Próbobranie na obecność GMO zasady i metodyka działania w laboratorium kontrolnym

Transkrypt

1 Próbobranie na obecność GMO zasady i metodyka działania w laboratorium kontrolnym Anna M. Linkiewicz Laboratorium Kontroli GMO, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin PIB w Radzikowie

2 Pobieranie prób nasion wg ISTA

3 Schemat analizy GMO Przyjęcie próbki w laboratorium Homogenizacja Wyodrębnienie próbki analitycznej Izolacja DNA Reakcja PCR Analiza produktów reakcji Raport z analiz Próbka analityczna ma odpowiadać próbce laboratoryjnej Raport z analiz odnosi się do próbki laboratoryjnej

4 ISO Metody badań i wzorcowań oraz ich walidacja Laboratorium powinno stosować właściwe metody i procedury dla wszystkich badań lub wzorcowań objętych zakresem jego działalności. Dotyczy to pobierania próbek, postępowania z obiektami poddawanymi badaniom, ich przygotowania, itd. 5.7 Pobieranie próbek Laboratorium powinno mieć plan pobierania próbek i procedury pobierania próbek, jeżeli przeprowadza pobieranie próbek substancji, materiałów lub wyrobów, które są następnie badane lub wzorcowane. Pobieranie próbek jest ustaloną procedurą pobierania do badań części jakiejś substancji, materiału, wyrobu, tak by zapewnić próbkę reprezentatywną dla całości.

5 Próbobranie - definicje Próbka laboratoryjna próbka uzyskana z analizowanej partii materiału i wysłana do laboratorium celem przeprowadzenie inspekcji czy badań (ISO/FDIS 6498:2011). Próbka analityczna próbka przygotowana z próby laboratoryjnej, z której zostaną pobrane podpróbki do analiz (ISO/FDIS 6498:2011).

6 Polecana wielkość próby laboratoryjnej JRC Technical Report 2014

7 Masa próbki laboratoryjnej Gatunek Masa ziarna (mg) Masa próbki 3000 nasion (g) Kukurydza Rzepak 4 14 Ryż Soja Pszenica

8 Zmniejszanie masy próbki Mielenie wstępne - jeśli próba laboratoryjna jest zbita, zgruźlona lub jej cząsteczki >6 mm powinna być zmielona wstępnie (lub pocięta na kawałki 4 do 6 mm) przed pobieraniem podpróbek (subsampling). Subsampling Próba laboratoryjna jest zmniejszana poprzez podzielenie jej na określoną liczbę podprób. Każda podpróba powstaje z jednakowej liczby próbek pierwotnych o jednakowej wielkości/masie. JRC Technical Report 2014

9 Wydzielanie podpróbek The spoon method (metoda szufelkowa) Rozprowadzenie próbki laboratoryjnej (S-shaped pattern ) i losowe miejsca poboru podpróbek The long pile method Próbka jest rozprowadzana na płaskiej powierzchni w kształcie słupka (przynajmniej 20x dłuższego niż wysokiego lub szerokiego). Podpróby pobierane są losowo z transekcji i łączone JRC Technical Report 2014

10 Rozdrobnienie próby Rozdrobnienie przez zastosowanie różnych metod (wg ISO 6498:2011): siekanie, miażdżenie, cięcie, mieszanie z miksowaniem, mielenie, sproszkowanie do uzyskania maksymalnie homogennej próby Zwykle zmniejszenie wielkości cząstek poprzedzane jest etapem zmniejszenia masy próbki

11 Homogenizacja próby Etap homogenizacji wiąże się z wysokim ryzykiem kontaminacji. Pył powstający podczas mielenia, może osiadać na sprzętach i zanieczyszczać następne próbki. Pomieszczenie, miejsce przeznaczone na mielenie prób wg. ISO 24276:2006 Mielenie w podwyższonej temperaturze przyczynia się do degradacji DNA i białek

12 Homogenizacja w plastikowych torbach Gdy próbka laboratoryjna jest płynna lub jest to mąka, homogenizacja w młynku nie jest konieczna, ale należy dokładne wymieszać próbkę. JRC Technical Report 2014

13 Narzędzia próbobiorcy JRC Technical Report 2014

14 Wielkość próbki nasion a możliwości analizy Nasiona [szt] 90% 95% 99% S.Kay, C.Paoletti, ,28% 2,95% 4,50% 200 1,14% 1,49% 2,28% 300 0,76% 0,99% 1,52% 400 0,57% 0,75% 1,14% 800 0,29% 0,37% 0,57% ,19% 0,25% 0,38% ,12% 0,15% 0,23% ,09% 0,12% 0,18% ,08% 0,10% 0,15% ,04% 0,05% 0,08% ,02% 0,03% 0,05% 0,1% GMO treshold requires sample of at least 3000 seeds LLP Regulation 619/2011 0,1% UGM equivalent of seeds

15 Masa próbki a możliwości oceny ilościowej

16 Mieszanie Próbobranie nasion (ISTA) kukurydza Próbka laboratoryjna (min 6000 nasion ) - sampling wg ISTA Próbka A (1000 nasion) Próbka B (1000 nasion) Próbka C (1000 nasion) Próbka analityczna A Próbka analityczna B Próbka analityczna C Izolacja DNA qpcr: PCR gene ref. Screening Identifikacja GMO Szkolenie _Pobieranie prób_ Linkiewicz A.M.

17 Seedcalc statistical software

18 No of samples No of seeds No of positive subsamples Seedcalc ,05 % ,04 % 0,11 % -

19 Rodzaje nieautoryzowanych GMO 1. Nieautoryzowane w żadnym kraju (doświadczenia) 2. autoryzowane w kraju trzecim, ale nie przewidywane w UE 3. autoryzowane w kraju trzecim i przewidywane w UE (w procesie autoryzacji)

20 Nieutoryzowane GMO (UGMO) Pobieranie prób w celu wykrycia UGMO powinno być prowadzone zgodnie z podstawowymi zasadami dla innych GMO Chyba że właściwy urząd ustali inny plan pobierania próbek Przykłady tak przygotowanych ad-hoc sampling schemes dla UGMO są dostępne i opublikowane porzez KE (European Commission, 2005; 2006a; 2006b; 2006c; 2008). Rozporządzenie (EU) No 619/2011 określa np. sposób pobierania prób dla określonej paszy.

21 Rozporządzenie (EU) No 619/2011 (Low Level Presence ) harmonizacja kontroli pasz UE zależna od importów paszy z krajów trzecich (33 mln ton soi ( ); 4 mln ton kukurydzy ( ), z Brazylii, Argentyny, USA.) harmonizacja zasad kontroli pasz z krajów trzecich, które mogą zawierać nieautoryzowane GMO ustanowiony jest limit 0,1% dla GMO autoryzowanych w innych krajach, dla których EFSA wydała pozytywną opinię oraz dostępne są certyfikowane materiały odniesienia i zwalidowana przez EURL- GMFF metoda służąca detekcji i ilościowemu oznaczaniu GMO.

22 Wielkość próby Zasady pobierania próbek pasz w Rozp. (WE) Nr 152/2009 metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz i Rozp. Komisji 691/2013. Wielkość próby zbiorczej nie może być mniejsza niż the nasion, a próba końcowa (laboratoryjna) do celów kontroli GMO musi zawierać co najmniej nasion/ziaren.

23 Zalecenia dotyczące wykrywania genetycznie zmodyfikowanego ryżu pochodzącego z Chin metodą Real Time PCR wykrywającą P-35S, T- nos i Cry1Ab/Ac. Produkty z ryżu z Chin zanieczyszczone nieautoryzowanymi modyfikacjami ryżu Bt63; RASFF w 2006; Decyzja Komisji Europ. 2008/289/EC Nowe nieautoryzowane linie ryżu Kefeng6, Kemingdao1, Decyzja Komisji Europ. 2011/884/EU Grohmann, 2012

24 Partia ryżu - ziarno Próbka laboratoryjna 2,5 kg 4 próbki analityczne 240 g ( ziaren) Izolacja DNA (100 mg-1 g) Analiza PCR min 20 ng/reakcję EU-RL GMFF revised guidance for testing GM rice originating from China JRC Publication JRC90142

25 Interpretacja wyników Real-Time PCR EU-RL GMFF revised guidance for testing GM rice originating from China JRC Publication JRC90142

26 Partie zawierające ryż produkty przetworzone Próbka laboratoryjna 2,5 kg 1 próbka analityczna (125g) Izolacja DNA (100 mg-1g) Analiza PCR min 20 ng/rxn EU-RL GMFF revised guidance for testing GM rice originating from China JRC Publication JRC90142

27 Interpretacja wyników Real-Time PCR EU-RL GMFF revised guidance for testing GM rice originating from China JRC Publication JRC90142

28 Literatura Measurement uncertainty arising from sampling. A guide to methods and approaches EURACHEM, Nordtest and the UK RSC Analytical Methods Committee Sampling strategies for GMO detection and/or quantification European Comission, JRC, IHCP, S.Kay, C.Paoletti Guidelines for sample preparation procedures in GMO analysis JRC Technical Report, 2014

29 Dziękuję za uwagę!