(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2012/28 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 9/16 ( ) C12N 15/55 ( ) C12N 15/11 ( ) C12P 21/02 ( ) C12N 1/20 ( ) A23K 1/165 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Fitazy (30) Pierwszeństwo: GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2010/40 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/12 (73) Uprawniony z patentu: Dupont Nutrition Biosciences ApS, Copenhagen, DK (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ANDREI MIASNIKOV, Mountain View, US VIJAY KUMAR, Casnate, IT OLIVER KENSCH, Cologne, DE KLAUS PELLENGAHR, Cologne, DE BIRGITTA LEUTHNER, Cologne, DE ULRICH KETTLING, Munich, DE ANDRE KOLTERMANN, Munich, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Anna Grzelak WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [001] Niniejszy wynalazek dotyczy fitaz, ich sekwencji nukleotydów, sposobów produkcji fitaz i ich wykorzystania. DZIEDZINA WYNALAZKU [002] Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny enzymów stosowanych jako dodatki do pasz. W szczególności wynalazek dotyczy fitaz, które mogą być wykorzystane w celu poprawy trawienia fosforanów w żywności i paszach dla zwierząt. INFORMACJE TECHNICZNE I STAN TECHNIKI [003] Fitynian jest główną formą magazynowania fosforu w zbożach i roślinach strączkowych. Jednakże zwierzęta monogastryczne, takie jak świnie, drób i ryby, nie są zdolne do metabolizowania lub pochłaniania fitynianu (lub kwasu fitynowego), a więc jest on wydalany, co prowadzi do zanieczyszczenia fosforem na obszarach intensywnej produkcji zwierzęcej. Ponadto kwas fitynowy działa również jako czynnik antyżywieniowy u zwierząt monogastrycznych poprzez chelatowanie metali takich jak wapń, miedź i cynk. [004] W celu zapewnienia wystarczającej ilości fosforanów niezbędnych dla wzrostu i zdrowia tych zwierząt, do ich diety dodawany jest fosforan nieorganiczny. Taki dodatek może być kosztowny i w dalszym ciągu zwiększa problemy związane z zanieczyszczeniem. [005] Dzięki działaniu fitazy, fitynian jest zazwyczaj poddawany hydrolizie w celu otrzymania niższych fosforanów inozytolu i fosforanu nieorganicznego. Fitazy są przydatne jako dodatki do pasz dla zwierząt, w których zwiększają dostępność fosforu organicznego dla zwierząt i zmniejszają zanieczyszczenie środowiska fosforanami (Wodziński RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, (1996)). [006] W literaturze opisano wiele fitaz pochodzenia grzybiczego (Wyss M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 65 (2), (1999); Berka R.M. et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (11), (1998); Lassen S. et al. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), (2001)) oraz bakteryjnego (Greiner R. et al Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), (1993); Kerovuo et al. Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), (1998); Kim H.W. et al. Biotechnol. Lett. 25, (2003); Greiner R. et al. Arch. Biochem. Biophys. 341 (2), (1997); Yoon S.J. et al. Enzyme and microbial technol. 18, (1996); Zinin N.V. et al. FEMS Microbiol. Lett. 236, (2004)). [007] Na przykład zmutowane enzymy fitazy E. coli i ich naturalne warianty są znane z WO2004/015084, a fitazy produkowane z Citrobacter braakii są znane z WO2004/ Inne bakteryjne fitazy zostały przedstawione za pomocą pobierania próbek i metod przesiewowych (Zinn N..V i wsp. Biotehnologia, Glavnoe Upravlenie Mikrobiologiceskoj Promy Lennosti Pri, 2, 3 10 (2003)). [008] Jednak do tej pory żadna z tych fitaz nie wykazuje właściwości niezbędnych do skutecznego stosowania jako suplement do paszy zwierzęcej. W szczególności fitazy grzybicze bywają proteolitycznie niestabilne (Igbasan F.A. i wsp. Arch. Anim. Nutr. 53, (2000)) i w związku z tym podlegają 2

3 rozkładowi, podczas gdy większość fitaz bakteryjnych ma wąską specyficzność substratową dla samego fitynianu i słabo degraduje fosforany inozytolu pośrednich stopni fosforylacji (Greiner R. i wsp., Arch. Biochem. Biophys. 303 (1), (1993); Kerovuo J. i wsp. Biochem. J. 352, (2000)). [009] W związku z powyższym, istnieje zapotrzebowanie na ulepszone fitazy. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0010] W szerokim aspekcie niniejszy wynalazek odnosi się do sposobów wytwarzania fitaz pochodzących z bakterii i ich zmodyfikowanych postaci. W szczególności wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania fitaz pochodzących z bakterii, Buttiauxella sp. i ich wariantów/ zmodyfikowanych postaci wybranych i/lub zmodyfikowanych w celu poprawy właściwości w porównaniu z enzymem dzikiego szczepu (macierzystym). [0011] Niniejszy wynalazek jest korzystny, ponieważ przedstawia sposoby wytwarzania nowych fitaz, których właściwości są szczególnie użyteczne i skuteczne jako enzymy paszowe. W szczególności wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania izolowanych i/lub oczyszczonych polipeptydów nowych fitaz, jak tu opisano, lub funkcjonalnego fragmentu, ich wariantów lub zmodyfikowanych postaci, lub ich zmodyfikowanej postaci. Opisano tu również sekwencje kwasu nukleinowego kodujące wspomniane fitazy. [0012] Dla skuteczności jako dodatek enzymowy do żywności lub paszy, fitaza musi łączyć wiele różnych właściwości. Aby móc obniżyć poziom kwasu fitynowego w kwaśnym środowisku żołądka zwierzęcego, fitaza musi być aktywna w niskim ph, najlepiej w szerokim zakresie wartości ph. Ponadto musi odznaczać się wysoką specyficzną aktywnością i posiadać korzystnie wysoką termostabilność, aby uaktywnić białko, które wytrzyma wysokie temperatury zazwyczaj stosowane w przygotowywaniu pasz takich jak granulaty paszowe. [0013] Ważne jest także, aby enzym posiadał szeroką specyficzność substratową, która pozwoli mu na hydrolizę nie tylko fitynianu, ale również produktów pośrednich rozkładu fitynianu, takich jak pentafosforany, trifosforany i tetrafosforany inozytolu. Badania dotyczące degradacji rozkładu fitynianu u świń wykazują, że te oligofosforany inozytolu pozostają w znacznym stopniu nierozpuszczalne w jelicie cienkim i grubym, i tym samym są niedostępne dla fosfatazy alkalicznej wytwarzanej przez zwierzęta i mikroflorę jelit (Schlemmer U. i wsp. Arch. Anim. Nutr (2001)). Stwierdzono występowanie różnic w profilach specyficzności substratowej różnych enzymów. Na przykład trifosforany inozytolu generowane przez fitazy z B. subtilis są zasadniczo odporne na dalszą hydrolizę przez ten enzym [Kerovuo J. i wsp. Biochem. J. 352, (2000)]. [0014] Ponadto opisany tu jest plazmid lub system wektorowy, lub przekształcony czy transgeniczny organizm zawierający nową fitazę tu opisaną lub jej zmodyfikowaną postać. [0015] Opisane są tu również organizmy transgeniczne zmodyfikowane w celu ekspresji nowej fitazy, jak tu opisano, lub jej zmodyfikowanej postaci, a więc zdolne do wytwarzania fitazy. Niniejszy wynalazek 3

4 dostarcza sposoby i metody produkcji biotechnologicznej fitaz i ich zastosowanie jako dodatków paszowych [0016] Aspekty niniejszego wynalazku przedstawione są w zastrzeżeniach patentowych i w następującym komentarzu. [0017] Dla ułatwienia, te i inne aspekty niniejszego wynalazku są omówione w odpowiednich pozycjach sekcji. Jednakże wiedza przedstawiona w poszczególnych sekcjach, nie jest koniecznie ograniczona do danej sekcji. Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku terminy produkować, produkowanie, produkowane, możliwe do wyprodukowania, produkcja są odpowiednio synonimami określeń: przygotować, przygotowanie, przygotowane, preparat, wytworzone, wytwarzanie i możliwe do wytworzenia. [0018] Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku określenia: ekspresja, dokonuje ekspresji, dokonano ekspresji i możliwe do ekspresji, są odpowiednio synonimami określeń: transkrypcja, transkrybuje, transkrybowane i dające się transkrybować. [0019] Stosowane w odniesieniu do niniejszego wynalazku określenia: transformacja i transfekcja dotyczą sposobu wprowadzenia sekwencji kwasu nukleinowego do gospodarzy, komórek gospodarza, tkanek lub narządów. [0020] Inne aspekty dotyczące sekwencji nukleotydowej, które mogą być stosowane w sposobach niniejszego wynalazku obejmują: konstrukt zawierający sekwencje niniejszego wynalazku, wektor zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, plazmid zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną komórkę zawierającą sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną tkankę zawierającą sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organ zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowanego gospodarza zawierającego sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organizm zawierający sekwencje do stosowania w niniejszym wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje także sposoby ekspresji sekwencji nukleotydowej do stosowania w niniejszym wynalazku, za pomocą tej samej ekspresji co w komórce gospodarza; włączając sposoby jego przenoszenia. Niniejszy wynalazek obejmuje też sposoby izolowania sekwencji nukleotydów, takie jak izolowanie z komórki gospodarza. [0021] Inne aspekty dotyczące sekwencji aminokwasowej do stosowania w sposobach niniejszego wynalazku obejmują: konstrukt kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, wektor kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, plazmid kodujący sekwencje aminokwasowe do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną komórkę dokonującą ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowaną tkankę dokonującą ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organ dokonujący ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowanego gospodarza dokonującego ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, transformowany organizm dokonujący 4

5 ekspresji sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku. Niniejszy wynalazek obejmuje również sposoby oczyszczania sekwencji aminokwasowej do stosowania w niniejszym wynalazku, za pomocą tej samej ekspresji co w komórce gospodarza, w tym sposobów przenoszenia, a następnie oczyszczania wspomnianej sekwencji. KRÓTKI OPIS FIGUR UNKU [0022] FIG 1 przedstawia analizę SDS PAGE fitazy rekombinowanej z Buttiauxella P1 29 oczyszczonej metodą chromatografii DEAE Sefaroza. Figura przedstawia ślad skanowania cyfrowego obrazu fotograficznego ścieżki zawierającej próbkę fitazy Buttiauxella. FIG 2 przedstawia profil ph fitazy z Buttiauxella P1 29. FIG 3 przedstawia specyficzność substratową oczyszczonej fitazy rekombinowanej z Buttiauxella P1 29 z frakcjami fosforanu inozytolu o różnym stopniu fosforylacji i substratami modelowymi. Skróty: IP6 kwas fitynowy, IP5, IP4 i IP3 mieszaniny izomerów, odpowiednio penta, tetra i trifosforanów inozytolu. Fru P2 1,6 difosforan fruktozy, Fru P1 6 fosforan fruktozy. [0023] SEKW. NR ID.: 1 przedstawia sekwencję uzyskaną do identyfikacji szczepu bakteryjnego. [0024] SEKW. NR ID.: 2 przedstawia sekwencję polinukleotydową zawierającą gen fitynianu z Buttiauxella P1 29. [0025] SEKW. NR ID.: 3 przedstawia sekwencję aminokwasu genu fitazy z Buttiauxella P1 29. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0026] Niniejszy wynalazek przedstawia sposób przygotowania enzymu zawierającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub zmodyfikowanej formie, homologowi lub wariantowi. Termin "fitaza" oznacza białko lub polipeptyd, który jest zdolny do katalizowania hydrolizy estrów kwasu fosforowego, w tym fitynianu i uwalniania fosforanu nieorganicznego. Niektóre fitazy, tak jak fitynian, są zdolne do hydrolizy przynajmniej niektórych fosforanów inozytolu o pośrednich stopniach fosforylacji. [0027] Termin "odpowiadający fitazie Buttiauxella sp." oznacza, że enzymy nie muszą być uzyskiwane ze źródła Buttiauxella sp. Zamiast tego, najlepiej jakby enzym posiadał te same właściwości funkcjonalne lub sekwencję taką, jak w fitazie Buttiauxella sp. Na przykład fitaza Buttiauxella sp. może być wariantem pochodzącym z Buttiauxella sp., ale nieobecnym naturalnie w gatunkach Buttiauxella. [0028] Gatunki Buttiauxella spp. obejmują: Buttiauxella agrestis, Buttiauxella brennerae, Buttiauxella ferragutiae, Buttiauxella gaviniae, Buttiauxella izardii, Buttiauxella noackiae, Buttiauxella warmboldiae. Szczepy gatunków Buttiauxella są dostępne w DSMZ, Niemieckim Narodowym Ośrodku Zasobów 5

6 Materiałów Biologicznych. Fitazy są korzystnie zidentyfikowane z Buttiauxella spp. za pomocą metod opisanych w niniejszym dokumencie, np.: hybrydyzacji do SEKW. NR ID. 2. Szczepy Buttiauxella spp. korzystne do izolowania polipeptydów i/lub polinukleotydów wynalazku są przedstawione w przykładach. [0029] Określenia fitaza typu dzikiego lub typ dziki, stosownie do wynalazku, opisują enzym fitazy z sekwencją aminokwasową występującą w przyrodzie. [0030] Określenia wariant enzymu fitazy, wariant fitazy lub wariant stosownie do wynalazku, opisują enzym fitazy z sekwencją aminokwasową pochodzącą z sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej, ale różniący się jednym lub więcej niż jednym podstawieniem, insercjami i/lub delecjami aminokwasów, które razem określane są jako mutacje. Przewiduje się, że wariant enzymu fitazy może być również enzymem fitazy macierzystej w dalszych etapach sposobów przygotowywania wariantów fitaz, takich jak ewolucja molekularna. [0031] Określenie polipeptyd(y) homologiczny(e), stosownie do niniejszego wynalazku, opisane tu również jako homologi, opisuje polipeptydy, korzystnie enzymy fitaz (np. homologiczne fitazy lub homologiczne enzymy ) z identycznością sekwencji powyżej 75 % w porównaniu do pierwszej sekwencji aminokwasowej polipeptydów/ fitaz/ enzymów, korzystnie posiada przynajmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologii sekwencji. [0032] Określenie jego funkcjonalny równoważnik oznacza, że enzym powinien posiadać prawie takie same właściwości funkcjonalne, jak fitaza Buttiauxella sp. Określenie zmodyfikowana postać lub wariant oznacza, że enzym został zmodyfikowany w pierwotnej postaci, ale zachowuje te same funkcjonalne właściwości enzymatyczne co fitaza Buttiauxella sp. W szczególności, określenie wariant lub zmodyfikowana postać obejmują enzymy fitaz z sekwencją aminokwasową pochodzącą od sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej/typu dzikiego i posiadającą jedną lub więcej podstawień, insercji i/lub delecji aminokwasów, które łącznie nazywa się mutacjami. Zmodyfikowane postaci lub warianty mogą wykazywać zmienione właściwości enzymu w porównaniu z enzymem macierzystym. Korzystnie, zmodyfikowane postaci lub warianty mają jeden lub więcej z następujących fenotypów ulepszonych: zwiększoną termostabilność i/lub; zwiększoną stabilność proteolityczną (np. pepsyna) i/lub zwiększoną aktywność specyficzną, i/lub szerszą specyfikację substratową i/lub aktywność w szerszym zakresie ph. Określenie funkcjonalny lub efektywny fragment oznacza fragment lub część fitazy Buttiauxella sp., który(a) zachowuje prawie taką samą funkcję enzymatyczną lub działanie. [0033] Korzystnie enzym fitazy wytworzony sposobami niniejszego wynalazku posiada taką samą sekwencję lub sekwencję, która jest co najmniej w 80% identyczna (homologiczna) z sekwencją fitazy Buttiauxella sp. [0034] Korzystnie, enzym zawiera sekwencję aminokwasową jak pokazano w SEKW. NR ID.: 3 lub sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności (homologii). W korzystnej postaci wykonania, wynalazek przedstawia sposób przygotowania polipeptydu izolowanego i/lub oczyszczonego posiadającego sekwencję aminokwasową określoną w SEK ID NR: 3 lub sekwencję wykazującą co najmniej 80% identyczności (homologii). W odniesieniu do SEKW. NR ID.: 3 i polipeptydów zawierających 6

7 SEKW. NR ID.: 3, przewiduje się, że to także odnosi się do polipeptydów, które są przetworzone współlub post translacyjnie podczas ekspresji, na przykład przez rozszczepienie peptydu sygnałowego. Post translacyjne rozszczepienie może również pojawić się przy końcówce C. Dlatego też, w korzystnym wykonaniu, jego efektywny fragment (określany również jako fragment funkcjonalny) jest dojrzałym polipeptydem wytwarzanym przez rodzimego gospodarza lub odpowiedniego gospodarza ekspresji. [0035] W innym wykonaniu, fitaza charakteryzuje się tym, że pochodzi ze szczepu P1 29 Buttiauxella sp. złożonym pod numerem akcesyjnym NCIMB [0036] W korzystnym wykonaniu wynalazek odnosi się do sposobu wytwarzania fitazy zgodnie z jakimkolwiek wykonaniem pierwszego aspektu wynalazku, który zawiera jedną lub więcej mutacji w następujących pozycjach (numeracja według numeracji w SEKW. NR ID. 3): 59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351. [0037] Pozycje te charakteryzują się tym, że mutageneza enzymu w tych pozycjach prowadzi do poprawy właściwości pożądanych enzymów. [0038] Poniższe podstawienia mogą być korzystnymi wariantami: K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W, lub Y T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y G 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y 1223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y S 225 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y L 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y 1336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y 7

8 [0039] Przez określenie mutacje konserwatywne rozumie się mutacje reszt aminokwasowych, które są konserwatywne pod względem właściwości aminokwasowych w porównaniu ze wskazaną resztą aminokwasową. Do właściwości aminokwasów należą: wielkość reszty, hydrofobowość, biegunowość, ładunek, wartość pk i inne znane właściwości aminokwasów w dziedzinie. Preferowane mutacje konserwatywne są wymienione poniżej jako podstawienia konserwatywne. [0040] W szczególnie korzystnej postaci wykonania, mutacje występują w jednej lub więcej z następujących pozycji: K59; T167; K240; T167; K240; D244; Q289; T209 i F197 [0041] Preferowane mutacje w tych określonych pozycjach są wymienione powyżej, korzystniejsze mutacje obejmują: K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K i F197S. [0042] W dalszym korzystnym wykonaniu, przedstawiony jest sposób wytwarzania fitazy zawierającej kombinację mutacji wybranych z grupy składającej się z: D125E/H193R; A294E/N303K; T167I/K240T; D223E/K240E/N351D; TI67I/K24017A294E/N303K; T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F i N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/ A294E/N303K. [0043] W związku z powyższym, korzystna fitaza wytworzona sposobami zgodnymi z niniejszym wynalazkiem, jest wariantem obejmującym sekwencję aminokwasową wymienionym jako SEKW. NR ID.: 3 lub jego efektywnym fragmentem, (lub jego homologiem, a najlepiej gdy fitaza charakteryzuje się tym, że pochodzi ze szczepu P1 29 Buttiauxella sp. złożonym pod numerem akcesyjnym NCIMB 41248, lub jest jego homologiem), z wyjątkiem posiadania jednej lub więcej mutacji aminokwasów wymienionych powyżej lub jednej z kombinacji wymienionych powyżej mutacji. [0044] W tych przykładach wykonania, nomenklatura wskazuje fitazę zawierającą sekwencję aminokwasową określoną w SEKW. NR ID: 3 z mutacjami wskazanymi w odniesieniu do pozycji aminokwasów w SEKW. NR ID.: 3. Nomenklatura opisana jest bardziej szczegółowo poniżej. [0045] Odpowiednio, warianty te wykazują polepszone właściwości w zakresie któregokolwiek z następujących: stabilność temperatury, zakres ph, stabilność pepsyny, specyficzna aktywność, specyficzność substratowa i szersza specyficzność substratowa. Ujawnione tu zostały odpowiednie sposoby określania tych właściwości. 8

9 [0046] W szczególności, poprawione właściwości fitazy dotyczą: stabilności enzymu w warunkach przetwarzania żywności i paszy, stabilności enzymu podczas transportu do żołądka, a także aktywności enzymatycznej i stabilności w żołądku ludzkim i zwierzęcym i/lub jelitach sprawiając, że ulepszone warianty są szczególnie odpowiednie do stosowania jako dodatki do pasz. Tak więc, takie ulepszenia obejmują, między innymi parametry wzrostu stabilności w podwyższonych temperaturach, najlepiej w temperaturze powyżej 65 C, wzrost w stabilności trawienia proteolitycznego, najlepiej proteazę przewodu pokarmowego, taką jak pepsyna, wzrost aktywności katalitycznej w niskim ph, najlepiej aktywność katalityczną poniżej ph 5,5 i ogólną efektywność uwalniania grupy fosforanowej z fitynianu, a najlepiej dodatkowo w fosforanach inozytolu. Nomenklatura [0047] W niniejszym opisie i zastrzeżeniach stosuje się konwencjonalne jednoliterowe i trzyliterowe kody reszt aminokwasowych. Dla ułatwienia, mutacje w wariantach enzymów zostały opisane poprzez zastosowanie następującej nomenklatury: reszta aminokwasowa w enzymie macierzystym, pozycja, podstawiona(e) reszta(y) aminokwasowa(e). Zgodnie z tą nomenklaturą, podstawienie na przykład reszty alaniny resztą glicyny w pozycji 20, jest oznaczone jako Ala20Gly lub A20G Delecja alaniny w tej samej pozycji jest pokazana jako Ala20 * lub * A20. Insercja dodatkowej reszty aminokwasowej (np. glicyny) jest oznaczona jako Ala20AlaGly lub A20AG. Delecja kolejnego odcinka reszt aminokwasowych (np. pomiędzy alaniną w pozycji 20 a glicyną w pozycji 21) jest oznaczona jako Δ(Ala20 Gly21) lub Δ(A20 G21). Kiedy sekwencja enzymu macierzystego zawiera delecję w porównaniu do sekwencji enzymu stosowanego do numeracji insercji w takiej pozycji (np. alanina w usuniętej pozycji 20 ), jest to oznaczone jako *20Ala lub *20A. Mutacje wielokrotne są oddzielone znakiem plus lub ukośnikiem. Na przykład dwie mutacje w pozycjach 20 i 21, zastępujące alaninę i kwas glutaminowy glicyną i seryną, są odpowiednio określone jako A20G+E21 S lub A20G/E21 S. Gdy reszta aminokwasowa w danym położeniu jest zastąpiona dwoma lub więcej alternatywnymi resztami aminokwasowymi, wtedy reszty te są oddzielone przecinkiem lub ukośnikiem. Na przykład zastąpienie alaniny w pozycji 30 glicyną lub kwasem glutaminowym jest oznaczone jako A20G,E lub A20G/E lub A20G, A20E. Gdy odpowiednia do modyfikacji pozycja jest tu określona bez sugerowania specyficznej modyfikacji, powinno zostać to zrozumiałe, że jakakolwiek reszta aminokwasowa może być podstawiona za resztę aminokwasową obecną w pozycji. Zatem, na przykład, kiedy wspomniana jest modyfikacja alaniny w pozycji 20, ale nie jest ona określona, należy rozumieć, że alanina może być usunięta lub zastąpiona przez inne reszty aminokwasowe (np. jedną z R, N, D, C, Q, E, G, H, I, P, K, K, K, P, S, T, S, T, V). [0048] Odpowiednio, fitaza wytworzona sposobami niniejszego wynalazku charakteryzuje się tym, że ma aktywność specyficzną co najmniej 300 U/mg, przy czym specyficzna aktywność jest określana przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2 mm fitynianiu, 0.8mm CaCl₂ w 200 mm buforu octanu sodu przy ph 3,5, jak określono w Przykładzie 1. Fitaza wytworzona sposobami według niniejszego wynalazku, może także korzystnie charakteryzować się tym, że maksima aktywności osiąga przy ph wynoszącym ok. 4 4,5, przy czym wspomniana aktywność jest określona przez inkubację fitazy w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu, 0,8mM CaCl₂ w 200mM buforu octanu sodu. Fitaza wytworzona sposobami według niniejszego wynalazku może również dogodnie charakteryzować się 9

10 tym, że 40% lub więcej maksymalnej aktywności zaobserwowano przy ph 2,5 i 5,5, przy czym do określania aktywności przy ph 2,5 służy bufor chlorowodorku glicyny. [0049] W jednym z wykonań, fitaza wytworzona sposobami według niniejszego wynalazku, charakteryzuje się aktywnością specyficzną 330 U/mg lub wyższą, przy czym aktywność specyficzna jest określona przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu, 0,8mM CaCl ₂ w 200mM buforu octanu sodu o ph 3,5. W innym wykonaniu, fitaza wytworzona sposobami według niniejszego wynalazku lub jej funkcjonalny odpowiednik, mogą dogodnie charakteryzować się tym, że osiągają dwa maksima aktywności przy ph wynoszącym około 3 i ph 4 4,5, przy czym wspomniana aktywność określana jest przez inkubację wspomnianej fitazy w roztworze zawierającym 2mm fitynianu, 0.8MM CaCl ₂ w 200 mm buforu octanu sodu. [0050] W innym aspekcie, w niniejszym dokumencie opisano wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego, lub sekwencję nukleotydową kodującą enzym zawierający sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jej homologowi. Odpowiednio wyizolowana i/lub oczyszczona cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEKW. NR ID.: 3 lub sekwencję o co najmniej 80% identyczności (homologii) lub jej fragment efektywny. W jednym wykonaniu cząsteczka kwasu nukleinowego koduje polipeptyd zawierający SEKW. NR ID.: 3 w tym zawierająca mutacje w preferowanych pozycjach wymienionych w niniejszym dokumencie lub dowolne specyficzne mutacje czy kombinacje mutacji wymienione w niniejszym dokumencie. W innym wykonaniu wynalazek przedstawia wyizolowaną i/lub oczyszczoną cząsteczkę kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję nukleotydową, która jest taka sama, lub jest komplementarna z, lub zawiera dowolne odpowiednie podstawienia kodonowe dla dowolnych z SEKW. NR ID.: 2 lub zawiera sekwencję, która posiada co najmniej 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% lub 99% homologii z sekwencją SEKW. NR ID.: 2. [0051] W jeszcze innym aspekcie, niniejszy dokument opisuje sekwencję nukleotydową i zastosowanie sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako: (a) sekwencja nukleotydowa przedstawiona jako SEKW. NR ID. 2, (b) sekwencja nukleotydowa, która jest wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEKW. NR ID. 2; (c) sekwencja nukleotydowa, która stanowi uzupełnienie sekwencji nukleotydowej określonej w SEKW. NR ID. 2; (d) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem wariantu, homologu, pochodnej lub fragmentu sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEKW. NR ID. 2; (e) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej określonej w SEKW. NR ID. 2; (f) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEKW. NR ID. 2; (g) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej, zdolnej do hybrydyzacji do sekwencji nukleotydowej określonej w SEKW. NR ID. 2; (h) sekwencja nukleotydowa, która jest uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej, która jest zdolna do hybrydyzacji z wariantem, homologiem, pochodną lub fragmentem sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEKW. NR ID. 2; 10

11 (i) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z uzupełnieniem sekwencji nukleotydowej określonej w SEKW. NR ID. 2; (j) sekwencja nukleotydowa, która jest zdolna do hybrydyzacji z uzupełnieniem wariantu, homologu, pochodnej lub fragmentu sekwencji nukleotydowej przedstawionej jako SEKW. NR ID. 2. [0052] Uznaje się, że nukleotyd hybrydyzuje się z jednym z powyższych nukleotydów (e), (f), (g), (h), (i) lub (j), jeżeli jest zdolny do hybrydyzacji w warunkach średniej ostrości, korzystniej wysokiej ostrości, a najlepiej w warunkach bardzo wysokiej ostrości. [0053] W celu przygotowania próby hybrydyzacyjnej, można skorzystać ze standardowych protokołów biologii molekularnej, stosowanych w hybrydyzacji (np. metoda Southerna wykorzystywana do hybrydyzacji DNA). Ilość docelowego DNA zależy od względnej obfitości sekwencji docelowej. Jeżeli zostanie zastosowana czysta sekwencja docelowa, to najlepiej jest użyć od 1 do 5 pikogramów DNA na kilobazę polinukleotydów. Zazwyczaj granica wykrywalności wynosi około 0,5 pg DNA dla sondy radioaktywnej ze specyficzną aktywnością 10⁹ dpm/mg., co jest równoważne pojedynczej kopii genu o długości 500 pb w 3,3 mg genomowego DNA złożonego genomu (np. człowieka). W praktyce używa się ok. 10 mg genomowego DNA na przykład w celu zbadania organizmów, takich jak mikroorganizmy, które zawierają polinukleotyd kodujący fitazę tego wynalazku. Jeżeli docelowe DNA jest bakteryjne lub, na przykład, plazmidowe, wtedy należy odpowiednio rozcieńczyć DNA, aby uniknąć narażenia na nadmierną ekspozycję. Docelowe DNA jest blotowane, np. metodą dot blotting lub przez transfer z żelu elektroforezowego. Preferowane warunki opisane są w Membrane Transfer and Detection Methods, Amersham International plc, UK. PI/162/85/1). Korzystne jest zastosowanie membrany nylonowej dodatnio naładowanej Hybond N+ (Amersham Life Science). Aby przygotować sondę > 1X10⁹ dpm/mikrogram., najlepiej ją wykonać zgodnie z zestawem do etykietowania. Sonda używana jest w buforze do hybrydyzacji, w stężeniu 1x10⁶ dpm na milimetr buforu. Przeniesione próbki są prehybrydyzowane w buforze do hybrydyzacji (6 x SSC, 5 x roztwór Denhardta, 0,5% SDS i denaturowane DNA ze spermy łososia w 100 mg/ml. bufora) przez godzinę w temperaturze 65'C, a następnie hybrydyzowane w buforze do hybrydyzacji zawierającym denaturowaną, znakowaną sondę, z wytrząsaniem przez 12 godzin w temperaturze 65'C. Próbka(i) są następnie przemywane odpowiednią objętością buforu do przemywania (zwykle 50 ml), w 2xSSC, 0,1% SDS przez 30 minut w 65'C, po czym są ponownie przemywane w odpowiedniej objętości buforu do przemywania (zwykle 50 ml) albo w tym samym buforze (2xSSC, 0,1% SDS) dla średniej ostrości lub 0,1% x SSC, 0,1% SDS przez 10 minut w 65'C (wysoka ostrość). Drugie mycie może być powtórzone w 70'C, dla osiągnięcia bardzo dokładnego przemywania. [0054] Sekwencja nukleotydowa zastosowana w sposobach niniejszego wynalazku, może zawierać sekwencje kodujące SEKW. Nr ID. 3. [0055] Wynalazek opisuje zwłaszcza plazmid lub system wektorowy zawierający opisaną tu fitazę lub jej homolog czy pochodną. Najlepiej, jeżeli plazmid lub system wektorowy zawiera sekwencję kwasu nukleinowego jak określono w SEKW. NR ID.: 2 lub sekwencję, która jest w co najmniej 80% homologiczna do niej lub jej fragment efektywny. Najlepiej, jeżeli plazmid lub system wektorowy jest wektorem ekspresyjnym dla ekspresji dowolnych enzymów kodowanych przez sekwencję kwasu nukleinowego, jak określono w którymkolwiek z SEKW. NR ID.: 2 lub sekwencję, która jest w mikroorganizmie co najmniej w 80% z nią homologiczna (identyczna). Właściwe wektory ekspresyjne są opisane w niniejszym dokumencie. Wynalazek dodatkowo opisuje plazmid lub system wektorowy ekspresji któregokolwiek ze zmodyfikowanych enzymów lub wariantów, lub fragmentów funkcjonalnych 11

12 opisanych w niniejszym dokumencie. Właściwe wektory ekspresyjne zostały opisane w niniejszym dokumencie. Warianty fitazy [0056] Niniejszy wynalazek podaje informacje o sposobach przygotowania wariantu enzymu fitazy, przy czym poprawa właściwości fitazy macierzystej może być dokonana przez modyfikację jednej lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji aminokwasowej fitazy macierzystej. [0057] Enzymy fitazy zastosowane jako enzymy macierzyste zgodnie z niniejszym wynalazkiem obejmują, w szczególności, fitazy typu dzikiego pochodzące z bakterii, najlepiej fitazy, które są uzyskane lub pochodzą z Buttiauxella sp.o sekwencji aminokwasowej, jak podano w Sekw. Nr ID. 3 lub jej fragmentu efektywnego lub sekwencji aminokwasowej o podobieństwie z Sekw. Nr ID. 3 wynoszącym ponad 80%, lepiej więcej niż 90%, najlepiej więcej niż 95%, 96%, 97%, 98%, a jeszcze lepiej więcej niż 99% (czyli polipeptyd homologiczny). [0058] Ulepszone warianty enzymu fitazy wytworzone sposobami wynalazku, najlepiej, jeżeli są identyczne z Sekw. Nr ID.: 3 lub z jej fragmentem efektywnym w więcej niż 80%, najlepiej w więcej niż 90%, najlepiej w więcej niż 95%, 96%, 97%, 98%, najlepiej w więcej niż 99%. Jednakże, przewiduje się również, że warianty mogą być heterologiczne (tj. nie są homologiczne) z SEKW. Nr ID. 3. Dla przykładu warianty wytworzone przy użyciu technik rekombinacji, takich jak rekombinacja z egzopośrednictwem, lub tasowanie rodziny, mogą skutkować wariantami, które chociaż zostały przygotowane z zastosowaniem fitazy macierzystej zgodnie z niniejszym wynalazkiem, mogą posiadać mniej niż 75% homologii. [0059] Dopasowania sekwencji, jak również określenie identyczności sekwencji, może być odpowiednio wykonane za pomocą programów komputerowych znanych w dziedzinie, takich jak GAP dostarczany w pakiecie programowym GCG (Needleman, S. B. i Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, str ). GAP może być stosowany z następującymi ustawieniami dla porównywania sekwencji polipeptydowej: GAP creation penalty 3,0 i GAP extension penalty 0.1 Dopasowania sekwencji są stosowane na przykład w celu określenia odpowiadających sobie pozycji w polipeptydach homologicznych. [0060] Enzymy fitazy zostały scharakteryzowane po ekspresji heterologicznej w jednym lub więcej z następujących gospodarzy ekspresji: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Można użyć innych gospodarzy ekspresji. [061] Ulepszenia właściwości fitazy zgodnie z niniejszym wynalazkiem, są przeznaczone do zastosowania w przetwórstwie żywności i paszy, jak również do stosowania jako dodatek do produktów spożywczych i pasz zwierzęcych. Ulepszenia są szczególnie ukierunkowane na stabilność warunków przetwarzania żywności i paszy, stabilność podczas transportu do żołądka, a także aktywność i stabilność w ludzkim lub zwierzęcym żołądku i/lub jelitach. Te ulepszenia obejmują takie parametry jak: wzrost stabilności w podwyższonych temperaturach, najlepiej w temperaturach powyżej 65 C, wzrost stabilności w trawieniu proteolitycznym, najlepiej wobec proteazy przewodu pokarmowego, wzrost 12

13 aktywności katalitycznej w niskim ph, najlepiej aktywność katalityczna poniżej ph 5.5 oraz ogólną wydajność grup uwalniających fosforan z fitynianu. [0062] Zwiększenie stabilności w podwyższonej temperaturze jest określane za pomocą temperatury inaktywacji enzymu. Temperaturę inaktywacji definiuje się jako temperaturę, w której aktywność resztkowa enzymu fitazy po pewnym czasie inkubacji, a następnie chłodzenia do temperatury pokojowej wynosi 50% aktywności resztkowej tego samego enzymu fitazy inkubowanego przez taki sam okres, w tych samych warunkach, w temperaturze pokojowej. Różnice w termostabilności są różnicami w C pomiędzy temperaturami inaktywacji dwóch enzymów. [0063] Pozycje i/lub regiony, które mają zostać zmutowane w celu uzyskania ulepszonych właściwości, stwierdzono na podstawie analizy sekwencji i struktury fitaz typu dzikiego, jak i przez mutagenezę enzymów macierzystych, w szczególności przez wprowadzenie mutacji do sekwencji aminokwasowej typu dzikiego, jak podano w Sekw. Nr ID. 3 oraz przez zbadanie wariantów enzymu o ulepszonych właściwościach. Tym samym, niektóre regiony, jak i pozycje w enzymach macierzystych zostały uznane za istotne dla poprawy właściwości enzymów fitazy. [0064] Dlatego też, wynalazek dotyczy sposobów wytwarzania wariantów fitazy o ulepszonych właściwościach, które w porównaniu z fitazą macierzystą, zawierają mutacje w jednej lub więcej następujących pozycji (numeracja według numeracji w Sekw. Nr ID. 3): 59, 70, 122, 125, 167, 193, 197, 204, 209, 211, 221, 223, 225, 240, 242, 244, 268, 281, 289, 294, 303, 336, 351; i/lub w odpowiadających im pozycjach w fitazie homologicznej do fitazy, jak przedstawiono w sekwencji aminokwasowej Sekw. Nr ID. 3. Pozycje te charakteryzują się tym, że mutageneza tych pozycji prowadzi do poprawy właściwości enzymów. [0065] K59E; T167V; K240T; T167I; K240E; D244C; Q289Y; T209K i F197S. lub mutacje konserwatywne w każdej pozycji. [0066] Poszczególne korzystne kombinacje mutacji obejmują: D125E/H193R; A294E/N303K; T1671/K240T; D223E/K240E/N351D; T167I/K240T/A294E/N303K; T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; A122T/DI25E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/ N303K; D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; A122T/T1671/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F oraz N70Y/D125E/T167I/H193R/F1975/T204K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K. 13

14 Sposoby przygotowania wariantów fitazy [0067] W szerokim wykonaniu wynalazek przedstawia sposoby wytwarzania wariantu(ów) enzymu fitazy. [0068] W najkorzystniejszym wykonaniu niniejszy wynalazek dotyczy sposobu przedstawionego w następujących ustępach. 1. Sposób przygotowania wariantu enzymu fitazy, gdzie wspomniany sposób obejmuje następujące etapy sekwencjonowania: a) wybór przynajmniej jednego macierzystego enzymu fitazy, przy czym co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy jest polipeptydem wybranym z grupy obejmującej: polipeptyd zawierający sekwencję aminokwasową taką, jak przedstawiono w SEKW. NR ID.: 3 lub sekwencję aminokwasową w przynajmniej 80% z nią identyczną; polipeptyd, który można otrzymać z Buttiauxella sp. szczepu P1 29 zdeponowanego pod numerem akcesyjnym NCIMB 41248; polipeptyd, który można otrzymać przez ekspresję SEKW. Nr ID. 2 lub sekwencję nukleotydową, którą można otrzymać z Buttiauxella sp. szczepu P1 29 zdeponowanego pod numerem akcesyjnym NCIMB lub sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną do tej sekwencji; oraz polipeptyd, który można otrzymać z Buttiauxella sp. szczepu P1 29 zdeponowanego pod numerem akcesyjnym NCIMB 41248, gdzie peptyd można otrzymać przez ekspresję sekwencji SEKW. Nr ID. 2, lub sekwencji nukleotydowej, którą można otrzymać z Buttiauxella sp. szczepu P1 29 zdeponowanego pod numerem akcesyjnym NCIMB lub sekwencję nukleotydową w co najmniej 80% identyczną do tej sekwencji, gdzie wspomniany polipeptyd posiada aktywność fitazy, przy czym wspomniany polipeptyd posiada aktywność specyficzną przynajmniej 300 U/mg, przy czym aktywność specyficzna jest wyznaczana przez inkubację wspomnianego polipeptydu w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu, 0,8nM CaCl₂, w 200 mm buforu octanu sodu o ph 3,5, w temperaturze 37 C; b) wytworzenie przynajmniej jednego wariantu fitazy poprzez wprowadzenie co najmniej jednej zmiany w macierzystym enzymie wspomnianej fitazy, którą może być insercja, delecja lub substytucja albo ich kombinacja, reszty aminokwasowej w macierzystym enzymie fitazy w celu uzyskania co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy; c) badania przesiewowe przynajmniej jednego wariantu enzymu fitazy w celu identyfikacji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu z macierzystym enzymem fitazy posiada ulepszoną(e) właściwość/właściwości wybrane spośród: 14

15 i. wyższa stabilność termiczna; i/lub ii. wyższa aktywność specyficzna; i/lub iii. wyższa stabilność proteolityczna; d) przygotowanie wspomnianego ulepszonego wariantu enzymu fitazy. 2. Sposób zgodny z ustępem 1, gdzie wspomniany polipeptyd jest wyizolowany i/lub oczyszczony. 3. Sposób zgodny z ustępami 1 lub 2, charakteryzuje się tym, że polipeptyd wykazuje maksymalną aktywność przy ph wynoszącym około 3 do 6, przy czym aktywność jest określona przez inkubację polipeptydu w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu, 8mm CaCl ₂ w 200 mm buforu octanu sodu, w temperaturze 37 C. 4. Sposób zgodny z ustępami 1 lub 2, charakteryzuje się tym, że polipeptyd wykazuje maksymalną aktywność przy ph wynoszącym około 4 do 5, przy czym aktywność jest określona przez inkubację polipeptydu w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu,8mm CaCl ₂ w 200 mm buforu octanu sodu, w temperaturze 37 C. 5. Sposób zgodny z ustępami 1 lub 2, charakteryzuje się tym, że polipeptyd wykazuje maksymalną aktywność przy ph wynoszącym około 4.5, przy czym aktywność jest określona przez inkubację polipeptydu w roztworze zawierającym 2 mm fitynianu,8mm CaCl ₂ w 200 mm buforu octanu sodu, w temperaturze 37 C. 6. Sposób, jaki opisano w którymkolwiek z ustępów od 1 do 5, który zawiera mutacje w co najmniej jednej z następujących pozycji, numerowanej zgodnie z systemem numeracji w SEKW. Nr ID. 3: K 59, T 70, A 122, D 125, T 167, H 193, F 197, T 204, T 209, A 211, S 221, I 223, S 225, K 240, A 242, D 244, A 268, S 281, Q 289, A 294, N 303, I 336 lub N Sposób, jaki opisano w którykolwiek z ustępów od 1 do 6, gdzie wspomniany polipeptyd zawiera jedną lub więcej z następujących mutacji: K 59 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 70 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 122 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 125 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, lub Y; lub T 167 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub H 193 A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub F 197 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub T 204 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub T 209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, V, W lub Y; lub A 211 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 221 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub I 223 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub S 225, A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W lub Y; lub K 240 A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 242 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub D 244 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub A 268 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M; N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub 15

16 S 281 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub Q 289 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W lub Y; lub A 294 C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 303 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub I 336 A, C, D, E, F, G, H, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W lub Y; lub N 351 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W lub Y. 8. Sposób, jaki opisano w którymkolwiek z ustępów od 1 do 7, zawierający przynajmniej jedną mutację wyselekcjonowaną z grupy składającej się z: K59E; T167V; K240T; T1671; K240E; D244C; Q289Y; T209K lub F197S. 9. Sposób, jaki opisano w którymkolwiek z ustępów od 1 do 8, który zawieraj kombinację mutacji wyselekcjonowanych z grupy składającej się z: D125E/H193R; lub A294E/N303K; lub T167I/K240T; lub D223E/K240E/N351D; lub T167IK240T/A294E/N303K; lub T167I/K240E/A242S/A294E/N303K; lub A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A294E/N303K; lub. A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K; lub A122T/D125E/H193R/F197S/T209K/A211P/S221N/G225A/K240E/A294E/N303K; lub D125E/T167I/1H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K; lub A122T/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K/I336F; lub N70Y/D125E/T167I/H193R/F197S/T204I/T209K/A211P/K240E/A268V/Q289H/A294E/N303K. 10. Sposób, jaki opisano w którymkolwiek z ustępów od 1 do 9, gdzie wspomniany polipeptyd zawiera kombinację mutacji: A122T/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/N303K. 11. Sposób, jaki opisano w którymkolwiek z ustępów od 6 do 10, gdzie wspomniany polipeptyd jest wariantem enzymu fitazy, który posiada wyższą stabilność termiczną i/lub wyższą aktywność specyficzną i/lub wyższą stabilność proteolityczną w porównaniu z enzymem fitazy zakodowanym przez SEKW Nr ID Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 11, gdzie w etapie b) wygenerowana jest populacja wariantów enzymu fitazy, a w etapie c) co najmniej część wspomnianej populacji wariantów enzymu fitazy poddana jest badaniu przesiewowemu. 13. Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 12, gdzie etap a) obejmuje poddanie mutagenezie sekwencji nukleotydowej kodującej macierzysty enzym fitazy, a etap b) obejmuje ekspresję zmutowanej sekwencji nukleotydowej otrzymanej w etapie (a) w komórce gospodarza, a etap c) obejmuje badania przesiewowe komórek gospodarza, lub ich wycinka(ów), w celu znalezienia ulepszonego wariantu enzymu fitazy ze wspomnianą(ymi) ulepszoną(ymi) właściwością/właściwościami. 16

17 14. Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 13, który po etapie c), i opcjonalnie d), w dalszym ciągu obejmuje przynajmniej jedną kolejną rundę powtarzających się etapów od a) do c) i opcjonalnie d). 15. Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 14, gdzie etap c) obejmuje badanie przesiewowe komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy wykazuje różnicę co najmniej 2,5 C w stabilności termicznej, przy czym różnica w stabilności termicznej jest obliczana poprzez odjęcie temperatury inaktywacji macierzystego enzymu fitazy od temperatury inaktywacji ulepszonego enzymu fitazy, gdzie temperatura inaktywacji jest temperaturą, w której aktywność resztkowa wynosi 50%, po inkubacji przez 10 minut, a następnie chłodzeniu do temperatury pokojowej, w porównaniu do aktywności resztkowej po inkubacji przez taki sam okres, w tych samych warunkach, w temperaturze pokojowej. 16. Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 15, gdzie etap c) obejmuje badanie przesiewowe komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy, wykazuje stabilność wobec pepsyny wynoszącą co najmniej 30% aktywności resztkowej, przy czym aktywność resztkową oblicza się przez porównanie aktywności mierzonej w ph 3,5, 37 C po inkubacji przez 2 godziny w ph 2,0 z 0,25 mg mg/ml pepsyny, 1 mm CaCb ₂ i 5mg/ml BSA w 37 C z aktywnością po inkubacji przez 2 godziny w ph 5,0, 1 mm CaCb ₂ i 5 mg/ml BSA, w 37 C bez pepsyny. 17. Sposób zgodny z którymkolwiek z ustępów od 1 do 16, gdzie etap c) obejmuje badania przesiewowe komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, którego współczynnik aktywności specyficznej w porównaniu z macierzystym enzymem fitazy wynosi co najmniej 110%. [0069] W korzystnym wykonaniu sposób wytwarzania wariantu enzymu fitazy składa się z następujących po sobie etapów: a) Wybór przynajmniej jednego macierzystego enzymu fitazy, przy czym co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy jest wybrany z i) polipeptydu zawierającego sekwencję aminokwasową odpowiadającą fitazie Buttiauxella sp. lub jej zmodyfikowanej postaci, polipeptydowi homologicznemu, wariantowi, równoważnikowi funkcjonalnemu lub efektywnemu fragmentowi, jak opisano w niniejszym dokumencie lub ii) co najmniej jednego wariantu fitazy jak opisano w niniejszym dokumencie; b) Wytwarzanie przynajmniej jednego wariantu fitazy poprzez wprowadzenie co najmniej jednej zmiany w macierzystym enzymie fitazy, którą może być insercja, delecja lub substytucja albo ich kombinacja, reszty aminokwasowej w macierzystym enzymie fitazy, w celu uzyskania co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy; c) Badania przesiewowe co najmniej jednego wspomnianego wariantu enzymu fitazy w celu identyfikacji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do macierzystego enzymu fitazy ma ulepszoną(e) właściwość/właściwości wybraną(e) spośród: 17

18 i. wyższa stabilność termiczna; i/lub ii. aktywność specyficzna; i/lub iii. stabilność proteolityczna; d) Przygotowanie ulepszonego wariantu enzymu fitazy, najlepiej do produkcji izolowanego i/lub oczyszczonego wariant enzymu fitazy. [0070] W korzystnym wykonaniu, w etapie b) wytwarzana jest populacja wariantów enzymu fitazy, a w etapie c) co najmniej część tej populacji wariantów enzymu fitazy poddawana jest badaniom przesiewowym. [0071] W korzystnym wykonaniu etap a) obejmuje poddanie sekwencji nukleotydowej według zastrzeżeń 11 do 13, kodującej macierzysty enzym fitazy, mutagenezie i etap b) zawiera ekspresję zmutowanej sekwencji nukleotydów otrzymanej w etapie (a) w komórce gospodarza i etap c ) obejmuje badania przesiewowe komórek gospodarza, lub ich ekstraktu(ów) pod kątem ulepszonego wariantu enzymu fitazy posiadającego wspomniane ulepszone właściwość/właściwości. [0072] W dalszym wykonaniu po etapie c) oraz opcjonalnie d), następuje co najmniej jedna kolejna runda powtórzenia etapów a) c) i opcjonalnie d), przy czym najlepiej w kolejnej(ych) rundzie(ach), co najmniej jeden macierzysty enzym fitazy z etapu a) jest wybrany spośród co najmniej jednego wariantu enzymu fitazy i/lub ulepszonego wariantu fitazy przygotowanego zgodnie ze sposobem. [0073]. W kolejnym korzystnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEKW. Nr ID. 3 lub jego funkcjonalnego fragmentu, ma różnicę stabilności termicznej wynoszącą co najmniej 2,5. [0074] W kolejnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEKW. Nr ID. 3 lub jego funkcjonalnego fragmentu, ma stabilność wobec pepsyny wynoszącą co najmniej 30. [0075] W kolejnym korzystnym wykonaniu etap c) zawiera badania przesiewowe wykonywane pod kątem komórek gospodarza dokonujących ekspresji ulepszonego wariantu enzymu fitazy, który w porównaniu do i) macierzystego enzymu fitazy i/lub ii) polipeptydu zawierającego SEKW. Nr ID. 3, ma współczynnik aktywności specyficznej, który w porównaniu z fitazą kodowaną przez SEKW. Nr ID. wynosi co najmniej 110. [0076] Wynalazek przedstawia także sposób wytwarzania wariantu enzymu fitazy, który to sposób obejmuje: a) Wybór macierzystego enzymu fitazy, przy czym macierzysty enzym fitazy jest wybrany z: i. macierzystego enzymu fitazy z co najmniej 80% homologią z SEKW. Nr ID. 3 18