(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 9/16 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/14 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Polipeptyd o aktywności fitazy i podwyższonej stabilności temperaturowej aktywności enzymatycznej oraz kodująca go sekwencja nukleotydowa (30) Pierwszeństwo: DE (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/39 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/09 (73) Uprawniony z patentu: AB Enzymes GmbH, Darmstadt, DE (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 KHANH Q. NGUYEN, Reichelsheim, DE BRUNO WINTER, Stuttgart, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Joanna Dargiewicz-Nowicka WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 PZ/1921/JDN 2 EP B1 Opis [0001] Wynalazek dotyczy rekombinowanej cząsteczki DNA kodującej polipeptyd o aktywności fitazy oraz podwyższonej stabilności temperaturowej i podwyższonej stabilności proteolitycznej aktywności enzymatycznej, jak również kodowanego polipeptydu jako takiego. W szczególności wynalazek dotyczy rekombinowanej cząsteczki DNA kodującej polipeptyd o aktywności fitazy oraz podwyższonej stabilności temperaturowej i podwyższonej stabilności proteolitycznej aktywności enzymatycznej, przy czym sekwencja DNA otrzymywana jest na drodze zmiany w sekwencji dojrzałej fitazy E. coli typu dzikiego, przy czym uzyskuje się modyfikacje w określonych pozycjach aminokwasów, w porównaniu do sekwencji typu dzikiego, względnie wydłużenia przy N- i/lub C-końcu. Wynalazek dotyczy ponadto sposobu eksprymowania rekombinowanej fitazy, jak również jej zastosowania w technologii żywności i paszy. [0002] Kwas fitynowy lub 1,2,3,4,5,6-heksakisdiwodorofosforan mioinozytolu (w skrócie heksakisfosforan mioinozytolu) jest głównym źródłem inozytolu i podstawową formą zapasową fosforanu w nasionach. W nasionach roślin strączkowych około 70% zawartości fosforanu występuje w formie mieszanych soli potasu, magnezu i wapnia kwasu fitynowego. Nasiona, ziarna zbóż i nasiona roślin strączkowych są ważnymi składnikami przetworów żywnościowych i paszowych, zwłaszcza preparatów paszowych; lecz również w żywieniu człowieka ziarna zbóż i nasiona roślin strączkowych zyskują coraz bardziej na znaczeniu. [0003] Grupy fosforanowe kwasu fitynowego wiążą w postaci kompleksu kationy dwuwartościowe i trójwartościowe, takie jak jony metali, to jest jony ważne z odżywczego punktu widzenia, takie jak wapń, żelazo, cynk i magnez, jak również pierwiastki śladowe: mangan, miedź i molibden. Poza tym kwas fitynowy wiąże się również w pewnym stopniu z białkami na drodze oddziaływań elektrostatycznych. [0004] Kwas fitynowy i jego sole, fityniany, często nie są metabolizowane, gdyż nie są wchłaniane z przewodu żołądkowo - jelitowego, co oznacza, że ani zawarty w nich fosfor, ani schelatowane jony metali ani związane białka nie są dostępne z odżywczego punktu widzenia. [0005] Ponieważ fosfor jest istotnym elementem dla wzrostu wszystkich organizmów, żywność i pasza muszą być wzbogacane o fosforan pochodzenia nieorganicznego. Bardzo często uzupełniane muszą być również niezbędne z odżywczego punktu widzenia jony, takie jak jony żelaza i wapnia. Dodatkowo wartość odżywczą każdej diety zubaża wiązanie się kwasu fitynowego z białkami. W rezultacie kwas fitynowy często określany jest jako czynnik antyodżywczy. [0006] Ponadto z uwagi na niemetabolizowanie kwasu fitynowego, fosfor fitynianu jest wydalany z przewodu żołądkowo - jelitowego zwierząt, co prowadzi do niekorzystnego zanieczyszczenia fosforanami środowiska, w wyniku czego może dojść na przykład do eutrofizacji wód i nadmiernego rozwoju glonów. [0007] Kwas fitynowy lub fityniany (wyrażenia te będą poniżej stosowane wymiennie, chyba że zostanie to stwierdzone inaczej) mogą być rozkładane przez fitazy. Fitazy katalizują hydrolizę fitynianu do mioinozytolu i/lub mono-, di-, tri-, tetra- i/lub pentafosforanu, jak również nieorganicznego fosforanu. Wyróżnia się dwa różne rodzaje fitaz wytwarzanych przez mikroorganizmy: 1) 3-fitazę/3-fosfohydrolazę heksafosforanu mioinozytolu, EC ; 2) 6-fitazę/6-fosfohydrolazę heksafosforanu mioinozytolu, EC fitaza hydrolizuje przede wszystkim wiązanie estrowe w pozycji 3, 6-fitaza atakuje przede wszystkim wiązanie estrowe w pozycji 6. Nasiona zawierające kwas fitynowy posiadają endogenne fitazy. Po ich spożyciu, fityniany znajdujące się w żywności, względnie paszy, są teoretycznie podatne na hydrolizę przez endogenne fitazy roślinne, fitazy flory bakteryjnej i fitazy śluzówki jelita. W praktyce jednak zdolność hydrolizacyjna endogennych fitaz roślinnych i fitaz występujących w jelitach, jeśli

3 PZ/1921/JDN 3 EP B1 występuje, jest zdecydowanie niewystarczająca, by w istotny sposób zapewnić dostępność biologiczną związanego w fitynianach fosforu. Z tego też względu do żywności, względnie paszy, często dodaje się egzogenne fitazy. [0008] Fitazy mogą być wytwarzane przez rośliny, jak też przez mikroorganizmy. Wśród mikroorganizmów znane są bakterie wytwarzające fitazę, jak również wytwarzające fitazę grzyby i drożdże. [0009] Organizmy będące naturalnymi producentami fitazy mają jednakże tę wadę, że wytwarzają fitazę tylko w określonych ilościach i o określonych właściwościach. Jak wspomniano powyżej, występuje jednak zwiększone zapotrzebowanie na fitazę, zwłaszcza w przemyśle żywnościowym i paszowym. [0010] Mimo, że w przemyśle żywnościowym i paszowym występuje zwiększone zapotrzebowanie na fitazę, a zastosowanie fitazy może być korzystne, to tylko nieliczne znane fitazy zostały szeroko zaakceptowane w przemyśle żywnościowym i paszowym. Typowe obawy dotyczą względnie wysokich kosztów wytwarzania i/lub słabej stabilności, względnie aktywności, enzymów w żądanym obszarze zastosowania. Ponadto taki enzym musi spełniać szereg kryteriów, by mógł zostać zastosowany w przemyśle. Obejmują one wysoką swoistą aktywność całkowitą, optimum przy niskim ph, odporność na proteazy przewodu żołądkowo - jelitowego, jak również stabilność temperaturową, względnie stabilność termiczną. Stabilność temperaturowa jest ważnym warunkiem skutecznego zastosowania przemysłowego, gdyż na przykład w procesach granulowania enzymy poddawane są działaniu temperatur w zakresie od 60 C do 95 C. [0011] Wszystkie znane fitazy wytwarzane przez mikroorganizmy rozwijają się w temperaturach w zakresie od 56 C do 78 C (Lehman i in., 2000), tracąc przez to swoją aktywność. Z tego też względu istnieje szczególne zapotrzebowanie na fitazy, które posiadają również w podwyższonych temperaturach wystarczającą z technicznego punktu widzenia aktywność, względnie na takie, które nie ulegają inaktywacji. [0012] Międzynarodowe zgłoszenie patentowe nr WO 01/90333 dotyczy sposobu zwiększania wartości odżywczej paszy zawierającej fitynian, przy czym pasza ta kontaktowana jest z fitazą o określonej sekwencji. Fitaza ta charakteryzuje się zwiększoną stabilnością termiczną. [0013] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zatem polipeptyd o aktywności fitazy wykazujący zwiększoną stabilność termiczną, względnie o wystarczającej z technologicznego punktu widzenia aktywności w podwyższonych temperaturach. Ponadto polipeptyd o aktywności fitazy również powinien posiadać zwiększoną stabilność proteolityczną. [0014] Polipeptyd powinno móc się wytwarzać w sposób ekonomiczny. W szczególności fitaza powinna być bardziej termostabilna niż enzym typu dzikiego. Fitaza powinna ponadto zachować istotne właściwości naturalnej fitazy E. coli typu dzikiego, lecz wyróżniać się jednakże ulepszoną stabilnością termiczną. Do istotnych właściwości naturalnej fitazy typu dzikiego zaliczają się zwłaszcza zdolność do zwiększenia dostępności fosforanu w warunkach in vivo i in vitro dzięki swej aktywności jako fitazy oraz fosfatazy, jej optimum ph w warunkach kwasowych i wyższa aktywność resztkowa w warunkach silnie kwasowych, jak również przydatność jako środek pomocniczy do pieczenia. [0015] Przedmiotem niniejszego wynalazku jest ponadto gen polipeptydu o aktywności fitazy o podwyższonej stabilności termicznej i o podwyższonej stabilności proteolitycznej. Polipeptyd powinien być wytwarzany w sposób ekonomiczny i niedrogi. W szczególności ekspresja polipeptydu w mikroorganizmach eukariotycznych powinna prowadzić do polipeptydu o podwyższonej stabilności

4 PZ/1921/JDN 4 EP B1 termicznej w stosunku do podobnej fitazy typu dzikiego. Przedmiotem wynalazku są również ponadto sekwencje DNA kodujące polipeptyd, odpowiednie konstrukty DNA i wektory, jak również źródło rekombinowanego enzymu nadającego się do komercyjnego zastosowania do żywności i paszy i w procesach przemysłowych oraz kompozycje zawierające enzym według niniejszego wynalazku. [0016] I tak też niespodziewanie stwierdzono, że mutacje w określonych pozycjach sekwencji fitazy E. coli typu dzikiego prowadzą do wewnątrzpochodnego zwiększenia stabilności termicznej, względnie stabilności temperaturowej, jak również do zwiększenia stabilności proteolitycznej białka fitazy, bez negatywnego wpływu na pozostałe działania i istotne właściwości fitazy E. coli typu dzikiego. [0017] Nieoczekiwanie stwierdzono, że mutacja w pozycji 74 (K74D) sekwencji aminokwasowej i/lub kombinacja mutacji w pozycjach 139 (N139R) i 142 (D142E) i/lub kombinacja mutacji w pozycjach 145 (L145I) i 198 (L198I) i/lub mutacja w pozycji 200 (V200P) fitazy E. coli typu dzikiego, jak również kombinacje tych mutacji, prowadzą do ulepszonej stabilności termicznej białka fitazy bez negatywnego wpływu na korzystne działania i istotne właściwości fitazy E. coli typu dzikiego. Ponadto stwierdzono, że dodanie do fitazy E. coli sekwencji fosfatazy kwaśnej z Aspergillus niger var. awamori przy N- lub C- końcu, względnie przy N- i C-końcu, również w połączeniu ze wspomnianymi powyżej mutacjami, prowadzi do zwiększenia stabilności termicznej i stabilności proteolitycznej enzymu. [0018] Wynalazek dotyczy zatem zrekombinowanej cząsteczki DNA, która po ekspresji w prokariotycznej lub eukariotycznej komórce - gospodarzu koduje polipeptyd o aktywności fitazy, przy czym zrekombinowana cząsteczka DNA zawiera sekwencję DNA wybraną spośród takich jak 1. a) sekwencje DNA kodujące polipeptyd o aktywności fitazy, otrzymany wskutek zmiany w sekwencji dojrzałej fitazy E. coli typu dzikiego, przy czym zmiana obejmuje kombinację mutacji asparagina arginina w pozycji 139 (N139R) i kwas asparaginowy kwas glutaminowy w pozycji 142 (D142E), 2. b) sekwencje DNA, które wskutek degeneracji kodu genetycznego spokrewnione są z sekwencjami wymienionymi w punkcie a), przy czym zrekombinowanej cząsteczce DNA przy ekspresji w odpowiedniej komórce - gospodarzu towarzyszy aktywność enzymatyczna tak kodowanego białka charakteryzująca się zwiększoną stabilnością temperaturową i proteazową. [0019] Wynalazek dotyczy ponadto zrekombinowanej cząsteczki DNA, charakteryzującej się tym, że sekwencja DNA obejmuje ponadto zmianę V200P w kodowanym polipeptydzie. [0020] Wynalazek dotyczy ponadto zrekombinowanej cząsteczki DNA, charakteryzującej się tym, że sekwencja DNA ponadto obejmuje zmiany L145I i L198I w kodowanym polipeptydzie. [0021] Wynalazek dotyczy ponadto zrekombinowanej cząsteczki DNA, charakteryzującej się tym, że obejmuje addycję przy N-końcu kodowanego polipeptydu sekwencji FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS i/lub addycję przy C-końcu kodowanego polipeptydu sekwencji LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD. [0022] W literaturze opisanych jest wiele fitaz z E. coli, na przykład kodujący fitazę gen appa z E. coli K- 12 (Dassa i in., J. Bacteriol. 172: (1990)). Gen ten koduje enzym periplazmatyczny, wykazujący aktywność zarówno fosfatazy kwaśnej jak i fitazy (patrz Greiner i in., Arch. Biochim, Biophys. 303: (1993)). Znane są naturalne mutanty tych enzymów (porównaj na przykład Rodriguez i in., Biochem. Biophys. Res. Comm. 257: (1999)). Opisano również genetycznie zmodyfikowane mutanty fitazy E. coli, skutkujące zwiększoną stabilnością temperaturową i/lub wyższą swoistą

5 PZ/1921/JDN 5 EP B1 aktywnością. Rodriguez i in. (Arch. Biochem. Biophys. 382: (2000)) uzyskali ekspresję genu AppA typu dzikiego i wielu mutantów otrzymanych metodą miejscowo-specyficznej mutagenezy w Pichia pastoris, by zbadać wpływ N-glikozylacji na stabilność temperaturową białka AppA. Chociaż doszło do zwiększenia glikozylacji, to mutant był aktywniejszy przy wartości ph od 3,5 do 5,5 i wykazywał po obróbce cieplnej większą aktywność niż wytworzone w P. pastoris białko typu dzikiego. [0023] Rodzina patentów opierająca się na międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 03/ obejmuje zgłoszenia patentowe St. Zjedn. Ameryki nr US 2003/ A1 i US 2003/ A1. Opisano w nich wytwarzanie przez mikroorganizmy termotolerancyjnej fitazy z przeznaczeniem paszowym. Mutant (Nov9X) fitazy (appa) szczepu B E. coli eksprymowany jest w E. coli, Pichia pastoris i Schizosaccharomyces pombe. Mutant Nov9X zawiera 8 mutacji aminokwasowych enzymu typu dzikiego. W płynie o temperaturze 70 C mutant wykazuje lepszą stabilność termiczną niż enzym typu dzikiego. W zgłoszeniu patentowym St. Zjedn. Ameryki nr US 2003/ A1 tej samej grupy roboczej domniemywa się, że gospodarz, w którym prowadzi się wytwarzanie enzymu, ma również wpływ na jego stabilność termiczną. Numeracja aminokwasów jest w przypadku NOV9X wyższa o 2 pozycje niż w niniejszym wynalazku (W48 NOV9X odpowiada W46 w niniejszym wynalazku). [0024] W międzynarodowych zgłoszeniach patentowych nr WO 02/ i WO 2004/ opisano szereg mutacji punktowych fitazy E. coli, z których jednakże nie wszystkie prowadziły do zwiększenia stabilności termicznej. Numeracja w zgłoszeniu WO 2004/ jest w porównaniu do niniejszego wynalazku wyższa o 30 pozycji aminokwasowych. [0025] Również w niemieckim zgłoszeniu patentowym nr DE opisano mutanty fitazy E. coli, które jednakże zmutowano w celu zwiększenia wydajności wydzielniczej w produkcji u grzybów nitkowatych. Wymieniona publikacja nie wspomina o zwiększeniu stabilności termicznej mutantów. [0026] Ponadto w publikacji Garrett i in.; Applied Environ. Microbiol., 2004, 70 (5), , opisano mutanty fitazy E. coli o zwiększonej stabilności termicznej i stabilności w przewodzie żołądkowo - jelitowym. [0027] Praktycznie nie jest możliwe przewidzenie wpływu jednej, względnie wielu mutacji na zachowanie aktywności enzymatycznej w warunkach podwyższonej temperatury. Ogólnie, przy wyższych temperaturach zachodzi denaturacja, względnie rozwinięcie, drugo- i trzeciorzędowej struktury białka. [0028] Stabilność temperaturowa, względnie stabilność termiczna, białek zależy od wielu wzajemnych oddziaływań. Konformacja białek utrzymywana jest dzięki wielu słabym oddziaływaniom. Stabilizacja może dotyczyć wszystkich poziomów hierarchii struktury białka: miejscowego upakowania łańcucha polipeptydowego, elementów struktury drugorzędowej i ponaddrugorzędowej, domen i podjednostek multimerowego białka. Zwiększona stabilność temperaturowa białka zależy od wielu aspektów, z których najczęstszymi są (a) ułożenie par jonów wewnątrz podjednostek i/lub między podjednostkami; (b) ulepszone upakowanie hydrofobowego rdzenia (oddziaływania van der Waalsa); (c) dodatkowe usieciowanie w wyniku wiązań wodorowych; (d) zwiększona tendencja do tworzenia struktury drugorzędowej; (e) zwiększona stabilizacja dipoli wewnątrz helisy; (f) zwiększona powierzchnia polarna; (g) zmniejszona liczba i wielkość całkowita luk; (h) zmniejszenie napięcia konformacyjnego (stabilizacja pętli) i (i) odporność na modyfikację chemiczną (utlenianie reszt metioninowych i/lub dezaminacja reszt asparaginowych i glutaminowych).

6 PZ/1921/JDN 6 EP B1 [0029] W stanie techniki nie istnieją żadne wskazówki dotyczące tego, jak i w jaki sposób należałoby zmienić sekwencję fitazy E. coli typu dzikiego, by uzyskać zwiększenie stabilności termicznej. W stanie techniki nie istnieją ponadto żadne odwołania dotyczące wymienionych mutacji w sekwencji fitazy E. coli. [0030] Stan techniki nie zawiera zwłaszcza żadnych informacji dotyczących kombinacji mutacji w pozycjach 139 (N139R) i 142 (D142E) fitazy E. coli typu dzikiego lub kombinacji tych mutacji prowadzących do ulepszonej stabilności termicznej białka fitazy i nie mających negatywnego wpływu na korzystne działania i istotne właściwości fitazy E. coli typu dzikiego. [0031] Korzystnymi zrekombinowanymi cząsteczkami DNA ze zmianami w sekwencji dojrzałej fitazy E. coli typu dzikiego według niniejszego wynalazku są konstrukty PhyM2 i PhyM10. Przedstawiono je w poniższej tablicy 1. Konstrukty PhyM1, PhyM3, PhyM7 i PhyM9 podano w charakterze produktu porównawczego. Tablica 1: Genotypy mutacji PhyM1, PhyM2, PhyM3, PhyM7, PhvM9 i PhyM10 Genotyp Pozycja aminokwasu Sekwencja typu dzikiego Mutacje PhyM1 200 E-L-K Val 200 S-A-D E-L-K Tyr 200 S-A-D PhyM2 139 D-N-A-Asn 139 -V-T-D 142 -A D-N-A-Arg 139 -V-T-E 142 -A 142 D-N-A-N V-T-Asp 142 -A D-N-A-R 139 -V-T-Glu 142 -A PhyM3 200 E-L-K Val 200 S-A-D E-L-K Pro 200 S-A-D PhyM7 74 L-L-A-Lys 74 -K-G L-L-A-Asp 74 -K-G PhyM9 145 D-A-I Leu 145 S-R-A D-A-I Ile 145 S-R-A 198 P-S-E Leu 198 K-V-S P-S-E Ile 198 K-V-S 74 L-L-A-Lys 74 -K-G L-L-A-Asp 74 -K-G PhyM N-A-Asn 139 -V-T-D 142 -A D-N-A-Arg 139 -V-T-E 142 -A 142 N-A-N 139 -V-T-Asp 142 -A D-N-A-R 139 -V-T-Glu 142 -A 200 E-L-K Val 200 S-A-D E-L-K Pro 200 S-A-D [0032] Poniższe plazmidy zdeponowano w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Mascheroder Weg 1b, Braunschweig, w dniu zgodnie z wymogami Traktatu Budapeszteńskiego. Plazmid Numer depozytu pet-phym2 DSM puc-phym3 DSM pet-phym7 DSM puc-phym9 DSM puc-phym10 DSM pphy2005 DSM pphy2006 DSM 18721

7 PZ/1921/JDN 7 EP B1 [0033] Zaskakujący był fakt, że mutacje, które mają wpływ na hydrofobową powierzchnię białka (PhyM3, PhyM7 i PhyM9), jak również mutacje wprowadzające jonowe wiązanie do helisy D (PhyM2), względnie stabilizujące pętlę B4 poprzez wiązanie jonowe (PhyM7) znacząco przyczyniają się do zwiększenia stabilności termicznej fitazy E. coli. [0034] Również addycja części sekwencji fosfatazy kwaśnej Aspergillus niger var. awamori, które w fosfatazie kwaśnej prowadzą do uformowania dimeru i tetrameru, miała działanie stabilizujące w fitazie E. coli. To samo tyczy się również addycji części sekwencji fitazy z Aspergillus niger. [0035] Polipeptydy o aktywności fitazy według niniejszego wynalazku w porównaniu z enzymem typu dzikiego z E. coli wykazują zwiększoną stabilność temperaturową, względnie stabilność termiczną, aktywności enzymatycznej. To zwiększenie stabilności termicznej można zmierzyć w płynie za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (Differential Scanning Calorimetry, DSC). W szczególności polepszenie stabilności termicznej objawia się silnym zwiększeniem aktywności resztkowej zmutowanych enzymów w porównaniu z enzymem typu dzikiego, po poddaniu obciążeniu cieplnemu, jakie ma miejsce podczas granulacji paszy. Ponadto polipeptydy według niniejszego wynalazku posiadają również zwiększoną odporność na rozkład proteolityczny zachodzący zwłaszcza w żołądku ptaków i zwierząt o żołądku jednokomorowym. Ponieważ fitaza w odżywianiu zwierząt, zwłaszcza podczas przejścia przez żołądek, musi uwolnić z kwasu fitynowego fosforan i produkty jego rozkładu, stabilność ta znajduje się w obszarze szczególnego zainteresowania, po to by dawkę enzymów można było utrzymać na możliwie niskim poziomie. Ze względu na zwiększoną stabilność temperaturową i/lub proteolityczną fitazy według niniejszego wynalazku nadają się zwłaszcza do zastosowań, w których występują podwyższone temperatury, względnie takich, w których należy liczyć się ze zwiększonym rozkładem proteolitycznym. Przykładami zastosowań są tu wytwarzanie enzymu, kiedy to musi być on chroniony przed proteazami szczepu gospodarza i wytwarzanie granulowanej paszy, lecz również zastosowanie enzymu w płynie w pogranulacyjnym nanoszeniu na granulowaną paszę. Zwiększona stabilność temperaturowa umożliwia wcześniejsze naniesienie na niezbyt jeszcze wystudzone granulki, dzięki czemu czas odparowywania naniesionej cieczy jest krótszy. Ma to zalety również z mikrobiologicznego punktu widzenia, gdyż zawartość wody jest wysoka jedynie przez krótki okres przy wysokich temperaturach, przy których większość patogenów nie może się rozwijać. [0036] Kodująca fitazę sekwencja DNA według niniejszego wynalazku obejmuje poniższą mutację w kodowanym polipeptydzie: 1. i) kombinację mutacji asparagina arginina w pozycji 139 (N139R) i kwas asparaginowy kwas glutaminowy w pozycji 142 (D142E), i ewentualnie 2. ii) kombinację mutacji leucyna izoleucyna w pozycji 145 (L145I) i leucyna izoleucyna w pozycji 198 (L198I), i/lub 3. iii) mutację walina prolina w pozycji 200 (V200P), i/lub 4. iv) addycję przy N-końcu lub C-końcu lub przy N- i C-końcu odcinka sekwencji fosfatazy kwaśnej z Aspergillus niger var. awamori lub fitazy z Aspergillus niger. [0037] Ponadto oprócz opisanych mutacji dostępna jest addycja przy N-końcu lub C-końcu lub N- i C- końcu określonego odcinka sekwencji fosfatazy kwaśnej z Aspergillus niger var. awamori. Również sama dostępność tych odcinków sekwencji prowadzi już do zwiększenia stabilności termicznej. Przy N- końcowym odcinku fosfatazy kwaśnej z A. niger var. awamori chodzi o pierwsze 51 aminokwasów dojrzałego białka (FSYGAAIPQS TQEKQFSQEF RDGYSILKHY GGNGPYSERV SYGIARDPPTS).

8 PZ/1921/JDN 8 EP B1 Ostatnie 4 aminokwasy tego polipeptydu zastępują przy tym pierwsze 4 aminokwasy (QSEP) dojrzałej fitazy E. coli. Możliwa jest również addycja części tego odcinka fosfatazy kwaśnej. Alternatywnie można również użyć część lub części N-końcowe pierwszych 40 aminokwasów dojrzałego białka fitazy z Aspergillus niger (SCDTVDQGYQ CFSETSHLWG QYAPFFSLAN ES-VISPEVPA). Addycję do fitazy E. coli można przeprowadzić również w innych miejscach, jak przy opisanej pozycji 4, o ile aktywność enzymu pozostanie zachowana. Do C-końcowego wydłużenia użyto ostatnich 29 aminokwasów (LSFWWNYNTT TELNYRSSPI ACQEGDAMD) fosfatazy kwaśnej z A. niger var. awamori połączonych bezpośrednio przy C-końcu fitazy E. coli. Fuzji tej, względnie fuzjom, towarzyszyć mogą również dalsze mutacje w fitazie E. coli i nie są ograniczone do dalszych mutacji wspomnianych w niniejszym zgłoszeniu. Poprzez mutację Lys43Cys umożliwione zostanie powstanie mostka disiarczkowego między nową częścią C-końcową a rdzeniem fitazy E. coli a przez to ulepszenie dimeryzacji. Możliwe są dalsze mutacje, które sprzyjają wiązaniom van der Waalsa, hydrofobowym lub jonowym wiązaniom międzycząsteczkowym lub je stabilizują a przez to zwiększają stabilność termiczną lub mogą ją jeszcze bardziej ulepszyć. Przykładami tego N-końcowego, względnie C-końcowego, wydłużenia sekwencji są opisane poniżej realizacje Phy2005 i Phy2006. [0038] Stabilność termiczną fitazy według niniejszego wynalazku w produktach handlowych można zwiększyć jeszcze bardziej, na przykład przez dodanie różnych substancji do koncentratu z ultrafiltracji przed suszeniem lub granulacją. Przykładowo stabilny preparat fitazy według niniejszego wynalazku można uzyskać w ten sposób, że mieszaninę płynnego roztworu enzymu natryskuje się na wypełniacz, taki jak maltodekstryna, a następnie mieszaninę suszy się, lub do płynnego roztworu enzymu przed suszeniem dodaje się 20-60% odtłuszczonego mleko w proszku (wag./wag. w stosunku do białka całkowitego w roztworze enzymu) i/lub 1-5% propionian wapnia (wag./wag. w stosunku do białka całkowitego w roztworze enzymu) i reguluje się ph do określonej wartości, w szczególności do ph 5,2 ± 0,5. Zmniejszenie wilgotności i związanie fitazy z wypełniaczem dodatkowo chronią enzym (oprócz jego zakodowanej w strukturze stabilnością) przez wpływem środowiska takim jak skrajne temperatury, które mogą wystąpić podczas wytwarzania paszy. Suche i płynne preparaty można dalej stabilizować przez zmniejszenie aktywności potencjalnych enzymów proteolitycznych, które jako produkty uboczne mogą występować w płynnej mieszaninie fermentacyjnej, którą wykorzystuje się do wytwarzania enzymu według niniejszego wynalazku. [0039] Odpowiadającą zmutowanej sekwencji fitazy według niniejszego wynalazku sekwencję DNA można uzyskać z zastosowaniem dowolnych optymalnych kodonów. I tak stosować można na przykład kodony optymalne wykorzystywanego do ekspresji mikroorganizmu, lecz można również użyć optymalne kodony E. coli, względnie jej wariantu. Ponadto zmutowana sekwencja fitazy E. coli według niniejszego wynalazku obejmować może dalsze warianty sekwencji. Przy czym uzyskiwać można dowolne warianty, oprócz opisanych powyżej mutacji, o ile nie będzie to miało negatywnego wpływu na właściwość zwiększonej stabilności temperaturowej i o ile zachowane zostaną aktywność enzymatyczna oraz dalsze istotne właściwości fitazy E. coli typu dzikiego. [0040] Odpowiednie warianty są dobrze znane specjaliście w dziedzinie inżynierii genetycznej i obejmują powyższe mutacje, jak również przedstawione poniżej przykładowe warianty. [0041] Zgodnie z wynalazkiem posłużyć się można dodawanymi i/lub usuwanymi cząsteczkami zmodyfikowanego polipeptydu według niniejszego wynalazku. I tak zmodyfikowany polipeptyd o aktywności fitazy według niniejszego wynalazku można wydłużyć przez addycję dalszych sekwencji przy

9 PZ/1921/JDN 9 EP B1 N-końcu i/lub C-końcu. W ten sposób można wytworzyć cząsteczki hybrydowe posiadające dalsze korzystne właściwości. Przykładowo dołączyć można białka fuzyjne, względnie natywnie wydzielane w dużych ilościach białka, dzięki którym zwiększona zostanie wydajność wydzielnicza. Korzystnie wykorzystuje się do tego celu część białka CBH2 z Trichoderma reesei, od aminokwasu Met 1 do Ser 86. [0042] Według niniejszego wynalazku usunąć można również odcinki sekwencji polipeptydu o aktywności fitazy, o ile nie będzie to miało negatywnego wpływu na właściwość zwiększonej stabilności temperaturowej przy jednoczesnym zachowaniu aktywności fitazy. [0043] Mutacje, wydłużenia i skrócenia uzyskać można dobrze znanymi w dziedzinie metodami. [0044] Powyższym rozważanym modyfikacjom polipeptydu o aktywności fitazy odpowiadają właściwe mutacje, względnie modyfikacje, przynależnego do cząsteczki DNA. Rozpatrywać można przy tym również takie sekwencje, które w łagodnych lub surowych warunkach hybrydyzują z sekwencjami według niniejszego wynalazku. Za surowe warunki uznaje się: hybrydyzację w temperaturze 65 C, 18 godz. w roztworze siarczanu dekstranu (GenescreenPlus, DuPont), a następnie płukanie membrany każdorazowo przez 30 minut najpierw 6 x SSC, dwukrotnie 2 x SSC, dwukrotnie 2 x SSC z 0,1% SDS a na koniec 0,2 x SSC w temperaturze 65 C (Membrane transfer and detection methods, Amersham). [0045] Ponadto ujawniono również sekwencje wykazujące homologię z zastrzeganą sekwencją nukleotydową, względnie jego zastrzeganą częścią, wynoszącą co najmniej 70%, korzystniej co najmniej 80%, jeszcze korzystniej co najmniej 90% a zwłaszcza co najmniej 95%, o ile odpowiednie sekwencje prowadzą do zwiększenia stabilności temperaturowej kodowanego przez nie polipeptydu o aktywności fitazy. Korzystnie homologia wynosi od 70 do 100 procent. Homologię definiuje się tu jako stopień identyczności. Przy czym stopień identyczności określa się w taki sposób, że ustala się liczbę reszt w krótszej sekwencji użytej do porównania oraz występujących w odpowiadającym jej odcinku komplementarnym w innej sekwencji. Homologię korzystnie określa się w typowy sposób z zastosowaniem typowych algorytmów. Do porównania stosowane są wyłącznie cdna odpowiednich dojrzałych białek. Jako sekwencje homologiczne wyznaczane są podobne, korzystnie identyczne, sekwencje komplementarne, z pomocą znanych programów komputerowych. Przykładem takiego programu jest program Clone Manager Suite, zawierający część programu Align Plus, dystrybuowany przez firmę Scientific & Educational Software, Durham, NC, USA. Przy jego użyciu przeprowadza się porównanie dwóch, jak to powyżej zdefiniowano, sekwencji DNA, w opcji local alignment zgodnie z metodą FastScan - MaxScore lub zgodnie z metodą Needlemana-Wunscha przy zachowaniu wartości domyślnych. Specjalnie do obliczenia homologii według niniejszego wynalazku użyto wersji programu Clone Manager 7 Align Plus 5 z zastosowaniem funkcji Compare Two Sequences/Local Fast Scan- Max Score/Compare DNA sequences. Przy czym wykorzystano dodatkowe algorytmy z następujących źródeł: Hirschberg, D.S. (1975) A linear space algorithm for computing longest common subsequences, Commun Assoc Comput Mach 18: ; Myers, E.W. and W. Miller. (1988) Optimal alignments in linear space, CABIOS 4:1, 11-17; Chao, K-M, W.R. Pearson and W. Miller. (1992) Aligning two sequences within a specified diagonal band, CABIOS 8:5, [0046] Wynalazek dotyczy ponadto również sekwencji DNA, które ze względu na degenerację kodu genetycznego spokrewnione są z sekwencjami według niniejszego wynalazku, jak również ich allelicznych wariantów. Degeneracja kodu genetycznego wynikać może z naturalnej degeneracji lub specjalnego doboru optymalnych kodonów. Naturalnie występujące alleliczne warianty można

10 PZ/1921/JDN 10 EP B1 zidentyfikować dzięki zastosowaniu dobrze znanych technik biologii molekularnej na przykład reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i technik hybrydyzacji. [0047] Sekwencję DNA, która koduje polipeptyd według niniejszego wynalazku, można wykorzystać do transformacji dowolnych komórek-gospodarzy jak na przykład komórek grzybów, drożdży, bakterii, roślin lub ssaków. W ten sposób poddane transformacji komórki odznaczają się wytwarzaniem i ewentualnie wydzielaniem fitazy o podwyższonej stabilności termicznej. W ten sposób wytworzona fitaza o podwyższonej stabilności termicznej prowadzi również do efektywnego uwalniania fosforanu z fitynianów. [0048] Wyrażenia białko, peptyd i polipeptyd stosuje się wymiennie. Wyrażenia polipeptyd o aktywności fitazy lub enzym o aktywności fitazy lub fitaza oznaczają każdy enzym, który może powodować uwolnienie nieorganicznego fosforanu z różnych fosforanów mioinozytolu. Przykładami takich substratów dla fitazy (fosfatazy mioinozytolu) są kwas fitynowy i wszelkie jego sole, na przykład fitynian sodu lub fitynian potasu lub sole mieszane. Również dowolne izomery położeniowe di-, tri-, tetralub pentafosforanu mioinozytolu służyć mogą jako substrat dla fitazy. Aktywność fitazy można określić z zastosowaniem każdego z dowolnych testów, w których stosowany jest jeden z tych substratów. Jeden z wariantów fitazy według niniejszego wynalazku obejmuje warianty polipeptydowe wytworzone ze szczególnej fitazy na drodze delecji lub addycji jednego lub większej liczby aminokwasów przy N- i/lub C- końcu natywnego białka, delecji lub addycji jednego lub większej liczby aminokwasów w jednym lub większej liczbie miejsc w natywnym białku lub substytucji jednego lub większej liczby aminokwasów w jednym lub większej liczbie miejsc w fitazie. Sposób wytwarzanie takich wariantów jest powszechnie znany w dziedzinie. Przykładowo warianty sekwencji aminokwasowej polipeptydów można wytworzyć na drodze mutacji DNA. Sposoby mutagenezy i modyfikacji sekwencji nukleotydowej są dobrze znane w dziedzinie (porównaj na przykład Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985), Kunkel i in., Methods in enzymol., 154:367 (1987), opis patentowy St. Zjedn. Ameryki nr US 4,873,192, Walker and Gaastra, red., Techniques in Molecular Biology, Mac Millan Publishing Company, New York (1983)). Wskazówki dotyczące odpowiednich substytucji aminokwasowych, które nie mają negatywnego wpływu na aktywność biologiczną białka będącego przedmiotem zainteresowania, można znaleźć w modelu Dayhoffa i in., Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C (1978). Korzystne są substytucje konserwatywne, takie jak wymiana jednego aminokwasu na inny o podobnych właściwościach. [0049] Takie, wymienne w obrębie jednej grupy, aminokwasy przedstawiono przykładowo między innymi w poniższej tablicy. Alifatyczne Aromatyczne Niepolarne Polarne i nieobdarzone ładunkiem Polarne i obdarzone ładunkiem G A P I L V C S T M N Q D E K R H F W Y [0050] Wynalazek dotyczy również wyizolowanych lub zasadniczo oczyszczonych kompozycji kwasów nukleinowych lub białkowych. Przy czym wyizolowany i oczyszczony polinukleotyd/polipeptyd, względnie

11 PZ/1921/JDN 11 EP B1 jego segment, oznacza polinukleotyd, względnie polipeptyd, względnie jego segment, wyizolowany z jego natywnego środowiska. Wyizolowany segment kwasu polinukleotydowego lub polipeptydu może występować w formie oczyszczonej lub może występować w nienatywnym środowisku, jak na przykład w transgenicznej komórce - gospodarzu. Przykładowo wyizolowanemu lub oczyszczonemu segmentowi polinukleotydowemu lub białkowemu lub jego biologicznie aktywnej części zasadniczo nie towarzyszy dalszy materiał komórkowy bądź pożywka hodowlana podczas wytwarzania zgodnie z technikami rekombinacji lub zasadniczo nie towarzyszą mu prekursory chemiczne bądź inne związki chemiczne. Korzystnie wyizolowanemu polinukleotydowi nie towarzyszą sekwencje (korzystnie sekwencje kodujące białko), które naturalnie flankują kwas nukleinowy (tj. sekwencje zlokalizowane na końcach 5' i 3' kwasu nukleinowego) w genomowym DNA organizmu, od którego kwas nukleinowy pochodzi. Przykładowo, zgodnie z różnymi realizacjami wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego może zawierać mniej niż około 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb lub 0,1 kb sekwencji nukleotydowych, które naturalnie flankują cząsteczkę kwasu nukleinowego w genomowym DNA komórki, z którego kwas nukleinowy pochodzi. Białko, któremu zasadniczo nie towarzyszy materiał komórkowy, obejmuje kompozycje białka lub polipeptydu o zawartości poniżej około 70%, 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (w przeliczeniu na suchą masę) zanieczyszczającego białka. Przy produkcji rekombinowanego białka według niniejszego wynalazku lub jego biologicznie aktywnego fragmentu, pożywka hodowlana korzystnie zawiera około 70%, 50%, 30%, 20%, 10% lub 5% (w przeliczeniu na suchą masę) chemicznych prekursorów lub nieproteinowych substancji chemicznych. Fragmenty i warianty sekwencji nukleotydowej lub kodowane przez nie białka według niniejszego wynalazku lub segmenty białkowe, są również objęte zakresem wynalazku. Fragment oznacza część sekwencji nukleotydowej lub część kodowanej przez nią sekwencji aminokwasowej, a zatem część polipeptydu lub białka. [0051] Wynalazek dotyczy również kaset ekspresyjnych, które mogą zostać użyte do wprowadzenia do komórki - gospodarza otwartej ramki odczytu kodującej fitazę według niniejszego wynalazku. Obejmują one korzystnie region rozpoczęcia transkrypcji połączony z otwartą ramką odczytu. Taka kaseta ekspresyjna zawierać może wiele miejsc restrykcyjnych do insercji otwartej ramki odczytu i/lub innego DNA, na przykład regionu regulatorowego transkrypcji i/lub genów markerów selekcyjnych. Kaseta transkrypcyjna w kierunku 5' 3' transkrypcji obejmuje region rozpoczęcia transkrypcji i translacji, sekwencję DNA będącą przedmiotem zainteresowania oraz region zakończenia transkrypcji i translacji, funkcjonujący w komórce mikroorganizmu. Region terminacji może być natywny w stosunku do regionu rozpoczęcia transkrypcji, może być natywny w stosunku do sekwencji DNA będącej przedmiotem zainteresowania lub może pochodzić z dowolnego innego źródła. [0052] Wyrażenie otwarta ramka odczytu (ORF) oznacza sekwencję aminokwasową kodowaną między kodonem start a kodonem stop sekwencji translacji. Wyrażenia kodon start i kodon stop oznaczają jednostkę zbudowana z trzech sąsiednich nukleotydów (kodon) w sekwencji kodującej, określającą początek i koniec łańcucha w syntezie białka (translacja mrna). [0053] Połączenie w sposób umożliwiający działanie oznacza w odniesieniu do kwasu nukleinowego połączenie stanowiące część tej samej cząsteczki kwasu nukleinowego w odpowiedniej pozycji i orientacji w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji promotora. DNA w połączeniu w sposób umożliwiającym działanie z promotorem znajduje się pod kontrolą decydującego o początku transkrypcji promotora. Sekwencje kodujące mogą być połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencją regulatorową w orientacji sensownej lub antysensownej. Jeśli chodzi o polipeptydy połączenie w sposób

12 PZ/1921/JDN 12 EP B1 umożliwiający działanie oznacza połączenie stanowiące część tego samego polipeptydu, tj. przez wiązanie peptydylowe. [0054] Według niniejszego wynalazku wykorzystane mogą zostać dowolne promotory. Promotor oznacza sekwencję nukleotydową przeważnie powyżej (5') sekwencji kodującej i kontroluje ekspresję sekwencji kodującej, w ten sposób, że zapewnia rozpoznanie przez polimerazę RNA i inne czynniki, co jest niezbędne do prawidłowej transkrypcji. Promotor stosowany według niniejszego wynalazku obejmować może promotor minimalny, tj. krótką sekwencję DNA z kasety TATA i inne sekwencje, określające miejsce rozpoczęcia transkrypcji, do których dołączone są elementy regulatorowe sterujące ekspresją. [0055] Promotor według niniejszego wynalazku obejmować może również sekwencję nukleotydową zawierającą promotor minimalny i elementy regulatorowe, który może kontrolować ekspresję sekwencji kodującej lub funkcjonalnego RNA. Ten typ sekwencji promotora składa się z proksymalnych i dystalnych elementów ułożonych powyżej genu, przy czym te ostatnie wymienione elementy często nazywane są sekwencjami wzmacniającymi. W konsekwencji sekwencja wzmacniająca to sekwencja DNA mogąca stymulować aktywność promotora i może być naturalnym elementem promotora lub może być wprowadzonym elementem heterogennym, służącym do zwiększania stopnia ekspresji lub swoistości tkankowej promotora. Może on funkcjonować w obu orientacjach i sam może funkcjonować przy ułożeniu promotora w położeniu upstream (w stronę końca 5 ) lub downstream (w stronę końca 3 ). Zarówno sekwencja wzmacniająca jak również inne elementy promotora ułożone w położeniu upstream (w stronę końca 5 ) wiążą swoiście dla sekwencji białka wiążące DNA, które pośredniczą w ich działaniach. Promotory mogą w całości pochodzić z natywnego genu lub mogą zostać złożone z różnych elementów, pochodzić z różnych naturalnie występujących promotorów lub mogą zostać złożone nawet z segmentów syntetycznego DNA. Promotor zawierać może również sekwencje DNA biorące udział w wiązaniu czynników białkowych, które kontrolują efektywność inicjacji transkrypcji w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne lub rozwojowe. [0056] Elementy promotora, zwłaszcza elementy TATA, które są nieaktywne lub wykazują silnie ograniczoną aktywność promotora przy braku aktywacji w położeniu upstream (w stronę końca 5 ), określane są jako promotory minimalne. Zadaniem promotora minimalnego jest umożliwienie transkrypcji w obecności odpowiedniego czynnika transkrypcyjnego, względnie odpowiednich czynników transkrypcyjnych. Promotor minimalny składa się zatem jedynie z elementów podstawowych niezbędnych do rozpoczęcia transkrypcji, na przykład kasety TATA i/lub inicjatora. [0057] Wynalazek dotyczy również wektorów zawierających DNA według niniejszego wynalazku. Wektory te obejmują dowolne plazmidy, kosmidy, fagi i inne wektory w formie dwuniciowej lub jednoniciowej, liniowej lub kolistej, które ewentualnie same mogą być przenoszone lub mobilizowane i mogące transformować prokariotycznego lub eukariotycznego gospodarza poprzez swoją integrację z genomem komórkowym lub pozostawanie poza chromosomami (np. autonomicznie replikujące się plazmidy zawierające miejsce inicjacji replikacji). [0058] Wektory, plazmidy, kosmidy, sztuczne chromosomy drożdżowe (YAC), sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) i segmenty DNA do zastosowania w celu transformacji komórki zawierają ogólnie DNA kodujący fitazę według niniejszego wynalazku, jak również inny DNA, taki jak cdna, gen lub geny, który ma zostać wprowadzony do komórek. Te konstrukty DNA zawierać mogą dalsze wymagane struktury, takie jak promotory, sekwencję wzmacniającą, polilinker lub również geny regulatorowe. Jeden z

13 PZ/1921/JDN 13 EP B1 wybranych segmentów DNA lub genów, wybranych do wprowadzenia do komórki, koduje dogodnie białko, które będzie ulegać ekspresji w tak otrzymanych, poddanych transformacji (zrekombinowanych) komórkach, co prowadzi do powstania umożliwiającej screening lub selekcję cechy i/lub nadaje poddanej transformacji komórce ulepszony fenotyp. [0059] Sposób konstrukcji wektorów, które można wykorzystać według niniejszego wynalazku, jest znany specjaliście w dziedzinie, której dotyczy powyższe ujawnienie (porównaj na przykład Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wyd. 2., Coldspring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y. (1989)). Kaseta ekspresyjna według niniejszego wynalazku zawierać może jedno lub większą liczbę miejsc restrykcyjnych, by nukleotyd kodujący fitazę znalazł się pod kontrolą sekwencji regulatorowej. Kaseta ekspresyjna zawierać może również sygnał zakończenia translacji w połączeniu w sposób umożliwiającym działanie z polinukleotydem, jak również sekwencje regulatorowe niezbędne do prawidłowej translacji polinukleotydu. Kaseta ekspresyjna zawierająca polinukleotyd według niniejszego wynalazku może być chimerowa, tj. co najmniej jeden z jej składników pochodzi z co najmniej jednego z innych heterogennych składników. Ekspresja polinukleotydu występującego obrębie kasety ekspresyjnej znajdować się może pod kontrolą promotora konstytutywnego, promotora indukowanego, promotora regulowanego, promotora wirusowego lub syntetycznego. [0060] Wektory mogą zawierać już elementy regulatorowe, na przykład promotory, lub sekwencje DNA według niniejszego wynalazku mogą zostać poddane takiej manipulacji, by zawierały takie elementy. Odpowiednie elementy promotora, które można zastosować, są znane w dziedzinie i obejmują na przykład promotor cbh-1 lub cbh-2 dla Trichoderma reesei, promotor amy dla Aspergillus oryzae, promotor xyl, glaa, alca, apha, tpia, gpda, suci i pkia dla Aspergillus niger. Odpowiednie elementy promotora, które można wykorzystać do ekspresji w drożdżach, są znane w dziedzinie i obejmują na przykład promotor pho5 lub gap do ekspresji w Saccharomyces cerevisiae i na przykład promotor aoxl lub fmd dla Pichia pastoris lub promotor mox dla H. polymorpha. [0061] DNA, nadający się do wprowadzenia do komórek obejmować może, oprócz DNA według niniejszego wynalazku, również DNA pochodzący z dowolnego źródła lub z niego wyizolowany. Przykładem takiego DNA pochodzącego z innego źródła jest sekwencja DNA zidentyfikowana jako przydatny fragment w danym organizmie a następnie zsyntetyzowana chemicznie w zasadniczo czystej formie. Przykładem takiego DNA jest odpowiednia sekwencja DNA otrzymana na przykład w wyniku zastosowania endonukleaz restrykcyjnych, która jest taka, że można nią dalej manipulować według niniejszego wynalazku, na przykład amplifikować. Taki DNA określany będzie przeważnie jako zrekombinowany DNA. Dlatego też odpowiedni DNA obejmuje całkowicie syntetyczny DNA, półsyntetyczny DNA, DNA izolowany ze źródeł biologicznych i DNA pochodzący z wprowadzonego RNA. Ogólnie, wprowadzony DNA nie stanowi oryginalnej części genotypu DNA biorcy, lecz może być również genem według niniejszego wynalazku wyizolowanym z danego genotypu i ewentualnie modyfikowanym i następnie wprowadzonym w wielu kopiach genu do tego samego genotypu, na przykład w celu zwiększenia wytwarzania danego produktu genu. [0062] Wprowadzony DNA obejmuje, bez ograniczenia, DNA z genów takich jak na przykład geny bakteryjne, drożdżowe, grzybowe lub wirusowe. Wprowadzony DNA obejmować może geny zmodyfikowane lub syntetyczne, części genów lub geny chimerowe, włącznie z genami pochodzącymi w tego samego lub różnego genotypu.

14 PZ/1921/JDN 14 EP B1 [0063] Wykorzystany do transformacji DNA według niniejszego wynalazku może być kolisty lub liniowy, dwuniciowy lub jednoniciowy. Ogólnie, DNA występuje w formie chimerowego DNA jak na przykład DNA plazmidowy, zawierającego również regiony kodujące flankowane sekwencjami regulatorowymi, które wspierają w poddanej transformacji komórce ekspresję istniejącego zrekombinowanego DNA. Przykładowo DNA może sam zawierać promotor lub z niego się składać, który to promotor jest aktywny w komórce, pochodzi ze źródła innego niż dana komórka lub użyć można promotora, który występuje już w komórce, tj. w komórce, która ma zostać poddana transformacji. [0064] Ogólnie, wprowadzony DNA jest względnie mały, krótszy niż około 30 kb, by ograniczyć do minimum wrażliwość na rozkład fizyczny, chemiczny lub enzymatyczny, która zwiększa się wraz z wielkością DNA. [0065] Dobór odpowiedniego wektora ekspresyjnego zależy od komórki - gospodarza. Drożdżowe lub grzybowe wektory ekspresyjne zawierać mogą miejsce początku replikacji, odpowiedni promotor i sekwencję wzmacniającą, jak również dowolne niezbędne miejsca wiązania rybosomów, miejsca poliadenylacji, splicingowe miejsca donorowe i akceptorowe, sekwencje zakończenia transkrypcji oraz nietranskrybowane sekwencje flankujące 5'. [0066] Przykładami odpowiednich komórek-gospodarzy są: komórki grzybów z rodzaju Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium itd., jak na przykład drożdży z rodzaju Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula, Pichia itp. Odpowiednimi systemami gospodarzy są na przykład grzyby, takie jak z rodzaju Aspergillus, na przykład Aspergillus niger (ATCC 9142) lub Aspergillus ficuum (NRLL 3135) lub Trichoderma (np. Trichoderma reseei QM6a) oraz drożdże, takie jak Saccharomyces, na przykład Saccharomyces cerevisiae lub Pichia, jak na przykład Pichia pastoris lub Hansenula, na przykład H. polymorpha (DSMZ 70277). Takie mikroorganizmy otrzymać można z uznanych miejsc deponowania, takich jak na przykład American Type Culture Collection (ATCC), Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) lub Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) lub wszelkich innych. [0067] Kaseta ekspresyjna zawierać może w kierunku 5'-3' transkrypcji region rozpoczęcia transkrypcji i translacji polinukleotydu według niniejszego wynalazku oraz region terminacji transkrypcji i translacji, funkcjonujący w warunkach in vivo lub in vitro. Region terminacji może być natywny względem regionu inicjacji transkrypcji lub może być natywny względem polinukleotydu lub może być innego pochodzenia. Sekwencje regulatorowe zlokalizowane mogą być w położeniu upstream (w stronę końca 5 ) (sekwencje niekodujące 5'), wewnątrz (intron) lub w położeniu downstream (w stronę końca 3 ) (sekwencje niekodujące 3') w stosunku do sekwencji kodującej i oddziaływać na transkrypcję, obróbkę RNA lub stabilność i/lub translację związanej z nimi sekwencji kodującej. Sekwencje regulatorowe obejmować mogą, bez ograniczenia, sekwencję wzmacniającą, promotory, miejsca wiązania represora, sekwencje liderowe translacji, introny lub sekwencje sygnałowe poliadenylacji. Obejmować one mogą również sekwencje naturalne i syntetyczne, jak również sekwencje będące kombinacją sekwencji syntetycznych i naturalnych. [0068] Zastosowany wektor według niniejszego wynalazku zawierać może również odpowiednie sekwencje potęgujące ekspresję. [0069] Przykładami promotorów, które można wykorzystać według niniejszego wynalazku, są promotory, o których wiadomo, że kontrolują ekspresję w komórkach eukariotycznych. Zastosować można wszelkie promotory o zdolności do ekspresji w grzybach nitkowatych. Przykładami są promotor silnie indukowany

15 PZ/1921/JDN 15 EP B1 przez skrobię lub celulozę, na przykład promotor dla glukoamylazy lub α-amylazy pochodzący z gatunku należącego do rodzaju Aspergillus lub celulazy (cellobiohydrolazy) pochodzący z gatunku należącego do rodzaju Trichoderma, promotor dla enzymów uczestniczących w szlaku glikolitycznym, na przykład kinazy fosfoglicerynianowej (PGK) i dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanu (GPD) itd. Korzystnie jest to promotor cellobiohydrolazy I, cellobiohydrolazy II, amylazy, glukoamylazy, ksylanazy lub enolazy. [0070] Znane są dwie główne metody kontroli ekspresji, tj. nadekspresja i obniżona ekspresja. Nadekspresję uzyskać można dzięki insercji jednej lub większej liczby dodatkowych kopii wybranego genu. W przypadku obniżonej ekspresji istnieją dwie główne metody, które zazwyczaj w dziedzinie nazywane są antysensowną regulacją w dół (ang. antisense downregulation) i sensowną regulacją w dół (ang. sense downregulation). Ogólnie, metody te nazywane będą wyciszaniem genów. [0071] Obie z tych metod prowadzą do hamowania ekspresji genu docelowego. [0072] Oprócz zastosowania specjalnego promotora, na ekspresję transgenów wpływ mogą mieć inne typy elementów. W szczególności wykazano, że zdolność do zwiększania ekspresji transgenów posiadają introny. [0073] Kaseta ekspresyjna zawierać może jeszcze inne elementy, na przykład takie, które mogą być regulowane przez elementy endogenne lub egzogenne, takie jak białka zawierające palce cynkowe, w tym naturalnie występujące białka zawierające palce cynkowe lub chimerowe białka zawierające palce cynkowe. [0074] Zastosowana kaseta ekspresyjna według niniejszego wynalazku zawierać może ponadto elementy sekwencji wzmacniającej lub elementy promotora w położeniu upstream (w stronę końca 5 ). [0075] Wektory do zastosowania według niniejszego wynalazku można tak skonstruować, aby zawierały element sekwencji wzmacniającej. Konstrukty według niniejszego wynalazku zawierają zatem gen będący przedmiotem zainteresowania wraz z sekwencją 3' DNA, funkcjonującą jako sygnał do zakończenia transkrypcji i umożliwiającą poliadenylację tak otrzymanego mrna. Zastosować można dowolne sekwencje sygnałowe umożliwiające wydzielanie z organizmu wybranego gospodarza. Korzystnie sekwencją sygnałową jest sekwencja sygnałowa fitazy z Aspergillus niger lub pochodzące z niej sekwencje sygnałowe do wydzielania z grzybów nitkowatych. [0076] Zastosować można również specjalną sekwencję liderową, gdyż sekwencja DNA między miejscem rozpoczęcia transkrypcji a miejscem rozpoczęcia sekwencji kodującej, tj. nieulegająca translacji sekwencja liderowa, może mieć wpływ na ekspresję genu. Korzystne sekwencje liderowe obejmują sekwencje sterujące optymalną ekspresją dołączonego genu, tj. obejmują korzystnie konsensusową sekwencję liderową zwiększającą lub nadającą stabilność mrna i zapobiegającą nieodpowiedniej inicjacji translacji. Dobór takich sekwencji jest dobrze znany specjaliście w dziedzinie. [0077] By polepszyć zdolność do identyfikacji transformantów do kasety ekspresyjnej wprowadzić można, podlegający selekcji lub skriningowi, gen markerowy. Tego rodzaju geny markerowe są dobrze znane specjaliście w dziedzinie. [0078] Kaseta ekspresyjna lub konstrukt wektora zawierający kasetę ekspresyjną, zostaje wprowadzona/y do komórki - gospodarza. Dostępnych jest wiele technik i są one dobrze znane specjaliście w dziedzinie do wprowadzenia konstruktów do komórki - gospodarza. Transformację komórek mikroorganizmów przeprowadzić można z zastosowaniem glikolu polietylenowego, chlorku wapnia, infekcji wirusowej, DEAE-dekstranu, infekcji fagowych, elektroporacji i innych metod znanych w dziedzinie. Transformację grzybów przeprowadzić można zgodnie z metodą przedstawioną w: Penttilä i

16 PZ/1921/JDN 16 EP B1 in., Gene 61: , Zrekombinowane wektory można wprowadzić do drożdży znaną metodą obejmującą elektroporację, zastosowanie sferoplastów, octanu litu itp. [0079] Po otrzymaniu kasety ekspresyjnej, względnie sekwencji DNA, według niniejszego wynalazku, można ją w znany sposób wprowadzić do wektorów, w celu uzyskania nadekspresji kodowanego polipeptydu w odpowiednich systemach gospodarzy. Jednakże zastosować można również sekwencje DNA jako takie, do transformacji odpowiednich systemów gospodarzy według niniejszego wynalazku, w celu uzyskania nadekspresji kodowanego polipeptydu. [0080] Po uzyskaniu ekspresji sekwencji DNA według niniejszego wynalazku w odpowiedniej komórce - gospodarzu w odpowiedniej pożywce, można kodowaną fitazę zatężyć i/lub wyizolować z pożywki, gdy fitaza wydzielana jest do pożywki, lub z organizmu gospodarza, gdy fitaza występuje wewnątrzkomórkowo, na przykład w przestrzeni periplazmatycznej, sposobem znanym jako taki. Do wytwarzania stężonych roztworów fitazy lub do przygotowania do suszenia fitazy zastosować można znany sposób oddzielania nierozpuszczalnych składników pożywki hodowlanej i biomasy a następnie sposób zatężania fitazy. Przykładowo zastosować można metody filtracji lub metody odwirowywania do oddzielenia nierozpuszczalnych składników a następnie metodę ultrafiltracji do zatężenia, lub stosuje się metody filtracji w przepływie krzyżowym. Suszenie przeprowadzić można metodą liofilizacji i suszenia rozpyłowego, granulacji, wytłaczania lub innymi metodami. Do wyizolowania fitazy według niniejszego wynalazku zastosować można znany sposób oczyszczania białka. Przykładowo, zastosować można różne metody chromatografii lub chromatografii w żelu, same lub w kombinacji. Zależnie od wykorzystywanej komórki - gospodarza, przy rekombinacyjnej metodzie wytwarzania, enzym według niniejszego wynalazku można modyfikować kowalencyjnie na drodze glikozylacji lub nie. W komórkach eukariotycznych glikozylacja służy wydzielanym białkom do tego by modulować fałdowanie białka, stabilność konformacyjną, stabilność termiczną i odporność na proteolizę. W odniesieniu do swoistego zastosowania fitazy, korzystniejszy może być glikozylowany wariant enzymu niż nieglikozylowany. Przykładowo, zastosowanie glikozylowanej fitazy w paszy służy ochronie enzymu przed denaturacją termiczną podczas granulacji paszy i przed inaktywacją proteolityczną przy przechodzeniu przez żołądek zwierzęcia, dzięki czemu zwiększa się występowanie aktywnego enzymu w przewodzie pokarmowym i w miejscu jego działania. Do zastosowań w przetwórstwie spożywczym, w którym aktywność enzymatyczna potrzebna jest jedynie podczas obróbki a nie w produkcie końcowym, korzystna może być fitaza termolabilna, tj. nieglikozylowana, i wrażliwa na rozkład proteolityczny. [0081] Wynalazek dotyczy również kompozycji fitazy zawierających polipeptyd według niniejszego wynalazku. Ogólnie kompozycje fitazy są płynne lub suche. Płynne kompozycje zawierają fitazę korzystnie w formie oczyszczonej lub wzbogaconej. Jednakże dodać można również substancje pomocnicze, takie jak na przykład stabilizator, jak gliceryna, sorbitol lub glikol monopropylenowy, dodatki takie jak sole, cukier, konserwanty, środki regulujące ph, białka i fitynian lub sole fosforanów mioinozytolu (substrat fitazy). Typowymi płynnymi kompozycjami są zawiesiny wodne lub olejowe. Płynne kompozycje dodawać można do żywności lub paszy przed lub po ewentualnej granulacji, względnie etapie obróbki. [0082] Suchymi kompozycjami mogą być kompozycje liofilizowane, suszone rozpyłowo, granulowane lub ekstrudowane, które zawierać mogą wyłącznie enzym. Lecz przed suszeniem dodać można również substancje do regulacji wartości ph, jak również dalsze dodatki i wypełniacze, takie jak maltodekstryny, laktoza, odtłuszczone mleko w proszku, sole kationów dwuwartościowych takie jak sole Mg, Ca, Zn itd. Suche kompozycje mogą być granulatami, które można lekko zmieszać na przykład z żywnością lub

17 PZ/1921/JDN 17 EP B1 składnikami paszy lub korzystniej stanowią składnik przedmieszki. Wielkość cząstek granulatu enzymatycznego jest korzystnie zgodna z innymi składnikami mieszaniny. Stanowi to pewny i praktyczny sposób dodania enzymów na przykład do przetwarzanej żywności, przedmieszek lub karmy. [0083] Przykładowo, stabilny preparat fitazy według niniejszego wynalazku można wytworzyć w taki sposób, że mieszaninę z płynnego roztworu enzymu natryskuje się na wypełniacz, taki jak maltodekstryna, a następnie suszy mieszaninę, lub do płynnego roztworu enzymu przed suszeniem dodaje się 20-60% odtłuszczone mleko w proszku (wag./wag. w stosunku do białka całkowitego w roztworze enzymu) i/lub 1-5% propionianu wapnia (wag./wag. w stosunku do białka całkowitego w roztworze enzymu) a wartość ph reguluje się do określonej wartości, zwłaszcza do ph 5,2 ± 0,5. Zmniejszenie wilgotności i wiązania fitazy z wypełniaczem chroni enzym, poza zawartą w jego strukturze stabilnością, przed wpływami środowiskowymi, takimi jak skrajne temperatury, które mogą wystąpić podczas wytwarzania paszy. Suche i płynne preparaty można dodatkowo ustabilizować, ograniczając aktywność potencjalnie proteolitycznych enzymów, które mogą występować jako produkty uboczne w płynnej mieszaninie fermentacyjnej wykorzystywanej do wytwarzania enzymu według niniejszego wynalazku. Tak otrzymana sucha mieszanina enzymu wykorzystana może zostać jako dodatek paszowy w hodowli drobiu i świń. Ponadto zmniejszenie suplementacji fosforanowej prowadzi do spadku zanieczyszczenia fosforanami, co z kolei istotnie zmniejsza skutki środowiskowe intensywnej hodowli zwierząt. [0084] Po otrzymaniu suchego preparatu enzymatycznego, można z niego wytworzyć w kolejnych etapach granulat aglomeracyjny. Do tego stosuje się mieszalnik charakteryzujący się dużymi siłami ścinającymi, dzięki czemu materiał wypełniający i enzym tworzą razem aglomerat i formują granulat. Granulaty absorpcyjne tworzy się w taki sposób, że enzymem według niniejszego wynalazku pokrywa się rdzenie z podłoża. Typowymi materiałami wypełniającymi są sole, takie jak siarczan sodu. Inne materiały wypełniające obejmują kaolin, talk, krzemian glinowo-magnezowy i włókna celulozowe. Ewentualnie do granulatu aglomeracyjnego dodaje się również środki wiążące, takie jak dekstryny. [0085] Typowe podłoża obejmują skrobię, na przykład w postaci manioku, skrobi kartoflanej i zbożowej, zwłaszcza kukurydzianej, ryżowej i pszenicznej, lub produkty białkowe, takie jak na przykład białko sojowe. Wykorzystać można również sole. Granulat ewentualnie obtacza się mieszaniną powlekającą. Taka mieszanina obejmuje środek powlekający, korzystnie hydrofobowy środek powlekający, odwodniony olej palmowy i talk, i ewentualnie inne dodatki, takie jak węglan wapnia lub kaolin, by zwiększyć dostępność biologiczną w docelowym miejscu działania. [0086] Dodatkowo mieszaniny fitazy mogą zawierać inne substancje jak barwniki, związki aromatyzujące, stabilizatory, witaminy, minerały, inne enzymy stosowane w żywności lub paszy i itp. Dotyczy to zwłaszcza tak zwanych przedmieszek. [0087] Dodatek do żywności lub paszy to zasadniczo czysty związek lub kompozycja z wielu związków, przeznaczone lub nadające się do dodania do żywności lub paszy. W szczególności jest to substancja, która w zależności od jej zastosowania końcowego stanowić będzie składnik żywności lub paszy lub będzie miała wpływ na właściwości produktu żywnościowego lub paszowego. I tak też dodatek fitazy oznaczać ma fitazę, niebędącą naturalną częścią składową stosowanych głównie w żywności i paszy substancji lub niewystępującą w jej naturalnym stężeniu. Przykładowo fitaza będzie dodawana do paszy oddzielnie od innych substancji paszy, sama lub w połączeniu z innymi dodatkami do paszy. Typowa

18 PZ/1921/JDN 18 EP B1 przedmieszka zawiera przeważnie jeden lub większą liczbę związków, takich jak witaminy, minerały lub wzbogacające paszę enzymy oraz odpowiedni nośnik i/lub substancje pomocnicze. [0088] Gotowy do użytku dodatek fitazy to dodatek, który nie jest wytwarzany w samej paszy ani w przetworzonej żywności. Gotowy do użytku dodatek fitazy można podawać ludziom lub zwierzętom bezpośrednio lub korzystnie bezpośrednio po zmieszaniu z innymi składnikami paszy lub żywności. Przykładowo, zgodnie z tym aspektem niniejszego wynalazku dodatek paszowy będzie połączony z innymi paszami i dodatkami paszowymi po otrzymaniu przedmieszki lub paszy suplementacyjnej. Takie inne części składowe paszy obejmują jeden lub większą liczbę innych (korzystnie termostabilnych) suplementów enzymatycznych, inne dodatki paszowe, paszę mineralną i aminokwasy. Tak otrzymane (połączone) dodatki paszowe zawierać mogą wiele różnych typów związków i mogą następnie zostać w ich odpowiedniej ilości zmieszane z paszami takimi jak nośniki zbożowe i białkowe w czasie wytwarzania paszy złożonej. Składniki te można przetworzyć w paszę po zmieszaniu z zastosowaniem znanych urządzeń przetwórczych, takich jak granulator dwuetapowy, granulator parowy, ekspander lub wytłaczarka. [0089] W podobny sposób dodatek do żywności, zgodnie z niniejszą realizacją niniejszego wynalazku, łączyć można z innymi składnikami żywności, w wyniku czego otrzymuje się przetworzone produkty żywnościowe. Takie inne składniki żywności obejmują jeden lub większą liczbę suplementów enzymatycznych, witamin, minerałów i pierwiastków śladowych. Tak otrzymane połączone suplementy do żywności można następnie zmieszać w odpowiedniej ilości z innymi składnikami żywności, takimi jak zboże i białka roślinne, by uzyskać żywność przetworzoną. Wspomniane składniki do żywności przetworzonej można przetworzyć z zastosowaniem znanych urządzeń przetwórczych. [0090] W korzystnej realizacji kompozycje fitazy według niniejszego wynalazku obejmują dodatkowo skuteczną ilość jednego lub większej liczby enzymów do żywności lub paszy, korzystnie wybranych spośród takich jak alfa-galaktozydazy, beta-galaktozydazy, lakazy, inne fitazy, fosfatazy, endoglukanazy, zwłaszcza endo-beta-1,4-glukanazy, endo-beta-1,3(4)-glukanazy, endo-1,2-beta-glukanazy i endo-1,3- alfa-glukanazy, celulazy, ksylozydazy, galaktanazy, zwłaszcza arabinogalaktano-endo-1,4-betagalaktozydazy i arabinogalaktano-endo-1,3-beta-galaktozydazy, enzymy rozkładające pektynę, zwłaszcza pektynazy, pektynoesterazy, pektynoliazy, poligalakturonazy, arabanazy, ramnogalakturonanazy, ramnogalakturonanoacetyloesterazy, alfa-ramnozydazy ramnogalakturonanu, liazy pektynianowe i alfa-galakturonidazy, mannanazy, beta-mannozydazy, mannanoacetyloesterazy, acetyloesterazy ksylanowe, proteazy, ksylanazy, arabinoksylanazy i enzymy lipolityczne takie jak lipazy, fosfolipazy i kutynazy. [0091] Dodatek do paszy według niniejszego wynalazku podawany będzie zwierzęciu przed paszą lub jednocześnie z nią. Korzystnie dodatek do paszy według niniejszego wynalazku będzie podawany zwierzęciu jednocześnie z paszą. [0092] Skuteczna ilość fitazy w żywności lub paszy wynosi około PPU/kg, korzystnie około PPU/kg, korzystniej około PPU/kg, jeszcze korzystniej około PPU/kg, zwłaszcza PPU/kg paszy lub żywności. [0093] Wynalazek dotyczy również zastosowania fitazy do przetwarzania i wytwarzania żywności i paszy. Zboże i mąkę do żywności można poddać obróbce enzymatycznej z użyciem fitazy, w celu zmniejszenia zawartości fityny w surowcach. Zmniejszenie zawartości fityny poprawia jakość żywności, z tego względu, że zwiększa dostępność niezbędnych minerałów, takich jak żelazo, wapń i cynk. Oprócz

19 PZ/1921/JDN 19 EP B1 poprawy jakości żywności, zastosowanie fitazy podczas przetwarzania może zwiększyć wydajność całkowitą produkcji żywności. Przykładowo, dodanie fitazy do białych płatków sojowych podczas wytwarzania izolatu białka sojowego istotnie zwiększa wydajność i jakość ekstrahowanego białka. Fitaza aktywna jest ponadto jedynie podczas wytwarzania i przetwarzania i nie jest już aktywna w produkcie końcowym. Aspekt ten ma znaczenie zwłaszcza w produkcji ciasta i przy pieczeniu i wytwarzaniu innych gotowych do spożycia produktów ze zboża. W podobny sposób, przed właściwym procesem wytwarzania, można potraktować wstępnie fitazą składniki paszy, takie jak prażona mąka sojowa lub śruta z rzepaku Canola. Oddzielenie czynników przeciwodżywczych od składników paszy przed wytwarzaniem prowadzi do jakości lepszej z fizjologicznego punktu widzenia oraz do cennych składników paszy. W tej metodzie przetwarzania fitaza jest aktywna podczas wytwarzania i z reguły nie jest już aktywna w przewodzie pokarmowym zwierzęcia po spożyciu przez nie poddanej obróbce paszy. [0094] Oprócz zastosowania fitazy jako środka pomocniczego w przetwórstwie paszy, niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania fitazy według niniejszego wynalazku jako środka ułatwiającego trawienie. Fitazę w postaci tabletki można przyjmować razem z pokarmem, w celu dystrybucji aktywnego enzymu w przewodzie żołądkowo - jelitowym. [0095] Fitazę według niniejszego wynalazku można równie korzystnie zastosować u zwierząt o żołądku jednokomorowym jak i tych o żołądku wielokomorowym, zwłaszcza u młodych cieląt. Karmę dla ryb i skorupiaków można również suplementować fitazą, w celu zwiększenia wykorzystania karmy i zmniejszenia zawartości wydalanego fosforu przy intensywnej hodowli zwierząt. Paszę według niniejszego wynalazku podawać można również zwierzętom takim jak drób, na przykład brojlerom, indykom, gęsiom, kaczkom, jak również psom, koniom, bydłu, owcom, kozom, psom i kotom oraz rybom i skorupiakom. Szczególnie korzystne jest jednakże podawanie paszy według niniejszego wynalazku świniom lub drobiu. [0096] Preparaty fitazy według niniejszego wynalazku połączyć można również z innymi składnikami, z uzyskaniem nowych i szczególnie korzystnych kompozycji paszy. Ponieważ, jak wskazano powyżej, dostępność roślinnego fosforanu z mąki sojowej i zboża na skutek jego związania z kwasem fitynowym jest niewielka, do paszy dodawany jest nieorganiczny fosforan, w celu zapewnienia zwierzętom odpowiedniej podaży fosforu. Pasza ta jednakże zawiera zbyt dużo fosforanu całkowitego, co prowadzi do zanieczyszczenia środowiska fosforanem. Szczególnie pasza według niniejszego wynalazku zawiera kombinację fitazy według niniejszego wynalazku ze składnikami paszy, co prowadzi do uzyskania paszy zawierającej istotnie obniżoną zawartość dodanego fosforu nieorganicznego. W korzystnej realizacji pasza według niniejszego wynalazku zawiera typowe składniki paszy, mikroskładniki odżywcze, pierwiastki śladowe, witaminy itd. jak również, w skutecznej ilości, fitazę i fosfor nieorganiczny, przy czym ilości fitazy i fosforu wynoszą od 50 do jednostek fitazy/kg paszy i mniej jako 0,45% fosforu nieorganicznego, korzystnie od 100 do jednostek fitazy/kg paszy i mniej jako 0,225% fosforu nieorganicznego, korzystniej od 150 do jednostek fitazy/kg paszy i mniej jako 0,15% fosforu nieorganicznego, jeszcze korzystniej ilości od 200 do jednostek fitazy/kg paszy i żadnego dodatku fosforu nieorganicznego. [0097] Wynalazek dotyczy również sposobu poprawy przyrostu masy i wskaźnika wykorzystania paszy (Feed Conversion Ratio, FCR) w odżywianiu zwierząt oraz zastosowania do tego celu fitazy według niniejszego wynalazku. Fitaza według niniejszego wynalazku umożliwia poprawę przyrostu masy i zwiększenie wskaźnika wykorzystania paszy, zwłaszcza w kontekście paszy zawierającej niewiele fosforu

20 PZ/1921/JDN 20 EP B1 nieorganicznego. Zgodnie ze sposobem według niniejszego wynalazku zawartość fosforu nieorganicznego w paszy obniża się do poniżej 0,45%, korzystnie poniżej 0,225%. Korzystnie nie dodaje się żadnego fosforu nieorganicznego. Dzięki zwiększonej dostępności fosforanu dzięki dodaniu enzymu według niniejszego wynalazku można istotnie polepszyć mineralizację kości zwierząt, co ma duże znaczenie zwłaszcza w przypadku szybko rosnących zwierząt. [0098] Zgodnie z jeszcze inną realizacją, wynalazek dotyczy zastosowania enzymu według niniejszego wynalazku w pieczeniu, dzięki czemu polepsza się rośnięcie, elastyczność i/lub stabilność ciasta i/lub objętość, strukturę miękiszu i/lub odporność wypieku na czerstwienie. Chociaż preparat enzymu według niniejszego wynalazku stosować można do wytwarzania ciasta lub wypieków z dowolnego rodzaju mąki, na przykład na bazie żyta, jęczmienia, owsa lub kukurydzy, to okazuje się, że preparat enzymu według niniejszego wynalazku jest szczególnie przydatny przy wytwarzaniu ciast lub wypieków z pszenicy lub w znacznym stopniu z pszenicy. Wypieki, które można uzyskać z zastosowaniem preparatu enzymu według niniejszego wynalazku, obejmują chleb, bułkę, bagietkę itp. Do pieczenia zastosować można preparat enzymu według niniejszego wynalazku o dodatkowej, oprócz fitazy, aktywności enzymatycznej, takiej jak aktywność na przykład ksylanazy, lipazy, amylazy, oksydazy lub lakkazy, lub można go zastosować w połączeniu z dalszymi enzymami, takimi jak lipaza, amylaza, oksydaza (np. oksydaza glukozy, peroksydaza). [0099] Załączone figury rysunku objaśniają wynalazek w sposób bardziej szczegółowy: na Fig. 1: zilustrowano mapę plazmidu pet-phym2 na Fig. 2: zilustrowano mapę plazmidu pab490-phym2 na Fig. 3: zilustrowano mapę plazmidu puc-phym3 na Fig. 4: zilustrowano mapę plazmidu pab489-phym3 na Fig. 5: zilustrowano mapę plazmidu puc-phym10 na Fig. 6: zilustrowano mapę plazmidu pab600-phym10 na Fig. 7: zilustrowano mapę plazmidu pphy2005 na Fig. 8: zilustrowano mapę plazmidu pab-phy2005 na Fig. 9: zilustrowano mapę plazmidu pphy2006 na Fig. 10: zilustrowano mapę plazmidu pab-phy2006 na Fig. 11: zilustrowano porównanie sekwencji pojedynczych mutantów i wariantów według niniejszego wynalazku, jak również mutantów odniesienia w oparciu o sekwencję typu dzikiego (Dassa). Wyróżniono mutacje, względnie warianty. [0100] Poniższe przykłady objaśniają wynalazek w sposób bardziej szczegółowy. Przykłady Przykład 1 - Oznaczanie aktywności fitazy [0101] Aktywność fitazy zmierzono za pomocą mieszaniny testowej składającej się z 0,5% kwasu fitynowego (około 5 mm), 200 mm cytrynianu sodu, ph 5,0. Po 15 - minutowej inkubacji w temperaturze 37 C reakcję przerwano, dodając taką samą objętość 15% kwasu trichlorooctowego. Uwolnione jony fosforanowe oznaczono ilościowo przez zmieszanie 100 µl mieszaniny testowej z 900 µl H 2 O i 1 ml 0,6 M H 2 SO 4, 2% kwasem askorbinowym i 0,5% molibdenianem amonu po inkubacji w temperaturze 50 C i odczekaniu 20 minut, przy długości fali 820 nm. Jako materiału odniesienia użyto roztworów wzorcowych fosforanu potasu.