Metody analiz GMO. Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB

Transkrypt

1 Metody analiz GMO Magdalena Żurawska-Zajfert Laboratorium Kontroli GMO IHAR-PIB

2 GMO Organizm Genetycznie Zmodyfikowany - organizm inny niż organizm człowieka, w którym materiał genetyczny został zmieniony w sposób niezachodzący w warunkach naturalnych wskutek krzyżowania lub naturalnej rekombinacji (przy zastosowaniu inżynierii genetycznej umożliwiającej: przenoszenie pojedynczych genów warunkujących znane cechy, przenoszenie genów pomiędzy gatunkami) (GMO - Genetically Modified Organisms) rośliny zwierzęta mikroorganizmy

3 Organizmy genetycznie zmodyfikowane Transgeniczne organizmy Transformacja: - proces wprowadzenia określonego fragmentu DNA do genomu biorcy - dawcą może być dowolny organizm

4 Informacja genetyczna chromosom jądro Gen jednostka dziedziczenia stanowiąca odcinek cząsteczki DNA komórka DNA gen publications.nigms.nih.gov/.../ch1_dnagenes.jpg

5 Struktura DNA podwójna helisa zasada grupa fosforanowa (P) cukier (D) para zasad nukleotyd - podstawowa jednostka strukturalna DNA TCAGGAGAAAAATAAGACCGAACTGCTAATTCGTATGCTATTAACCCGATCGATGGGGATAGCCTCCGAATGACTGACCTATGCCCCT TAAGTACTGATAACCGAGCTAGCTGACCTTCTTTAGCTTCACCTAAAATCTTGTGAACTTCGATGCCTTGATCGAAACGTGTCTAAGA CGAACTGCTAATTCGTATGCTATTAACCCGATCGATGGGGATAGCCTCCGAATGACTGACCTATGCCCCTTTAAGTACTGATAACCGA CTTAAGTACTGATAACCGAGCTAGCTGACCTTCTTTAGCTTCACCCCGAACTGCTAATTCGTATGCTATTCATCCGGATA

6 Analizie na obecność GMO można poddawać: Tkanki roślinne Nasiona Produkty żywnościowe, składniki żywności, pasze

7 Metody detekcji GMO Materiał produkt cel metoda Soja DNA PCR Kukurydza Białko Testy immunologiczne Rzepak Kw tłuszczowe HPLC

8 Podstawowe metody detekcji GMO Oparte na analizie DNA (PCR) Oparte na analizie białek (ELISA)

9 PCR (Pomerase chain reaction) Reakcja łańcuchowa polimerazy ds DNA 1. denaturacja (95 C) 2. przyłączanie (50-65 C) 3. polimeryzacja (72 C) x

10 PCR Reakcja łańcuchowa polimerazy Sekwencja docelowa cykl 1 cykl 2 cykl 3 cykl 4 35 cykli Po 35 cyklach 2 35 = 34 miliardy kopii

11 DETEKCJA GMO NA POZIOMIE DNA Etap 1: Izolacja DNA Etap 2: Screening: 35S, NOS Etap 3: Identyfikacja specyficznego GMO Etap 4: Ilościowe oznaczenie GMO Screening i identyfikacja: PCR + elektroforeza Ilościowe oznaczenie: PCR w czasie rzeczywistym

12 DNA roślinne Konstrukt Prom. Gen Reporter Termin. DNA roślinne Gatunkowospecyficzny PCR Czy zachodzi reakcja PCR? 2.Screening Czy jest GMO? 3.PCR specyficzny dla genu 4 4. PCR specyficzny dla konstruktu Identyfikacja konstruktu GMO 5.PCR specyficzny dla zdarzenia Identyfikacja zdarzenia transformacyjnego Identyfikacja genu GMO

13 Rozwój metod PCR Konwencjonalny PCR RealTime PCR PCR w czasie rzeczywistym Digital PCR PCR cyfrowy

14 Detekcja GMO metodą PCR Homogenizacja i pobieranie podpróbek Izolacja DNA Gotowe zestawy CTAB PCR elektroforeza

15 Wymagania PCR matrycowy DNA deoksynukleotydy startery polimeraza DNA bufor Mg 2+ termocykler

16 PCR konwencjonalny PCR ELEKTROFOREZA

17 Badane DNA Schemat elektroforezy Rezultaty konwencjonalnego PCR wizualizowane są w procesie zwanym elektroforezą. PCR 1.DNA nanoszone jest do studzienek w żelu zanurzonym w buforze w komorze aparatu do elektroforezy pomiędzy dwoma elektrodami. 2.Pod wpływem przepływającego prądu fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku katody. 3.Mniejsze fragmenty DNA migrują szybciej i dalej niż większe fragmenty

18 PCR Metoda wysoko specyficzna Potwierdzenie: hybrydyzacja, analiza restrykcyjna, Nested PCR, sekwencjonowanie DNA Do zastosowania nawet do wysoko przetworzonych próbek, np. żywności, pasz Granica wykrywalności - kilka kopii Wrażliwa na kontaminacje Konieczność stosowania kontroli: negatywnych, pozytywnych specjalistyczne wyposażenie laboratorium (termocykler)

19 Real Time PCR Real Time PCR - PCR w czasie rzeczywistym Metoda bazująca na konwencjonalnym PCR, wykorzystuje techniki fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w każdym cyklu prowadzonej reakcji PCR

20 PCR w czasie rzeczywistym Czym jest Real-Time PCR? Oglądaniem PCR w czasie jego trwania Jak możemy obejrzeć ten proces? Dzięki fluorescencji znakowanego DNA Dzięki instrumentom odczytującym fluorescencję

21 RealTime PCR Zasada działania sond Taqman denaturacja przyłączanie polimeryzacja

22 (Rn) Real Time PCR krzywa amplifikacji Threshold jest ustalany powyżej wartości tła Threshold cycle (CT) - crossing point: określa moment, w którym fluorescencja przekracza poziom tła (cykl, po którym możliwa jest detekcja produktu). Wartość CT służy do obliczania ilości matrycy użytej w reakcji CT treshold line (linia graniczna)

23 RealTime PCR Ilościowe oznaczanie GMO Zastosowanie sond oligonukleotydowych znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi Możliwość śledzenia przebiegu reakcji w czasie rzeczywistym różnica w amplifikacji sekwencji specyficznej dla GMO i endogennego genu referencyjnego- podstawą do obliczenia zawartości GMO w próbce Konieczne odniesienie do amplifikacji materiału referencyjnego CRM (1%)

24 Gen referencyjny gatunkowo specyficzny niewielka liczba kopii niewielka heterogenność wśród odmian niezmieniony podczas manipulacji genetycznych

25 Ilościowe oznaczanie GMO metoda krzywej standardowej dwie krzywe (dla GMO i genu referencyjnego) jedna krzywa (ΔCt) oznaczanie ilościowe ΔΔCt

26 Ilościowe oznaczanie GMO powielane są specyficzne sekwencje transgeniczne, a ich ilość określana jest w stosunku do endogennego genu referencyjnego określającego całkowitą ilość DNA w próbce gmdna % GMO x100 referencyjnydna system wymaga więc starterów specyficznych dla transgenu i starterów gatunkowo-specyficznych komplementarnych do endogennego genu referencyjnego

27 Metoda dwóch krzywych standardowych Dwie oddzielne krzywe standardowe: dla genu referencyjnego i dla transgenu (wyliczenie ilości specyficznych sekwencji GMO i referencyjnych sekwencji endogennych) %GMO = liczba sekwencji GMO w genomie haploidalnym liczba sekwencji endogennego genu referencyjnego w genomie haploidalnym x 100%

28 Porównawcza metoda C T (Δ C T ) gdzie Δ C T = C T genu referencyjnego - C TGMO

29 DCt (FAM-VIC) Krzywa standardowa wartości (Δ C T ), powstaje przez zastosowanie serii próbek o różnych znanych zawartościach GMO (IRMM) 18,00 16,00 Ct 14,00 12,00 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 y = Ln(x) R 2 = 0,99 GM Soy Ref. Stds. Log. (GM Soy Ref. Stds.) 0,00 0,01 0,10 1,00 10,00 %GM %GM

30 Materiał odniesienia Oznaczanie ilościowe - metoda ΔΔCt względem materiału odniesienia np. 1% Gen referencyjny Numer cyklu GMO Próbka badana GMO Gen referencyjny Numer cyklu

31 RealTime PCR LOD (Limit of Detection) Granica wykrywalności Najmniejsza ilość substancji oznaczanej, jaką można wykryć w badanej próbce daną metodą badawczą. LOQ (Limit of Quantification) Granica oznaczalności Najmniejsza ilość substancji oznaczanej, jaką można wiarygodnie oznaczyć ilościowo w badanej próbce daną metoda badawczą

32 PCR Cyfrowy Droplet Digital PCR Sondy fluorescencyjne lub barwnik EvaGreen Analiza end-point Obliczenie liczby kopii szukanej sekwencji w próbce- rozkład Poissona Zawartość GMO= liczba kopii szukanej sekwencji/liczba kopii genu referencyjnego

33 Digital PCR Oznaczenie ilościowe, jednostka: % kopii GM DNA w przeliczeniu na genom haploidalny Obliczenie bezpośrednie, brak konieczności stosowania materiałów referencyjnych Wysoka wartość metrologiczna oznaczenia Zastosowanie do analiz GMO Zastosowanie do walidowania materiałów referencyjnych w odniesieniu do liczby kopii DNA Zastosowanie do oznaczania liczby kopii genów w genomie Specjalny sprzęt i oprogramowanie, wysokie koszty

34 DETEKCJA GMO NA POZIOMIE BIAŁEK Etap 1: Izolacja białek Etap 2: ELISA lub inne testy białkowe

35 Białka Produkty genów Wielkocząsteczkowe biopolimery Ważne funkcje w organizmie m.in.: Kataliza enzymatyczna Budulcowe (kolagen, keratyna) Transport Regulatorowe (hormony) Odpornościowe (przeciwciała) białko Transkrypcja Translacja Replikacja

36 ELISA- wykrywanie białek Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (test immunoenzymatyczny lub immunoenzymosorbcyjny) Specyficzna reakcja przeciwciała z antygenem. Przeciwciało unieruchomione na stałym podłożu (ścianka probówki, mikropłytka, kulki szklane lub z tworzyw sztucznych) Przeciwciało i antygen pasują do siebie jak klucz do zamka Soja RR: antygen - nowo syntetyzowane białko EPSPS kodowane przez wprowadzony gen EPSPS, nadające roślinie odporność na herbicyd Roundup. Na immunosorbencie (pasku) umieszczone jest przeciwciało do tego białka.

37 Kolor Enzym Linia kontrolna SUBSTRAT Linia wyniku RR Przeciwciało CP4 EPSPS Wynik negatywny Wynik pozytywny

38 0% 0,5% 1% 5% 10% 50% 100% Granica wykrywalności 0,1% soi RoundupReady

39 Zastosowanie paskowego testu ELISA Testowanie pojedynczych nasion Testowanie liści Testowanie mączek

40 Zalety metody ELISA Szybka analiza (Czas trwania analizy minut) Nieskomplikowana analiza (można stosować w warunkach polowych) Specyficzność Wady metody ELISA Wynik zależy od poziomu ekspresji białka (poziom ekspresji niewystarczający do detekcji, ekspresja tylko w określonych partiach rośliny lub na różnych etapach rozwoju) Degradacja białka (wysoko przetworzone produkty żywnościowe) Brak możliwości screeningu

41 ELISA oznaczenie ilościowe Barwna reakcja enzymatyczna -zabarwienie wprost proporcjonalne do stężenia antygenu. Po zatrzymaniu reakcji pomiar absorbancji Obliczenie zawartości GMO na podstawie porównania do standardów (krzywa standardowa)

42 Testy polowe przy wykorzystaniu pasków ELISA Materiały do wykonania paskowego testu ELISA w warunkach polowych: Rękawiczki lateksowe, wycinak rymarski (korkobor), podkładka plastikowa, młotek, probówki typu eppendorf, patyczki drewniane lub szpatułki, pipetki pasteurowskie lub buteleczki z zakraplaczem, paski ELISA do wykrywania konkretnego białka (np. Cry1Ab), bufor ekstrakcyjny lub woda, alkohol etylowy 70% Wykrywanie białka metodą ELISA Dyski liściowe pobrane z odpowiednio ułożonych liści (w tej samej fazie rozwojowej), homogenizacja dysków i zawieszenie ich w buforze lub wodzie; umieszczenie testu paskowego ELISA w zawiesinie; po 5 minutach odczyt wyniku analizy

43 Wymagania dla detekcji GMO Poszukiwane DNA musi być obecne brak lub zdegradowane niewykrywalne! duże znaczenie procesu przetwarzania znaczenie opracowania metod do izolacji Poszukiwane DNA musi być znane i dostępne niemożliwe bez opisu poszukiwanego DNA konieczny materiał dla opracowania i oceny metod Materiały referencyjne materiały potrzebne do produkcji MR są trudno dostępne materiały muszą pełnić wiele funkcji

44 Problemy w analizach GMO Coraz więcej odmian transgenicznych, złożone konstrukty Stacked events Problem screeningu (35s/nos już nie wystarcza) Nieautoryzowane GMO Trudności z multipleksowaniem reakcji

45 Powszechna definicja stacków Odmiany zawierające więcej niż jeden gen ulepszający cechy roślin uprawnych Metody otrzymywania stacków Taverniers I. et al. Environ. Biosafety Res. (2008)

46 Jak odróżnić stacks od ich form rodzicielskich? 50% 50% T25 MON810 x T25 50% 50% MON810 Nie GMO

47 Zapewnienie jakości wyników badań Każda analiza izolacja, reakcja PCR wykonana w powtórzeniach Stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej Stosowanie certyfikowanych materiałów referencyjnych Stosowanie metod zwalidowanych Zapewnienie odpowiednich warunków środowiskowych: Nadzór nad wyposażeniem Rozdzielenie etapów analizy Warunki temperatury i wilgotności w pomieszczeniach i lodówkachmonitoring,

48 Dziękuję za uwagę