C. tropicalis were found. Conclusion: could be regarded as a useful medium for presumptive identification of most commonly isolated Candida species, including fluconazole resistant. Key words: identification of Candida, chromogenic media, Wprowadzenie jest nowym pod³o em chromogennym dla grzybów, wyprodukowanym przez firmê BioRad (Francja). Pod³o- e jest przeznaczone do hodowli grzybów, bezpoœredniej identyfikacji Candida albicans oraz wstêpnej identyfikacji gatunków Adres do korespondencji: Dr n. med. Urszula Nawrot Katedra i Zak³ad Mikrobiologii AM ul. Cha³ubiñskiego 4, Wroc³aw, nawrot@mbio.am.wroc.pl C. glabrata, C. krusei oraz C. tropicalis. Podstaw¹ ró nicowania grzybów na pod³o u jest kolor i morfologia kolonii. C. albicans wzrasta w postaci ró owopurpurowych kolonii, C. glabrata tworzy kolonie jasnozielone z charakterystyczn¹ morfologi¹ rybiego oka (intensywnie zabarwione centrum kolonii, przezroczysta czêœæ peryferyjna), C. krusei tworzy kolonie turkusowe, szorstkie, a C. tropicalis turkusowe g³adkie. Zró nicowanie koloru jest zwi¹zane z wytwarzaniem przez grzyby enzymów, które dzia³aj¹ na chromogenne substraty, dodane do pod- ³o a. Enzymami, tymi s¹ heksozoaminidaza, produkowana przez 267

2 268 Urszula Nawrot et al. Evaluation of (BioRad) a chromogenic medium for yeasts differentiation C. albicans i C. dubliniensis, oraz fosfataza, produkowana przez C. glabrata, C. krusei i C. tropicalis. Dziêki obecnoœci antybiotyków przeciwbakteryjnych (chloramfenikol, gentamycyna) pod³o- e jest wybiórcze dla grzybów i mo e byæ stosowane zarówno do bezpoœredniego posiewu materia³ów klinicznych, jak i hodowli izolatów uzyskanych na innych pod³o ach (1). Cel pracy Celem pracy by³a ocena przydatnoœci pod³o a do hodowli i identyfikacji grzybów z rodzaju Candida. Materia³ i metody Na badania sk³ada³y siê: 1. Kontrola selektywnoœci pod³o a. 2. Ocena morfologii ró nych gatunków grzybów dro d opodobnych na pod³o u. 3. Ocena przydatnoœci pod³o a do hodowli i wstêpnej identyfikacji grzybów bezpoœrednio z materia³ów klinicznych. 1. Kontrola selektywnoœci Na pod³o e wysiewano kliniczne izolaty bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Posiewy inkubowano w temp. 37 o C przez 5 dni. Zastosowano nastêpuj¹ce gatunki bakterii: Staphylococcus aures (3 szczepy), S. epidermidis (2 szczepy), S. saprophiticus (1 szczep), Enterococcus spp. (12 szczepów), Pseudomonas aeruginosa (8 szczepów), Klebsiella pneumoniae (2 szczepy), Seratia marcescens (2 szczepy), Escherichia coli (2 szczepy), Stenotrophomonas maltophilia (1 szczep), Acinetobacter sp. (2 szczepy). 2. Ocena morfologii grzybów na pod³o u W badaniach zastosowano ³¹cznie 204 szczepy, w tym 19 szczepów wzorcowych z kolekcji ATCC i IHEM oraz 185 szczepów klinicznych (tab. I), zidentyfikowanych wczeœniej na podstawie testów asymilacyjnych ID 32C (biomérieux) oraz wzorców restrykcyjnych (metoda RFLP) (2, 3). 24-godzinne hodowle badanych szczepów na pod³o u Sabourauda z dodatkiem glukozy (4%) zawieszano w roztworze soli fizjologicznej (gêstoœæ 3, w skali MF), a nastêpnie wysiewano na p³ytki z pod³o em. Ka dy szczep wysiewano jednoczeœnie technik¹ redukcyjn¹ oraz rys¹ (posiew izolacyjny). P³ytki inkubowano w ciemnoœci, w temp. 35 o C przez 72 godz. Morfologia wzrostu grzybów by³a opisywana co 24 godz. przez osobê niepoinformowan¹ o przynale noœci gatunkowej badanych szczepów. Kolor i intensywnoœæ zabarwienia kolonii porównywano z wzorcem barw katalogu RAL (Niemcy). 3. Zastosowanie pod³o a do izolacji i identyfikacji grzybów z materia³u klinicznego Materia³ badany stanowi³o 88 próbek klinicznych (mocz 32, plwocina 30, ka³ 26), które wysiewano jednoczeœnie na pod³o e, pod³o e agarowe Sabourauda z chloramfenikolem oraz na pod³o e p³ynne Sabourauda. Zgodnie z procedur¹ przyjêt¹ w naszym laboratorium próbki ka³u i plwociny o masie oko³o 10 mg rozprowadzano na powierzchni p³ytki Sabourauda, bez przepalania ezy. Przy wysiewie tych materia- ³ów na pod³o e stosowano technikê posiewu redukcyjnego. Próbki moczu wysiewano iloœciowo, ezami kalibrowanymi o objêtoœci 1 i 10 µl. P³ytki inkubowano w 35 o C, w ciemnoœci przez 4 dni. Hodowle na pod³o u Sabourauda inkubowano 24 godz. w temp. 35 o C, a nastêpnie w temp. 28 o C przez 3 dni. Wyhodowane grzyby wstêpnie identyfikowano na podstawie morfologii kolonii na pod³o u Candi- Select 4, a nastêpnie identyfikacjê potwierdzano klasycznymi metodami (morfologia na pod³o u ry owym, auksanogram wêglowodanowy, testy ID 32-C, biomérieux) oraz metod¹ RFLP. Mikologia Lekarska 2005, 12 (4) 4. Identyfikacja szczepów na podstawie polimorfizmu restrykcyjnego w wybranym regionie rdna (RFLP) DNA izolowano z grzybów hodowanych przez 20 godz. w p³ynnym pod³o u YPG (1% ekstrakt dro d owy, 2% pepton i 2% glukoza) w temp. 30 o C z wytrz¹saniem (196 cykli/min), wg metody podanej przez Rose i wsp. (4) z modyfikacjami. Odwirowane komórki grzybów zawieszano w 200 µl 50 mm buforu Tris-HCl (ph 7,5) zawieraj¹cego 25 mm EDTA, 1% merkaptoetanolu i 0,5% enzymu do trawienia dro d y (ICN, nr kat ). Po 40 min inkubacji w temp. 37 o C, dodawano 200 µl roztworu do lizy (1% SDS i 0,2 M NaOH) i po delikatnym wymieszaniu inkubowano przez 10 min w temp. 65 o C. Nastêpnie dodawano 240 µl 3 M octanu sodu (ph 5,2) ponownie mieszano i inkubowano przez 10 min w temp. -20 o C. Lizat wirowano przez 15 min ( rpm, 4 o C), po czym supernatant przenoszono do nowej probówki. DNA wytr¹cano, dodaj¹c równ¹ objêtoœæ zimnego (-20 o C) izopropanolu i zbierano przez odwirowanie (15 min, rpm, 4 o C). Osad DNA przemywano 70% etanolem, suszono i rozpuszczano w 100 µl wody z dodatkiem 3 µl RNazy o stê eniu 10 mg/ml. Otrzymane w ten sposób próbki DNA s³u y- ³y jako matryca w reakcji PCR ze starterami ITS1 (TCCGTAGGT- GAACCTGCGG) i NL2 (CTCTCTTTTCAAAGTGCTTTTCATCT) amplifikuj¹cymi konserwatywny region koduj¹cy 5,8S rrna wraz z otaczaj¹cymi go sekwencjami ITS. Produkty reakcji PCR poddawano dzia³aniu enzymu restrykcyjnego HpaII. Uzyskane fragmenty restrykcyjne rozdzielano elektroforetycznie w 1,7% elu agarozowym w obecnoœci markera masy. Wzory restrykcyjne uzyskane dla szczepów badanych porównywano z wzorami szczepów wzorcowych (2, 3). Badaniami tymi objêto ³¹cznie 158 izolatów, w tym 52 izolowane z aktualnie badanych materia³ów klinicznych. Ocena statystyczna wyników Identyfikacja uzyskana na podstawie testów biochemicznych i wzorów restrykcyjnych zosta³a uznana za prawdziw¹ i by³a punktem odniesienia dla wyników uzyskiwanych na pod- ³o u. Czu³oœæ oraz specyficznoœæ identyfikacji poszczególnych gatunków Candida za pomoc¹ pod³o a Candi- Select 4 obliczano nastêpuj¹co: wyniki prawdziwie dodatnie 100 Czu³oœæ = wyniki prawdziwie dodatnie + wyniki fa³szywie ujemne wyniki prawdziwie ujemne 100 Specyficznoœæ = wyniki prawdziwie ujemne + wyniki fa³szywie dodatnie Wyniki 1. Kontrola selektywnoœci Na pod³o u nie uzyskano wzrostu adnego z badanych szczepów bakteryjnych. 2. Ocena morfologii grzybów na pod³o u Szczegó³owe wyniki przedstawiono w tabeli I. Z wyj¹tkiem jednego szczepu C. albicans, wszystkie szczepy (wzorcowe i kliniczne) z gatunków C. albicans, C. glabrata, C. krusei i C. tropicalis wykazywa³y typow¹ morfologiê i kolor, zgodnie z opisem producenta. Candida spp., a tak e szczepy S. cerevisiae i C. neoformans tworzy³y kolonie o ró nych odcieniach koloru zielonego i niebieskiego, tylko 2 szczepy S. cerevisiae tworzy³y bezbarwne kolonie. Kolonie o kolorze czerwono-liliowym tworzy³y tylko szczepy C. albicans oraz C. dubliniensis, przy czym po d³u szej, 72-godzinnej, inkubacji kolor kolonii C. albicans stawa³ siê mniej intensywny, podczas gdy kolonie C. dubliniensis zyskiwa³y odcieñ niebieski (ryc. 1a). Czu³oœæ identyfikacji C. albicans w tej grupie szczepów wynosi³a 98%, a specyficznoœæ 97%.

3 Tabela I: Charakterystyka wzrostu grzybów na pod³o u Table I: Morphology of the yeast growing on medium Gatunek/Liczba szczepów Species/Number of strains Szczepy wzorcowe, i liczba szczepów klinicznych Strains from collections and number of clinical isolates Kolor (po 48 godz.) Colour after 48 hrs incubation C. albicans n=58 C. dubliniensis n=4 C. glabrata n=44 C. krusei n=19 C. tropicalis n=14 C. parapsilosis n=24 C. kefyr n=5 C. guilliermondii n=4 C. inconspicua n=2 C. rugosa n=2 S. cerevisiae n=22 Urszula Nawrot i wsp. Ocena przydatnoœci chromogennego pod³o a (BioRad) do izolacji i wstêpnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida Nr koloru wg katalogu RAL Colour number according to catalogue RAL ATCC Czerwono-liliowy 4001/4009 W=K n=56 Red-violet + n=1 Bia³y / White W=K ATCC-MYA-646 Czerwono-liliowy n=3 z odcieniem niebieskim Red-violet with blue shade ATCC Jasnozielony/turkusowy W: K: 6027 IHEM /turquoise n=42 ATCC-6258 n=18 ATCC-750 n=13 Ciemny turkusowo- -niebieski Dark turquoise blue Ciemny turkusowo- -niebieski Dark turquoise blue Jasnozielony/turkusowo- -niebieski /turquoise blue Halo Uwagi Remarks Po 72 godz. spada intensywnoœæ barwy After 72 hrs intensity of the colour decreased 4001/4009 W=K + Po 72 godz. inkubacji wzmaga siê odcieñ niebieski 5014 i 024 / After 72 hrs blue shade increased (No. 5014) 5018/5021 W=K ATCC IHEM 3270 n=22 IHEM Jasnozielony 6019/6027 W=K n=4 IHEM Niebieski / Blue 5021/5019 W=K + n=3 Turkusowo-niebieski 6033/5018 W=K IHEM15763 Jasnoturkusowy 6034 W=K n=1 Light turquoise IHEM 6703 Turkusowo-niebieski 5018/5019 W=K n=1 Turkusowo-niebieski W: 5021/5019 K: d IHEM3963 Turkusowo-niebieski W: 6034/5018 K:6033 n=3 n=14 Turkusowo-niebieski Kolonie o morfologii rybiego oka, mo na zaobserwowaæ tylko po uzyskaniu pojedynczych kolonii o odpowiednio du ej wielkoœci Colonies with the fish eye morphology were observed only in single colonies of appropriate size Kolonie szorstkie / Rough colonies 5018/5021 W=K + Kolonie g³adkie, po 72 godz. wzrasta intensywnoœæ barwy niebieskiej Colonies smooth, after 72 hrs blue shade increase W: 6027/p K: 6027 W: 5018/ K: n=2 Jasnozielony 6027/6034 W=K n=2 Kremowobia³y 9001 W=K Creamy-white C. norvegensis n=1 IHEM Turkusowy / Turquoise 6034 W=K C. lusitaniae n=1 IHEM 3979 Turkusowo-niebieski W: p K: 6033 C. lipolytica n=1 IHEM 1958 Turkusowy / Turquoise W: 6033 K: p Pichia anomala IHEM 4425 Jasnozielony W: 6027/6034 n=1 K: p Cryptococcus neoformans n=2 IHEM14227 IHEM 3969 Turkusowo-niebieski W: K: p Kolonie œluzowe / Slimy colonies W kolor obserwowany przy posiewie izolacyjnym / colour of closely-growing yeast; K kolor pojedynczych kolonii uzyskanych w wyniku rozsiewu redukcyjnego / colour of single colonies Kolonie C. glabrata o charakterystycznej morfologii rybiego oka, z zielon¹ czêœci¹ centraln¹ i jasn¹ czêœci¹ peryferyjn¹, mo na by³o zaobserwowaæ tylko wówczas, gdy uzyskano kolonie odpowiednio du ych rozmiarów (ryc. 1b). Jasnozielony kolor kolonii, zbli ony do typowego dla C. glabrata wykazywa³y niektóre szczepy C. parapsilosis (14 szczepów), C. inconspicua (1 szczep) i S. cerevisiae (2 szczepy) (ryc. 1c). Czu³oœæ identyfikacji C. glabrata wynosi³a 100%, a specyficznoœæ 90%. C. tropicalis i C. krusei tworzy³y kolonie o kolorze ciemnoniebieskim, przy czym ró ni³y siê struktur¹, kolonie C. krusei by³y szorstkie, a C. tropicalis g³adkie (ryc. 1d). Dwa szczepy C. rugosa i jeden S. cerevisiae tworzy³y kolonie zbli one kolorem i morfologi¹ do C. tropicalis. Czu³oœæ i specyficznoœæ identyfikacji C. tropicalis wynosi³a odpowiednio 100 i 98%, natomiast C. krusei 100 i 100%. 3. Zastosowanie pod³o a do hodowli i izolacji grzybów z materia³ów klinicznych Grzyby wyhodowano z 40 (44,3%) spoœród 88 badanych materia³ów. Posiew na pod³o e umo liwi³ wyhodowanie 40 szczepów (z 27 materia³ów), z czego 22 (55%) zosta³o zidentyfikowane w ci¹gu 48 godz. do poziomu gatunku, a 14 jako C. spp. (tab. II). W trzech badaniach nast¹pi³o odbarwienie agaru w miejscu naniesienia materia³u (ka³), co uniemo liwi³o bezpoœredni odczyt koloru kolonii i opóÿni³o identyfikacjê. Z 13 materia³ów wyhodowano grzyby tylko na p³ynnym lub sta³ym pod³o u Sabourauda. Grzyby te by³y nastêpnie przesiewane na Candi Select 4. Hodowle mieszane uzyskano z 12 materia³ów, przy czym z 3 materia³ów wyizolowano 3, a z 9 2 gatunki grzybów dro d opodobnych. W czte- 269

4 Urszula Nawrot et al. Evaluation of (BioRad) a chromogenic medium for yeasts differentiation Mikologia Lekarska 2005, 12 (4) b a c d Ryc. 1. Morfologia wzrostu grzybów na pod³o u : a) C. albicans (góra) i C. dubliniensis; b) C. parapsilosis (góra) i C. glabrata; c) C. rugosa, S. caerevisiae, C. inconspicua; d) C. krusei (góra) i C. tropicalis Fot. 1. Morphology of the yeast : a) C. albicans (top) and C. dubliniensis; b) C. parapsilosis (top) and C. glabrata; c) C. rugosa, S. caerevisiae, C. inconspicua; d) C. krusei (top) and C. tropicalis 270 rech materia³ach oprócz grzybów dro d opodobnych stwierdzono pojedyncze kolonie grzybów z rodzaju Aspergillus (1 materia³) i Penicilium (3 materia³y), które wyhodowano na pod³o u sta³ym Sabourauda. Ogó³em wyizolowano 53 szczepy grzybów dro d opodobnych, w tym 2 szczepy Geotrichum sp. i 2 szczepy Rhodotorula sp., które wy³¹czono z dalszej analizy. Identyfikacjê pozosta³ych 49 szczepów na podstawie morfologii na pod- ³o u oraz testów biochemicznych i RFLP zestawiono w tabelach II i III. ¹cznie 31 szczepów sklasyfikowano jako C. albicans, 1 jako C. tropicalis i 17 jako C. spp. Weryfikacja identyfikacji testami metabolicznymi i genetycznymi potwierdzi³a jej prawid³owoœæ w stosunku do wszystkich szczepów zaklasyfikowanych jako C. albicans (23) i C. tropicalis (1). W grupie szczepów Candida spp. znalaz³y siê dwa szczepy C. krusei oraz jeden C. tropicalis. Omówienie Pod³o e umo liwia prawid³ow¹ identyfikacjê blisko 100% szczepów C. albicans gatunku który jest najczêstszym czynnikiem etiologicznym kandydozy. Wœród przebadanych 204 szczepów reprezentuj¹cych ³¹cznie 16 gatunków grzybów dro d opodobnych, jedynie C. albicans i C. dubliniensis dawa³y kolonie o zbli onym ró owo-czerwonym zabarwieniu, przy czym grzyby te ró ni³y siê odcieniem kolonii (ryc. 1a). Gatunki C. albicans i C. dubliniensis s¹ filogenetycznie blisko spokrewnione i cechuj¹ siê znacznym podobieñstwem morfologicznym. Oba gatunki wytwarzaj¹ chlamydospory na pod³o u Nickersona, maj¹ dodatni test filamentacyjny i zwykle s¹ trudne do odró nienia na znanych pod³o ach chromogennych np. CHROMagar Candida (BectonDickinson) (5), lecz mo na je ³atwo rozró niæ testami biochemicznymi, np. ID32C biomérieux, lub metodami genetycznymi, np. PCR ze specyficznymi starterami (6, 7). C. dubliniensis jest zaliczana do patogennych grzybów i jest izolowana g³ównie od pacjentów z obni on¹ odpornoœci¹. Gatunek ten jest spotykany zdecydowanie rzadziej ni C. albicans, jednak nie powinien byæ z tego wzglêdu pomijany w diagnostyce. Wydaje siê, e wnikliwa obserwacja hodowli na pod³o u, prowadzona przez 3 kolejne dni, powinna umo liwiæ wyizolowanie szczepów C. dubliniensis, ró ni¹cych siê pojawiaj¹cym siê niebieskim odcieniem od typowych czerwonych kolonii C. albicans. Identyfikacja C. glabrata, C. krusei i C. tropicalis za pomoc¹ pod ³o a jest zdecydowanie trudniejsza, co producent uwzglêdni³, rekomenduj¹c jedynie wstêpn¹ identyfikacjê tych gatunków. W omawianej ocenie szczególnie k³opotliwe okaza³o siê rozró nienie C. glabrata. Na pod³o u gatunek ten wzrasta w postaci jasnozielonych kolonii, jednak charakterystyczn¹ morfologiê rybiego oka mo na zaobserwowaæ tylko po uzyskaniu pojedynczych kolonii, odpowiedniej wielkoœci. Istnieje niebezpieczeñstwo, e niedoœwiadczony obserwator zaliczy szczepy z gatunków C. parapsilosis, C. inconspicua, czy S. cerevisiae, wzrastaj¹ce w postaci jasnozielonych kolonii, do C. glabrata. W tym miejscu nale y podkreœliæ, e równie na innych pod³o ach chromogennych czêœæ szczepów C. spp. wykazuje podobieñstwo do C. glabrata. Problem ten dotyczy m.in. pod³o a Chromagar Candida, na którym niektóre szczepy gatunków C. parapsilosis, C. inconspicua, C. kefyr, C. lusitaniae, C. guilliermondii, czy C. famata tworz¹ kolonie zbli one kolorem do C. glabrata (8-10). W badaniach w³asnych (3) wykazano b³êdn¹

5 Urszula Nawrot i wsp. Ocena przydatnoœci chromogennego pod³o a (BioRad) do izolacji i wstêpnej identyfikacji grzybów z rodzaju Candida Tabela II: Wstêpna identyfikacja grzybów wyros³ych z posiewu bezpoœredniego materia³ów klinicznych na pod³o u ; porównanie z identyfikacj¹ na podstawie testów metabolicznych i RFLP Table II: presumptive identification of yeast growing directly from clinical samples Liczba szczepów (n=40) Number of strains (n=40) Rodzaj materia³u Clinical sample Nr koloru wg katalogu RAL Colour number according to catalogue RAL Kolor (po 48 godz.) Colour after 48 hrs incubation Identyfikacja wg Presumptive identification on Identyfikacja koñcowa Final identification Zgodnoœæ Agreement between presumptive and final identification 16 Plwocina / Sputum 4001/4009 Czerwono-liliowy / Red-violet C. albicans C. albicans Tak / Yes 5 Ka³ / Stool 4001/4009 Czerwono-liliowy / Red-violet C. albicans C. albicans Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 5018 Turkusowy hallo / Turquoise with halo C. tropicalis C. tropicalis Tak / Yes 1 Mocz / Urine 5000 Niebiesko-fioletowy z hallo C. sp. C. krusei Nie / No Blue-violet with halo 1 Plwocina / Sputum 5000 Niebiesko-fioletowy z hallo C. sp. C. krusei Nie / No Blue-violet with halo 1 Ka³ / Stool 6027 Bardzo jasny zielony C. sp. S. cerevisiae Tak / Yes 1 Ka³ / Stool 6027 Bardzo jasny zielony / C. sp. C. parapsilosis Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 9018 Bezbarwny / Colourless C. sp. C. sp. Tak / Yes 1 Ka³ / Stool 9018 Bezbarwny / Colourless C. sp. C. rugosa Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 6027/6019 Jasny zielono-niebieski C. sp C. rugosa Tak / Yes -blue 1 Plwocina / Sputum 6027/5018 Jasny zielony / C. sp. S. cerevisiae Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 6027 Jasny zielony / C. sp. C. inconspicua Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 6027 Jasny zielony / C. sp. C. inconspicua Tak / Yes 1 Ka³ / Stool 5021/5018 Turkusowo-morski / C. sp. S. cerevisiae Tak / Yes 1 Plwocina / Sputum 5018 Turkusowy 5018 / Turquoise C. sp. C. inconspicua Tak / Yes 1 Mocz / Urine 6027 Bardzo jasny zielony C. sp./c. parapsilosis C. parapsilosis Tak / Yes 1 Ka³ / Stool 6027 Bardzo jasny zielony C. sp./c. parapsilosis C. parapsilosis Tak / Yes 1 Ka³ / Stool Podbarwione materia³em Sample changed colour of the medium Brak No identification C. inconspicua 3 Ka³ / Stool Podbarwione materia³em Sample changed colour of the medium Brak No identification C. albicans Tabela III: Wstêpna identyfikacja izolatów grzybów na pod³o u ; porównanie z identyfikacj¹ na podstawie metabolizmu i RFLP Table III: Presumptive identification of yeast isolates on ; comparison with identification based on biochemical features and RFLP Liczba szczepów (n=13) Number of strains (n=13) Rodzaj materia³u Clinical sample Nr koloru wg katalogu RAL Colour number according to catalogue RAL Kolor (po 48 godz.) Colour after 48 hrs incubation Identyfikacja wg Presumptive identification on Identyfikacja koñcowa Final identification Zgodnoœæ Agreement between presumptive and final identification 1 Ka³ / Stool 6027/p.5018 Jasnozielony / C. sp. C. parapsilosis Tak / Yes 1 Ka³ / Stool 5021 Turkusowy / Turquoise C. sp. C. tropicalis Nie / No 1 Ka³ / Stool 6034 Jasny turkusowy / Light turquoise C. sp. C. inconspicua Tak / Yes 7 Ka³ / Stool 4001/4009 Czerwono-liliowy / Red-violet C. albicans C. albicans Tak / Yes 2 Plwocina / Sputum 4001/4009 Czerwono-liliowy / Red-violet C. albicans C. albicans Tak / Yes 1 Mocz / Urine 4001/4009 Czerwono-liliowy / Red-violet C. albicans C. albicans Tak / Yes identyfikacjê na pod³o u Chromagar Candida 30% izolatów oznaczonych przez laboratorium diagnostyczne jako C. glabrata. Ze wzglêdu na czêst¹ opornoœæ tego gatunku na triazole prawid³owa identyfikacja izolatów klinicznych ma ogromne znaczenie praktyczne, decyduje o wyborze w³aœciwej terapii. Identyfikacjê C. glabrata mo na ³atwo potwierdziæ, stosuj¹c proste testy biochemiczne oparte na asymilacji trehalozy (11, 12) i innych cukrów (np. testy ID32C biomérieux, AUXACOLOR BioRad). Problemem mo e byæ równie identyfikacja C. krusei i C. tropicalis, które rosn¹ na pod³o u w postaci ciemnoniebieskich kolonii, szorstkich i p³askich u C. krusei oraz g³adkich u C. tropicalis (ryc. 1d). Ciemnoniebieski kolor mia³y tak e niektóre szczepy gatunków C. rugosa i S. cerevisiae, które b³êdnie zaklasyfikowano jako C. tropicalis. Gatunki te rzadko powoduj¹ zaka enia, jednak mog¹ wystêpowaæ w materia³ach klinicznych, np. S. cerevisiae, który czêsto jest obecny w przewodzie pokarmowym. C. tropicalis jest uwa ana za gatunek szczególnie niebezpieczny u pacjentów hematologicznych, u których powoduje zaka enia krwi, cechuj¹ce siê wysok¹ œmiertelnoœci¹. W tej grupie pacjentów wykrycie kolonizacji œluzówek przez C. tropicalis jest podstaw¹ rozpoczêcia prewencyjnej terapii przeciwgrzybiczej. Prawid³owa identyfikacja jest w tym wypadku niezmiernie istotna i pod³o a chromogenne s¹ w niej bardzo przydatne. Chocia nie daje 100-proc. pewnej identyfikacji C. tropicalis, to jednak zawê a liczbê izolatów, które wymagaj¹ bardziej dok³adnych metod diagnostycznych. Kolejny gatunek ró nicowany na pod³o u C. krusei jest znany z naturalnej opornoœci na flukonazol. Ze wzglêdu na charakterystyczn¹ morfologiê kolonii jest on stosunkowo ³atwy do identyfikacji. W badanym materiale rozró - nienie C. krusei by³o bardzo dobre, jednak dwa izolaty C. krusei wykazuj¹ce nietypow¹ morfologiê nie zosta³y rozpoznane. Przydatnoœæ pod³o a jako wybiórczego do hodowli grzybów oceniono bardzo wysoko. Nie stwierdzono 271

6 Urszula Nawrot et al. Evaluation of... Mikologia Lekarska 2005, 12 (4) wzrostu adnych bakterii na tym pod³o u, jednoczeœnie wszystkie badane szczepy grzybów dro d opodobnych hodowano na. Wysiewaj¹c materia³y kliniczne (ka³, plwocina) na agar Sabourauda i na pod³o e stosowano ró ne techniki posiewu, co utrudnia bezpoœrednie porównanie uzyskanych wyników. Rozsiew redukcyjny umo liwia wzrost grzybów w postaci pojedynczych kolonii, co jest decyduj¹ce, aby dokonaæ prawid³owej oceny morfologii na pod³o u. Stosuj¹c technikê bezpoœredniego rozsiewu, nanoszono na pod- ³o e Sabourada wiêksz¹ iloœæ badanego materia³u, dziêki czemu uzyskano wzrost grzybów z wiêkszej liczby badanych materia³ów. Technika ta umo liwia pó³iloœciow¹ ocenê wzrostu grzybów, jednak e w przypadku masywnej infekcji uzyskuje siê zlewny wzrost grzybów, co z kolei uniemo liwia charakterystykê pojedynczych kolonii. Z tego wzglêdu przy posiewie na pod³o e nale y stosowaæ rozsiew redukcyjny. W naszej opinii przy posiewie materia³ów klinicznych, a szczególnie materia³ów pochodz¹cych od pacjentów z obni on¹ odpornoœci¹, gdzie nawet niewielka iloœæ wyhodowanych grzybów mo e mieæ wartoœæ diagnostyczn¹, powinno siê stosowaæ jednoczeœnie pod³o e chromogenne oraz agar Sabourauda. Uzyskane przez nas wyniki potwierdzaj¹ przydatnoœæ pod³o- a w izolacji dro d aków z infekcji mieszanych, a tak e we wstêpnej identyfikacji gatunków C. albicans, C. glabrata, C. krusei i C. tropicalis. Podziêkowania Autorzy pracy dziêkuj¹ firmie BioRad za udostêpnienie pod³o y oraz zakup szczepów wzorcowych z kolekcji ATCC. Piœmiennictwo 1. : Interpretation. Instrukcja wydana przez BioRad. 2. Koczocik K., Nawrot U., Potocka N., Ska³a J.: Przypadki b³êdnej identyfikacji szczepów Candida glabrata na pod³o u CHROMagar Candida (EMAPOL): II Krajowy Kongres Biotechnologii. ódÿ, czerwca 2003 r. Materia³y konferencyjne, s. 55, poz. P A Jab³oñska J., Punicka J., Nawrot U., Ska³a J.: Typing of pathogenic Candida strains on the basis of restrictive r DNA analysis. Med. Sci. Monit. 2000, 6, Suppl. 3; s. 119, abstr. C/P-39 XXIV Congress of the Polish Society of Microbiologists. Bia- ³ystok, September 12-15, Book of Abstracts. 4. Rose M.D., F. Winston, Hietr P. : Methods in yeast genetics. A laboratory course manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Kirkpatrick W.R., Revankar S.G., Mcatee R.K., Lopez-Ribot J.L., Fothergill A.W., McCarthy D.I., Sanche S.E., Cantu R.A., Rinaldi M.G., Patterson T.F.: Detection of Candida dubliniensis in oropharyngeal samples from human immunodeficiency virus-infected patients in North America by primary CHROMagar candida screening and susceptibility testing of isolates. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, Sullivan D., Coleman D.: Candida dubliniensis: characteristics and identyfication. J. Clin. Microbiol., 1998, 36, Mahnss B., Stehr F., Schafer W., Neuber K.: Comparison of standard phenotypic assays with a PCR method to discriminate Candida albicans and C. dubliniensis. Mycoses, 2005, 48, Hospenthal D.R., Murray C.K., Beckius M.L., Green J.A., Dooley D.P.: Persistence of pigment production by yeast isolates grown on CHROMagar Candida medium. J. Clin. Microbiol., 2002, 40, Yucesoy M., Marol S.: Performance of CHROMAGAR Candida and BIGGY agar for identification of yeast species. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrobiol., 2003, 2, Odds F.C., Bernaerts R.: CHROMagar Candida, a new differential isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J. Clin. Microbiol., 1994, 32, Piens M.A., Perry J.D., Raberin H., Parant F., Freydiere A.M.: Routine use of a one minute trehalase and maltase test for the identification of Candida glabrata in four laboratories. J. Clin. Pathol., 2003, 56, Freydiere A.M., Parant F., Noel-Baron F., Crepy M., Treny A., Raberin H., Davidson A., Odds F.C.: Identification of Candida glabrata by a 30-second trehalase test. J. Clin. Microbiol., 2002, 40, Praca wp³ynê³a do Redakcji: Zaakceptowano do druku: