KATARZYNA SMYKAŁ, ALEKSANDRA ROCHOWIAK, ANNA KUBIAK, ZOFIA I. NIEMIR

Transkrypt

1 Nowiny Lekarskie 2006, 75, 2, KATARZYNA SMYKAŁ, ALEKSANDRA ROCHOWIAK, ANNA KUBIAK, ZOFIA I. NIEMIR EKSPRESJA Β1 INTEGRYNY I WITRONEKTYNY W KŁĘBUSZKACH NERKOWYCH CHORYCH NA KŁĘBUSZKOWE ZAPALENIE NEREK THE EXPRESSION OF Β1 INTEGRIN AND VITRONECTIN IN HUMAN GLOMERULONEPHRITIS Pracownia Nefrologii Molekularnej przy Katedrze i Klinice Nefrologii, Transplantologii i Chorób Wewnętrznych Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu Kierownik Pracowni: dr hab. n. med. Zofia I. Niemir Kierownik Katedry i Kliniki: prof. dr hab. med. Stanisław Czekalski Streszczenie Wstęp. Dotychczasowe badania wykazały, iż integryna β1 reguluje proliferację, migrację i apoptozę różnych typów komórek, jak również obrót macierzy pozakomórkowej. W połączeniu różnymi typami podjednostek α integryn (α1-11, αv), β1 integryna stanowi receptor dla białek macierzy pozakomórkowej, takich jak: kolagen, fibronektyna, laminina oraz witronektyna (VT). Cel. Celem naszych badań była analiza ekspresji β1 integryny oraz VT w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenia nerek (KZN). Metodyka. Badaniami objęto 38 chorych z różnymi formami kłębuszkowego zapalenia nerek. Materiał kontrolny stanowiło 5 fragmentów prawidłowych morfologicznie nerek pozyskanych z okolic wyciętego guza nerki. Oceny ekspresji badanych antygenów dokonano za pomocą immunohistochemii z użyciem trójstopniowej metody APPAP. CD31 użyto jako markera komórek śródbłonka. Wyniki i wnioski. W zdrowych kłębuszkach, ekspresja β1 integryny miała charakter rozlany i dotyczyła wszystkich komórek kłębuszka nerkowego. Ekspresję VT obserwowano na komórkach śródbłonka i na komórkach mezangialnych kłębuszka nerkowego. Porównywalną do nerki zdrowej ekspresję β1 integryny i VT stwierdzono w kłębuszkach z łagodną lub umiarkowaną proliferacją komórek mezangialnych. Natomiast zaobserwowano wyraźny spadek ekspresji obu molekuł w kłębuszkach z dużym rozplemem komórek mezangium, jak również z zaawansowanym procesem sklerotyzacji. Stwierdzono linijną zależność pomiędzy ekspresją VT i CD31, jak również β1 integryny i CD31 w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN (r = 0,72, p < 0,01 oraz r = 0,72, p < 0,0005). Ekspresja β1 integryny korelowała również z ekspresją VT w kłębuszkach nerkowych (r = 0,42, p < 0,05) i była zróżnicowana w zależności od aktywności procesu zapalnego w kłębuszku. Nasze wyniki sugerują udział β1 integryny jako istotnego receptora dla VT w kłębuszku nerkowym. Spadek ekspresji β1 integryny i VT wraz z postępującym procesem zapalnym dotyczy głównie komórek mezangialnych. Wskazuje to na zaangażowanie tych białek w utrzymanie integralności struktury kłębuszka nerkowego. SŁOWA KLUCZOWE: kłębuszkowe zapalenie nerek, β1 integryna, witronektyna, CD31. Summary Introduction. Recent results have shown that β1 integrin regulates proliferation, migration and apoptosis of different types of cells, as well as turnover of the extracellular matrix. Coupled with various types of α integrin subunits (α1-11, αv), β1 integrin can serve as a receptor for extracellular matrix proteins, such as: collagen, fibronectin, laminin and vitronectin (VT). Aim. In this study, we analyzed the glomerular expression of β1 integrin and VT in the renal tissue with glomerulonephritis (GN). Methods. Thirty-eight patients with different forms of GN were enrolled into the study. Five normal kidneys (NK) served as controls. Immunohistochemistry with the use of APPAP (Alkaline Phosphatase anti-alkaline Phosphatase) method was employed to evaluate the expression of the examined peptides. CD31 was used as a marker of endothelial cells. Results and conclusions. In the normal glomerulus, a wide-spread expression of β1 integrin was observed. The expression of VT could be confined to endothelial and mesangial cells. In GN, compared to NK, the immunoreactivity for β1 integrin and VT was preserved in glomeruli with minor-to-mild proliferation of mesangial cells. But the expression of both peptides was markedly reduced in mesangial areas of glomeruli with marked proliferative response of glomerular cells, as well as in those with advanced sclerotic alterations. In general, a linear relationship between the expression of VT and CD31, as well as β1 integrin and CD31 could be stated in GN (r = 0.72, p < 0.01 and r = 0.72; p < , respectively). Although also the immunoreactivity for β1 integrin and VT was positively related with that for VT in GN (r = 0.42, p < 0.05), the expression of these peptides varied and seemed to be related with the activity of the glomerular inflammation. Our results seem to indicate that β1 integrin is an important receptor for VT in the glomerulus. Since the reduction in the reactivity for β1 integrin and VT during the progression of GN concerns mainly the glomerular mesangium, the engagement of these proteins in fulfilling the supportive function for mesangial cells may be suggested. KEY WORDS: glomerulonephritis, β1 integrin, vitronectin, CD31. Wstęp Kłębuszek nerkowy stanowi unikalną strukturę, która pozwala mu na pełnienie ważnej funkcji, jaką jest oczyszczanie krwi w mechanizmie filtracji. W skład kłębuszka nerkowego wchodzą elementy komórkowe, takie jak: komórki mezangialne, komórki śródbłonka i podocyty oraz macierz pozakomórkowa. Wzajemne interakcje

2 Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek 147 VT stanowi ligand dla kompleksu αvβ3 integryn (CD51/CD61), którego ekspresję wykazano na podocytach [7]. Ostatnie badania wskazują jednak, iż sekwencja Arg- Gly-Asp umożliwia interakcje VT z innym receptorem, jakim jest kompleks integryn α8 z β1 [9]. Kagami i wsp. potwierdzili obecność tego kompleksu na powierzchni komórek mezangialnych [10]. Podobną lokalizację VT wykazały nasze poprzednie badania [7]. Ze względu na istniejące rozbieżności, co do roli β1 integryn oraz VT w procesie zapalnym toczącym się w kłębuszku nerkowym celem naszej pracy była analiza ekspresji obu molekuł w materiale biopsyjnym pochodzącym od chorych na KZN. Materiały i metody Badaniem objęto 38 chorych z potwierdzonym morfologicznie rozpoznaniem KZN. Wśród badanych u 28 zdiagnozowano mezangialne rozplemowe KZN (MesPGN), u 5 błoniasto-rozplemowe KZN (MPGN), u 3 ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych (FSGS) oraz u 2 błoniaste KZN (IMGN). Dane kliniczne i biochemiczne chorych zostały przedstawione w tabeli 1. Podstawą rozpoznania KZN stanowiło badanie morfologiczne skrawka nerki w mikroskopie świetlnym wraz z wynikami badania immunopatologicznego. Do badań własnych użyto Tab. 1. Dane kliniczne i biochemiczne chorych na KZN Morfologia Liczba chorych Wiek lata (średnia ± SD) Stężenie kreatyniny w surowicy (µmol/l) (średnia ± SD) Białkomocz g/24h (średnia ± SD) MesPGN 28 40,63 ± 8,55 146,25 ± 40,23 3,2 ± 2,15 MPGN 5 48,00 ± 9,25 164,65 ± 70,25 3,5 ± 1,80 FSGS 3 32,28 ± 3,15 105,10 ± 38,65 1,2 ± 0,32 IMGN 2 54,80 ± 6,20 180,40 ± 60,05 6,00 ± 2,40 MesPGN: mezangialne rozplemowe kłębuszkowe zapalenie nerek; MPGN: błoniasto-rozplemowe kłębuszkowe zapalenie nerek; FSGS: ogniskowe segmentalne stwardnienie kłębuszków nerkowych; IMGN: błoniaste kłębuszkowe zapalenie nerek. między komórkami i składnikami macierzy pozakomórkowej: kolagenem, fibronektyną czy witronektyną (VT) są możliwe dzięki integrynom [1]. Integryny to niekowalnecyjnie połączone heterodimeryczne cząsteczki adhezyjne, które składają się z hydrofobowej części przezbłonowej oraz części zewnątrz- i wewnątrzkomórkowej. Część cytoplazmatyczna wykazuje aktywność enzymatyczną, łączy się za pomocą białek pośredniczących z cytoskeletonem oraz szeregiem kinaz, co warunkuje przekazanie sygnału z otoczenia do wnętrza komórki [1]. Szczególną rolę w regulacji proliferacji, migracji, apoptozie komórek, jak i obrocie macierzy pozakomórkowej przypisuje się β1 integrynie. W połączeniu z różnymi podjednostkami α integryn stanowi ona receptor dla białek macierzy pozakomórkowej (np.: α1β1 dla kolagenu typu IV i lamininy; α5β1 dla fibronektyny czy wspomniany poprzednio α8β1 dla VT) [1, 2]. Z przeprowadzonych dotychczas badań wynika, że ekspresja β1 integryny w zdrowej nerce jest zależna od towarzyszącego jej typu podjednostki α. Kagami i wsp. wykazali ekspresję β1 integryny na komórkach mezangialnych (głównie α1-3β1, α8β1), komórkach śródbłonka (α1β1, α3β1), podocytach (α3β1) oraz w mniejszym stopniu na komórkach nabłonka cewek nerkowych [1]. Główną rolę w regulacji syntezy β1 integryny przypisuje się transformującemu czynnikowi wzrostu β (TGF-β) [3]. Baraldi i wsp. wskazali także na czynnik martwicy nowotworów α (TNFα) oraz interferon γ (INF-γ), jako inne czynniki modulujące ekspresję tej integryny na różnych typach komórek [4]. Przeprowadzone dotychczas badania nie pozwalają jednoznacznie określić wpływu β1 integryny na przebieg zmian zapalnych w kłębuszku nerkowym. Cook i wsp. sugerują, że kompleks α1β1 integryn jest czynnikiem promującym proces włóknienia i pogorszenia funkcji kłębuszka nerkowego [5]. Natomiast, według Chena i wsp., kompleks α1β1 integryn zapobiegał uszkodzeniu komórek kłębuszka nerkowego po podaniu adriamycyny [6]. Jedną z molekuł macierzy pozakomórkowej, której przypisuje się rolę w regulacji funkcji i procesów życiowych dotyczących komórek własnych kłębuszka nerkowego jest VT [7]. Jest to glikoproteina, której obecność wykazano nie tylko w obrębie kłębuszka nerkowego, ale i w wielu płynach ustrojowych między innymi w surowicy, moczu i płynie owodniowym [8]. materiał biopsyjny, pozostały po zakończeniu diagnostyki immunopatologicznej KZN. Skrawki zdrowej nerki (n = 5) uzyskano z okolicy wyciętego guza nerki. Ekspresję VT, β1 integryny oraz CD31 badano za pomocą immunohistochemii z wykorzystaniem skrawków nerek utrwalonych uprzednio w acetonie. Zastosowano trójstopniową metodę APPAP (Alkaline Phosphatase-anti- Alkaline Phosphatase) [7]. Badania przeprowadzono z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciw VT, β1 integrynie (Chemicon International, Temeccula, Stany Zjednoczone) i CD31 (Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, Wielka Brytania). Ekspresje VT, β1 integryny oraz CD31 u chorych na KZN porównywano do ekspresji w prawidłowym kłębuszku nerkowym, gdzie poziom ekspresji tych molekuł oceniono na 3,0. Następnie badano zależności między nasileniem ich ekspresji wykorzystując test Spearmanna.

3 148 Katarzyna Smykał i inni Wyniki W prawidłowym kłębuszku nerkowym, ekspresja β1 integryny miała charakter rozlany i dotyczyła wszystkich komórek kłębuszka (Ryc. 1.A). Ekspresję VT stwierdzano zarówno na komórkach śródbłonka, jak i komórkach mezangialnych kłębuszka nerkowego (Ryc. 1.B). Ekspresja CD31 lokalizowała się na komórkach śródbłonka na całym obszarze kłębuszka nerkowego (Ryc. 1.C). Zmiany ekspresji β1 integryny oraz VT u chorych na KZN związane były z aktywnością procesu zapalnego w kłębuszku nerkowym. U chorych z umiarkowanym rozplemem komórek mezangium ekspresja obu molekuł w kłębuszkach była zbliżona do obserwowanej w nerce zdrowej. Natomiast w przypadku nasilonego rozplemu mezangium oraz zaawansowanych zmian sklerotycznych w kłębuszkach obserwowano wyraźny spadek ekspresji β1 integryny oraz VT na komórkach mezangialnych i, w mniejszym stopniu, na komórkach śródbłonka (Ryc. 2.). Stwierdzono wyraźną korelację między ekspresją VT i CD31 (Ryc. 3.), jak również między ekspresją β1 integryny i CD31 (Ryc. 4.). Wykazano także istotnie statystyczną zależność między ekspresją β1 integryny i VT (Ryc. 5.). A B C Ryc. 1. Ekspresja β1 integryny (A), VT (B) i CD31 (C) w prawidłowym kłębuszku nerkowym. A B C D E F Ryc. 2. Porównanie ekspresji β1 integryny (A, D), VT (B, E) i CD31 (C, F) w kłębuszkach nerkowych z nasilonym (A, B, C) rozplemem mezangium oraz sklerotyzacją (D, E i F).

4 Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek 149 3,0 2,5 r = 0,72 p < 0,01 Ekspresja VT 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Ekspresja CD31 Ryc. 3. Zależność między ekspresją VT i CD31 w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN. Ekspresja β1 integryny 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 r = 0,72 p < 0,0005 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Ekspresja CD31 Ryc. 4. Zależność między ekspresją β1 i CD31 w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN. 3,5 Ekspresja β1 integryny 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 r = 0,42 p < 0,05 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Ekspresja VT Ryc. 5. Zależność między ekspresją β1 i VT w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN. Dyskusja Wyniki naszych badań wskazują na ekspresję VT i β1 integryny na komórkach śródbłonka, co wydaje się potwierdzać wykazana przez nas linijna zależność między ekspresją VT i CD31 (markera komórek śródbłonka) oraz β1 integryny i CD31. Jednak zmiany w ekspresji VT i β1 integryny w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN obserwowano przede wszystkim na komórkach mezangium.

5 150 Katarzyna Smykał i inni W odniesieniu do ekspresji VT, wyniki te są zgodne z otrzymanymi przez Shikata i wsp., którzy wykrywali VT na komórkach mezangialnych za pomocą przeciwciał poliklonalnych metodą immunofluorescencji [11]. Wyraźna korelacja między ekspresją obydwóch cząsteczek sugeruje, że β1 integryna jest ważnym receptorem VT w kłębuszku nerkowym. Jak już wspomniano, dotychczasowe wyniki badań dotyczące roli β1 integryny w procesie zapalnym w kłębuszku nerkowym są rozbieżne. Kagami i wsp. obserwowali wyraźny wzrost ekspresji α1β1 integryn w kłębuszkach nerkowych szczurów z wywołanym za pomocą przeciwciał anty-thy 1 mezangialnym rozplemowym KZN. Wzrost ekspresji α1β1 integryn skojarzony był z nasileniem produkcji TGF-β, znanego czynnika stymulującego proces włóknienia. Według powyższych autorów, TGF-β wpływa na akumulację składników macierzy pozakomórkowej poprzez indukcję syntezy β1 integryn [10]. Podobne wyniki uzyskał Uchio-Hamada i wsp. u myszy z wrodzonym zespołem nerczycowym [12]. W kłębuszkach ludzkich nerek, wzrost ekspresji β1 integryn w przebiegu nefropatii IgA oraz toczniowego KZN wykazał Kuhara i wsp. [13]. Odmienną lokalizację ekspresji β1 integryn u chorych na nefropatię IgA stwierdził Hillis i wsp. Autorzy ci nie obserwowali zmian w ekspresji β1 integryn na komórkach własnych kłębuszka w stosunku do nerki zdrowej. Ekspresję α1β1 integryn wykrywali oni w półksiężycach, ale wzrost ekspresji tego receptora dotyczył przede wszystkim ognisk włóknienia w śródmiąższu oraz uszkodzonych cewek nerkowych. Podobnie do wyników naszych badań, stwierdzali oni brak ekspresji α1β1 integryn w kłębuszkach zmienionych sklerotycznie [2]. Tymczasem Baraldi i wsp. obserwowali wyraźny wzrost ekspresji α1β1 oraz α2β1 integryn na komórkach mezangialnych w kłębuszkach nerkowych chorych na gwałtownie postępujące KZN [4]. Cook i wsp. badali efekt zastosowania przeciwciał przeciwko α1β1 integrynom szczurom z gwałtownie postępującym KZN. Podczas gdy u szczurów, którym nie podano przeciwciał obserwowano wzrost ekspresji α1β1 integryn na komórkach mezangialnych oraz na komórkach nabłonka cewek nerkowych (w porównaniu do nerki zdrowej), brak α1β1 integryn prowadził do zahamowania proliferacji fibroblastów, zwiększenia produkcji metaloproteinaz i w rezultacie zmniejszenia akumulacji kolagenu [5]. Za szkodliwym wpływem α1β1 integryn na przebieg procesu zapalnego w kłębuszkach nerkowych przemawiają również wyniki badań genetycznych na myszach, przeprowadzonych przez Cosgrove i wsp. Stwierdzili oni, iż pozbawienie zwierząt genu kodującego łańcuch α3 kolagenu typu IV oraz genu kodującego α1 integrynę wyraźnie zahamowało progresję KZN, zmniejszyło akumulację białek macierzy pozakomórkowej i zapobiegało zanikowi wyrostków stopowatych podocytów [3]. Jednak całkowicie odmienne wnioski, co do roli α1β1 integryn w kłębuszku nerkowym wysnuł Chen i wsp., którzy badali wpływ α1β1 integryn na utrzymanie struktury kłębuszków nerkowych myszy po ich uszkodzeniu za pomocą adriamycyny. Porównali oni skutki podania adriamycyny myszom pozbawionym genu kodującego α1 integrynę z myszami posiadającymi kompleks α1β1 integryn. U myszy pozbawionych α1β1 integryn obserwowano wyraźny wzrost produkcji wolnych rodników, zmniejszenie liczby komórek mezangialnych oraz wzrost syntezy i odkładania się kolagenu typu IV. Przyczyniło się to do szybko postępującej sklerotyzacji kłębuszków nerkowych i pogorszenia funkcji nerek [6]. Autorzy sugerują, iż kompleks α1β1 integryn pełni funkcję ochronną w stosunku do komórek kłębuszka nerkowego. Wykazany przez nas wyraźny spadek VT i β1 integryny w kłębuszkach nerkowych chorych na KZN z nasilonym rozplemem komórek mezangialnych oraz w przebiegu zmian sklerotycznych wydaje się potwierdzać ochronną rolę β1 integryny oraz VT w stosunku do komórek własnych kłębuszka nerkowego. Wyniki naszych badań wskazują zatem na te molekuły, jako ważne czynniki zaangażowane w utrzymanie integralności struktury kłębuszka nerkowego. Piśmiennictwo 1. Kagami S., Kondo S.: β1-integrins and glomerular injury. J. Med. Invest., 2004, 51, Hillis G.S., Roy-Chaudhury P., Duthie L.A., Stewart K.N., Brown P.A.J., Simpson J.G., MacLeod A.M.: Expression of β1 integrins in IgA nephropathy. Nephrol. Dial. Transplant., 1997, 12, Cosgrove D., Rodgers K., Meehan D., Miller C., Bovard K., Gilroy A., Gardner H., Kotelianski V., Gotwals P., Amatucci A., Kalluri R.: Integrin α1β1 and transforming growth factorβ1 play distinct roles in Aport glomerular pathogenesis and serve as dual targets for metabolic therapy. Am. J. Pathol., 2000, 157, Baraldi A., Zambruno G., Furci L., Ballestri M., Tombesi A., Ottami D., Lucchi L., Lusvarghi E.: β1 and β3 integrin upregulation in rapidly progressive glomerulonephritis. Nephrol. Dial. Transplant., 1995, 10, Cook H.T., Khan S.B., Allen A., Bhangal G., Smith J., Loob R.R., Pusey C.D.: Treatment with an antibody to VLA-1 integrin reduces glomerular and tubulointerstitial scarring in a rat model of crescentic glomerulonephritis. Am. J. Pathol., 2002, 4, Chen X., Moeckel G., Morrow J.D., Cosgrove D., Harris C.R., Fogo A.B., Zent R., Pozzi A.: Lack of integrin α1β1 leads to severe glomerulosclerosis after glomerular injury. Am. J. Pathol., 2004, 165, Jadczyszyn J., Rochowiak A., Smykał K., Kubiak A., Niemir Z.: Czy αvβ3 integryny biorą udział w procesie zapalnym w kłębuszku nerkowym? Now. Lek., 2005, 5, Conlan M.G., Tomasini B.R., Schulz R.L., Mosher D.F.: Plasma vitronectin polymorphism in normal subjects and patients with disseminated intravascular coagulation. Blood, 1988, 72, Schnapp L.M., Hatch N., Ramos D.M., Klimanskaya I.V., Scheppard D., Pytela R.: The human integrin α8β1 functions as a receptor for tenascin, fibronectin and vitronectin. J. Biol. Chem., 1995, 270, Kagami S., Border W.A., Ruoslahti E., Noble N.A.: Coordinated expression of β1 integrins and transforming growth fac-

6 Ekspresja β1 integryny i witronektyny w kłębuszkach nerkowych chorych na kłębuszkowe zapalenie nerek 151 tor-β-induced matrix proteins in glomerulonephritis. Lab. Invest., 1993, 69, Shikata K., Makino H., Marioka S., Kashitani T., Hirata K., Ota Z., Wada J., Kanwar Y.S.: Distribution of extracellular matrix receptors in various form of glomerulonephritis. Am. J. Kidney Dis., 1995, 25, Uchio-Yamada K. Manabe N., Yamaguchi M., Akashi N., Goto Y., Yamamoto Y., Ogura A., Miyamoto H.: Localization of extracellular matrix receptors in ICGN mice, a strain of mice with hereditary nephrotic syndrome. J. Vet. Med. Sci., 2001, 63, Kuhara T., Kagami S., Kuroda Y.: Expression of β1 integrins on activaced mesangial cells in human glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 1997, 8,