Zmienność genetyczna odnowień naturalnych świerka (Picea abies (L.) Karst.) w zamierających drzewostanach Beskidu Śląskiego i Żywieckiego

Transkrypt

1 INSTYTUT BADAWCZY LEŚNICTWA Elżbieta Chomicz Zmienność genetyczna odnowień naturalnych świerka (Picea abies (L.) Karst.) w zamierających drzewostanach Beskidu Śląskiego i Żywieckiego Autoreferat rozprawy doktorskiej Promotor: Dr hab. Justyna Nowakowska, Prof. IBL Recenzenci: Prof. dr hab. Wiesław Prus-Głowacki Prof. dr hab. Tomasz Wodzicki SĘKOCIN STARY 213

2 1. WSTĘP Naczelnym celem gospodarki nasiennej w Lasach Państwowych jest dążenie do zachowania naturalnego bogactwa lasu na poziomie ekosystemowym, gatunkowym i genetycznym (Zasady Hodowli Lasu, 211). Podstawą różnorodności biologicznej na wszystkich wymienionych poziomach organizacji przyrody jest różnorodność genetyczna. W populacjach drzew leśnych, wysoki stopień zmienności genetycznej oznacza większe możliwości ich adaptacji do zmieniających się warunków środowiska przyrodniczego. W znacznym stopniu warunkuje to stabilność i trwałość lasu, mającą największe znaczenie w przyjętym modelu leśnictwa wielofunkcyjnego. Zachowanie jak najbardziej zróżnicowanych pul genetycznych poszczególnych gatunków drzew leśnych jest zatem istotnym zadaniem dla leśnictwa, szczególnie w obliczu obserwowanych zmian klimatycznych, o trudnych do przewidzenia konsekwencjach przyrodniczych. Powszechnie stosowaną miarą zmienności genetycznej populacji jest heterozygotyczność, której monitorowanie odgrywa szczególną rolę w ochronie leśnych zasobów genowych. Do najczęściej stosowanych w Lasach Państwowych metod zachowania zasobów genowych in situ należy wybór i wyłączanie z wyrębu drzewostanów nasiennych, charakteryzujących się najwyższą wartością hodowlaną i użytkową oraz mających właściwe zdolności adaptacyjne. Według obowiązujących wytycznych (Matras i Fonder 26), w momencie likwidacji drzewostanu nasiennego, w miarę gdy traci on zdolność do optymalnego pełnienia funkcji nasiennych ze względu na zaawansowany wiek lub zaistniałe szkody, powinno pozostać po nim następne jego pokolenie, o zbliżonej puli genowej. Należy przy tym dążyć do uzyskania go drogą samosiewu, który uważa się za genetycznie znacznie bogatszy od pokolenia z odnowienia sztucznego. Zasadę dotyczącą wyłączonych drzewostanów nasiennych można odnieść także do pozostałych drzewostanów, których pula genowa ma być zachowana w przyszłym pokoleniu. Zjawisko zamierania drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim rodzi obawy związane z utratą lub ograniczeniem zasobów genowych świerka w tym regionie, w tym najcenniejszych genotypów rasy istebniańskiej. Przeważająca część drzewostanów świerkowych w Beskidach uległa rozpadowi lub została w znacznym stopniu przerzedzona, pozostawiając jednocześnie po sobie samorzutnie powstałe odnowienie. To nowe pokolenie drzew powstawało 2

3 spontanicznie, w miarę rozpadu drzewostanów dojrzałych, bez kierunkowego przygotowywania drzew do obsiewu w roku największego urodzaju nasion poprzez przeprowadzenie odpowiednich cięć. W związku z tym powstaje pytanie, na ile odnowienie naturalne otrzymane w ten sposób, z udziałem nieznanej liczby drzew rodzicielskich, odzwierciedla zasoby genowe drzewostanów, z których powstało? Zatem czy zasoby genowe świerka w Beskidach będą zachowane w następnym pokoleniu drzewostanów? Uwzględniając powyższe przesłanki przeprowadzono badania zmienności genetycznej odnowień naturalnych świerka powstałych w zamierających drzewostanach Beskidu Śląskiego i Żywieckiego. Struktura genetyczna odnowień została porównana ze strukturą genetyczną odpowiednich populacji rodzicielskich, określoną w czasie wcześniejszych badań przeprowadzonych przez Zakład Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych IBL w Sękocinie Starym. Pozwoliło to określić czy wystąpiły istotne zmiany w pulach genowych populacji pomiędzy pokoleniami. Analogiczne analizy zostały ponadto przeprowadzone dla drzewostanu świerkowego o charakterze naturalnym (objętego ochroną rezerwatową), nie wykazującego cech rozpadu, mogącego stanowić referencję dla zamierających drzewostanów beskidzkich. Analiza struktury genetycznej drzewostanu rodzicielskiego i odnowienia w rezerwacie ścisłym pozwoliła odpowiedzieć na pytanie, czy proces zamierania drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim wpłynął na przekazanie informacji genetycznej pomiędzy pokoleniami drzewostanu w znacząco inny sposób niż procesy o charakterze naturalnym. Na podstawie wyznaczonych celów pracy sformułowano następujące hipotezy badawcze: 1. Zmienność genetyczna populacji potomnych drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim jest zbliżona do zmienności genetycznej populacji rodzicielskich. 2. Różnice w pulach genowych pomiędzy populacją rodzicielską i potomną drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim są zbliżone do obserwowanych w drzewostanie o charakterze naturalnym. 3

4 2. MATERIAŁ I METODY 2.1. WYBÓR DRZEWOSTANÓW Badaniami objęto cztery drzewostany świerkowe z występującym odnowieniem naturalnym, w tym trzy drzewostany z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego, zlokalizowane na terenie nadleśnictw należących do najsilniej dotkniętych zjawiskiem zamierania świerka oraz jeden drzewostan z obszaru ochrony ścisłej zlokalizowany w Tatrzańskim Parku Narodowym. Drzewostany z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego reprezentowały najcenniejsze krajowe pochodzenia świerka tzw. rasy istebniańskiej, charakteryzujące się wyjątkowo wysoką wartością hodowlaną i dużą plastycznością, udokumentowanymi w licznych doświadczeniach proweniencyjnych. W warunkach obserwowanego zamierania świerczyn w Beskidzie Śląskim i Żywieckim drzewostany te znajdowały się w różnych stadiach rozpadu. Dokładną lokalizację oraz charakterystykę obiektów badawczych (drzewostanów) z terenu Beskidu Śląskiego i Żywieckiego przedstawiono poniżej. W prezentowanej rozprawie nazwy leśnictw zostały przyjęte jako nazwy znajdujących się w nich obiektów badawczych. Nadleśnictwo Wisła, Leśnictwo Bukowiec, wydzielenie 149 h Był to wyselekcjonowany drzewostan nasienny świerka (numer w rejestrze LMP: MP/2/3114/5). Drzewostan zajmował powierzchnię 7,88 ha, na siedlisku lasu mieszanego górskiego (LMGśw), w I klasie bonitacji. Drzewostan położony był w reglu dolnym, na wysokości m n.p.m. Wiek drzewostanu dojrzałego oszacowano na około 17 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 9 świerk i 1 jodła. Drzewostan charakteryzował się luźnym zwarciem, ze znacznym udziałem odnowienia bukowego w fazie podrostu. W 21 r. na znacznej powierzchni wydzielenia obserwowano rozpad dojrzałego drzewostanu świerkowego oraz obecność grup i kęp odnowienia naturalnego świerka w powstałych lukach. Nadleśnictwo Wisła, Leśnictwo Zapowiedź, wydzielenie 18f Był to wyselekcjonowany drzewostan nasienny świerka (numer w rejestrze LMP: MP/2/3117/5). Drzewostan zajmował powierzchnię 21,91 ha, na siedlisku lasu mieszanego górskiego (LMGśw), w I klasie bonitacji. Drzewostan położony był w reglu dolnym, na wysokości m n.p.m. Wiek drzewostanu dojrzałego oszacowano na około 13 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 1 świerk. Drzewostan charakteryzował się przerywanym zwarciem. W 21 r. obserwowano 4

5 pojedyncze i grupowe zamieranie świerków w dojrzałym drzewostanie. Odnowienie naturalne świerka występowało średnio obficie na powierzchni całego wydzielenia, pod okapem przerzedzonego górnego piętra drzewostanu. Nadl. Węgierska Górka, Leśnictwo Skrzyczne, wydzielenie 38g Był to drzewostan gospodarczy. Drzewostan zajmował powierzchnię 6,28 ha, na siedlisku lasu mieszanego górskiego (LMG), w I klasie bonitacji. Drzewostan położony był w reglu dolnym, na wysokości 75-9 m n.p.m. Wiek drzewostanu dojrzałego oszacowano na około 12 lat. Skład gatunkowy drzewostanu to 1 świerk. Drzewostan charakteryzował się przerywanym zwarciem. W 21 r. na znacznej powierzchni wydzielenia obserwowano rozpad dojrzałego drzewostanu świerkowego. Pozostające kulisy (pasy) starodrzewu sąsiadowały z dużą powierzchnią otwartą, porośniętą trzcinnikiem. Odnowienie naturalne świerka występowało niezbyt obficie pod przerzedzonym drzewostanem oraz na sąsiadującej otwartej powierzchni. Czwartym obiektem badawczym był bór świerkowy o charakterze pierwotnym znajdujący się w rezerwacie Wyżnia Mała Łąka, Wantule na terenie Tatrzańskiego Parku Narodowego (w rozprawie przyjęto nazwę: Wantule). Badaniami objęto drzewostan na obszarze właściwych Wantuli, tj. około 25 ha boru świerkowego porastającego złomy i bloki skalne (tzw. wanty) poniżej północnej krawędzi stopnia Wielkiej Świstówki, na wysokości od 117 do 135 m n.p.m. (regiel górny). Drzewostan był litą świerczyną, pochodzenia naturalnego, na siedlisku boru wysokogórskiego (BWG). Drzewostan charakteryzował się znaczną rozpiętością wieku drzew zarówno w górnej warstwie drzewostanu jak i w odnowieniu. Przeciętny wiek drzewostanu dojrzałego oszacowano na 17 lat. Drzewostan charakteryzował się umiarkowanym zwarciem. W 21 r. obserwowano wydzielanie się posuszu (posusz stojący), szczególnie w dolnych partiach drzewostanu. Odnowienie naturalne świerka występowało pojedynczo pod okapem drzewostanu MATERIAŁ BADAWCZY W każdym drzewostanie pobrano krótkie odcinki pędów (1-2 cm) pokrytych igłami z 5 osobników rozmieszczonych losowo w populacji rodzicielskiej oraz z 5 osobników rozmieszczonych losowo w populacji potomnej. Zbiór materiału roślinnego z populacji rodzicielskich drzewostanów z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego oraz odpowiednie analizy biochemiczne dla tych prób zostały przeprowadzone w 29 roku w ramach tematu badawczego realizowanego na 5

6 zlecenie Lasów Państwowych w Zakładzie Hodowli Lasu i Genetyki Drzew Leśnych IBL w Sękocinie Starym (Nowakowska i in. 21). Pędy pozyskiwano ze świerków nie przejawiających wyraźnych symptomów chorobowych, oddalonych od siebie o około 3 4 m. Zbiór materiału roślinnego z populacji potomnych oraz z populacji rodzicielskiej drzewostanu Wantule przeprowadzono w roku 21 w ramach tematu badawczego realizowanego na zlecenie Lasów Państwowych w Zakładzie Gospodarki Leśnej Regionów Górskich IBL w Krakowie (Niemtur i in. 211). W populacjach potomnych drzewostanów z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego pędy pozyskiwano z osobników w wieku uprawy (o wysokości około 5 cm), w populacji potomnej drzewostanu Wantule także z nieco starszych osobników (od wieku uprawy do młodnika). Odległość pomiędzy osobnikami, z których pobierano pędy była zależna od sposobu występowania (grupowo, kępowo, pojedynczo) oraz obfitości odnowienia i wynosiła co najmniej 1 m METODY BIOCHEMICZNE Izolacja DNA DNA każdego osobnika izolowano z około 1 mg igieł rozdrobionych w ciekłym azocie. Izolację wykonano za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji całkowitego DNA z materiału roślinnego DNeasy Plant Mini Kit firmy Qiagen, zgodnie z procedurą podaną przez producenta (DNeasy Plant Handbook, July 26, Qiagen). Wydajność izolacji badano za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny o stężeniu,5 µg/ml. Dokumentację żeli wykonano w systemie Bio-Rad Gel Doc 2 (Bio-Rad Laboratories, USA) poprzez wizualizację w świetle UV o długości fali 32 nm. Stężenie i czystość DNA w każdej próbie określano spektrofotometrycznie, poprzez pomiar absorbcji światła o długościach fali 23 (A 23 ), 26 (A 26 ) i 28 (A 28 ) nm, za pomocą aparatu NanoDrop ND-1 (Biotech, Wilmington, USA). Próbki z wyizolowanym DNA przechowywano w buforze stabilizującym Tris- EDTA TE (ph 7,) w temperaturze -75 C. 6

7 Amplifikacja DNA mikrosatelitarnego Zmienność genetyczną badanych populacji świerka wykonano na podstawie analizy polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych (SSR) DNA jądrowego, przy zastosowaniu trzech loci: SpAG2, SPAC1H8, SpAGD1 (tab. 1). Sekwencje mikrosatelitarne stanowią proste, tandemowe powtórzenia 1-6 nukleotydowych motywów, występujące z wysoką częstością w części niekodującej genomu. Wysokie tempo mutacji i znaczna zmienność alleliczna powodują, że markery mikrosatelitarne są idealnym narzędziem do badania procesów zachodzących w ekologicznej skali czasowej i śledzenia zmian genetycznych, które zaszły w ostatniej przeszłości populacji (Selkoe i Toonen 26). Tab. 1. Charakterystyka amplifikowanych loci mikrosatelitarnych (źródło: Pfeiffer i in. 1997) Locus Motyw Sekwencja starterów SpAG2 (TC) 16 F: GCTCTTCACGTGTACTTGATC R*: TTCGAAGATCCTCCAAGATAC SpAC1H8 (GT) 27 F: CCCAAGAAAAAAGTCATGGAT R*: TCATTGGGATATGTGATACTTCC Wielkość produktu PCR [pz] SpAGD1 (AG) 25 F: GTCAACCAACTTGTAAAGCCA R*: ACTTGTTTGGCATTTTCCC R* - starter znakowany fluorescencyjną sondą Sekwencje SSR amplifikowano w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) według zmodyfikowanej procedury Pfeiffera i in. (1997) oraz Yazdani i in. (23). Amplifikację DNA prowadzono w 25µl następującej mieszaniny reakcyjnej (Qiagen): 1 x stężony bufor PCR, 1x Q-Solution, 2mM MgCl 2, 2 µm dntp Mix,,15 µm (dla loci SpAG2, SpAGD1) lub,24 µm (dla locus SPAC1H8) startera F,,135 µm (dla loci SpAG2, SpAGD1) lub,216 µm (dla locus SPAC1H8) znakowanego fluorescencyjnie startera R,,3 U Taq polimerazy i 5 ng matrycy DNA. Całość inkubowano w termocyklerze PTC-2 (MJ Research, Inc.) zaprogramowanym na wstępne podgrzewanie prób przez 5 min w temp. 95 C oraz 4 cykli amplifikacji DNA według schematu: 45 s w 94 C, 45 s w 56 C (dla loci SpAG2, SpAGD1) lub 6 C (dla locus SPAC1H8), 45 s w 72 C, końcowe wydłużanie powielonych fragmentów DNA przez 1 min. w 72 C. 7

8 Po zakończeniu reakcji, oceniano jakość powielonych fragmentów mikrosatelitarnego DNA poprzez elektroforezę produktów PCR w 1,5% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Wizualizację żeli w świetle UV wykonano w systemie Bio-Rad Gel Doc 2 (Bio-Rad Laboratories, USA) Analiza polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych Produkty PCR rozdzielano elektroforetycznie w 7% żelu akrylamidowym w automatycznym sekwenatorze CEQ 8 (Beckman-Coulter, Fullerton, USA), w celu określenia wielkości poszczególnych alleli. Próbki DNA przygotowano poprzez dodanie wyznacznika masy DNA Size Standard Kit 4 Genome Lab oraz roztworu SLS (Sample Loading Solution) według zaleceń producenta Beckman-Coulter. Wyznakowane fragmenty DNA były automatycznie denaturowane i rozdzielane metodą elektroforezy kapilarnej. Wielkość powielonych fragmentów mikrosatelitarnego DNA, w parach zasad (pz), odczytano za pomocą oprogramowania CEQ 8 Series Genetic Analysis System Software v 9. (Beckman-Coulter, USA) ANALIZY STATYSTYCZNE Na podstawie danych otrzymanych po genotypowaniu każdego z loci, określono liczbę oraz częstość występowania (frekwencję) poszczególnych wariantów (alleli) mikrosatelitarnego DNA. Podobieństwo rozkładów częstości alleli w poszczególnych loci pomiędzy populacją rodzicielską i potomną przeanalizowano za pomocą dokładnego testu Fishera (Fisher 1934) w programie SPSS Statistics 17. (Mehta i Patel 21). Zmienność genetyczną populacji rodzicielskiej, populacji potomnej oraz całego drzewostanu (drzew z populacji rodzicielskiej i potomnej łącznie) określono za pomocą następujących wskaźników: obserwowana liczba alleli na locus N a, oczekiwana liczba alleli na locus N e (wg Hartla i Clarka 1989), indeks różnorodności Shannona I (wg Shannona i Weavera 1949), heterozygotyczność obserwowana H o, heterozygotyczność oczekiwana H e (wg Levene a 1949) oraz heterozygotyczność według Nei (1973) h, jako miara różnorodności genetycznej. Zróżnicowanie genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną w ramach drzewostanu oszacowano za pomocą współczynnika utrwalenia (fiksacji) F ST (wg Wrighta 1921). Określono także wartości pozostałych statystyk F opisujących 8

9 hierarchiczną strukturę populacji, tj. współczynnik wsobności F IS oraz współczynnik heterozygotyczności F IT (wg Hartla i Clarka 1989). Na podstawie współczynnika utrwalenia F ST określono wartość wskaźnika Nm (wg Wrighta 1978), określającego wielkość przepływu genów pomiędzy populacją rodzicielską i populacją potomną. W prezentowanej rozprawie wskaźnik Nm był miarą powtórzenia tego samego genotypu w populacji rodzicielskiej i w populacji potomnej drzewostanu. Podobieństwo genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i populacją potomną wyrażono za pomocą dystansu genetycznego D N (wg Nei 1978). Obliczenia wszystkich wymienionych parametrów opisujących strukturę genetyczną populacji wykonano w programie PopGen 1.31 (Yeh i in. 1999). 3. WYNIKI 3.1. FREKWENCJA ALLELI Locus SpAG2 Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano w drzewostanie Skrzyczne (22 allele; ryc. 1C), zaś najmniejszą w drzewostanie Wantule (15 alleli; ryc. 1D). Istotne różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i populacją potomną zanotowano w drzewostanach Zapowiedź (p =,1) i Skrzyczne (p <,), natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w drzewostanach Bukowiec (p =,919) i Wantule (p =,462). W stosunku do populacji rodzicielskiej, w populacji potomnej liczba alleli była niższa w drzewostanach Bukowiec (zanotowano utratę 3 alleli oraz obecność 1 nowego allelu, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,12 do,23; ryc. 1B) i Zapowiedź (zanotowano utratę 4 alleli o frekwencji,14 oraz obecność 1 nowego allelu o frekwencji,64; ryc. 1A), wyższa w drzewostanie Wantule (nie zanotowano utraty żadnego z alleli oraz obecność 1 nowego allelu o frekwencji,45; ryc. 1D) oraz pozostawała bez zmian w drzewostanie Skrzyczne (zanotowano utratę 7 alleli oraz obecność 7 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,85; ryc. 1C). 9

10 Locus SpAC1H8 Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano ponownie w drzewostanie Skrzyczne (42 allele; ryc. 2C), zaś najmniejszą w drzewostanie Bukowiec (37 alleli; ryc. 2A). Istotne różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i populacją potomną zanotowano jedynie w drzewostanie Bukowiec (p <,), natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w drzewostanach Zapowiedź (p =,12), Skrzyczne (p =,72) oraz Wantule (p =,85). W stosunku do populacji rodzicielskiej, w populacji potomnej liczba alleli była niższa jedynie w drzewostanie Wantule (zanotowano utratę 13 alleli oraz obecność 8 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,33; ryc. 3A), a wyższa w drzewostanach Bukowiec (zanotowano utratę 8 alleli oraz obecność 11 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,52; ryc. 2A)., Zapowiedź (zanotowano utratę 11 alleli oraz obecność 12 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,35; ryc. 2B) i Skrzyczne (zanotowano utratę 1 alleli oraz obecność 15 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,37 za wyjątkiem nowego allelu 19 pz o frekwencji,6; ryc. 2C) Locus SpAGD1 Największą liczbę alleli na locus zaobserwowano w drzewostanie Bukowiec (47 alleli; ryc. 4A), zaś najmniejszą w drzewostanie Zapowiedź (42 allele; ryc. 4B). Istotne różnice w rozkładzie częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i populacją potomną zanotowano w drzewostanach Bukowiec (p =,2), Zapowiedź (p =,47) i Skrzyczne (p =,8), natomiast nie stwierdzono różnic pomiędzy pokoleniami w drzewostanie Wantule (p =,861). W stosunku do populacji rodzicielskiej, w populacji potomnej liczba alleli była niższa jedynie w drzewostanie Zapowiedź (zanotowano utratę 9 alleli oraz obecność 5 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,43; ryc. 4B), a wyższa w drzewostanach Bukowiec (zanotowano utratę 8 alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,43; ryc. 4A), Skrzyczne (zanotowano utratę 7 alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych alleli były mieściły się w zakresie od,1 aż do,61 dla allelu 148 pz i,71 dla allelu 159 pz; ryc. 4C) i Wantule (zanotowano utratę 5 alleli oraz obecność 13 nowych alleli, frekwencje tych alleli mieściły się w zakresie od,1 do,3; ryc. 3B). 1

11 A,25,2,15,1,5 B,35,3,25,2,15,1, ,5,4,3,2, C D,3,25,2,15,1, Populacja rodzicielska Populacja potomna Ryc. 1. alleli mikrosatelitarnego locus SpAG2 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne, (D) Wantule

12 ,14,12,1,8,6,4, A,18,16,14,12,1,8,6,4, B,2,18,16,14,12,1,8,6,4, C Populacja rodzicielska Populacja potomna Ryc. 2. alleli mikrosatelitarnego locus SpAC1H8 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne

13 ,2,18,16,14,12,1,8,6,4, A,16,14,12,1,8,6,4,2 Populacja rodzicielska Populacja potomna B Populacja rodzicielska Populacja potomna Ryc. 3. alleli mikrosatelitarnych loci: (A) SpAC1H8, (B) SpAGD1 w drzewostanie Wantule

14 ,1,8,6,4, B,14,12,1,8,6,4, A,1,8,6,4,2 C Populacja rodzicielska Populacja potomna Ryc. 4. alleli mikrosatelitarnego locus SpAGD1 w drzewostanach: (A) Bukowiec, (B) Zapowiedź, (C) Skrzyczne

15 Podsumowanie Badane loci mikrosatelitarne charakteryzowały się wysokim polimorfizmem, przy czym najbardziej zmienny był locus SpAGD1. Podobieństwo rozkładów częstości alleli pomiędzy populacją rodzicielską i potomną kształtowało się odmiennie w drzewostanach z obszaru Beskidu Śląskiego i Żywieckiego niż w drzewostanie o charakterze naturalnym z rezerwatu Wantule. Brak istotnych statystycznie różnic w rozkładzie częstości alleli dla wszystkich analizowanych loci zanotowano jedynie w drzewostanie Wantule, w pozostałych drzewostanach brak różnic dotyczył tylko jednego z trzech analizowanych loci. Jednocześnie we wszystkich drzewostanach zaobserwowano zmiany w składzie puli genowej pomiędzy populacją rodzicielską i potomną, dotyczące przede wszystkim alleli o niskiej frekwencji. Wyższy udział rzadkich alleli, tym samym większą liczbę alleli na locus, obserwowano częściej w populacjach potomnych aniżeli w populacjach rodzicielskich badanych drzewostanów PARAMETRY ZMIENNOŚCI GENETYCZNEJ Badane drzewostany charakteryzowały się wysokim poziomem zmienności genetycznej (tab. 2), niezależnie od stopnia ich naturalności. We wszystkich drzewostanach średnia obserwowana liczba alleli na locus (N a ) była wyższa od średniej efektywnej liczby alleli na locus (N e ) (tab. 2). Wartości indeksu różnorodności genetycznej Shannona (I) oraz wysoki poziom heterozygotyczności obliczony według wzoru Nei (h) wskazywały na wysoką polimorficzność badanych loci DNA w analizowanych drzewach (tab. 2). Średnia dla 3 loci wartość współczynnika heterozygotyczności obserwowanej (H o ) była niższa od heterozygotyczności oczekiwanej (H e ) we wszystkich drzewostanach (tab. 2), co wskazywało na nieznaczny niedobór genotypów heterozygotycznych w stosunku do wartości oczekiwanej w populacji znajdującej się w równowadze Hardy-Weinberga. Największy niedobór heterozygot, tym samym najwyższą wartość współczynnika wsobności (F IS ; tab. 5), odnotowano w drzewostanach Zapowiedź (ok. 18%) oraz Wantule (ok. 15%). Populacje potomne badanych drzewostanów charakteryzowały się większą liczbą alleli na locus aniżeli populacje rodzicielskie (tab. 3). Wyjątek stanowił drzewostan Zapowiedź, w którym zanotowano odwrotną sytuację. 15

16 Tab. 2. Współczynniki zmienności genetycznej badanych drzewostanów wartości średnie dla 3 loci Nazwa drzewostanu N a N e I H o H e h Bukowiec 33,667 19,313 3,82,844,94,935 Zapowiedź 33,667 17,5 3,16,754,932,927 Skrzyczne 36,667 17,924 3,1,848,934,929 Wantule 34, 16,597 3,32,784,932,927 N a obserwowana liczba alleli na locus, N e oczekiwana liczba alleli na locus, I indeks różnorodności Shannona, H o heterozygotyczność obserwowana, H e heterozygotyczność oczekiwana, h heterozygotyczność wg Nei (1973) Tab. 3. Obserwowana (N a ) i oczekiwana (N e ) liczba alleli na locus w populacji rodzicielskiej (R) oraz populacji potomnej (P) badanych drzewostanów wartości średnie dla 3 loci Nazwa drzewostanu N a N e R P R P Bukowiec 25,333 27,333 15, 17,726 Zapowiedź 27,333 25,667 16,4 14,373 Skrzyczne 25,333 28,667 14,293 15,89 Wantule 26,667 28, 15,27 15,859 W stosunku do populacji rodzicielskich, populacje potomne charakteryzowały się podobną zmiennością genetyczną opisywaną przez indeks Shannona (I) oraz poziom heterozygotyczności (h) obliczonej według wzoru Nei (tab. 4), przy czym nie odnotowano różnic w tym zakresie pomiędzy odnowieniem powstałym w następstwie rozpadu drzewostanów w Beskidach a samosiewem występującym pod drzewostanem o charakterze naturalnym. Indeks różnorodności Shannona (I) był generalnie wyższy w populacjach potomnych aniżeli w populacjach rodzicielskich, jedynie w drzewostanie Zapowiedź przyjmował nieznacznie niższą wartość w populacji potomnej (tab. 4). Współczynnik heterozygotyczności (h) wskazywał na niewielkie wzbogacenie puli genetycznej potomstwa w stosunku do pokolenia rodzicielskiego we wszystkich badanych drzewostanach (tab. 4), przy czym największy wzrost udziału osobników heterozygotycznych w pokoleniu potomnym wystąpił w 16

17 drzewostanie Skrzyczne (5%). Wzrost heterozygotyczności w pokoleniu potomnym drzewostanu Skrzyczne należy przypisać przepływowi genów z drzewostanów sąsiednich, któremu mogło dodatkowo sprzyjać znaczne zaawansowanie procesu rozpadu drzewostanu Skrzyczne. W czasie zbioru materiału roślinnego z populacji potomnej drzewostanu Skrzyczne, drzewostan rodzicielski reprezentowany był już tylko przez przerzedzoną kulisę (pas) starodrzewu, natomiast odnowienie znajdowało się w większości na sąsiadującej otwartej powierzchni. Przepływ genów w silnie przerzedzonym drzewostanie mógł być większy aniżeli w zwartym kompleksie leśnym, ponieważ dyspersja pyłku i nasion drzew mogła odbywać się na większe odległości. Tab. 4. Indeks różnorodności Shannona (I), heterozygotyczność obserwowana (H o ), heterozygotyczność oczekiwana (H e ) oraz heterozygotyczność wg Nei 1973 (h) w populacji rodzicielskiej (R) i populacji potomnej (P) badanych drzewostanów wartości średnie dla 3 loci Nazwa drzewostanu I H o H e h R P R P R P R P Bukowiec 2,882 2,964,854,833,936,94,925,93 Zapowiedź 2,882 2,839,786,724,923,93,912,92 Skrzyczne 2,761 2,938,799,894,887,934,878,924 Wantule 2,93 2,929,73,833,93,934,919,924 Heterozygotyczność obserwowana (H o ) była niższa od heterozygotyczności oczekiwanej (H e ) zarówno w populacji rodzicielskiej, jak i w populacji potomnej wszystkich badanych drzewostanów (tab. 4). Największe różnice w tym zakresie wystąpiły w drzewostanach Zapowiedź i Wantule. W drzewostanie Zapowiedź niedobór heterozygot był większy w pokoleniu potomnym (21%) niż w rodzicielskim (14%), natomiast odwrotna sytuacja wystąpiła w drzewostanie Wantule niedobór heterozygot w pokoleniu rodzicielskim (2%) był dwukrotnie wyższy niż w potomnym (1%). Stwierdzone prawidłowości mogą wskazywać na przeciwne kierunki selekcji zachodzącej w obu drzewostanach. W drzewostanie Zapowiedź byłaby to selekcja eliminująca homozygoty i powodująca wzrost udziału genotypów heterozygotycznych wraz z wiekiem drzewostanu, aż do ustalenia się równowagi Hardy-Weinberga w wieku dojrzałości sukcesyjnej. Z kolei stwierdzony dwukrotnie większy niż w 17

18 potomstwie niedobór heterozygot w populacji rodzicielskiej, jak również najmniejsza wartość heterozygotyczności obserwowanej w pokoleniu rodzicielskim drzewostanu Wantule (tab. 4), mogą wskazywać na selekcję faworyzującą homozygoty, jako formę adaptacji do specyficznych warunków regla górnego. Analizując przyczyny niedoboru heterozygot w pokoleniu potomnym drzewostanu Zapowiedź należy też wziąć pod uwagę możliwość wystąpienia tzw. efektu Wahlunda, tj. redukcji heterozygotyczności populacji związanej z istnieniem wewnątrz niej subpopulacji różniących się frekwencjami alleli. W populacji potomnej drzewostanu Zapowiedź młode osobniki występowały średnio obficie na powierzchni całego wydzielenia, a zbiór prób obejmował obszar większy niż w odnowieniu pozostałych drzewostanów. Istnieje zatem prawdopodobieństwo, że odnowienie naturalne reprezentujące w badaniach pokolenie potomne drzewostanu Zapowiedź stanowiło w rzeczywistości dwie genetycznie odmienne populacje, czego wynikiem jest stwierdzony duży udział homozygot. Najmniejszy deficyt heterozygot odnotowano w populacji potomnej silnie przerzedzonego drzewostanu Skrzyczne (4%), co należy wiązać z intensywniejszym napływem genów spoza lokalnej populacji. Przepływ genów z sąsiednich drzewostanów skutecznie przeciwdziała redukcji zmienności genetycznej młodego pokolenia drzewostanu Skrzyczne na skutek działania dryfu genetycznego, pomimo znacznego zmniejszenia liczebności populacji rodzicielskiej PODOBIEŃSTWO GENETYCZNE I PRZEPŁYW GENÓW W drzewostanach Bukowiec, Zapowiedź i Wantule populację rodzicielską i potomną dzielił niewielki dystans genetyczny (D N ; tab. 5), co świadczy o dużym pokrewieństwie pomiędzy dwoma pokoleniami drzewostanu. Również wartość współczynnika utrwalenia F ST dla populacji rodzicielskiej i potomnej była bardzo niska w tych drzewostanach (tab. 5), co potwierdza brak istotnego zróżnicowania genetycznego pomiędzy osobnikami rodzicielskimi i ich potomstwem. Największe podobieństwo genetyczne pomiędzy pokoleniami zanotowano w drzewostanie o charakterze naturalnym. W drzewostanie Wantule badane odnowienie naturalne aż w 93% odzwierciedlało pulę genetyczną drzewostanu, z którego powstało (wartość podobieństwa genetycznego wynosiła,926). Nieco niższe, ale nadal bardzo wysokie wartości podobieństwa wystąpiły w drzewostanach Bukowiec (86%) i Zapowiedź (82%), reprezentujących najcenniejsze pochodzenia świerka istebniańskiego. 18

19 Otrzymane wartości podobieństwa genetycznego pozwalają przypuszczać, że korzystne cechy wymienionych drzewostanów beskidzkich zostały w dużej mierze przekazane potomstwu. Największym dystansem genetycznym pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym (D N ; tab. 5) charakteryzował się z kolei drzewostan Skrzyczne. Odnowienie naturalne w drzewostanie Skrzyczne odzwierciedlało pulę genetyczną populacji rodzicielskiej w około 45% (wartość podobieństwa genetycznego wynosiła,445), co wskazuje na znaczny udział osobników spoza lokalnej populacji w procesie reprodukcji drzewostanu. W drzewostanie Skrzyczne zanotowano również największe zróżnicowanie genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną (F ST ; tab. 5), kilkakrotnie wyższe niż w pozostałych drzewostanach, oraz najmniejszy przepływ genów pomiędzy pokoleniami (Nm; tab. 5). Największy przepływ genów pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym wystąpił natomiast w drzewostanach Bukowiec i Wantule (Nm; tab. 5). Tab. 5. Wartości statystyk F, wskaźnik przepływu genów (Nm) oraz dystans genetyczny (D N ) pomiędzy populacją rodzicielską i potomną badanych drzewostanów wartości średnie dla 3 loci Nazwa drzewostanu F IS F IT F ST Nm D N Bukowiec,9,96,8 5,285,156 Zapowiedź,176,184,1 23,819,197 Skrzyczne,61,92,32 21,52,81 Wantule,15,154,6 46,96,77 F IS -współczynnik wsobności, F IT - współczynnik heterozygotyczności, F ST - współczynnik utrwalenia, Nm wskaźnik przepływu genów Drzewostan Wantule charakteryzował się większą wsobnością (F IS ; tab. 5) niż badane drzewostany zagospodarowane z terenu Beskidów (za wyjątkiem drzewostanu Zapowiedź), co najprawdopodobniej było skutkiem częstszego krzyżowania pomiędzy spokrewnionymi osobnikami wewnątrz drzewostanu. Na niewielki udział genów spoza lokalnej populacji w kształtowaniu puli genetycznej potomstwa drzewostanu Wantule wskazuje także najmniejszy wśród badanych drzewostanów dystans genetyczny (D N ; tab. 5) i poziom zróżnicowania genetycznego (F ST ; tab. 5) pomiędzy obydwoma pokoleniami drzewostanu. Ponadto, jedynie w drzewostanie Wantule rozkłady częstości alleli w populacji rodzicielskiej i w populacji 19

20 potomnej nie różniły się istotnie od siebie we wszystkich badanych loci. Duże podobieństwo genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomstwem drzewostanu Wantule świadczy o wiernym przekazaniu informacji genetycznej kolejnemu pokoleniu drzewostanu, co pozostaje w zgodzie z ideą zachowania zasobów genetycznych chronionych populacji oraz ukształtowanych przez naturalne procesy lokalnych adaptacji. Z drugiej strony, ograniczony dopływ genów spoza badanej populacji może także przyczyniać się do większej wsobności w drzewostanie Wantule, prowadzącej z czasem do redukcji zmienności genetycznej (heterozygotyczności) wsobnej populacji. Kwestią otwartą pozostaje pytanie, czy potencjalnie częstsze krzyżowanie się pomiędzy spokrewnionymi osobnikami wewnątrz populacji jest związane ze sposobem ochrony drzewostanu Wantule (rezerwat ścisły) czy raczej z lokalizacją w reglu górnym, charakteryzującym się specyficznymi warunkami środowiska. 4. PODSUMOWANIE I WNIOSKI Przedstawione w rozprawie wyniki badań wskazują na pozytywny stan zachowania zmienności genetycznej zamierających drzewostanów świerkowych z Beskidu Śląskiego i Żywieckiego w powstałym samorzutnie odnowieniu naturalnym tych drzewostanów. Radykalne ograniczenie liczebności drzew w zamierających świerczynach beskidzkich nie wpłynęło w znaczący sposób na jakość informacji genetycznej przekazanej potomstwu. Stwierdzony w badaniach wysoki poziom zmienności genetycznej powstałych samosiewów pozwala sądzić, że wykorzystanie ich w procesie odnawiania lasu w Beskidach nie przyczyni się do zubożenia zasobów genetycznych przyszłych drzewostanów. Na podstawie wyników przedstawionych w prezentowanej rozprawie sformułowano następujące wnioski: Zmienność genetyczna zamierających drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim została zachowana w powstałym samorzutnie odnowieniu naturalnym. Populacje potomne świerczyn beskidzkich utrzymują podobny poziom zmienności genetycznej jak populacje rodzicielskie, przy czym odnotowano nieznaczne wzbogacenie puli genetycznej potomstwa w stosunku do pokolenia rodzicielskiego w każdym z badanych drzewostanów. 2

21 Nie stwierdzono negatywnego wpływu zjawiska zamierania drzewostanów świerkowych w Beskidzie Śląskim i Żywieckim na zmienność genetyczną powstałych odnowień naturalnych. Różnice w zakresie zmienności genetycznej pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym świerczyn beskidzkich są zbliżone do stwierdzonych w drzewostanie świerkowym o charakterze naturalnym, w innych drzewostanach świerkowych opisanych w literaturze, a także w odnawiających się naturalnie drzewostanach innych gatunków. Pule genetyczne odnowień naturalnych nie są zupełnie tożsame z reprezentowanymi przez pokolenie rodzicielskie. We wszystkich drzewostanach odnotowano zmiany w obecności rzadkich alleli pomiędzy populacją rodzicielską i potomną. Jedynie w przypadku drzewostanu o charakterze naturalnym nie stwierdzono różnic w rozkładzie frekwencji alleli pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym. Podobieństwo genetyczne pomiędzy populacją rodzicielską i potomną było wysokie w większości badanych drzewostanów. Największe podobieństwo pomiędzy pokoleniem rodzicielskim i potomnym odnotowano w drzewostanie o charakterze naturalnym, niewiele mniejsze w wyłączonych drzewostanach nasiennych świerka istebniańskiego, zaś umiarkowane w drzewostanie gospodarczym z terenu Beskidów. W drzewostanie o charakterze naturalnym odnotowano nieznacznie wyższą wsobność niż w większości drzewostanów świerkowych z Beskidu Śląskiego i Żywieckiego. Problematyka kształtowania się zmienności genetycznej i systemu kojarzenia w drzewostanach o charakterze naturalnym wymaga dalszych badań. 5. LITERATURA Zasady Hodowli Lasu obowiązujące w Państwowym Gospodarstwie Leśnym Lasy Państwowe Centrum Informacyjne Lasów Państwowych, Warszawa. Matras J., Fonder W. 26. Wytyczne w sprawie ochrony leśnych zasobów genowych na potrzeby nasiennictwa i hodowli drzew leśnych. Załącznik nr 1 do Zarządzenia nr 7A z 7 kwietnia 26 r. dyrektora generalnego LP w sprawie ochrony leśnych zasobów genowych na 21

22 potrzeby nasiennictwa i hodowli drzew leśnych (znak sprawy: ZG/713/7/26). IBL, DGLP, Warszawa. Nowakowska J., Aniśko E., Bieniek J., Kantorowicz W., Klisz M., Michalska A., Przyborowski J., Sułkowska M., Zawadzka A. 21. Określenie struktury genetycznej populacji sosny zwyczajnej i świerka pospolitego w wybranych regionach pochodzenia z weryfikacją granic regionów po uwzględnieniu zróżnicowania genetycznego populacji. Sprawozdanie końcowe z tematu BLP-39, Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary. Niemtur S., Sierota Z., Głaz J., Nowakowska J., Jachym M., Małecka M., Matras J., Piszczek M., Wójcik J., Chomicz E., Kapsa M., Kowalik W Kierunki zagospodarowania lasów beskidzkich na terenach poklęskowych. Sprawozdanie końcowe z tematu BLP-34, Instytut Badawczy Leśnictwa, Sękocin Stary. Selkoe K. A., Toonen R. J. 26. Microsatellites for ecologists: a practical guide to using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters 9: Pfeiffer A., Olivieri A. M., Morgante M Identification and characterization of microsatellites in Norway spruce (Picea abies K.). Genome 4: Yazdani R., Scotti I., Jansson G., Plomion C., Mathur G. 23. Inheritance and diversity of simple sequence repeat (SSR) microsatellite markers in various families of Picea abies. Hereditas 138: Fisher R. A Statistical methods for research workers (5th ed.). Edinburgh: Oliver and Boyd. Mehta C. R., Patel N. R. 21. IBM SPSS Exact Tests. SPSS. Hartl D. L., Clark A. G Principles of population genetics. Sinauer Associates. Shannon C. E., Weaver W The mathematical theory of communication. University of Illinois Press, Urbana. Levene H On the matching problem in genetics. Annals of Mathematical Statistics 2: Nei M Analysis of gene diversity in subdivided populations. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 7: Wright S Systems of mating. Genetics 6: Wright S Variability within and among natural populations. W: Evolution and the genetics of populations. University of Chicago Press, Chicago, USA. Nei M Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics 89: Yeh F. C., Yang R., Boyle T POPGEN Version Microsoft Window based for population genetic analysis. Department Renewable Resources, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada. 22