ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH ZESZYT 573

Transkrypt

1 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH ZESZYT 573 WARSZAWA 2013

2 ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH Zeszyt 573 Wydział Nauk o Żywności Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie 2013

3 Wydział Nauk o Żywności, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie RADA REDAKCYJNA Andrzej Lenart przewodniczący André Chwalibog (Dania) Rui Costa (Portugalia) Marco Dalla Rosa (Włochy) Frédéric Debeaufort (Francja) Jesus Frias (Irlandia) Józef Horabik Tadeusz Kudra (Kanada) Jan Łabętowicz Jan Niemiec Edward Pierzgalski KOMITET REDAKCYJNY Dorota Witrowa-Rajchert redaktor naczelna Mirosław Słowiński zastępca redaktor naczelnej Ewa Gondek sekretarz ADRES REDAKCJI Wydział Nauk o Żywności SGGW w Warszawie ul. Nowoursynowska 159c Warszawa Opracowanie redakcyjne Ewa Ramus, Elżbieta Wojnarowska Czasopismo w postaci wydrukowanej jest wersją pierwotną ISSN Wydawnictwo SGGW, ul. Nowoursynowska 166, Warszawa tel (-22; -25 sprzedaż), fax wydawnictwo@sggw.pl Druk: POLIMAX s.c., ul. Nowoursynowska 161 L, Warszawa

4 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 573, 2013, 3 11 WYKRYWANIE BAKTERII SALMONELLA METODAMI MOLEKULARNYMI W PRODUKTACH ŻYWNOŚCIOWYCH Anna Misiewicz, Anna Goncerzewicz Instytut Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Warszawa Streszczenie. Bakterie z rodzaju Salmonella są najbardziej znanymi bakteriami patogennymi występującymi w przemyśle spożywczym. Powodują zakażenia prawie wszystkich produktów żywnościowych od mięsnych, mlecznych, jajecznych po rośliny oleiste i pasze. Wykrycie i identyfikacja bakterii Salmonella na podstawie tradycyjnej metody mikrobiologicznej, zgodnie z normą PN-EN 6579:2003, jest ciągle powszechnie stosowane w laboratoriach. Analiza ta jest czaso- i pracochłonna, jej wykonanie trwa około 5 7 dni. Wykorzystanie nowoczesnych technik biologii molekularnej, z etapem namnożenia i izolacji DNA, do uzyskania końcowego wyniku trwa znacznie krócej. W niniejszej pracy zastosowano metodę Real-Time PCR i klasyczny PCR do identyfikacji bakterii Salmonella w różnych produktach żywnościowych. Określono czas potrzebny do wykonania tej analizy molekularnej. Do reakcji Real-Time PCR wykorzystano komercyjny kit. Klasyczną reakcję PCR prowadzono z użyciem starterów Sal465Li Sal142F, uzyskując właściwy produkt o wielkości 343 pz. We wszystkich badanych próbkach wykryto bakterie Salmonella. Wynik analiz molekularnych uzyskano w ciągu godzin. Słowa kluczowe: PCR, Real-Time PCR, Salmonella sp., identyfikacja WSTĘP Gram-ujemne pałeczki z rodzaju Salmonella są głównymi z ponad 30 czynników patogennych zakażających żywność. Na świecie odnotowuje się miliony zakażeń pokarmowych spowodowanych przez bakterie Salmonella. Jak wynika z szacunkowych danych, corocznie odnotowuje się około 1,3 mld chorób wywołanych bakteriami z rodzaju Salmonella, z czego około 3 mln przypadków kończy się śmiercią. Główną przyczyną zakażeń ludzi i zwierząt jest podgatunek Enterica. Adres do korespondencji Corresponding author: Anna Misiewicz, Instytut Biologii Przemysłu Rolno-Spożywczego, Zakład Mikrobiologii, ul. Rakowiecka 36, Warszawa, anna. misiewicz@ibprs.pl

5 4 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz Globalne zmiany w procesach produkcji żywności, w sposobie przechowywania i spożywania mogą być przyczyną ciągłych infekcji bakteriami Salmonella sp. Jednym z bardziej niebezpiecznych produktów są surowe lub niedogotowane jaja [Coyle i in. 1988, Stephens i in. 2007] oraz produkty mięsne, nabiałowe, wyroby ciastkarskie i deserowe. Bakterie z rodzaju Salmonella są także izolowane z pasz oraz próbek środowiskowych [Fegan i in. 2004, Boughton i in. 2007]. Mogą one zakażać produkty na każdym etapie procesu produkcyjnego. Bardzo wiele zależy od higieny warunków produkcji, począwszy od obróbki wstępnej po końcowe jej etapy pakowanie i transport [Boughton i in. 2007]. Bakterie Salmonella mogą rozwijać się także w sposób nieograniczony podczas nieodpowiedniego przechowywania żywności, najważniejszą rolę odgrywa wówczas temperatura. Przeprowadzone badania dowodzą, iż znaczny wzrost bakterii następuje w temperaturze 8 C [Pindar i in. 2007]. Uważa się, iż nie rozwijają się one w temperaturze poniżej 6 C, natomiast według D Aousta [1991], w zależności od serotypów i szczepów, możliwy jest jednak rozwój bakterii Salmonella w przedziale temperatury od 2 do 7 C. Zapewnienie jakości i bezpieczeństwa żywności jest najważniejszym kryterium dla zdrowia i życia ludzi oraz zwierząt [Naravaneni i Jamil 2005]. Od 1 stycznia 2006 roku na mocy Rozporządzenia (WE) [2004] obowiązują nowe zasady dotyczące specjalnych gwarancji na żywność [Misiewicz i in. 2009]. Tradycyjne metody mikrobiologiczne stosowane przez laboratoria do wykrywania i identyfikacji bakterii z rodzaju Salmonella są praco-, materiało- i czasochłonne [Malorny i in. 2008, Misiewicz i in. 2009]. Związane są z mnogością przesiewów i hodowli, różnych etapów identyfikacji od morfologicznych, przez biochemiczne, po serologiczne [Swaminathan i Feng 1994]. Szczególnego znaczenia nabierają zatem metody pozwalające na szybkie wykrycie bakterii patogennych. Są to metody immunoabsorbcyjne, oparte na zjawisku hybrydyzacji lub powielenia DNA [Seo i in. 2004, Blais i Martinem-Perez 2008]. Najbardziej obiecujące metody oparte są na technice PCR (Łańcuchowa Reakcja Polimerazy, ang. Polymerase Chain Reaction), pozwalającej na wykrycie różnych czynników patogennnych. Techniki te są wykorzystywane do wykrywania wielu bakterii, m.in.: Yersinia enterocolitica, Campylobacter sp., Listeria sp., Listeria monocytogenes, Esherichia coli oraz Salmonella sp., w różnych produktach żywnościowych. Otrzymany wynik jest obiektywny, ponieważ w testach wykorzystywana jest znajomość stałej struktury DNA sekwencji określonych nukleotydów, niezależnej od stanu fizjologicznego organizmu [Nissen i Sloots 2002, Atkins i Clark 2004]. Wykrywane są obecne wszystkie cząsteczki DNA, bez różnicowania żywych i martwych komórek. Martwe komórki bakterii nie odgrywają istotnej roli, mogą świadczyć tylko o skuteczności środków dezynfekcji [Malorny i in. 2008]. Startery o bardzo wysokiej specyficzności konstruowane są na podstawie fragmentów genów odpowiedzialnych za kodowanie cząsteczek RNA rybosomowego (rdna): 18S rdna, 28S rdna i 5.8S rdna. Wykorzystywane są także sekwencje nukleotydowe genów fima, inva charakterystycznych dla Salmonella sp. [Malorny i in. 2003, Naravaneni i Jamil 2005]. Nowoczesną generacją analiz opartych na reakcji PCR są analizy z zastosowaniem reakcji Real-Time PCR [Atkins i Clark 2004]. Wykazano, iż jest to metoda pozwalająca na wykrycie bakterii Salmonella, bez potrzeby uzyskania czystej kultury [Day i in. 2009]. Zastosowanie techniki PCR bazuje na wykryciu odpowiednich sekwencji nukleotydowych w genomie. Otrzymany wynik jest obiektywny, opiera się na stałej strukturze DNA, niezależnej od stanu fizjologicznego organizmu [Nissen i Sloots 2002, Atkins Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

6 Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 5 i Clark 2004]. Do identyfikacji bakterii konstruowane są specyficzne startery, najczęściej na podstawie fragmentów genów odpowiedzialnych za kodowanie cząsteczek RNA rybosomowego (rdna): 18S rdna, 28S rdna i 5.8S rdna. W analizach wykorzystuje się również sekwencje nukleotydowe genów fima, inva, charakterystycznych dla Salmonella sp. [Malorny i in. 2003, Naravaneni i Jamil 2005]. Większość metod molekularnych bazuje na metodzie PCR (Polymerase Chain Reaction), wynalezionej przez Kary Mullis w 1993 roku. Metoda ta pozwala na amplifikację DNA i składa się z trzech etapów: rozpadu podwójnej helisy DNA, przyłączenia starterów i dobudowywania nowej nici z wykorzystaniem enzymu polimerazy Taq. Po cyklach reakcji PCR powstaje kilka miliardów kopii cząsteczki DNA, a produkty zwykle analizowane są poprzez ich rozdział na żelu agarozowym, po wybarwieniu żelu bromkiem etydyny. Ważnym wydarzeniem stało się opracowanie przez Higuchi i współpracowników w 1992 roku metody łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (Real-time PCR), pozwalającej na analizę ilości produktu w każdym cyklu reakcji [Wyska i Rosiak 2006]. W technice Real-time PCR, dzięki przeprowadzaniu jednocześnie amplifikacji i detekcji, zmniejsza się możliwość kontaminacji. Na reakcję Real-time PCR składają się następujące etapy: faza wykładnicza, faza liniowa i faza plateau [Wyska i Rosiak 2006]. W początkowej fazie reakcji ilość produktu jest niewielka, a sygnał fluorescencji jest maskowany przez tło. Cykl, w którym natężenie fluorescencji przewyższa wartość tła (wartość progową threshold), jest podstawą obliczeń początkowej ilości matrycy i jest określany jako Ct [Wyska i Rosiak 2006]. Ct jest proporcjonalny do wyjściowej ilości kopii DNA. Wyczerpanie składników mieszaniny reakcji, konkurencja starterów i produktów o matrycę i spadek aktywności polimerazy, powodują spowolnienie szybkości reakcji i w konsekwencji osiąga ona fazę plateau, w której nie obserwuje się zmian natężenia fluorescencji. Zwykle ilość matrycy w ostatniej fazie jest zbliżona do początkowej ilości matrycy, stąd też ilość produktu oznacza się w fazie wykładniczej [Wyska i Rosiak 2006, Wiedro i Stachowska 2007]. Dotychczas wykazano, iż metoda ta pozwala wykryć nawet niewielką ilość bakterii Salmonella, bez potrzeby uzyskania w badaniach czystej kultury [Fricker i in. 2007, Day i in. 2009]. Technika Real-time PCR pozwala na skrócenie czasu hodowli badanej próbki, w zależności od zastosowanych zestawów pozwalających na wykrycie bakterii. Są one jedno- lub dwuetapowe. Jednoetapowe polegają na przeniesieniu próbki żywności do buforu lizującego, w którym następuje od razu etap uwolnienia DNA bakteryjnego, a dwuetapowe na pobraniu próbki żywności, a następnie krótkim namnożeniu kultury, po czym następuje izolacja DNA. Im krótszy jest czas hodowli, tym szybciej można przejść do ekstrakcji DNA i analizy molekularnej [Malorny i in. 2008]. Zaletą techniki Real-Time jest prostota, specyficzność i duża wrażliwość, co umożliwia wykrycie nawet pojedynczej cząsteczki DNA, a tym samym pozwala na szybką identyfikację próbki żywności [Naravaneni i Jamil 2005 i Reynisson i in. 2006]. W przypadku klasycznej metodyki, zgodnej z normą PN-EN 6579:2003, czas potrzebny na przeprowadzenie pełnej analizy wymaga aż 7 dni. Uzyskany wynik obarczony jest subiektywną oceną analityka i zmiennością cech fizjologicznych ocenianych w testach biochemicznych. Szybkie techniki identyfikacji patogenów występujących w żywności, które bazują na analizie struktury DNA, stanowią jedne z najważniejszych rozwiązań technicznych w mikrobiologii molekularnej. Techniki PCR pozwalają na znaczne skrócenie nr 573, 2013

7 6 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz czasu wykrycia bakterii z rodzaju Salmonella. Całkowity czas analizy wraz z etapami nieselektywnego namnożenia i izolacji DNA mieści się w 24 h. Real-Time PCR oraz klasyczny PCR są technikami czulszymi niż metody tradycyjne [Malorny i in. 2008]. Celem przeprowadzonych badań było wykrycie bakterii Salmonella sp. z wykorzystaniem techniki Real-Time PCR w różnych matrycach żywnościowych, potwierdzenie wyników przez zastosowanie klasycznej reakcji PCR oraz sprawdzenie wpływu izolacji DNA na końcowy wynik analizy Real-Time PCR. MATERIAŁ I METODY Materiałem były szczepy: Salmonella enterica serowar Enterica KKP 1193, Salmonella sp. KKP 1169, Salmonella sp. KKP 1611, Salmonella enterica serowar Gaminara KKP Wszystkie szczepy w badaniach pochodziły z Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych IBPRS [KKP, Podłożem stosowanym do namnożenia próbek zakażonych patogenami była zbuforowana woda peptonowa (BioMerieux). Reakcję amplifikacji prowadzono z parą specyficznych starterów Sal465L i Sal142F. Do Real-Time PCR zastosowano zestaw komercyjny Salmonella spp. Identification STRIP KitTM Manual for Rotorgene firmy Biolytix AG. W badaniach były zastosowane dwa protokoły izolacji DNA: 1. Szybka metoda izolacji DNA. Po odpowiednim czasie hodowli pobierano 300 μl zawiesiny komórek. Następnie próbki były ogrzewane w temperaturze 99 C przez 15 min, stosowano klasyczny sposób izolacji DNA metodą gotowania. Źródłem DNA jest otrzymany supernatant. 2. Metoda izolacji za pomocą zestawu komercyjnego GeneMatrix (EUR x ). Próbki rozdrabniono, poddawano lizie w buforze Res FE i Lyse FE w celu rozpuszczenia struktur tkankowych i komórkowych. Do uzyskanego materiału dodawano proteinazę K w celu degradacji białek komórkowych, białek wiążących DNA i nukleaz. Postępowano zgodnie z metodyką producenta. Czystość i jakość wyizolowanego DNA sprawdzano na spektrofotometrze NanoDrop. Amplifikacja DNA: 1. Tradycyjny PCR. Reakcje PCR przeprowadzono w objętości 25 μl, zawierającej w odpowiednich ilościach: 2,5 μl każdego ze starterów, o stężeniu 2 μm, 13 μl H 2 O; 2,5 μl dntps, każdy o stężeniu 2,5 μm, 2,5 μl buforu Run 10-razy stężonego, 1 U 1 μl polimerazy Run (A&ABiotechnology), 1 μl badanego DNA. Amplifikację wykonano z wykorzystaniem termocyklera (Termocykler Px2 Thermo Electron). Profil temperaturowy reakcji: 94 C 4 min; [94 C 30 s, 60 C 30 s, 72 C 40 s] przez 20 cykli; następnie 15 cykli [94 C 30 s, 63 C 30 s, 72 C 40 s]; 62 C 20 min. 2. Real-Time PCR. Do reakcji Real-Time PCR wykorzystano Salmonella spp. Identification STRIP-Kit TM Manual for Rotorgene firmy Biolytix AG. Kontrola pozytywna zawierała DNA Salmonella, o takim samym stężeniu w każdej próbce, w kontroli negatywnej DNA zastąpiono wodą. Objętość końcowa próbki do reakcji Real-Time PCR wynosiła 20 μl, w tym 5 μl DNA po izolacji DNA. Profil temperaturowy reakcji amplifikacji: 50 C 2 min; 95 C 10 min; [95 C 15 s, 60 C 60 s] x 50. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

8 Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 7 Jako matryce żywnościowe zastosowano produkty płynne (mleko, woda) i produkty stałe (serek, ciasto, kiełbasa, czekolada). Zakażone próbki żywności przetrzymano przez 18 godzin w temperaturze 37 C. Po tym czasie pobierano z każdej próbki 300 μl próbki do izolacji DNA. Kolejne pobrania próbek do badań odbywały się po 2, 4, 6, 8, i 18 godzinach hodowli. Do czasu izolacji próbki zamrażano. WYNIKI I DYSKUSJA Uzyskane wyniki czystości (1,45 do 2,09) i ilości DNA (od 16,59 ng μl 1 do 61,10 ng μl 1 ) z różnych matryc wskazują na prawidłowo przeprowadzoną izolację. Próbki serka homogenizowanego zakażono bakteriami: Salmonella enterica serowar Enterica KKP 1193 i Klebsiella pneumoniae KKP 1586, która pełniła rolę kontroli negatywnej. DNA uzyskane z obu rodzajów izolacji zastosowano do reakcji PCR w czasie rzeczywistym. W obu przypadkach uzyskano właściwy produkt amplifikacji. Przy stosowaniu DNA z bakterii Klebsiella pneumoniae zaobserwowano produkt amplifikacji DNA na poziomie kontroli negatywnej. Na rysunkach 1 i 2 przedstawiono wyniki uzyskane po reakcji molekularnej. W każdej zakażonej próbce żywności wykryto z wykorzystaniem metody Real-time PCR bakterie z rodzaju Salmonella. Następnie dokonano analizy obecności DNA Salmonella w zakażonych próbkach metodą klasycznego PCR. W każdej pobranej do analizy zakażonej próbce stwierdzono obecność bakterii z rodzaju Salmonella sp. Wyniki uzyskane w wyniku klasycznej reakcji PCR były zgodne z wynikami uzyskanymi w reakcji Real-Time PCR. Wyniki otrzymany metodą Real-Time PCR uzyskano znacznie szybciej niż w klasycznej reakcji PCR, nie wymagały one bowiem rozdziału elektroforetycznego. Rys. 1. Fig. 1. Analiza próbek żywności zakażonych bakteriami Salmonella sp.: KP kontrola pozytywna, KN kontrola negatywna Analysis of food samples contaminated of Salmonella sp.: KP positive control, KN negative control nr 573, 2013

9 8 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz Rys. 2. Fig. 2. Analiza próbek żywności zakażonych bakteriami Klebsiella pneumoniae Analysis of food samples contaminated of Klebsiella pneumoniae 400pz 300pz Rys. 3. Fig. 3. Wynik analizy otrzymany w reakcji PCR ze starterami Sal465L i Sal142F. Produkty reakcji o wielkości 343 pz: 1 6 próbki żywności zakażone bakteriami Salmonella sp., 7 kontrola pozytywna, 8 kontrola negatywna, M Gene Ruler DNA Ladder, Low Range Fermentas Result of PCR analysis using Sal465L and Sal142F starter. Reaction product of 343 bp: 1 6 food samples Salmonella sp. contaminated, 7 positive control, 8 negative control, M Gene Ruler DNA Ladder, Low Range Fermentas Day i inmi [2009] w swoich badaniach wykazali, iż Real-Time PCR jest skutecznym narzędziem do identyfikacji Salmonella enterica serowar Enteritidis z surowych i niedogotowanych jaj. W produktach tych znajduje się wiele związków, które mogą powodować inhibicję reakcji molekularnej, dlatego wykorzystali oni zmodyfikowaną procedurę, wykorzystując Real-Time PCR. Arrach i inni [2008] zastosowali technikę Real-Time PCR do identyfikacji różnych genotypów w obrębie jednego serowaru bakterii Salmonella. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

10 Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi... 9 Technika Real-Time PCR znalazła zastosowanie w badaniach epidemiologicznych. Przypadek taki miał miejsce w USA w Teksasie w 2002 roku, gdzie odnotowano ponad 100 pacjentów zakażonych bakteriami Salmonella [Daum i in. 2002]. Malorny i inni [2004] w analizach Real-Time PCR wykryli wszystkie ze 110 badanych szczepów Salmonella, dodatkowo sprawdzili selektywność metody dla 87 szczepów bakterii towarzyszących bakterii Salmonella sp. Specyficzność i selektywność metody określono na 100%. W niniejszej pracy porównano Real-Time PCR i klasyczny PCR pod względem czasu analiz i trudności w interpretacji wyników. Analizy wykazały obecność bakterii dla obydwu technik we wszystkich próbach zakażonych bakteriami z rodzaju Salmonella, jednakże wyniki uzyskane Real-Time PCR były bardziej czytelne. Przykładowo Molarny i inni [2003] w swoich badaniach wykorzystali klasyczny PCR do identyfikacji genu inva, który jest genem typowym dla większości bakterii Salmonella. W niniejszej pracy zastosowano startery bazujące na stabilnych fragmentach genomu bakterii Salmonella. WNIOSKI 1. Metoda identyfikacji z wykorzystaniem Real-Time PCR jest skutecznym narzędziem do identyfikacji bakterii z różnych matryc żywnościowych. 2. Potwierdzono, że zastosowanie techniki PCR i Real-Time PCR pozwala na skrócenie czasu wykrycia bakterii Salmonella sp. w żywności w porównaniu z metodami klasycznymi. 3. Zastosowane w analizach różne metody izolacji nie wpłynęły na identyfikację metodą Real-Time PCR. 4. Metoda Real-Time PCR pozwala na uzyskanie graficznych, łatwych w interpretacji wyników, nie wymaga rozdziału elektroforetycznego. LITERATURA Arrach N., Porwollik S., Cheng P., Cho A., Long F., Choi A., McClelland M., Salmonella serovar identification using PCR-based detection of gene presence and absence. J. Clin. Microbiol. 46 (8), Atkins S.D., Clark I.M., Fungal molecular diadnostics: a mini revive. J. Appl. Genet. 45 (1): Blais B.W., Martinez-Perez A., Detection of group D salmonellae including Salmonella Enteritidis in eggs by polymyxin-based enzyme-linked immunoabsorbent assay. J. Food Prot. 71, Boughton C., Egan J., Kelly G., Markey B., Leonard N., Quantitative examination of Salmonella spp. in the lairage environment of a pig abattoir. Foodborne Pathog. Dis. 4, Coyle E.F., Palmer S.R., Ribeiro C.D., Jones H.I., Howard A.J., Ward L., Rowe B., Salmonella enteritidis phage type 4 infection: association with hen s eggs. Lancet. Dec. 3, 2 (8623), nr 573, 2013

11 10 A. Misiewicz, A. Goncerzewicz D Aoust J.Y., Psychrotrophy and foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 13, Daum L.T., Barnes W.J., McAvin J.C., Neidert M.S., Cooper L.A., Huff W.B., Daul L., Riggins W.S., Morris S., Salmen A., Lohman K.L., Real-Time PCR detection of Salmonella in suspect foods from a gastroenteritis outbreak in Kerr Country, Texas. J. Clin Microbiol. 40 (8), Day J.B., Basavanna U., Sharma S.K., Development of a cell culture method to isolate and enrich Salmonella enterica serotype Enteritidis from shell eggs for subsequent detection by Real-Time PCR. Appl. Environ. Microbiol. 75 (16), Fegan N., Vanderlinde P., Higgs G., Desmarchelier P., Quantification and prevalence of Salmonella in beef cattle presenting at slaugher. J. Appl. Microbiol. 97, Fricker M., Messelhausser U., Busch U., Scherer S., Ehling-Schulz M., Diagnostic real-time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food- -borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, Malorny B., Hoorfar J., Bunge C., Helmuth R., Multicenter validation of the analytical accuracy of Salmonella PCR: towards and international standard. Appl. Environ. Microbiol. 69 (1), Malorny B., Paccassoni E., Fach P., Bunge C., Martin A., Helmuth R., Diagnostic Real- -Time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70 (12), Malorny B., Löfström C., Wagner M., Krämer N., Hoorfar J., Minireviews: Enumeration of Salmonella bacteria in food and feed samples by Real-Time PCR for quantitative microbial risk assessment. Appl. Environ. Microbiol. 74 (5), Misiewicz A., Goncerzewicz A., Suchorzyńska M., Rapid molecular methods for the identification Salmonella sp. in food. poster. Konferencja Naukowa BioMillenium, Politechnika Gdańska, Naravaneni R., Jamil K., Rapid detection of food-borne pathogens by using molecular techniques. J. Med. Microbiol., 54, Nissen M.D., Sloots T.P., Rapid diagnosis in pediatric infectious diseases: the past, the present and the future. Pediatr. Infect. Dis. J. 21, Pindar K., Cook A., Pollari F., Ravel A., Lee S., Odumeru A.J., Quantitative effect of refrigerated storage time on the enumeration of Campylobacter, Listeria, and Salmonella on artificially inoculated raw chicken meat. J. Food Prot. 70, PN-EN ISO 6579:2003/A1:2007 Mikrobiologia żywności i pasz. Horyzontalna metoda wykrywania Salmonella spp. Rozporządzenie (WE) nr 853/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. Dz. Urz. UE L 139/55. Seo K.H., Valentin-Bon I.E., Bracket R.E., Holt P.S., Rapid specific detection of Salmonella enteritidis in pooled eggs by real-time PCR. J. Food Prot. 67, Stephens N., Sault C., Firestone S.M., Lightfoot D., Bell C., Large outbreaks of Salmonella Typhimurium phage type 135 infections associated with the consumption of products cointaining raw egg in Tasmania. Commun. Dis. Intell. 31, Swaminathan B., Feng P Rapid detection of food-borne pathogenic bacteria. An. Rev. Microbiol. 48, Wiedro K., Stachowska E., Chlubeko D., Łańcuchowa reakcja polimerazy z analizą w czasie rzeczywistym (RT-PCR). Roczniki Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie 53, 3, 5 9. Wyska E., Rosiak M., Zastosowanie łańcuchowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (real-time PCR) w badaniach farmakokinetycznych. Postępy Hig. Med. Dośw. 60, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

12 Wykrywanie bakterii Salmonella metodami molekularnymi DETECTION OF SALMONELLA SP. IN FOOD USING MOLECULAR METHODS Summary. Pathogenic bacteria of Salmonella genus are the most common infections in food industry. They might to contaminate wide range of products, protein food e.g. meat, milk food, eggs and egg foods, plants and its preserves, fodder and feeds. Detection and identification of Salmonella sp. are made using traditional methods corresponding with standard PN-EN 6579:2003. That method is commonly used in the microbiological laboratories its time consuming and laborious analysis. Using a modern molecular biology techniques allow to confirm the Salmonella infections in 24-hours with enrichment and isolation steps. In our study were used Real-Time PCR and traditional PCR techniques to detect Salmonella pathogens from various foods. In addition we checked time of molecular analysis. In the study was used commercial kit to Real-Time PCR analysis and primer set Sal465L, Sal142F with are based on characteristic and solid genomic fragments of Salmonella genus. In every experiment we got positive results for food contaminated by Salmonella. The results were obtained in hours. Key words: identification, PCR, Real-Time PCR, Salmonella sp. nr 573, 2013

13

14 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 573, 2013, ZASTOSOWANIE POMIARÓW GĘSTOŚCI DO OCENY PODSTAWOWEGO SKŁADU CHEMICZNEGO MODELOWYCH UKŁADÓW MIĘSNO-TŁUSZCZOWYCH Lech Adamczak, Marta Chmiel, Tomasz Florowski, Dorota Pietrzak Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Streszczenie. Celem niniejszej pracy była ocena możliwości wykorzystania technicznych pomiarów gęstości do szacowania składu chemicznego mięsa. Mieszaniny modelowe uzyskiwano przez wymieszanie rozdrobnionego chudego mięsa wieprzowego (mięsień najdłuższy) z tłuszczem (słonina). Analizowano mieszaniny o różnym stopniu rozdrobnienia 10, 4 i 2 mm. W poszczególnych układach wymieniano 10% mięsa na składnik tłuszczowy, uzyskując, poza próbkami mięsa i tłuszczu, 9 mieszanin (o stosunku wagowym mięso/ /tłuszcz odpowiednio 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20 i 90/10). Gęstość wyznaczano, dokonując pomiaru masy układu mięsno-tłuszczowego przy znanej jego objętości, którą wyznaczano, umieszczając mieszaniny w 3 różnych rurach pomiarowych o znanej objętości. Wyznaczoną gęstość korelowano z wynikami oznaczeń analitycznych podstawowego składu chemicznego. Wartość uzyskanych współczynników korelacji zależała od stopnia rozdrobnienia układu mięsno-tłuszczowego. W przypadku mniejszych cząstek (2 i 4 mm) uzyskiwano wyższe (w wartości bezwzględnej) współczynniki korelacji (maksymalnie 0,9958 i 0,993) niż przy rozdrobnieniu 10 mm (maksymalnie 0,9814). Badania na układzie modelowym pozwoliły na stwierdzenie, że pomiary techniczne gęstości są metodą o zadowalającej dokładności w szacowaniu składu chemicznego mięsa. Słowa kluczowe: mięso, tłuszcz, gęstość, skład chemiczny WSTĘP Ważnym problemem krajowego przemysłu mięsnego jest znaczne zróżnicowanie składu chemicznego surowca, głównie zawartości tłuszczu. Brak możliwości dokładnej standaryzacji surowca stwarza problemy technologiczne, jak również odgrywa istotną rolę w aspekcie ekonomicznym i prawnym produkcji, związanym na przykład z deklara- Adres do korespondencji Corresponding author: Lech Adamczak, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Nauk o Żywności, Zakład Technologii Mięsa, ul Nowoursynowska 159c, Warszawa, lech_adamczak@sggw.pl

15 14 L. Adamczak, M. Chmiel, T. Florowski, D. Pietrzak cją zawartości mięsa w produktach mięsnych (zgodnie z Dyrektywą Komisji 2001/101/ WE i wprowadzającym ją Rozporządzeniem Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia r.) oraz z wkrótce wymaganą deklaracją wartości odżywczej przetworów mięsnych (od r. zgodnie z Rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności). Z tych powodów znajomość zawartości podstawowych składników chemicznych mięsa powinna stanowić jeden z elementów ścisłej kontroli. W większości zakładów mięsnych, w przypadku drobnego mięsa przerobowego, klasyfikacja pod względem zawartości tłuszczu opiera się na wizualnej ocenie przeprowadzanej przez pracownika w linii rozbioru i wykrawania. Ocena ta jest jednakże subiektywna i często bardzo niedokładna. Jedynie duże zakłady mięsne, posiadające własne laboratoria przyzakładowe, dokonują oceny składu chemicznego mięsa na podstawie standardowych, odwoławczych metod analiz. Do metod tych należą: metoda Soxhleta [PN-ISO 1444:2000] lub Gerbera (metoda techniczna) do oznaczenia zawartości tłuszczu w mięsie oraz metoda Kjeldahla do oznaczenia zawartość białka [PN-A-04018:1975/ /Az3:2002]. Aby analitycznie oznaczyć zawartość wody, stosuje się metodę suszenia według zmodyfikowanej normy PN-ISO 1442:2000. Wymienione standardowe metody są pracochłonne, drogie i praktycznie niemożliwe do zastosowania on line [Prieto i in. 2009]. Ich wadą jest także konieczność pobrania reprezentatywnej próbki z partii produkcyjnej i jej destrukcja w trakcie badania. Coraz częściej w praktyce przemysłowej stosowane są nowoczesne metody oceny składu chemicznego mięsa i produktów mięsnych przy użyciu prostych, mało pracochłonnych metod pomiarowych, wykorzystujących bliską podczerwień (NIR) czy też promieniowanie rentgenowskie (X-ray, DXR). Część z tych rozwiązań wykorzystywana jest w systemach on-line do oznaczania zawartości tłuszczu, bezpośrednio w linii rozbioru i wykrawania (X-ray, DXR). W przypadku zastosowania bliskiej podczerwieni (NIR) wymagane jest niestety pobranie reprezentatywnej próbki oraz jej rozdrobnienie, a także stworzenie obszernej bazy danych potrzebnej w kalibracji urządzeń. Wadą tych rozwiązań jest również bardzo wysoki koszt urządzeń (od do nawet zł, związany głównie ze stworzeniem rozbudowanej bazy danych), co ogranicza ich dostępność, ze względów ekonomicznych, dla zakładów o małej lub średniej wielkości produkcji. Z danych literaturowych wynika, że skład chemiczny mięsa (szczególnie zawartość wody i tłuszczu) jest ściśle skorelowany z jego gęstością [Ginzburg in. 1990, Niesteruk 1996]. Może być ona obliczana z zastosowaniem reguły addytywności. Przy założeniu, że składa się ono z wody, białek, tłuszczu i popiołu, gęstość mięsa można wyrazić wzorem: ρ = wρ w + bρ b + tρ t + pρ p gdzie: w, b, t, p ułamki masowe odpowiednio: wody, białka, tłuszczu, popiołu, ρ w, ρ b, ρ t, ρ p gęstość odpowiednio: wody, białka, tłuszczu, popiołu. Wydaje się, że możliwe jest wykorzystanie tej zależności w praktyce przemysłowej. Stosowane dotychczas metody wyznaczania gęstości mięsa powodowały konieczność zanurzania próbek w płynie/wodzie (metoda hydrostatyczna), co powodowało chłonięcie Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

16 Zastosowanie pomiarów gęstości do oceny podstawowego składu chemicznego przez nie wody lub zniszczenie próbki w przypadku stosowania toluenu, jako cieczy odniesienia. Z tych względów nie mogą być one zastosowane w warunkach przemysłowych. Zastosowanie piknometru gazowego jest również trudne do wykorzystania w praktyce przemysłowej ze względu na ograniczenie wielkości próbki, znaczny koszt urządzenia oraz długotrwałość procedury pomiarowej. Do oznaczania gęstości mięsa możliwe wydaje się zatem wykorzystanie metody piknometrycznej, czyli zastosowanie piknometrów naczyń o różnych kształtach i znanej objętości. Celem niniejszych badań była próba oceny możliwości wykorzystania pomiarów gęstości do oszacowania podstawowego składu chemicznego modelowej mieszaniny mięsno-tłuszczowej. MATERIAŁ I METODY Badania wykonano w Zakładzie Technologii Mięsa Katedry Technologii Żywności SGGW w Warszawie. Materiał do badań stanowił mięsień najdłuższy grzbietu (stanowiący składnik mięsny w układzie) oraz podskórna okrywa tłuszczowa (słonina, stanowiąca składnik tłuszczowy). Surowiec niezbędny do realizacji części eksperymentalnej został zakupiony jednorazowo w sieci hipermarketów Makro Cash & Carry. Surowiec mięsny i tłuszczowy rozdrabniano za pomocą wilka laboratoryjnego zaopatrzonego w sito o średnicy oczek 10 mm. Próbki do badań przygotowywano poprzez wymieszanie surowca mięsnego z tłuszczowym, przy czym udział poszczególnych składników zmieniał się w każdym modelowym układzie o 10%, uzyskując 9 mieszanin (o stosunku wagowym mięso/tłuszcz odpowiednio 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20 i 90/10). Dodatkowo badaniom poddano próbki zawierające tylko surowiec mięsny oraz tylko surowiec tłuszczowy. Łącznie przebadano 11 próbek. Próbki przygotowano jednorazowo. Do pomiarów gęstości mięsa posłużyły rury badawcze o zróżnicowanej średnicy i zbliżonej wysokości, a więc zróżnicowanej także objętości. Zestawienie przyrządów pomiarowych przedstawiono w tabeli 1. Tabela 1. Charakterystyka przyrządów pomiarowych służących do wyznaczania gęstości Table 1. Characteristics of measuring instruments used to determine the density Nr rury badawczej Number of test tubes Średnica [cm] Diameter Wysokość [cm] Height Objętość [cmł] Volume 1 2,75 9,84 58,44 2 3,5 9,85 94,76 3 4,6 9,9 164,52 Próbki przed pomiarami odpowietrzano, umieszczając materiał we wnętrzu zamykarki próżniowej i kilkakrotnie obniżając ciśnienie do około 25 hpa. Rury pomiarowe napełniano materiałem badawczym, ustawiając je na płytce szklanej. Napełnianie przeprowadzano niewielkim porcjami materiału w celu uniknięcia powstania wolnych przestrzeni. Górną powierzchnię wyrównywano również za pomocą płytki szklanej. Napełnione rury nr 573, 2013

17 16 L. Adamczak, M. Chmiel, T. Florowski, D. Pietrzak pomiarowe ważono na wadze analitycznej, a za wynik przyjmowano średnią z pięciu pomiarów. Uzyskaną masę próbki dzielono przez jej objętość, uzyskując w ten sposób gęstość mieszaniny mięsno-tłuszczowej. Podczas badań kontrolowano temperaturę materiału przechowywanego w warunkach chłodniczych (4 ±2 C). Po wyznaczeniu gęstości próbek o rozdrobnieniu Ø 10 mm rozdrobniono je po raz drugi w wilku laboratoryjnym przy użyciu sita o średnicy oczek 4 mm. Powtarzano następnie czynności związane z wyznaczaniem gęstości układu mięsno-tłuszczowego przy dalszym rozdrobnieniu. Po zakończeniu tego etapu pomiaru gęstości próbki rozdrobniono w wilku z sitem o średnicy oczek 2 mm i powtórzono procedurę badawczą. W celu określenia korelacji między gęstością a składem chemicznym próbek metodami odwoławczymi oznaczono zawartość wody [PN-ISO 1442: 2000], zawartość białka [PN-75/A-04018] oraz zawartość tłuszczu [PN-ISO 1444: 2000]. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej z wykorzystaniem programu Statgraphics 4.1, wyznaczając współczynniki korelacji i równania regresji prostoliniowej. WYNIKI I DYSKUSJA Wraz ze zmniejszeniem się udziału mięsa w próbce zmniejszała się zawartość wody od początkowych 72,9% do 12,6%. Dodatek do układu składnika tłuszczowego spowodował zwiększenie się zawartości tłuszczu od 7,4% w próbce składającej się tylko z mięsa do 83,7% w próbce, którą stanowiła słonina. Wraz ze zmniejszaniem się udziału składnika mięsnego w mieszaninie zmniejszała się zawartość białka z 19,6 do 4,9% (rys. 1). Zawartość składnika [%] Content of component ,9 7,4 14,8 66,4 białko protein tłuszcz fat woda water 60,1 54,5 48,5 43,2 37,5 28,6 22,3 21,5 29,5 36,7 42,2 51,9 60,0 67,9 17,1 75,3 12,7 83,7 Rys. 1. Fig ,6 18,6 17,6 15,4 14,6 13,7 0/100 10/90 20/80 30/70 40/60 50/50 60/40 70/30 80/20 90/10 100/0 Udział składnika tłuszczowego / udział składnika mięsnego [%] Fat component part / meat component part 11,6 10,5 Skład chemiczny próbek układu mięsno-tłuszczowego The chemical composition of samples of the meat-fat system 9,0 7,6 4,9 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

18 Zastosowanie pomiarów gęstości do oceny podstawowego składu chemicznego W przypadku korelacji zaobserwowanych przy 10-milimetrowym rozdrobnieniu układu stwierdzono istotność jej współczynników między gęstością wyznaczoną za pomocą wszystkich rur pomiarowych a zawartością wszystkich podstawowych składników chemicznych (tab. 2). Zastosowanie rury pomiarowej o największej objętości pozwoliło na uzyskanie wyższych (w wartości bezwzględnej) i istotnych statystycznie współczynników korelacji. Tabela 2. Analiza statystyczna korelacji między gęstością a podstawowym składem chemicznym modelowego układu mięsno-tłuszczowego o rozdrobnieniu Ø 10 mm Table 2. The statistical analysis of correlation between the density and content of basic chemical compounds of model meat-fat system, grinding Ø 10 mm Gęstość Density Wyszczególnienie Specification Nr rury badawczej Number of test tubes 1 a 2 a 3 a p-value 0,0012 0,0000 0,0000 Woda Water Tłuszcz Fat Białko Protein wsp. korelacji cor. coefficient wzór regression model 0,8403 0,9283 0,9814 woda = 303, ,30 ρ 1 woda = 518, ,22 ρ 2 woda = 495, ,31 ρ 3 p-value 0,0011 0,0000 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,8422 0,9276 0,9763 wzór regression model tłuszcz = 475,46 tłuszcz = 740,57 tłuszcz = 709,07 330,57 ρ 1 548,13 ρ 2 566,85 ρ 3 p-value 0,0010 0,0001 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,8462 0,9178 0,9651 wzór regression model białko = 67,84 + białko = 115,61 + białko = 109, ,05 ρ ,31 ρ ,68 ρ 3 a Objętość przyrządów pomiarowych: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3. Volume of measuring instruments: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3. Rozdrobnienie analizowanych modelowych mieszanin mięsno-tłuszczowych z zastosowaniem sita o rozmiarze oczek Ø 4 mm spowodowało, że otrzymane współczynniki korelacji były istotne statystycznie i wyższe niż współczynniki stwierdzone w przypadku zastosowania rozdrobnienia o większych wymiarach cząstek. Zależność tę zaobserwowano dla wszystkich składników chemicznych i stosowanych przyrządów pomiarowych (tab. 3). W przypadku tego stopnia rozdrobnienia nie można jednoznacznie wskazać objętości rury badawczej, która pozwala na osiągnięcie najwyższych (w wartości bezwzględnej) współczynników korelacji. Również przy 2-milimetrowym rozdrobnieniu modelowych układów mięsno-tłuszczowych stwierdzono istotność wszystkich współczynników korelacji wyznaczonych między gęstością a zawartością wody, białka i tłuszczu (tab. 4). Wartość bezwzględna otrzymanych współczynników korelacji była większa niż wyznaczona przy 10-milimetrowym rozdrobnieniu cząstek. nr 573, 2013

19 Tabela 3. Analiza statystyczna korelacji między gęstością a podstawowym składem chemicznym modelowego układu mięsno-tłuszczowego o rozdrobnieniu Ø 4 mm Table 3. The statistical analysis of correlation between the density and content of basic chemical compounds of model meat-fat system, grinding Ø 4 mm Gęstość Density Wyszczególnienie Specification Nr rury badawczej Number of test tubes 1 a 2 a 3 a p-value 0,0000 0,0000 0,0000 Woda Water Tłuszcz Fat Białko Protein wsp. korelacji cor. coefficient 0,9963 0,9861 0,9896 wzór regression model woda = 297, ,97 ρ 1 woda = 437, ,507 ρ 1 woda = 413, ,66 ρ 3 p-value 0,0000 0,0000 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,9935 0,9824 0,9905 wzór regression model tłuszcz = 466,08 328,51 ρ 1 tłuszcz = 638,53 476,26 ρ 2 tłuszcz = 611,31 489,88 ρ 3 p-value 0,0000 0,0000 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,9824 0,9735 0,9862 wzór regression model białko = 64,82 + białko = 96,91 + białko = 92, ,68 ρ ,1609 ρ ,10 ρ 3 a Objętość przyrządów pomiarowych: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3. Volume of measuring instruments: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3. Tabela 4. Analiza statystyczna korelacji między gęstością a podstawowym składem chemicznym modelowego układu mięsno-tłuszczowego o rozdrobnieniu Ø 2 mm Table 4. The statistical analysis of correlation between the density and content of basic chemical compounds of model meat-fat system, grinding Ø 2 mm Gęstość Density Wyszczególnienie Specification Nr rury badawczej Number of test tubes 1 a 2 a 3 a p-value 0,0000 0,0000 0,0000 Woda Water Tłuszcz Fat Białko Protein wsp. korelacji cor. coefficient 0,9958 0,9879 0,9952 wzór regression model woda = 300, ,84 ρ 1 woda = 436, ,91 ρ 2 woda = 412, ,081 ρ 3 p-value 0,0000 0,0000 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,9921 0,9841 0,9940 wzór regression model tłuszcz = 468,68 330,53 ρ 1 tłuszcz = 637, ,487 ρ 2 tłuszcz = 609, ,357 ρ 3 p-value 0,0000 0,0000 0,0000 wsp. korelacji cor. coefficient 0,9801 0,9746 0,9878 wzór regression model białko = 65,23 + białko = 96,71 + białko = 91, ,00 ρ ,96 ρ ,85 ρ 3 a Objętość przyrządów pomiarowych: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3. Volume of measuring instruments: 1 58,44 cm 3, 2 94,76 cm 3, 3 164,52 cm 3.

20 Zastosowanie pomiarów gęstości do oceny podstawowego składu chemicznego Różnice w wartościach bezwzględnych współczynników korelacji między pomiarami dla rozdrobnienia 4 i 2 mm są niewielkie, co wskazuje, że zwiększenie stopnia rozdrobnienia w tym przypadku nie skutkuje poprawą siły korelacji (tab. 3 i 4). Marcotte i inni [2008] określili wartość współczynników korelacji między gęstością produktów drobiowych a podstawowym składem chemicznym na zdecydowanie niższym poziomie (zawartość wody 0,53, zawartość tłuszczu 0,39, zawartość białka 0,05). W przypadku tych badań najwyższy współczynnik korelacji (w wartości bezwzględnej) stwierdzono między gęstością a zawartością węglowodanów w analizowanych wyrobach ( 0,83). W badaniach tych autorów podkreślono również wpływ temperatury pomiaru na uzyskiwaną gęstość produktów. W badaniach Zorba i Şükrü [2006] stwierdzono, że gęstość emulsji mięsnej jest uzależniona od wzajemnego udziału w niej wołowiny, wieprzowiny i mięsa drobiowego, z czego można wnioskować o uzależnieniu gęstości mięsa od gatunku zwierzęcia, z którego to mięso pochodzi. Nowoczesną i szybką metodą szacowania jakości i składu chemicznego mięsa jest komputerowa analiza obrazu (KAO). W licznych badaniach stwierdzono możliwość jej zastosowania do oznaczania jedynie zawartości tłuszczu [Dasiewicz i Szymański 2005, Dasiewicz i Mierzwińska 2006, Dasiewicz i in. 2007, 2008, 2010, Chmiel i in. 2011a, b], natomiast wyniki niniejszych badań wskazują na możliwość wykorzystania pomiarów gęstości do szacowania poziomu wszystkich podstawowych składników mięsa. W badaniach nad wykorzystaniem tomografii komputerowej do określenia składu chemicznego szynek peklowanych metodą suchą stwierdzono, iż metoda ta może być wykorzystana do szacowania poziomu zawartości soli i wody (współczynniki determinacji na poziomie 0,80 0,90), natomiast nie jest wystarczająco dokładna do szacowania poziomu tłuszczu w produkcie [Fulladosa i in. 2010]. Przeniesienie badań modelowych na warunki przemysłowe może być trudne ze względu na liczne czynniki warunkujące gęstość mięsa. Podstawowym elementem będzie zachowanie stałej temperatury pomiarów. Dodatkowo należy rozważyć kwestie związane z wpływem żywienia na skład tkanki tłuszczowej, a więc również możliwą zmianę jej gęstości, w zależności od warunków hodowlanych [Smet i in. 2004, Wood i in. 2004, 2008]. WNIOSKI Pomiary we wszystkich zastosowanych rurach badawczych pozwoliły na osiągnięcie istotnych korelacji o wysokich współczynnikach między gęstością a składem chemicznym. Wartość uzyskanych współczynników korelacji zależy od stopnia rozdrobnienia modelowego układu mięsno-tłuszczowego. W przypadku mniejszych cząstek (2 i 4 mm) uzyskiwano wyższe współczynniki korelacji niż przy rozdrobnieniu 10 mm. Badania na układzie modelowym pozwoliły na stwierdzenie, że pomiary techniczne gęstości są metodą o zadowalającej dokładności w szacowaniu składu chemicznego. Wydaje się celowe kontynuowanie badań z wykorzystaniem surowca w warunkach przemysłowych. nr 573, 2013

21 20 L. Adamczak, M. Chmiel, T. Florowski, D. Pietrzak LITERATURA Chmiel M., Słowiński M., Dasiewicz K., 2011a. Application of computer vision systems for estimation of fat content in poultry meat. Food Control 22, Chmiel M., Słowiński M., Dasiewicz K., 2011b. Lightness of the color measured by computer image analysis as a factor for assessing the quality of pork meat. Meat Sci. 88, Dasiewicz K., Szymański P., Optymalizacja warunków szacowania metodą komputerowej analizy obrazu zawartości tłuszczu w drobnym mięsie wieprzowym klasy II. Postępy Techniki Przetwórstwa Spożywczego 2, Dasiewicz K., Mierzwińska I., The use of a computer digital analysis for evaluating the quality of pork trimmings. Acta Sci. Pol. Technol. Aliment. 5 (2), Dasiewicz K., Pisula A., Cegiełka A., The use of computer image analysis for pork trimmings quality evaluation under industrial conditions. Anim. Sci. 1 (Proc.), Dasiewicz K., Pisula A., Słowiński M., Noga A., Zastosowanie komputerowej analizy obrazu do szacowania jakości peklowanego drobnego mięsa wieprzowego klasy II. Żywność. Nauka. Technologia. Jakość 4 (59), Dasiewicz K., Słowiński M., Pisula A., Chmiel M., Wpływ procesu mieszania drobnego mięsa wieprzowego na dokładność szacowania metodą komputerowej analizy obrazu zawartości tłuszczu i wybranych wyróżników jakości technologicznej. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 552, Dyrektywa Komisji 2001/101/WE z dnia r. zmieniająca dyrektywę 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie zbliżenia ustawodawstw Państw Członkowskich odnoszących się do etykietowania, prezentacji i reklamy środków spożywczych. Dz. Urz. UE, L 31 z Fulladosa E., Santos-Garcés E., Picouet P., Gou P., Prediction of salt and water content in dry-cured hams by computed tomography. J. Food Eng. 96, Marcotte M., Taherian A.R., Karimi Y., Thermophysical properties of processed meat and poultry products. J. Food Eng. 88, Ginzburg A.S., Gromow M.A., Krasowskaja G.I., Tiepłofiziczeskije charakteristiki piszczewych produktów. Sprawocznik izdieła 3 dopołoczennoje i piererabotannoje. WO. Agropromizdat, Moskwa. Niesteruk R., Właściwości termofizyczne żywności. Część I. Rozprawy Naukowe nr 33. Wydawnictwo Politechniki Białostockiej, Białystok. PN-A-04018:1975/Az3 Oznaczenie zawartości azotu metodą Kjeldahla i przeliczenie na białko. PN-ISO 1442:2000 Mięso i przetwory mięsne. Oznaczenie zawartości wody. PN-ISO 1444:2000 Mięso i przetwory mięsne. Oznaczenie zawartości tłuszczu wolnego. Prieto N., Ross D.W., Navajas E.A., Nute G.R., Richardson R.I., Hyslop J.J., Simm G., Roehe R., On-line application of visible and near-infrared reflectance spectroscopy to predict chemical, physical and sensory characteristics of beef quality. Meat Sci. 83, Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia r. w sprawie znakowania środków spożywczych. Dz.U. z 2007 r., nr 137, poz Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1169/2011 z dnia r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004. Dz. Urz. UE, L 304/18, z Smet S., Raes K., Demeyer D., Meat fatty acid composition as affected by fatness and genetic factors: a review. Anim. Res. 53, 2, Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych

22 Zastosowanie pomiarów gęstości do oceny podstawowego składu chemicznego Wood J.D., Richardson R.I., Nute G.R., Fisher A.V., Campo M.M., Kasapidou E., Sheard P.R., Enser M., Effects of fatty acids on meat quality: a review. Meat Sci. 66, Wood J.D., Enser M., Fisher A.V., Nute G.R., Sheard P.R., Richardson R.I., Hughes S.J., Whittington F.M., Fat deposition, fatty acid composition and meat quality: A review. Meat Sci. 78, Zorba O., Şükrü K., Optimization of emulsion characteristics of beef, chicken and turkey meat mixtures in model system using mixture design. Meat Sci. 73, THE USE OF THE DENSITY MEASUREMENTS TO EVALUATE THE BASIC CHEMICAL COMPOSITION OF MODEL MEAT-FAT SYSTEMS Summary. The aim of this study was to evaluate the possibility of using the technical density measurements to estimate the chemical composition of meat. The model mixtures were obtained by mixing minced lean pork meat (m. longissimus) with fat (lard). The mixtures with different degree of mincing 10, 4 and 2 mm were analyzed. In particular systems 10% of meat was replaced by fat. Beside samples of meat and fat, 9 mixtures (with weight ratio meat/fat 90/10, 80/20, 70/30, 60/40, 50/50, 60/40, 70/30, 80/20 and 90/10 respectively) were prepared. The density was determined by measuring the weight of meat-fat system with its known volume. The mixtures were placed in 3 test tubes with different known volumes. Obtained density was correlated with the results of basic chemical compounds of meat evaluated by analytical methods. The obtained values of correlation coefficients depended on the degree of mincing of model meat-fat system. For smaller pieces (2 and 4 mm) correlation coefficients (in absolute value) were higher (maximum and 0.993) than 10 mm pieces (maximum ). Studies on the model system had confirmed that the technical density measurements had satisfactory accuracy for the estimation of the chemical composition of meat. Key words: meat, fat tissue, density, basic chemical composition nr 573, 2013

23

24 Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych nr 573, 2013, WPŁYW DODATKU BŁONNIKA NA WŁAŚCIWOŚCI SORPCYJNE OWOCOWYCH NADZIEŃ CUKIERNICZYCH Ewa Gondek, Ewa Jakubczyk, Bogumił Jażdzyk Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Streszczenie. W pracy badano żele wieloowocowe stosowane jako dodatki w produkcji cukierniczej. Celem podjętych badań była próba ograniczenia procesu dyfuzji wody w produkcie. Zmodyfikowano recepturę produktu handlowego, wzbogacając jego skład o dodatek preparatów błonnika różnego pochodzenia. W pracy analizowano właściwości sorpcyjne produktu standardowego oraz próbek z dodatkiem błonnika jabłkowego, marchwiowego i pszennego w warunkach statycznych i dynamicznych. Uzyskano izotermy sorpcji III typu, według klasyfikacji Brunauera i innych [1940]. Proces desorpcji wody w warunkach dynamicznych badano w środowisku o aktywności wody zbliżonej do zera. Uzyskane krzywe kinetyczne opisano równaniem dyfuzji nieustalonej Ficka. Wyznaczono efektywny współczynnik dyfuzji wody oraz wilgotność równowagową przy nieskończenie długim czasie przechowywania produktu. Wykazano, że dodatek preparatów błonnika wpływał na właściwości sorpcyjne badanych produktów, co skutkowało obniżeniem efektywnego współczynnika dyfuzji wody oraz zmianami przebiegu izoterm sorpcji. Słowa kluczowe: sorpcja, nadzienia cukiernicze, błonnik, dyfuzja WSTĘP Współczesne produkty cukiernicze to bardzo często żywność o złożonym i zróżnicowanym składzie, w której sąsiadują ze sobą obszary różniące się zawartością wody i jej aktywnością do tej grupy zaliczamy różnego rodzaju ciastka, batoniki, cukierki i żelki z nadzieniem. Zapewnienie wysokiej jakości tego rodzaju produktom jest trudnym zadaniem, ponieważ zarówno podczas przechowywania produktu gotowego, jak i w fazie jego produkcji między poszczególnymi składnikami zachodzi wymiana masy Adres do korespondencji Corresponding author: Ewa Gondek, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Wydział Nauk o Żywności, Katedra Inżynierii Żywności i Organizacji Produkcji, ul. Nowoursynowska 159c, Warszawa ( ewa_gondek@sggw.pl)