ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 517:

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 517: ZRÓśNICOWANIE GENETYCZNE WYBRANYCH DRZEWOSTANÓW ŚWIERKA POSPOLITEGO (Picea abies L. KARST.) NA PRZYKŁADZIE RASY ISTEBNIAŃSKIEJ PRZY WYKORZYSTANIU MARKERÓW RAPD Anna Faber 1, Janusz Sabor 2, Dariusz Grzebelus 3 1. Międzywydziałowe Studium Biotechnologii, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 2. Katedra Nasiennictwa, Szkółkarstwa i Selekcji Drzew Leśnych, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie 3. Katedra Genetyki, Hodowli i Nasiennictwa, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie Wstęp Populacja świerka istebniańskiego oddziału 149h Nadleśnictwa Wisła od wielu lat uznawana jest za bardzo cenny ekotyp gatunku Picea abies L. KARST. Ze względu na swoją wysoką wartość genetyczno-hodowlaną, stwierdzoną w ramach krajowych i zagranicznych doświadczeń proweniencyjnych, jest obiektem zainteresowań leśników i genetyków. Ponadto ten drzewostan z Bukowca stanowi wzorzec krajowy wybrany w programie testowania potomstwa wyłączonych drzewostanów nasiennych (WDN), drzew doborowych (DD), plantacji nasiennych (PN) i plantacyjnych upraw nasiennych (PUN), oraz jest źródłem leśnego materiału rozmnoŝeniowego (LMR). Jako waŝny gatunek gospodarczy, świerki istebniańskie uwaŝane są za prawdziwą elitę selekcyjną [SABOR 1996] oraz źródło surowca najwyŝszej jakości wykorzystywanego w budownictwie, przemyśle, a takŝe do produkcji instrumentów muzycznych. Badania polimorfizmu świerków z Wisły związane są głównie ze zmiennością opartą na cechach fenotypowych oraz adaptacyjnych analizowanych podczas doświadczeń proweniencyjnych. Zmienność proweniencyjna nie wyczerpuje zagadnienia zmienności świerka pospolitego, chociaŝ pozwala na określenie wartości genetycznej poszczególnych populacji cząstkowych [SABOR 2005]. Uzupełnienie zmienności wewnątrzmiędzypopulacyjnej, określonej w doświadczeniach proweniencyjnych, stanowią badania metodami markerów biochemicznych, które pozwalają na charakterystykę struktury genetycznej analizowanych populacji. W dotychczasowych publikacjach prezentujących wykorzystanie markerów genetycznych w badaniu genomu świerków [KRAJ 2002; NOWAKOWSKA 2004] większą uwagę zwracano na zmienność międzypopulacyjną.

2 278 A. Faber, J. Sabor, D. Grzebelus Natomiast zróŝnicowanie między poszczególnymi osobnikami i wytypowanie tych najbardziej zmiennych w oparciu o analizę DNA jest bardzo istotne, gdyŝ ułatwia wybór drzew najwartościowszych do selekcji indywidualnej. Zachowanie bioróŝnorodności, która warunkuje przeŝycie organizmów długowiecznych, jakimi są drzewa leśne, stanowi jedyny sposób ochrony drzew i zachowanie ich zdolności adaptacyjnych do zmiennych warunków środowiska. Celem niniejszej pracy było wykorzystanie markerów RAPD do oceny polimorfizmu genetycznego świerków populacji istebniańskiej w leśnictwie Bukowiec na przykładzie drzew selekcyjnych wybranych w krajowym Programie testowania potomstwa wyłączonych drzewostanów nasiennych, drzew doborowych, plantacji nasiennych i plantacyjnych upraw nasiennych [SABOR 2004]. Materiał i metody Materiał badawczy stanowiły igły 24 losowo wybranych drzew reprezentujących wyselekcjonowaną populację cząstkową świerka pospolitego Picea abies L. KARST. rasy istebniańskiej pochodzących z Leśnictwa Bukowiec, oddziału 149h, zlokalizowanego w Beskidzie Śląskim. Całkowite DNA izolowano z ok. 100 mg zamroŝonych igieł przy uŝyciu zestawu DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) postępując zgodnie z metodyką podaną przez producenta. Wyizolowane DNA sprawdzano pod kątem ilościowym i jakościowym poprzez rozdział elektroforetyczny na 1% Ŝelu agarozowym wybarwionym bromkiem etydyny. Zmienność wewnątrzpopulacyjną świerka istebniańskiego badano przy wykorzystaniu techniki RAPD. Dla kaŝdego drzewa przygotowano 20 l mieszaniny reakcyjnej zawierającej: ok. 20 ng DNA, 1,6 mm MgCl 2, 0,2 mm dntp, 1,6 M startera RAPD i 0,5 jednostki polimerazy DNA (Fermentas). Reakcję PCR przeprowadzano z wykorzystaniem termocyklera T-Personal (Biometra), zaprogramowanego na 40 cykli amplifikacji DNA. KaŜdy cykl obejmował cztery etapy: denaturację (94 C/30 ), hybrydyzację startera (42 C/30 ), wydłuŝanie nici, tj. polimeryzację (68 C/2 30 ) oraz inkubację, czyli dodatkową polimeryzację (68 C/5 ). Dla kaŝdej próby DNA proces amplifikacji powtarzano dwukrotnie, by określić powtarzalność procedury oraz wyeliminować ewentualne błędy. Uzyskane produkty reakcji PCR rozdzielano w 1% Ŝelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny, w buforze TBE. W celu zobrazowania polimorfizmu wewnątrzpopulacyjnego świerka istebniańskiego uzyskane profile elektroforetyczne analizowano statystycznie przy uŝyciu programów Phylip 3.65 oraz Statistica 6.0. Na podstawie stworzonej macierzy występowania fragmentów RAPD dla wszystkich badanych drzew wyliczono dystans genetyczny dla kaŝdej pary porównywanych osobników. Podobieństwo genetyczne między badanymi osobnikami zobrazowano za pośrednictwem dendrogramu przy uŝyciu metody UPGMA (unweighted pair-group metod of arithmetic averages). Dodatkowo związki między wszystkimi testowanymi świerkami potwierdzono metodą skalowania wielowymiarowego. Wyniki

3 ZRÓśNICOWANIE GENETYCZNE WYBRANYCH DRZEWOSTANÓW ŚWIERKA Dziewiętnaście pojedynczych starterów RAPD przetestowano w celu zbadania zmienności wewnątrzpopulacyjnej wybranych drzew świerka istebniańskiego. Rys. 1. Profile elektroforetyczne uzyskane dla 24 osobników reprezentujących populację świerka istebniańskiego, uzyskane przy uŝyciu techniki RAPD, po amplifikacji starterem A17. ŚcieŜki: profile dla badanych osobników, M- marker wielkości Fig. 1. Elektrophoretic profiles of 24 individuals of Norway spruce, Istebna population, following RAPD-PCR amplification with primer A17. Lanes: profiles for individuals, M - molecular size marker

4 280 A. Faber, J. Sabor, D. Grzebelus wymiar 2; dimension 2 Rys. 2. Dystans genetyczny pomiędzy 24 osobnikami reprezentującymi populację świerka istebniańskiego, zobrazowany względem dwóch wymiarów przy uŝyciu techniki skalowania wielowymiarowego Fig. 2. Genetic distance of 24 individual plants of Norway spruce, Istebna provenance, represented in two dimensions using multidimensional scaling Spośród analizowanych starterów siedem: A01, A09, A10, A11, A17, B04 i B05, generowało wyraźne profile elektroforetyczne róŝnicujące badane osobniki. Pozostałe startery nie dawały Ŝadnych produktów reakcji PCR (3 startery) lub amplifikowały wyłącznie monomorficzne produkty (9 starterów). Całkowita liczba amplikonów uzyskanych przy uŝyciu siedmiu starterów wynosiła 52, a liczba produktów polimorficznych 27. Na podstawie uzyskanych powtarzalnych i specyficznych układów prąŝkowych (rys. 1) dla wszystkich badanych drzew analizowano podobieństwo genetyczne między nimi. Wykreślony dendrogram oraz obraz przestrzennego rozmieszczenia osobników względem dwóch wymiarów i wartości ich dystansów genetycznych (rys. 2) pozwoliły na wyróŝnienie dwóch grup osobników najbardziej podobnych genetycznie oraz grupę drzew cechujących się duŝym zróŝnicowaniem w stosunku do pozostałych. Pierwsza z grup obejmowała 13 osobników, a druga 6. Pozostałe pięć osobników cechowało się większym dystansem genetycznym.

5 ZRÓśNICOWANIE GENETYCZNE WYBRANYCH DRZEWOSTANÓW ŚWIERKA Dyskusja Przeprowadzone badania zmienności genetycznej jednej z polskich proweniencji świerka pospolitego rasy istebniańskiej, przy uŝyciu markerów RAPD, wykazały niski poziom zróŝnicowania genetycznego w obrębie testowanej populacji selekcyjnej. Obliczone wartości dystansów genetycznych pomiędzy badanymi drzewami nie przekroczyły 0,041. Określone duŝe podobieństwo świerków istebniańskich kontrastuje z wysokim stopniem zmienności przypisywanym drzewom tego gatunku pochodzących z rejonu karpacko-hercyńskiego. Wyniki przedstawione w niniejszej pracy znajdują swoje potwierdzenie w najnowszych danych, uzyskanych przez IBL [GŁOWACKA i in. 2006] stwierdzających, Ŝe markery RAPD wykazują niski stopień detekcji zróŝnicowania na poziomie jądrowym polskich populacji świerka pospolitego. Ponadto wcześniejsze dane dotyczące poziomu zróŝnicowania izoenzymów świerków z Istebnej pochodzące z doświadczeń POLAK- BERECKIEJ [2001] równieŝ określają polimorfizm genetyczny tych drzew jako niski, równy 0,204. Określenie polimorfizmu fragmentów RAPD wybranych osobników selekcyjnych świerków istebniańskich pozwoliło stwierdzić, Ŝe pięć spośród nich cechowało się wyŝszą zmiennością genetyczną od pozostałych. Jest to bardzo istotne z perspektywy konieczności wytypowania genotypów, które stanowią potencjalną bazę drzew do selekcji indywidualnej, pozyskania materiału do długookresowego przechowywania w bankach genów oraz do zakładania powierzchni zachowawczych in situ i ex situ, czy tworzenia upraw pokoleń potomnych [MATRAS 1996]. Niski stopień zmienności genetycznej świerczyn rasy istebniańskiej oddziału 149h podkreśla konieczność podjęcia kroków w kierunku ochrony róŝnorodności tego drzewostanu. Wysoka wartość drzew Beskidu Śląskiego określona podczas wieloletnich doświadczeń proweniencyjnych sprawia, Ŝe zajmują one istotne miejsce w programach selekcji i zachowania leśnych zasobów genowych. Od wielu pokoleń trwa proces uszlachetniania drzew leśnych, który ma na celu zachowanie pełnej puli genowej gatunku i poprawę zdrowotności i produkcyjności potomstwa. Markery genetyczne wykorzystane w programach ochrony leśnych zasobów genowych i hodowli selekcyjnej drzew w Polsce pozwalają na monitorowanie struktury genetycznej osobników wybranych do selekcji indywidualnej. Ponadto umoŝliwiają określenie wartości genetyczno-hodowlanej materiału rozmnoŝeniowego. Wnioski 1. Analizowana populacja świerka pochodzenia istebniańskiego, tworząca reprezentację standardu krajowego w programach testowania potomstwa, charakteryzowała się niewielkim poziomem zróŝnicowania genetycznego. Polimorfizm pomiędzy osobnikami był niŝszy od obserwowanego dla drzew elitarnych, doborowych (DD) testowanego wyłączonego drzewostanu nasiennego (WDN) w Bukowcu. 2. Technika wykorzystująca markery RAPD była wystarczająca do zidentyfikowania osobników najbardziej zmiennych spośród badanych drzew selekcyjnych.

6 282 A. Faber, J. Sabor, D. Grzebelus 3. Wyodrębniono grupę świerków charakteryzujących się wyŝszą zmiennością. W obrębie badanej populacji grupa ta moŝe stanowić istotne źródło polimorfizmu do realizacji kolejnego programu selekcji i zachowania bioróŝnorodności rasy istebniańskiej. Wskazane genotypy w oparciu o analizę DNA mogą być podstawą w tworzeniu plantacji i plantacyjnych upraw nasiennych. Literatura GŁOWACKA B., GOZDALIK M., STASIAK M., SZEWCZYKIEWICZ J., TOPCZEWSKA M Populacyjna zmienność oraz identyfikacja wybranych pochodzeń sosny zwyczajnej i świerka pospolitego na podstawie analizy zmienności DNA. Temat nr: BLP-219 Sprawozdanie z działalności Instytutu Badawczego Leśnictwa w roku 2005". Maszynopis, Warszawa: KRAJ W The estimation of genetic variation within and between Polish provenances of Norway spurce (Picea abies L. Karst.) on the basis of RAPD polymorphism. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Forestry 5(2). MATRAS J Ochrona zasobów genowych świerka pospolitego [Picea abies (L.) Karst.] w Polsce. Sylwan 10: NOWAKOWSKA J Zmienność genetyczna świerka pospolitego w Polsce na podstawie markerów RAPD. Notatnik Naukowy Instytutu Badawczego Leśnictwa. 7(67). POLAK-BERECKA M Określenie struktury genetycznej wybranych populacji świerka pospolitego z terenów Karpat metodą markerów izoenzymowych. Maszynopis. Rozprawa doktorska, Katedra Nasiennictwa, Szkółkarstwa i Selekcji Drzew Leśnych AR. SABOR J. (red.) Program testowania potomstwa wyłączonych drzewostanów nasiennych, drzew doborowych, plantacji nasiennych i plantacji upraw nasiennych. Maszynopis. Dyrekcja Generalna Lasów Państwowych, Warszawa. SABOR J MoŜliwości zachowawcze i metody selekcji drzewostanów świerkowych rasy istebniańskiej. Sylwan 3: SABOR J Ocena wyników proweniencyjnych świerka [Picea bies (L.) Karst.], jodły (Abies alba Mill.) i modrzewia europejskiego (Larix decidua Mill.), w: Ochrona leśnych zasobów genowych w Polsce - stan i perspektywy. Międzyn. Konf. Nauk.-Techn., Milówka, VI 2005: Słowa kluczowe: Picea abies L. KARST., RAPD, zmienność wewnątrzpopulacyjna Streszczenie Niniejszej praca prezentuje analizę polimorfizmu genetycznego 24 losowo wybranych drzew reprezentujących populację cząstkową świerka istebniańskiego przy wykorzystaniu markerów RAPD. Spośród 19 pojedynczych starterów RAPD wybrano siedem, które pozwoliły uzyskać powtarzalne i specyficzne układy prąŝkowe dla

7 ZRÓśNICOWANIE GENETYCZNE WYBRANYCH DRZEWOSTANÓW ŚWIERKA wszystkich badanych drzew. W wyniku analizy stwierdzono niski poziom zróŝnicowania genetycznego występujący wewnątrz testowanej populacji, wyraŝony wartościami dystansu genetycznego poniŝej 0,041. Fakt ten potwierdza zmniejszone zróŝnicowanie genetyczne populacji świerka istebniańskiego w porównaniu z naturalnymi populacjami świerka pospolitego z Europy Centralnej. Zastosowana technika RAPD pozwoliła wyodrębnić grupę 5 drzew selekcyjnych charakteryzujących się wyŝszą zmiennością od pozostałych analizowanych osobników. W obrębie badanej populacji grupa ta moŝe stanowić istotne źródło polimorfizmu do realizacji kolejnego programu selekcji i zachowania bioróŝnorodności rasy istebniańskiej. GENETIC DIVERSITY OF NORWAY SPURCE (Picea abies L. KARST.) OF THE POLISH PROVENANCE FROM ISTEBNA BASED ON THE RAPD ANALYSIS Anna Faber 1, Janusz Sabor 2, Dariusz Grzebelus 3 1 Interdisciplinary School of Biotechnology, Agricultural University, Kraków 2 Department of Forest Tree Breeding, Agricultural University, Kraków 3 Department of Genetics, Plant Breeding and Seed Science, Agricultural University, Kraków Kye words: Picea abies L. KARST., RAPD, intra-population genetic variation Summary In the present paper, the level of intra-population genetic diversity is described for 24 individuals belonging to the selected population of the Istebna region, in relation to the Polish Progeny Test. Using the RAPD-PCR technique, nineteen random primers were initially screened and seven, generating clear and polymorphic profiles, were selected. The intra-population genetic variation was low. The fact that the level of diversity did not exceed 0.041, showed a decrease of genetic variation of Istebna trees as compared to the genuine Norway spruce population from Central Europe. In the present study, the application of RAPD-PCR allowed the selection of a group of individuals characterized by a relatively higher level of genetic diversity. Mgr inŝ. Anna Faber Katedra Nasiennictwa, Szkółkarstwa i Selekcji Drzew Leśnych Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja ul. 29 Listopada KRAKÓW anna_faber@tlen.pl