INSTYTUT CHEMII I TECHNIKI JĄDROWEJ INSTITUTE OF NUCLEAR CHEMISTRY AND TECHNOLOGY 32/ 28 WARSZAWA. TEST KOMETOWY W ph OBOJĘTNYM

Transkrypt

1 ISSN PLO INCT--2/B/2000 RAPORTY IChTJ. SERIA B nr 2/2000 TEST KOMETOWY W ph OBOJĘTNYM Maria Wojewódzka, Iwona Grądzka, Iwona Buraczewska INSTYTUT CHEMII I TECHNIKI JĄDROWEJ INSTITUTE OF NUCLEAR CHEMISTRY AND TECHNOLOGY 32/ 28 WARSZAWA

2 PLEASE BE AWARE THAT ALL OF THE MISSING PAGES IN THIS DOCUMENT WERE ORIGINALLY BLANK

3 y. -,<> -> - RAPORTY IChTJ. SERIA B nr 2/2000 TEST KOMETOWY W ph OBOJĘTNYM Maria Wojewódzka, Iwona Grądzka, Iwona Buraczewska Warszawa 2000

4 WYDAWCA Instytut Chemii i Techniki Jądrowej ul. Dorodna 16, Warszawa tel.: (0-22) ; tlx: ichtj pi; fax: (0-22) ; sekdyrn@orange.ichtj.waw.pl Raport został wydany w postaci otrzymanej od Autorów

5 Test kometowy w ph obojętnym Elektroforeza pojedynczych komórek (test kometowy) jest szybką i czułą metodą fluorescencyjną oznaczania uszkodzeń DNA na poziomie pojedynczej komórki. Test kometowy w odczynie obojętnym pozwala na wykrywanie podwójnoniciowych pęknięć DNA uważanych za biologicznie ważny typ uszkodzenia wywołanego przez promieniowanie. Raport opisuje modyfikacje wprowadzone do metody kometowej w ph obojętnym oraz zastosowanie jej do badania uszkodzeń i naprawy DNA w napromienionych limfocytach ludzkich. The neutral comet assay The single-cell gel electrophoresis (or comet) assay is a rapid and sensitive fluorescence microscopic method that is used for the detection of DNA damage at the individual cell level. Comet assay under neutral conditions allows the detection of DNA double-strand breaks, considered to be the biologically relevant radiation-induced lesion. In this report we describe modifications of the neutral comet method and its use for studying DNA damage and its repair in irradiated human lymphocytes.

6 SPIS TREŚCI 1. WSTĘP 7 2. BADANIA WŁASNE Materiał i metody Przygotowanie komórek Warunki napromieniania Liza Płukanie P Elektroforeza Komputerowa analiza obrazu Opracowanie wyników 9 3. WYNIKI I DYSKUSJA LITERATURA 17

7 1. WSTĘP... ; Test kometowy czyli elektroforeza pojedynczych komórek (ang. single cell gel electrophoresis - SCGE) pozwała na pomiar różnorodnych typów uszkodzeń DNA oraz badanie ich naprawy w indywidualnych komórkach. Obecnie stosowany jest szeroko w toksykologii genetycznej, onkologii, biomonitoringu, jak również do identyfikacji napromienionej żywności. Pierwsze metody mające za zadanie pomiar pęknięć DNA w pojedynczych komórkach powstały ponad 20 lat temu. W 1978 roku Rydberg i Johanson [1] wykazali, że jądra komórkowe poddane lizie w warunkach alkalicznych pozostają stosunkowo skondensowanymi strukturami, natomiast po napromienieniu promieniowaniem jonizującym następuje, zależne od dawki promieniowania, rozluźnienie struktury DNA. Obserwacja, że traktowanie komórek 2 M NaCl i detergentami anionowymi powoduje powstawanie nukleoidów" zbudowanych z pętli DNA o wielkości kb (kilopar zasad, Cook i Brazell [2]) stała się podstawą rozwoju metody poświaty fluorescencyjnej [3]. W 1984 roku Óstling i Johanson [4] wprowadzili dodatkowo etap krótkiej elektroforezy komórek uprzednio poddanych lizie i zatopionych w agarozie na szkiełku mikroskopowym. Elektroforeza powodowała wyciąganie ujemnie naładowanych uszkodzonych fragmentów DNA w kierunku anody. Przesunięcie DNA było proporcjonalne do dawki promieniowania X jaką napromieniano badane komórki i po wy barwieniu żelu uzyskano charakterystyczny obraz komety". Elektroforeza przeprowadzona była w warunkach neutralnych. Ponieważ komórki zostały napromienione małymi dawkami promieniowania, wydaje się, że opisane wówczas różnice spowodowane były nie wykryciem podwójnoniciowych pęknięć DNA, ale relaksacją pętli DNA. Taką relaksację mogą powodować pęknięcia pojedynczoniciowe również w ph obojętnym. W taki sposób tłumaczy się zbliżone wyniki oznaczania indukcji pęknięć nici DNA przez H2O2 w ph alkalicznym i obojętnym [5]. Singh i wsp. [6] zmodyfikowali procedurę przez zastosowanie alkalicznego buforu do elektroforezy i wprowadzenie dodatkowego etapu rozwijania DNA prowadzonego bezpośrednio w alkalicznym roztworze elektroforetycznym. Pozwala to na pomiar sumy pęknięć jedno- i dwuniciowych oraz stanowi podstawę najczęściej stosowanego obecnie testu kometowego. Badania Singha i wsp. [6-8] oraz późniejsze dobranie warunków elektroforezy przez Vijayalaxami'ego i wsp. [9] pozwoliło ustalić próg czułości metody na poziomie uszkodzeń indukowanych przez dawkę 0,05 Gy. Jest to poziom porównywalny z najczulszymi testami cytogenetycznymi, takimi jak analiza aberracji chromosomowych czy test mikrojądrowy. Wzrastające zainteresowanie techniką elektroforezy pojedynczych komórek doprowadziło do opracowania szeregu wariantów procedury podstawowej. Zmieniając nieco warunki prowadzenia testu oraz obniżając zasadowość buforów do lizy i elektroforezy zastosowano test kometowy do określania liczby podwójnoniciowych pęknięć DNA i ich naprawy. Dotychczas podwójnoniciowe pęknięcia nici DNA (DSB) oznaczano m.in. metodami sedymentacyjnymi, pomiaru lepkosprężystości, elucji DNA z filtrów w ph obojętnym, metodami immunofluorescencyjnymi i elektroforetycznymi. Każda z nich ma zalety i wady. Metoda kometowa łączy w sobie zalety metod elektro foretyczny ch z możliwościami metod cytogenetycznych, zaś prostotą wykonania dorównuje metodzie wytrącania DNA. W swojej najprostszej formie, gdy oceny dokonuje się wizualnie, metoda ta wymaga posiadania jedynie mikroskopu fluorescencyjnego i prostego aparatu do elektroforezy DNA. W celu wykrycia podwójnoniciowych pęknięć DNA, których częstość jest razy niższa niż pęknięć jednoniciowych, należy wprowadzić pewne modyfikacje testu kometowego. Wyodrębniły się dwie grupy badaczy, których podejście do zagadnienia nieco się różni. Olive i wsp. [10-16] zwiększyli intensywność lizy wydłużając czas lizy do

8 4-5 godzin i zwiększając temperaturę inkubacji w buforze lizującym do C. Czułość metody autorzy określili jako 5 Gy promieniowania X i uzyskali liniową zależność dawkaefekt (moment ogonowy jako funkcja dawki) dla podwójnoniciowych pęknięć w przedziale Gy. Druga grupa badaczy, na czele których należy wymienić Singha i wsp. [17-18] skupiła się na maksymalnym zwiększeniu czułości metody wprowadzając po lizie komórek dodatkowo inkubację z rybonukleazą i proteinaząk. 2. BADANIA WŁASNE W Zakładzie Radiobiologii i Ochrony Zdrowia IChTJ test kometowy w ph zasadowym stosowany jest od kilku lat [19-20]. Znalazł on zastosowanie w badaniach uszkodzeń popromiennych DNA i ich naprawy, badaniach genotoksyczności różnych związków chemicznych, biomonitoringu, identyfikacji napromienionej żywności [21-26]. Ostatnio opracowano metodę testu kometowego w ph obojętnym, która pozwala oznaczać podwój no niciowe pęknięcia DNA w pojedynczych komórkach. W porównaniu z opisywanymi w literaturze procedurami doświadczalnymi udało się znacznie uprościć i skrócić poszczególne etapy testu kometowego. Uzyskano dobrą korelację pomiędzy wielkością uszkodzenia mierzoną momentem ogonowym" a zastosowaną dawką promieniowania, przy czym kinetyka naprawy podwójnoniciowych pęknięć DNA jest również zgodna z danymi literaturowymi Materiał i metody Przygotowanie komórek Pobierano krew z żyły i izolowano limfocyty przy użyciu Histopaque (Sigma) wg standardowej metody podanej przez producenta. Natychmiast po izolacji komórki zawieszano w buforowanym roztworze soli (PBS) i wstawiano do łaźni lodowej albo umieszczano w pożywce RPMI (Sigma) w celu dalszej inkubacji Warunki napromieniania Komórki napromieniano w temperaturze 0 C w bombie kobaltowej Issledovatel. Moc dawki wynosiła średnio 3,28 kgy/godz. Czas napromieniania: - 10Gy-24s, - 20 Gy - 48 s, 50 Gy - 2 min, Gy-4 min. Limfocyty bezpośrednio z kąpieli lodowej przekładano do probówek z roztworem agarozy w temperaturze 37 C (3 objętości 1% agarozy + 1 objętość limfocytów w PBS), następnie nakładano na szkiełka i pozostawiano na 2-3 minuty na zimnej płytce metalowej w celu zestalenia się agarozy. Po zdjęciu szkiełek nakrywkowych natychmiast umieszczano szkiełka w roztworze lizującym. Wszystkie etapy przygotowania preparatów prowadzono w czerwonym świetle w celu ochrony komórek przed dalszym uszkodzeniem DNA. Naprawę podwójnoniciowych pęknięć DNA badano po napromienianiu dawką 10 Gy limfocytów pochodzących z krwi 5 dawców (niepalących, średnia wieku: 24,8 ±3,5). Uszkodzenia początkowe badano po napromienianiu komórek w temperaturze 0 C, natomiast

9 komórki, w których następowała naprawa napromieniano w temperaturze 37 C i inkubowano w pożywce RPMI z dodatkiem 20% cielęcej surowicy płodowej przez 15, 30, 60 lub 120 minut Liza Podstawowy bufor do lizy o składzie: 2,5 M NaCl, 100 mm EDTA, 10 mm Tris HC1 i 1% sarkozyl (N-laurylosarkozyna, Sigma) oraz o ph=9,5 przygotowano wcześniej i przetrzymywano w temperaturze pokojowej około 1 miesiąca. Bezpośrednio przed użyciem dodawano 0,5% Triton X-100 (Sigma) i 10% dimetylosulfotlenek (DMSO), mieszano na mieszadle magnetycznym około 20 minut i schładzano w lodówce. Do zimnego buforu wkładano szkiełka z komórkami zawieszonymi w agarozie i pozostawiano w temperaturze 4 C, w ciemności na 1-2 godziny Płukanie Po lizie preparaty przemywano 3 razy buforem do elektroforezy (skład: 300 mm octan sodowy, 100 mm Tris HC1; ph=8,5) i pozostawiano w świeżej porcji buforu na co najmniej 1 godzinę w celu dokładnego wypłukania resztek soli Elektroforeza Wypłukane szkiełka podstawowe umieszczano w aparacie do elektroforezy w buforze do elektroforezy. Elektroforezę prowadzono przez 1 godzinę przy napięciu 14 V i natężeniu prądu raa, w ciemności, w temperaturze nie przekraczającej 10 C. Po elektroforezie szkiełka płukano trzykrotnie buforem neutralizującym (0,4 M Tris (Sigma); ph=7,5), osuszano z nadmiaru roztworu, barwiono 1 um roztworem DAPI (Sigma) i nakrywano szkiełkiem przykrywkowym. Preparaty pozostawiano w zamkniętym pudełku, wyłożonym wilgotną bibułą, w lodówce na około 20 godzin. Tak przygotowane preparaty mikroskopowe poddawano komputerowej analizie obrazu Komputerowa analiza obrazu Obróbki obrazu komputerowego dokonywano za pomocą programu Comet v.3.1 (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Program ten analizuje natężenie fluorescencji i na tej podstawie oblicza dla każdej komórki szereg parametrów charakter}'żujących wielkość uszkodzenia DNA. Procentowa zawartość DNA w głowie" komety odpowiada materiałowi genetycznemu zlokalizowanemu na terenie jądra komórkowego, a obszar fluorescencji ogona" komety - materiałowi genetycznemu, który opuścił jądro komórkowe na skutek migracji w polu elektrycznym. Najczęściej stosowanym parametrem oceny uszkodzenia DNA jest moment ogonowy (ang. tail moment), czyli iloczyn procentowej zawartości DNA w ogonie" komety i jego długości. Podane wyniki są średnią z pomiaru 50 kometek dla każdego dawcy ± odchylenie standardowe (SD) w 3 oddzielnych doświadczeniach. W przypadku badania zależności dawka-efekt policzono 100 komet dla jednego dawcy ± odchylenie standardowe (SD) Opracowanie wyników Opracowanie statystyczne i graficzne uzyskanych wyników przeprowadzono za pomocą programu Statistica 5.1 (StatSoft, Inc Tulsa, USA).

10 3. WYNIKI I DYSKUSJA Wprowadzona modyfikacja testu kometowego w ph obojętnym pozwoliła na otrzymanie komet o zarysie znacznie bardziej zwartym (rys.l) niż w testach wykonanych zgodnie z procedurami opisanymi w publikacjach innych autorów [10,17]. Komety otrzymywane według tamtych procedur miały ogony bardzo wydłużone i rozmyte, co obniżało dokładność pomiaru lub nawet go uniemożliwiało. Rys. 1. Obraz komet" uzyskany w mikroskopie fluorescencyjnym po elektroforezie w ph obojętnym. Izolowane limfocyty ludzkie a - kontrolne i b - napromienione dawką 10 Gy. 10

11 Zmodyfikowaną metodą w ph obojętnym zbadano odpowiedź limfocytów ludzkich na promieniowanie w zakresie dawek Gy. Na rys. 2 przedstawiono zależność momentu ogonowego od dawki zmierzoną w limfocytach pochodzących z krwi obwodowej jednego dawcy. Porównanie tych danych z opublikowanymi przez innych autorów [10-16] świadczy, że opracowana modyfikacja nie obniżyła czułości metody a 80 o 70 & 60 S0 o Kontrola 10 Gy 20 Gy! Dawka r I! 50 Gy 100 Gy Rys. 2. Odpowiedź limfocytów ludzkich na różne dawki promieniowania y mierzona metodą testu kometowego w ph obojętnym. Na rysunku zaznaczono odchylenie standardowe. Rysunek 3 przedstawia rozkład uszkodzeń DNA wyrażonych momentem ogonowym. Podobny rozkład uszkodzeń uzyskała Banath i wsp. [14] stosując test kometowy w ph obojętnym po trwającej 2,5 godziny lizie w temperaturze 50 C. Autorzy ci nie stwierdzili heterogenności w indukcji uszkodzeń w populacji komórek pochodzących zarówno z pełnej krwi, jak i w izolowanych limfocytach. Także nasze wyniki wskazują na jednorodność populacji limfocytów i brak subpopulacji o innej promieniowrażliwości. Kolejne dwa rysunki - rys. 4 i 5 - pokazują naprawę DNA w limfocytach pochodzących od 5 dawców. Limfocyty zostały napromienione dawką 10 Gy, zaś pomiar przeprowadzono po 15, 30, 60 lub 120 minutach naprawy. Do wyników uzyskanych na podstawie testu kometowego dopasowano krzywe (rys. 6), zwykle używane do opisu kinetyki naprawy, o ogólnym wzorze y=a*exp(-bt)+c, gdzie c jest końcowym uszkodzeniem nienaprawialnym, a oznacza początkowe uszkodzenia naprawialne (całkowite początkowe uszkodzenie = a+c), zaś b(-l/i)]qs\ względną naprawą (z jest stałym czasem potrzebnym do redukcji naprawianych uszkodzeń do 37% uszkodzenia początkowego). 11

12 Ił 2(1 In 6(1 81) Uli 161) 181 Moment ogonowy 10 Gy «6 i ) NI) ) 1GI> 180 Moment ogonowy 20 Cy 21) -II) (1 Moment ogonowy 50 Gy (l 2( ) UO Ul) ( Moment ogonowy 100 Gy» ) lth) 120 U\) Moment ogonowy Rys. 3. Heterogenny rozkład uszkodzeń dla tych samych 100 komet co na rys

13 30 o C O o c <& o O- dawca dawca 2 -O- dawca dawca 4 -Bh dawca 5 o Czas (min) Rys. 4. Naprawa uszkodzeń DNA w limfocytach ludzkich mierzona metodą testu kometowego w ph obojętnym dla 5 dawców. Limfocyty napromieniano dawką 10 Gy. Średnia wartość momentu ogonowego dla każdej kontrolnej próbki (nienapromienianej) została odjęta od wartości uszkodzenia mierzonego w każdym punkcie czasowym. 100 o 2 '3 N "O i N Vi S Q- dawca 1 -^- dawca 2 -Q- dawca 3 -^- dawca 4 - f- dawca 5 - = Czas (min) Rys. 5. Naprawa uszkodzeń DNA dla tych samych 5 dawców co na rys. 4. Średnia wartość momentu ogonowego dla każdej kontrolnej próbki (nienapromienianej) została odjęta od wartości uszkodzenia mierzonego w każdym punkcie czasowym, a wynik przedstawiono jako procent uszkodzenia początkowego DNA. 13

14 Dawca t y=(16.01)*exp((-{0.016))*x)+(1.85) Dawca 2 y=(! 5.65)*exp((-(0.027))*x)+(4.83) S Czas (min) Czas (min) Dawca 3 > =( 13.12)*cxp((-(l).016))*x)+(-0.19) Dawca 4 y=(18.79)*exp((-(0.046))*x)+(5.97)»f 15 1 S IO I 5 M,5 "a V S o io SO 60 TO Czas (min) Czas (min) Dawca S y=(17.23)*exp((-(0.025))*x)+(3.11) I Czas (min) Rys. 6. Kinetyka naprawy uszkodzeń DNA oznaczonych testem kometowym w limfocytach ludzkich (5 dawców) napromienionych dawką 10 Gy. Dla tak opisanych krzywych uzyskano najlepsze dopasowanie do punktów wyznaczonych przez dane eksperymentalne. W tabeli zamieszczono parametry krzywych opisujących kinetykę naprawy DNA w limfocytach pochodzących od 5 dawców. Stosunkowo duże różnice w przebiegu naprawy limfocytów napromienionych taka samą dawką promieniowania obserwowane były też uprzednio [14]. Zmiany w rozkładzie uszkodzeń w czasie naprawy dla wszystkich dawców łącznie przedstawiono na rys

15 Tabela. Porównanie parametrów krzywychy=a*exp(-bt)+c ludzkich (5 dawców) napromienionych dawką 10 Gy. opisujących naprawę DNA w limfocytach Dawca a ± SEM b±sem c±sem Współczynnik korelacji 1 16,01 i 2,416 0,16 ±0,006 1,85 ±2,560 0, ,65 + 0,980 0,27 ± 0,004 4,83 ± 0,932 0, ,18 ± 1,451 0,16 ±0,004-0,19 ± 1,553 0, ,79 ±0,964 0,05 ± 0,006 5,97 ±0,703 0, ,23 ±0,960 0,25 ± 0,004 3,11 ±0,897 0,99 SEM - błąd standardowy. Sprawna i wierna naprawa DSB DNA jest szczególnie ważna dla organizmu, gdyż nienaprawione DSB są letalne, a niedokładna naprawa może prowadzić do powstania mutacji. DSB indukowane są nie tylko przez czynniki zewnętrzne, takie jak promieniowanie jonizujące, ale również enzymatycznie w normalnych procesach komórkowych, np. w inicjacji procesu rekombinacji, podczas mejozy, mitozy czy rekombinacji V(D)J. Zaburzenie naprawy prowadzi więc nie tylko do zwiększonej wrażliwości na czynniki klastogenne, ale także zaburza wiele procesów komórkowych. Proces naprawy DSB DNA przebiega według dwufazowej kinetyki z wyraźnym okresem szybkiej naprawy (w ciągu pierwszej godziny od działania czynnika) i okresu wolniejszej naprawy trwającego kilka godzin. Proces szybkiej naprawy jest prawdopodobnie prowadzony przez konstytutywne enzymy stale obecne w komórce, natomiast powolna naprawa wymaga wytworzenia przez komórkę specyficznych białek [16,17]. Poziom pęknięć podwójnoniciowych po 120 minutach naprawy (wyrażony jako procent uszkodzenia początkowego) wahał się od 14,4 do 24,5% u poszczególnych dawców (rys. 5). Podawana przez innych autorów szybkość łączenia DSB różni się znacznie w zależności od rodzaju badanych komórek oraz stosowanej metody i jest znacznie wolniejsza w limfocytach niż w komórkach nowotworowych [14]; po 24 godzinach od napromienienia limfocytów ludzkich dawką 75 Gy wciąż była obecna istotna ilość uszkodzeń DNA badanych metodą kometową w ph obojętnym. Wyniki te pozostają w zgodzie z obserwacją Mayer'a i wsp. [27,28], którzy stosując metodę elucji DNA z filtrów w ph obojętnym, stwierdzili, że tylko około 30% DSB było łączonych w tym czasie. Tobi i Itzhaki [29], badając naprawę DSB metodą elektroforezy pulsowej w limfocytach ludzkich po dawce równej 40 Gy, obserwowali szybką składową naprawy o Ti/ 2 (czas połowicznej naprawy) równą ł godzinie i niemal całkowitą naprawę po 3 godzinach. Olive podaje w jednej z prac [16], że Ti/2 łączenia DSB oznaczanych metodą kometową w różnych liniach komórkowych waha się od kilkunastu minut dla komórek linii nowotworowych do ponad 240 minut dla leukocytów pochodzących z pełnej krwi. Nowo opracowana w Zakładzie Radiobiologii i Ochrony Zdrowia IChTJ metoda testu kometowego w ph obojętnym pozwala na badanie powstających pod wpływem promieniowania jonizującego uszkodzeń DSB DNA oraz kinetyki ich naprawy 15

16 O min Kontrola s» 5 M 3 ' \ 5 II) IS » 35 4n 4$ ( IS 2(1 2S III -IS fill Moment ogonowy ) li ( łilł 6? Moment ogonowy a Rys. 7. Heterogenny rozkład uszkodzeń w limfocytach ludzkich podczas naprawy po napromienieniu dawką 10 Gy (a) i kontrolnych (b). Wyniki zbiorcze dla 5 dawców (liczono po 100 kometek w 3 osobnych doświadczeniach). 16

17 Paca została zrealizowana w ramach grantu Komitetu Badań Naukowych (KBN) nr 4PO5A LITERATURA [1]. Rydberg B., Johanson K.: Mammalian Cells. In: DNA Repair Mechanisms. Academic Press, New York 1978, pp [2]. Cook P.R., Brazell I.A.: Eur.J.Biochem., 84,2, (1978). [3]. Roti Roti J.L., Wright W.D.: Cytometry, 8, 5, (1987). [4]. Óstling O., Johanson K.: Biochem.Biophys.Res.Commun., 123, (1984). [5]. Collins A.R., Dobson V.L., Dusinska M., Kennedy G., Stetina R.: Mutat.Res., 375 (1997). [6]. Singh N., McCoy M., Tice R.R., Schneider EX.: Exp.Cell.Res., 175, (1988). [7]. Singh N.P., Tice R.R., Stephens R.E., Schneider E.L.: Mutat.Res., 252, 289 (1991). [8]. Singh N.P., Stephens R.E., Schneider E.L.: Int.J.Radiat.Biol., 66, (1994). [9]. Vijayalaxmi, Tice R., Strauss G.: Mutat.Res., 271, (1992). [10]. Olive P.L., Wlodek D., Banath J.P.: Cancer Res., 51., (1991). [11]. Olive P.L., Banath J.P.: Int.J.Radiat.BioL, 64, (1993). [12]. Hu Q., Hill R.P.: Radiat.Res., 146, (1996). [13]. Olive P.L., Banath J.P.: Radiat.Res., 142, (1995). [14]. Banath J.P., Fushiki M., Olive P.L.: Int.J.Radiat.Biol., 73, (1998). [15]. Olive P.L.: Radiat.Res., 150, S42-S51 (1998). [16]. Olive P.L.: Int.J.Radiat.Biol., 75, (1999). [17]. SinghN.P., Stephens R.E.: MutatRes., 383, (1997). [18]. Singh N.P., Stephens R.E.: Mutagenesis, 13, (1998). [19]. Wojewódzka M., Kruszewski M., Iwaneńko T.: Raport IChTJ. Seria B nr 1/96. [20]. Kruszewski M.: Raport IChTJ. Seria B nr 2/96. [21]. Wojewódzka M., Kruszewski M., Szumiel L: Mutagenesis, U, (1996). [22]. Wojewódzka M., Kruszewski M., Szumiel I.: Int.J.Radiat.Biol., 71, (1997). [23]. Kruszewski M., Wojewódzka M., Iwaneńko T., Szumiel L., Okuyama A.: Mutat.Res., 409,31-36(1998). [24]. Wojewódzka M., Kruszewski M., Iwaneńko T., Collins A.R., Szumiel I.: Mutat.Res., (1998). [25]. Wojewódzka M., Kruszewski M., Iwaneńko T., Collins A.R., Szumiel I.: Mutat.Res., 440, 1, (1999). [26]. Kruszewski M., Iwaneńko T., Boużyk E., Szumiel I.: Mutat.Res., 434, (1999). [27]. Mayer P.J., Lange C.S., Bradley M.O., Nichols WW.: Mutat.Res., 219, (1989). [28]. Mayer P.J., Lange C.S., Bradley M.O., Nichols W.W.: Annals of Human Biology, US, (1991). [29]. Tobi S.E., Itzhaki R.F.: Int.J.Radiat.Biol., 63, (1993). 17

18 UKD: INIS:C11.00 SŁOWA KLUCZOWE: TEST KOMETOWY W ph OBOJĘTNYM, NAPRAWA DSB DNA 18