lek. Katarzyna Gniewek Katedra i Klinika Nefrologii i Medycyny Transplantacyjnej UMW

Transkrypt

1 lek. Katarzyna Gniewek Katedra i Klinika Nefrologii i Medycyny Transplantacyjnej UMW CD80, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 i supar-użyteczność markerów uszkodzenia podocyta w ocenie aktywności kłębuszkowych zapaleń nerek Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: prof. dr hab. Magdalena Krajewska Katedra i Klinika Nefrologii i Medycyny Transplantacyjnej UMW Recenzenci: dr hab.marcin Adamczak Katedra i Klinika Nefrologii, Endokrynologii i Chorób Przemiany Materii Śląskiego UM wkatowicach prof. dr hab. Ewa Żukowska-Szczechowska Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii w Zabrzu Śl. UM w Katowicach Wrocław, 6 lutego 2015

2 Katarzyna Gniewek Data i miejsce urodzenia: r., Wrocław Wykształcenie i przebieg pracy zawodowej: r. VII Liceum Ogólnokształcące im. Krzysztofa Kamila Baczyńskiego we Wrocławiu r. studia na Wydziale Lekarskim Akademii Medycznej im. Piastów Śląskich we Wrocławiu r. studia w Bochum (Niemcy) na Wydziale Lekarskim, Ruhr-Universität Bochum, w ramach programu wymiany studentów ERASMUS r. staż podyplomowy w Uniwersyteckim Szpitalu Klinicznym we Wrocławiu od 2009r. szkolenie specjalizacyjne z chorób wewnętrznych w Katedrze i Klinice Nefrologii i Medycyny Transplantacyjnej Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu Dorobek naukowy: Opublikowane prace: 1. Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Wacław Weyde, Katarzyna Grzegorczyk, Marian Klinger.: Pentraksyny - znaczenie w patogenezie tocznia rumieniowatego układowego Post.Hig.Med.Dośw.(online) 2011 Vol.65; s Katarzyna Grzegorczyk, Magdalena Krajewska, Wacław Weyde, Katarzyna Jakuszko, Andrzej Gniewek, Marian Klinger.: Płeć a choroby nerek - znaczenie kliniczne i mechanizmy modyfikującego oddziaływania. Post.Hig.Med.Dośw.(online) 2011 Vol.65; s Doniesienia zjazdowe: 1. Katarzyna Grzegorczyk, Katarzyna Jakuszko, Hanna Bartosik, Maria Magott, Maria Boratyńska, Dariusz Patrzałek, Marian Klinger: Zapalenie jelita grubego w przebiegu zakażenia Clostridium difficile (C. diffiicile) u pacjentów po przeszczepieniu nerki = Clostridium difficile colitis in patients after kidney transplantation; Ann.Transplant Vol.15 suppl.1; s.18 IX

3 Sympozjum Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego "Zakażenia w transplantologii". Łódź, września 2010 r. Program i streszczenia 2. Katarzyna Jakuszko, Katarzyna Grzegorczyk, Hanna Bartosik, Maria Magott, Mirosław Banasik, M. Szott, Maria Boratyńska, Dariusz Patrzałek, Marian Klinger.: Zakażenia wieloopornymi szczepami bakteryjnymi pacjentów po przeszczepieniu nerki = Multiply resistant Gram positive and Gram negative bacteria in kidney transplant recipients; Ann.Transplant Vol.15 suppl.1; s.19 IX Sympozjum Polskiego Towarzystwa Transplantacyjnego "Zakażenia w transplantologii". Łódź, września 2010 r. Program i streszczenia 3. Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marta Myszka, Agata Sebastian, Katarzyna Grzegorczyk, Augustyniak- Bartosik H, Wiland P, Klinger M: Antibodies against monomeric CRP - a promising biomarker of lupus nephritis? Nephrol.Dial.Transplant Vol.28 suppl.1; s.i42-i43 poz.mo058; 50th Congress of the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association (ERA-EDTA). Istanbul, Turkey, May 18-21, Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Hanna Augustyniak-Bartosik, Katarzyna Grzegorczyk, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marta Myszka, Marcelina Żabińska and Marian Klinger. Anti-CRP antibodies in tubulointerstitial nephritis and uveitis (TINU) syndrome. World Congress of Nephrology, May 31-June , Hong Kong 5. Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Hanna Augustyniak-Bartosik, Katarzyna Grzegorczyk, Katarzyna Kościelska- Kasprzak, Marta Myszka, Marcelina Żabińska, Agnieszka Hałoń, Wacław Weyde, Marian Klinger: Anti-CRP antibodies in tubulointerstitial nephritis and uveitis (TINU) syndrome; W:XI Zjazd Polskiego Towarzystwa Nefrologicznego. Wrocław, czerwca 2013 r. [CD-ROM]; s Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marta Myszka, Agata Sebastian, Katarzyna Grzegorczyk, Hanna Augustyniak-Bartosik, Piotr Wiland, Wacław Weyde, Marian Klinger.: Antibodies against monomeric CRP - a promising biomarker of lupus nephritis; W:XI Zjazd Polskiego Towarzystwa Nefrologicznego. Wrocław, czerwca 2013 r. [CD-ROM]; s Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marta Myszka, Marcelina Żabińska, Katarzyna Gniewek, Agata Sebastian, Piotr Wiland, Marian Klinger. Cytokines as biomarkers of active lupus nephritis. Trilateral Meeting in Dresden 27th-28th September 2013

4 8. Katarzyna Jakuszko, Magdalena Krajewska, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marta Myszka, Marcelina Żabińska, Hanna Augustyniak-Bartosik, Katarzyna Gniewek, Agnieszka Hałoń, Marian Klinger. Antibodies against monomeric C- reactive protein a link between the kidney and eye in tubulointerstitial nephritis and uveitis (TINU) syndrome. Trilateral Meeting in Dresden 27th- 28th September Katarzyna Gniewek, Magdalena Krajewska, Katarzyna Jakuszko, Katarzyna Kościelska-Kasprzak, Marian Klinger.: MMP-2 and TIMP-2 as the players in various types of primary glomerulonephritis. Nephrol.Dial.Transplant Vol.29 suppl.3; s.iii192 poz.sp358; 51st Congress of the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association (ERA-EDTA). Amsterdam, The Netherlands, May 31st - June 3rd, Katarzyna Jakuszko, Zofia Bednarz, Agata Sebastian, Magdalena Krajewska, Katarzyna Gniewek, Piotr Wiland, Wacław Weyde, Marian Klinger.: Bilirubin as aditional biomarker of active lupus? Nephrol.Dial.Transplant Vol.29 suppl.3; s.iii437 poz.mp328; 51st Congress of the European Renal Association European Dialysis and Transplant Association (ERA-EDTA). Amsterdam, The Netherlands, May 31st - June 3rd, Katarzyna Jakuszko, Zofia Bednarz, Agata Sebastian, Magdalena Krajewska, Katarzyna Gniewek, Piotr Wiland, Wacław Weyde, Marian Klinger: Stężenie bilirubiny jako dodatkowy marker aktywności tocznia układowego; XII Zjazd Polskiego Towarzystwa Nefrologicznego. Lublin czerwca 2014 r.

5 Wstęp: Pierwotne kłębuszkowe zapalenia nerek są częstą przyczyną schyłkowej niewydolności nerek i drugim, po nefropatii cukrzycowej, powodem podejmowania leczenia nerkozastępczego w Polsce. Etiopatogeneza glomerulopatii pierwotnych jest przedmiotem intensywnych badań. W ostatnich latach dzięki osiągnięciom biologii molekularnej i genetyki poszerzyły się możliwości badań nad nowymi cząstkami, które mogłyby wejść do panelu wskaźników typu i aktywności glomerulopatii. W kręgu zainteresowań znajduje się obecnie wiele cząstek, w tym enzymy - metaloproteinazy MMP-2 i MMP-9, ich inhibitory TIMP-2 i TIMP-1 a także białka CD80 i supar- rozpuszczalny receptor urokinazowego aktywatora plazminogenu. MMP-2 i MMP-9 oraz ich inhibitory TIMP-2 i TIMP-1 odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu równowagi między procesami syntezy i degradacji macierzy pozakomórkowej kłębuszka nerkowego. Nadmierny rozplem mezangium wynika z zaburzenia równowagi pomiędzy aktywnością metaloproteinaz i ich inhibitorów tkankowych, co doprowadza do szkliwienia kłębuszków nerkowych i włóknienia śródmiąższu. MMP-9 przypisywana jest szczególna rola w przybytku macierzy pozakomórkowej, natomiast znaczenie MMP-2 w patogenezie glomerulopatii polega na uszkodzeniu błony podstawnej kłębuszka z uwagi na duże powinowactwo do jej składowych. Inhibitory metaloproteinaz mają zdolność hamowania ich działania, przy czym TIMP-2 wykazuje szczególne powinowactwo do MMP-2 a TIMP-1 do MMP-9. SuPAR jest białkiem powstałym wskutek degradacji receptora upar w miejscu zakotwiczenia do błony podstawnej podocyta. U zdrowych ludzi cząstka ta występuje w niewielkim stężeniu w osoczu i bierze udział w przyleganiu i migracji komórek. SuPAR jest potencjalnym kandydatem na osoczowy czynnika zwiększający przepuszczalność błony filtracyjnej kłębuszka nerkowego w glomerulopatii FSGS. Osocze pacjentów z nawrotem zespołu nerczycowego indukuje rozwój białkomoczu u szczurów oraz podwyższa wskaźnik osoczowej przepuszczalności dla albumin w ludzkich kłębuszkach nerkowych. U niektórych chorych z wysokimi stężeniami supar dochodzi do nawrotu FSGS w przeszczepionej nerce, czemu można zapobiec usuwając białko przy pomocy zabiegu plazmaferezy lub immunoabsorpcji. Podwyższone stężenie supar obserwowano u pacjentów z chorobami infekcyjnymi, co wskazuje na konieczność oceny tego wskaźnika w kontekście stężeń markerów zapalnych. CD80 jest przezbłonowym białkiem obecnym na powierzchni wielu komórek, między innymi na limfocytach B i komórkach prezentujących antygen (ang. antigen presenting cells; APC). Podocyty są zdolne do nabywania właściwości komórek APC pod wpływem stymulacji fragmentami bakteryjnymi, wirusami i limfokinami.

6 Nadmierna aktywacja i utrzymywanie się ekspresji CD80 na podocytach może leżeć u podłoża białkomoczu w nefropatii zmian minimalnych ( hipoteza dwóch uderzeń ). Cel pracy: W pracy analizowane były stężenia MMP-2, MMP-9, ich inhibitorów TIMP-2 i TIMP-1 a także białek CD80 i supar w grupach nefropatii o wspólnym mechanizmie patogenetycznym, a także w poszczególnych typach KZN. Określano zależność stężeń badanych cząstek od aktywności choroby oraz stopnia ubytku funkcji filtracyjnej nerek Materiał i metody: Badaniem objęto 120 pacjentów w wieku od 1 do 86 lat (średnia wieku 39,4 ± 19,1 lat) z rozpoznaniem glomerulopatii pierwotnej. U 100 chorych rozpoznanie kłębuszkowego zapalenia nerek potwierdzono badaniem histopatologicznym, u 20 biopsja nerki nie była wykonywana z powodu przeciwskazań lub braku zgody pacjenta. Do grupy kontrolnej zakwalifikowano 29 zdrowych ochotników (średnia wieku 41,4 ± 10,7 lat). Pobrano łącznie 183 próbki krwi i 183 próbki moczu u 149 osób. W pracy zastosowano dwa podziały grupy badanej. Pierwszy oparto na rozpoznaniach histopatologicznych kłębuszkowych zapaleń nerek. Grupę podocytopatii, ze względu na wspólny mechanizm patogenetyczny uszkodzenia podocyta, utworzyły - FSGS, nefropatia zmian minimalnych oraz błoniaste kłębuszkowe zapalenie nerek. Liczebność grupy wynosiła 62 osoby. Cechą wspólną drugiej grupy, liczącej 38 pacjentów, był przybytek macierzy mezangium pozakomórkowego. Zaliczono do niej postacie błoniasto-rozplemowe (mezangialnowłośniczkowe) oraz mezangialne rozplemowe KZN, zarówno IgA jak i non-iga. Odrębną, trzecią grupę, stanowiło 20 pacjentów z rozpoznaniem kłębuszkowego zapalenia nerek na podstawie cech klinicznych. Drugi z podziałów opierał się na wyodrębnieniu grupy chorych wykazujących cechy klinicznej aktywności choroby oraz grupy bez cech aktywności. Kryteria stanowiły wielkość białkomoczu dobowego wyliczanego za pomocą współczynnika Ginsberga oraz obecność minimum sześciu erytrocytów wyługowanych i przynajmniej jednego wałeczka patologicznego (tj. ziarnistego, woskowego, z komórek nabłonka lub erytrocytarnego) w osadzie moczu. Na podstawie powyższych kryteriów 57 pacjentów zaklasyfikowano do grupy aktywnej i w tej grupie uzyskano łącznie 79 pobrań krwi i moczu. W grupie nieaktywnej było 63 chorych, u których wykonano 75 pobrań.

7 Za pomocą standardowych testów diagnostycznych oznaczono kliniczne wskaźniki aktywności choroby, takie jak morfologia, funkcja filtracyjna nerek, stężenie białka całkowitego, albumin, lipidów, wapnia i fosforu w surowicy, stężenie białka i kreatyniny w moczu oraz obecność aktywnego osadu moczu. Pomiary stężenia MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, CD80 i supar wykonano w surowicy i moczu osób grupy badanej i kontrolnej przy pomocy komercyjnych testów immunoenzymatycznych ELISA, zgodnie z instrukcjami producentów. Testy opierały się na metodzie sandwich" ELISA, czyli teście podwójnego wiązania, w którym antygen zostaje związany pomiędzy dwiema "warstwami" przeciwciał, a następnie zidentyfikowany dzięki reakcji barwnej. Natężenie tej reakcji badano przy pomocy spektrofotometru przy długości fali 450 nm. Wyniki: Najwyższe stężenia MMP-2, TIMP-2 i TIMP-1 w surowicy i moczu obserwowano w grupie aktywnej choroby, w porównaniu do grupy nieaktywnej (MMP-2 surowica: p=0,001; MMP-2 mocz: p=0,001; TIMP-2 surowica: p=0,001; TIMP-2 mocz: p=0,02; TIMP-1 surowica: p=0,001; TIMP-1 mocz: p=0,001). Wykazano istotne zależności pomiędzy stężeniem MMP-2 i TIMP-2 w surowicy i moczu a wykładnikami zespołu nerczycowego - dodatnie ze stężeniem cholesterolu całkowitego i trójglicerydów oraz z białkomoczem dobowym i ujemne ze stężeniami białka całkowitego i albumin. Ponadto stwierdzono istotne korelacje stężeń MMP-2 i TIMP-2 z wykładnikami przewlekłej choroby nerek - dodatnie ze stężeniem kreatyniny i fosforu oraz ujemne z egfr i stężeniem wapnia. Wykazano istotnie wyższe stężenia cząstki supar w surowicy i moczu w grupie aktywnej w porównaniu z grupą nieaktywną (supar surowica: p=0,001; supar mocz: p=0,023). Ponadto, po uwzględnieniu grup rozpoznań histopatologicznych, najwyższe stężenie supar w surowicy stwierdzono w grupie aktywnych podocytopatii, istotnie wyższe w porównaniu z grupą podocytopatii nieaktywną oraz grupą mezangialną aktywną i nieaktywną (supar surowica: p=0,002, p=0,03 i p=0,04). W surowicy i moczu stwierdzono istotne zależności między stężeniem supar a wskaźnikami aktywności zespołu nerczycowego - ujemne ze stężeniem białka całkowitego i albumin oraz dodatnie ze stężeniem cholesterolu całkowitego, trójglicerydów i białkomoczem dobowym. Zaobserwowano silne korelacje pomiędzy stężeniem supar a wykładnikami przewlekłej choroby nerek w surowicy - dodatnie ze stężeniem kreatyniny i fosforu a ujemne z egfr i stężeniem wapnia. W surowicy stwierdzono istotnie wyższe stężenia cząstki CD80 w grupie nieaktywnej w porównaniu z grupą aktywną (CD80 surowica: p=0,014), natomiast w moczu wykazano wyższe stężenia CD80 w grupie aktywnej w porównaniu z nieaktywną

8 (CD80 mocz: p=0,001). Ponadto zaobserwowano statystycznie istotne korelacje pomiędzy stężeniem CD80 a wskaźnikami aktywności nefropatii - w surowicy wykazano dodatnie korelacje ze stężeniem białka całkowitego i albumin i ujemne ze stężeniem cholesterolu całkowitego i trójglicerydów oraz białkomoczem dobowym, w moczu stwierdzono odwrotne zależności niż w surowicy. Wnioski: 1. Stężenia MMP-2 i TIMP-2 mogą być uznane jako potencjalne wskaźniki aktywności glomerulopatii. 2. Stężenia MMP-2 i TIMP-2 ulegają zwiększeniu wraz z narastaniem zaawansowania przewlekłej choroby nerek. 3. Najwyższe stężenia supar w aktywnej fazie glomerulopatii, w patogenezie których podstawową rolę odgrywa pierwotne uszkodzenie podocyta, wskazuje na jego rolę jako wskaźnika w ocenie aktywności choroby. 4. Stężenie supar w surowicy odzwierciedla aktualny stopień zaawansowania PChN. 5. Stężenia CD80 w surowicy i moczu mogą być wskaźnikiem aktywności glomerulopatii. 6. Stężenia metaloproteinaz, ich inhibitorów, a także stężenia supar i CD80 nie różnicują typu kłębuszkowego zapalenia nerek.