wiele aminokwasowych pochodnych indolo[2,3-b]chinoliny,

Katarzyna Sidoryk*, Wojciech J. Szczepek, Łukasz Kaczmarek Instytut Farmaceutyczny, Warszawa Synteza aminokwasowych pochodnych 6-indolo[2,3-b]chinoliny Synthesis of amino acid derivatives of 6-indolo[2,3-b]quinoline Indolo[2,3-b]chinoliny to grupa związków o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym. Badania nad kolejnymi analogami indolo[2,3-b]chinoliny są prowadzone w Instytucie Farmaceutycznym już od kilkunastu lat i zaowocowały jak do tej pory otrzymaniem ponad 100 nowych pochodnych. statnie 5 lat poświęcono badaniom nad syntezą koniugatów indolo[2,3-b]chinoliny z aminokwasami. trzymano wiele aminokwasowych pochodnych indolo[2,3-b]chinoliny, a pomyślne wyniki badań biologicznych skłaniają do kontynuowania prac badawczych. A series of new aminoacid derivatives of 6,11-dimethyl- 6-indolo[2,3-b]quinolin-2-ylamine and 6,11-dimethyl- 6-indolo[2,3-b]quinolin-9-ylamine were synthesized and studied for cytotoxic activity. The glycine and L-proline derivatives were the most efficient (3.3 and 4.3 µm). owotwory stanowią jeden z najpoważniejszych problemów współczesnej medycyny i są chorobą, która wywołuje w społeczeństwie najwięcej emocji. Postawienie diagnozy choroby nowotworowej często bowiem kojarzy się pacjentom z równoczesnym wyrokiem śmierci. I niestety są ku temu podstawy. W Polsce, po chorobach serca i naczyń, nowotwory są przyczyną największej liczby zgonów. Liczba ta cały czas rośnie, pomimo stosowania coraz lepszych metod leczenia nowotworów. W latach 90. XX w. było to 19% ogółu zgonów, a obecnie 24,5% 1). Być może wiąże się to również z większą wykrywalnością tego typu schorzeń. Metodami leczenia, oprócz od wielu lat z powodzeniem stosowanych zabiegów chirurgicznych i napromieniowania, są także metody farmakologiczne, czyli chemioterapia. Chemioterapia, za pomocą naturalnych i syntetycznych cytostatyków, rozwinęła się najbardziej w ostatnim dwudziestoleciu 2) i zaliczana jest do jednej z najtrudniejszych metod leczenia. Wynika to przede wszystkim z nieznajomości przyczyn wywołujących nowotwory, minimalnych różnic biochemicznych między komórką nowotworową a prawidłową, braku swoistości przeciwnowotworowego działania leków cytostatycznych, ich małego współczynnika leczniczego oraz toksyczności dla prawidłowych tkanek. Dużym problemem w chemioterapii jest też słaba rozpuszczalność chemioterapeutyków. W celu łatwiejszego absorbowania przez komórki nowotworowe, leki te wymagają zastosowania specjalnych rozpuszczalników, które jednak nie tylko zmniejszają działanie leków, ale mogą być także toksyczne. W Instytucie Farmaceutycznym od 1995 r. trwają badania nad nową grupą związków przeciwnowotworowych, będących pochodnymi indolochinolin. Zapoczątkowały je przeprowadzone w Instytucie Chemii rganicznej PA w Warszawie oraz w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PA we Wrocławiu w latach 80. XX w. badania, które pomogły wyselekcjonować aktywne związki przeciwnowotworowe w obrębie α-karbolin 3, 4). Prace te wykazały, że α-karboliny nie mające aktywności cytostatycznej in vitro, ograniczają in vivo wzrost mięsaka. Przeprowadzone następnie badania przemian metabolicznych α-karboliny i jej pochodnych wykazały, że związki te ulegają bioaktywacji w wyniku działania transferaz adenozyno-smetionino-zależnych, tworząc pochodne -metylowe 5, 6). Powstające pochodne, o strukturze izo-α-karbolin, wykazywały właściwości cytotoksyczne w stosunku do linii komórek KB (ludzki rak szyjki macicy) oraz hamowały rozwój bakterii i drożdży. Dalsze badania, polegające na rozbudowie trójpierścieniowego układu α-karbolin do układu czteropierścieniowego, doprowadziły do uzyskania nowej generacji cytostatyków o strukturze benzo-izo-α-karboliny (indolo[2,3-b]chinoliny 7) ), które zalicza się do syntetycznych analogów neokryptolepiny. Analogiem wykazującym największą aktywność cytostatyczną wobec komórek linii KB, rzędu ID 50 = 1 μm, była 5,11-dimetylo-5-indolo[2,3-b]chinolina (DiMIQ, rys. 1), która stała Dr Katarzyna SIDYK w roku 2001 ukończyła studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. W 2011 r. uzyskała stopień doktora nauk farmaceutycznych na Wydziale Farmaceutycznym Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. d 2001 r. pracuje w Instytucie Farmaceutycznym, w Zakładzie Chemii. Specjalność synteza organiczna, chemia peptydów. * Autor do korespondencji: Instytut Farmaceutyczny, ul. ydygiera 8, 01-793 Warszawa, tel.: (22) 456-39-15, fax: (22) 456-38-38, e-mail: k.sidoryk@ifarm.eu Dr hab. Wojciech J. SZCZEPEK w roku 1967 ukończył studia na Wydziale Chemii Uniwersytetu Warszawskiego. W latach 1968-1994 pracował na Wydziale Chemii UW, a w latach 2000-2011 na wydziale MTiW Politechniki adomskiej. d 1994 r. jest pracownikiem Instytutu Farmaceutycznego. Specjalność chemia organiczna. 264 91/3(2012)

się strukturą wiodącą do uzyskania nowych pochodnych. Badania 5,11-dimetylo-5-indolo[2,3-b]chinoliny wykazały, że wartość pk a dla tego związku wynosi 7,45, co oznacza, że w komórce (p = 7,4) występuje ona w formie protonowanej, i uważa się, że właśnie ta forma jest odpowiedzialna za jej cytotoksyczne właściwości. W badaniach in vitro udowodniono, że DiMIQ silnie interkaluje DA, stabilizuje kompleks topoizomeraza II-DA, a siła jego wiązania z DA jest uzależniona od p, czyli występowania DiMIQ w formie protonowanej. DiMIQ wykazuje znaczącą aktywność przeciwnowotworową in vitro wobec komórek mysiej białaczki, czerniaka i raka piersi. Jednak rozpuszczalność DiMIQ i jej pochodnych w roztworach wodnych jest bardzo mała (zwłaszcza w obojętnym p) i poważnie ogranicza ich praktyczne użycie i zastosowanie w leczeniu wielu nowotworów. Badania SA (structure activity relationship) w obrębie indolo[2,3-b]chinolin objęły pochodne zawierające podstawniki alkilowe, alkilo-amino-alkilowe w pozycjach C-2, C-9 i -6 oraz pochodne zawierające podstawnik fluorowy w pozycji C-2 i C-9 układu chromoforowego. Badania aktywności cytotoksycznej wobec komórek KB wykazały, że pochodne zawierające podstawniki alkilowe w pozycji -6 nie wykazują aktywności cytotoksycznej. atomiast zamiana tego podstawnika na podstawnik alkilo-amino-alkilowy powodowała pojawienie sie aktywności cytotoksycznej, a wartości ID 50 wynosiły 2 9 μm 8). Pomyślne wyniki badań związków zawierających alkilo-amino-alkilowe podstawniki w pozycji -6 chromofora indolochinolinowego zaowocowały kolejną serią pochodnych. Były to związki zawierające podstawniki dialkilo-amino-alkilowe w pozycjach C-2, C-9 i -6. Wszystkie otrzymane pochodne wykazywały aktywność cytotoksyczną wobec komórek linii KB. ID 50 dla tych związków wynosiło 2,1 9,0 μm 9). Wśród otrzymanych pochodnych indolochinolin, tylko te, które zawierały łańcuch alkilo-amino-alkilowy (a więc spełniały warunki narzucone typem budowy minor-groove binders, jako analogi biogennych amin) wykazywały znamienną aktywność cytotoksyczną oraz zdolność do hamowania aktywności topo izomerazy II (rys. 1). = = =, = = = nieaktywne (seria 6-) = ( C 3)2 ()2, 3 = ID 50 =5,1 =, 3 = ( C 3)2 (C ID 3)2 50 =2,1 aktywne (seria 6-) Prof. dr hab. Łukasz KACZMAEK w roku 1973 ukończył Wydział Matematyki, Fizyki i Chemii Uniwersytetu Jagiellońskiego. W latach 1974-1994 pracował w Instytucie Chemii rganicznej PA, a od roku 1995 jest zatrudniony w Instytucie Farmaceutycznym, obecnie na stanowisku profesora zwyczajnego. Jest kierownikiem Zakładu Chemii. Specjalność synteza organiczna. 3 4 Kolejne modyfikacje struktury polegały na wprowadzeniu do szkieletu chromofora w pozycje C-2, C-9 i -6 podstawników alkiloamino-alkilowych połączonych z pierścieniem indolo[2,3-b]chinolinowym poprzez atom azotu, za pośrednictwem wiązania amidowego lub poprzez wiązanie eterowe 10). Wprowadzenie tych podstawników do nieaktywnej 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny spowodowało, jak wykazały badania biologiczne in vitro na komórkach linii KB, pojawienie się aktywności cytotoksycznej. Wartości ID 50 otrzymanych pochodnych wahały się od kilku do kilkunastu mikromoli. Z kolei wprowadzenie tych podstawników do aktywnej cytotoksycznie DiMIQ spowodowało duży wzrost aktywności cytotoksycznej. Wszystkie pochodne wykazały znamienną aktywność cytotoksyczną, przewyższającą aktywność związków referencyjnych (rys. 2) 11). Badania SA w obrębie indolo[2,3-b]chinolin objęły również pochodne cukrowe i aminocukrowe. Spodziewano się tu wzrostu rozpuszczalności otrzymanych pochodnych w wodzie oraz wzrostu aktywności cytotoksycznej, za który odpowiedzialna mogłaby być reszta cukrowa, co ma miejsce w antracyklinach, w których aminocukier układa się w mniejszej bruździe DA. trzymano wiele pochodnych cukrowych (deoksy-glukozylowych, deoksy-ramnozylowych, deoksy-laktozylowych) oraz aminocukrowych (daunozaminylowych i akozaminylowych) 6-indolochinoliny. kazało się, że żadna z pochodnych cukrowych 6-indolochinoliny nie spełnia warunków cytotoksyczności. Dopiero w obrębie pochodnych zawierających aminocukry jako podstawniki wartości ID 50 spełniały wobec komórek linii KB kryterium cytotoksyczności i wynosiły od kilku do kilkunastu mikromoli 12, 13). 3 3 = 4 = DiMIQ ID 50 = 1 3 = 4 = ID 50 = 2 3 = 4 = ID 50 = 1 aktywne (seria 5-) ys. 1. Wpływ podstawników metylowych, metoksylowych i alkiloaminoalikilowych na aktywność cytotoksyczną indolo[2,3-b]chinoliny (ID 50 dawka powodująca zahamowanie proliferacji 50% populacji komórek nowotworowych, μm) Fig. 1. Effect of methyl, methoxy and alkylaminoalkyl substituents on the cytotoxic activity of indolo[2,3- b]quinoline (ID 50 the dose of a compound that inhibiting proliferation rate of tumor cells by 50% as compared to control untreated cells, μm) 3 = -C(C 2 ) 2 ( ) 2, =, 3 = ID 50 = 4,5 =, = -CC 2 (C 2 ) 2, 3 = ID 50 = 8 =, = -(C 2 ) 2 (C 2 ) 2, 3 = ID 50 = 1 =, = -CC 2 ( ) 2, 3 = -(C 2 ) 2 ( ) 2 ID 50 = 0,15 Przeprowadzone badania in vivo wyselekcjonowanych pochodnych indolochinoliny, wśród których znalazły się zarówno aminocukrowe, jak i aminowe pochodne 5,11-dimetylo-5indolo[2,3-b]chinoliny nie przyniosły jednak zadowalających wyników. kazało się, że problem stanowi nie tylko mała rozpuszczalność otrzymanych koniugatów, ale przede wszystkim ich duża toksyczność. W badaniach in vivo pochodne te w niskich dawkach nie wykazywały aktywności przeciwnowotworowej, a w wysokich dawkach okazały się zbyt toksyczne 14). Chcąc uniknąć problemów związanych ze słabą rozpuszczalnością większości otrzymanych do tej pory pochodnych indolo[2,3-b]chinolin, a przede wszystkim, by zmniejszyć toksyczość pochodnych indolochinolin podjęto dalsze badania. Miały one na celu znalezienie pochodnych o zachowanej bądź wyższej aktywności przeciwnowotworowej oraz obniżonej toksyczności. Do budowy koniugatów z chromoforami indolochinolinowymi wybrano aminokwasy i peptydy. W literaturze można bowiem znaleźć wiele doniesień na temat tworzenia koniugatów aminokwasów i peptydów z liczną grupą stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowych. Aminokwasy i peptydy wykorzystuje się, łącząc je w koniugaty z lekami w celu zwiększenia selektywności działania danego leku, zmniejszenia toksyczności oraz zwiększenia biodostęp- = -C(C 2 ) 2 ( ) 2, =, ID 50 = 0,46 = -CC 2 ( ) 2, =, ID 50 = 0,81 =, = -(C 2 ) 2 ( ) 2, ID 50 = 0,25 ys. 2. Cytotoksyczność wybranych pochodnych indolo[2,3-b]chinoliny (wartości ID 50, μm) Fig. 2. Cytotoxic activity of selected derivatives of indolo[2,3-b]quinoline (ID 50, μm) 91/3(2012) 265

ności. Koniugat aminokwas/peptyd-lek jest swego rodzaju prolekiem, a sama cząsteczka aminokwasu/peptydu ma za zadanie dostarczyć lek (często pokonać barierę krew-mózg) do miejsca działania. kreślenie prolek zostało po raz pierwszy użyte przez Alberta 15) w stosunku do związku nieaktywnego farmakologicznie, który w wyniku farmakologicznej biotransformacji stał się aktywnym lekiem. Jednak koncepcję proleku stworzył już w 1908 r. Paul Ehrlich, niemiecki uczony, jeden z głównych twórców idei chemioterapii i zdobywca agrody obla za pomysł magicznego pocisku 16). Ten magiczny pocisk był średniowiecznym ideałem leku, wypędzającego diabła z ciała opętanego bez czynienia szkody pokrzywdzonemu. aukowcy szukają magicznego pocisku całe dekady do dzisiaj, niestety ciągle bezskutecznie. Magiczny przeciwnowotworowy pocisk powinien bowiem zabijać tylko i wyłącznie komórki nowotworowe, oszczędzając komórki prawidłowe. Koniugaty aminokwas/peptyd-lek, będące prolekami, wykazują selektywną aktywność biologiczną. W wielu przypadkach wiąże się to ze zmniejszoną toksycznością, która może wynikać z ich bardziej zróżnicowanego i specyficznego działania ukierunkowanego na tkankę nowotworową. W zależności od rodzaju przyłączonego aminokwasu bądź peptydu do leku, powstały prolek ulega aktywacji wg różnych mechanizmów. Podstawowy mechanizm uwalniania leku z połączenia z aminokwasem lub peptydem oparty jest na reakcjach enzymatycznych. eakcjom hydrolizy stosunkowo łatwo ulegają wiązania peptydowe, co często stanowi duży problem, zwłaszcza gdy sam peptyd jest lekiem. W tym jednak przypadku taki sposób uwalniania leku jest jego ogromną zaletą. Stwierdzono, że we wnętrzu tkanki nowotworowej, w odróżnieniu do zdrowych tkanek, występuje duże stężenie aminopeptydaz. Enzymy te hydrolizując wiązanie aminokwas-lek, aktywują tym samym lek już we wnętrzu tkanki nowotworowej. bserwuje się przy tym zmniejszoną kardiotoksyczność, tak bardzo charakterystyczną np. dla antracyklin. Pierwsze doniesienia na temat tworzenia koniugatów antracyklin z aminokwasami pojawiły się już w latach 80. XX w. Dobrymi przykładami takich koniugatów są połączenia daunorubicyny i doksorubicyny z glicyną, alaniną, leucyną, izoleucyną, waliną i dipeptydami, takimi jak alanyloalanina, alanyloleucyna i glicyloleucyna 17). a szczególną uwagę zasługuje koniugat leucyny z doksorubicyną, który spośród wszystkich tego typu połączeń wykazał najmniejszą kumulację wolnej doksorubicyny w tkance mięśnia sercowego (rys. 3) 18, 19). Przykładem prekursora leku korzystającego z peptydowego nośnika jest również koniugat doksorubicyny z -glutarylo-(4- hydroksyprolilo)-l-ala-l-ser-cykloheksyloglicylo-l-glu-l-ser-l- -Leu (czyli L-377,202), a także z peptydem L-is-L-Ser-L-Ser-L- -Lys-L-Leu-L-Gln. Prekursory te ulegają aktywacji przez specyficzny antygen PSA (prostate-specific antigen) o aktywności proteazowej, stając się tym samym lekiem specyficznym dla nowotworu prostaty. Przeprowadzone badania wykazały, że lek ten jest kilkunastokrotnie bardziej efektywny w hamowaniu wzrostu raka prostaty niż konwencjonalna doksorubicyna, wykazując przy tym dużą selektywność oraz znacznie mniejszą kardiotoksyczność 20, 21). Innym równie obiecującym związkiem, należącym do grupy leków aktywowanych pozakomórkowo, jest -β-ala-l-leu-l-ala-l-leu- -doksorubicyna (rys. 3). Związek ten, dzięki obecności reszty β-ala nie Leu Ala-L-Leu-L-Ala-L-Leu ys. 3. Struktury -L-Leu-doksorubicyny i -β-ala-l-leu-l-ala-l-leu-doksorubicyny Fig. 3. Structures of -L-Leu-doxorubicin and -β-ala-l-leu-l-ala-l-leu-doxorubicin ulega hydrolizie we krwi, ale również nie ma zdolności wchodzenia do komórek. Jego aktywacja, podobnie jak w przypadku L-377,202, polega na hydrolizie do -L-Ala-L-Leu-doksorubicyny lub do L-Leu- -doksorubicyny, które mają zdolność do przechodzenia przez błony komórek nowotworowych 22, 23). Kolejne badania wykorzystujące peptydy do tworzenia koniugatów z lekami przeciwnowotworowymi były zapoczątkowane przez uoslahti 24). Do tworzenia koniugatów z doksorubicyną wykorzystał on bardzo popularne w ostatniej dekadzie XX w. peptydy GD (L-Arg- -Gly-L-Asp) oraz G (L-Asn-Gly-L-Arg). Peptydy te pełnią funkcję swoistych dostarczycieli leku do określonych komórek w organizmie, a ponadto uczestniczą również w zahamowaniu angiogenezy nowotworu oraz w tworzeniu przerzutów 25, 26). Do tworzenia koniugatów z lekami przeciwnowotworowymi wykorzystano także peptydy mające zdolność przenikania bariery krew-mózg, której to zdolności nie ma większość stosowanych cytostatyków. Przeprowadzono syntezy wielu koniugatów takich peptydów, jak neuropeptyd Y, kalcytonina, somatostatyna, L- (gonadoliberyna) i bombezyna z cytostatykami, w których to koniugatach peptydy lub hormony peptydowe pełnią funkcję wektorów transportujących lek przez barierę krew-mózg 27 30). Użycie tych peptydów jako wektorów w koniugatach z doksorubicyną ułatwiło przenikanie leku przez barierę krew-mózg i spowodowało zahamowanie wzrostu nowotworu przy zmniejszonej cytotoksyczności. Biorąc pod uwagę powyższe przykłady zastosowań aminokwasów i peptydów do tworzenia koniugatów z lekami, jak najbardziej słuszne i zasadne było wybranie tych cząsteczek do utworzenia ich koniugatów z indolochinolinami. Aminokwasowe pochodne 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny Celem pracy była synteza nowego typu pochodnych, to jest aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny (I), o potencjalnej aktywności cytotoksycznej (rys. 4). ależało sprawdzić, czy w wyniku dołączenia podstawników aminokwasowych do szkieletu nieaktywnego cytotoksycznie związku (I) można otrzymać cytotoksyczne hybrydy. Wśród aminokwasów, które zdecydowano się połączyć z 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliną znalazły się zarówno aminokwasy o charakterze hydrofilowym, jak i hydrofobowym. Prace obejmowały syntezę pochodnych 6,11-dimetylo-6- -indolo[2,3-b]chinoliny sfunkcjonalizowanych grupą 2 w pozycjach 9 i 2 (ponieważ największy wpływ na oddziaływanie indolochinolin z DA wywierają podstawniki w pozycjach 2, 6 i 9 układu), a następnie reakcje sprzęgania tych amin (po wybraniu najkorzystniejszej metody sprzęgania) z α -Boc- -glicyną i α -Boc-L-aminokwasami. Zostały one też poszerzone o syntezę 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny sfunkcjonalizowanej grupą karboksylową w pozycji 9 oraz jej aminokwasowych pochodnych. Ważnym elementem całej pracy były prowadzone na bieżąco badania biologiczne na aktywność cytotoksyczną wobec linii komórkowej KB nowych pochodnych aminokwasowych wymienionych indolo[2,3-b]chinolin. Co ważne, synteza kolejnych serii pochodnych i wybór amino- 266 91/3(2012) (I) (II) ys. 4. 6,11-Dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolina (I) i 5,11-dimetylo-5indolo[2,3-b]chinolina (DiMIQ, II) Fig. 4. 6,11-Dimethyl-6-indolo[2,3-b]quinoline (I) and 5,11-dimethyl-5indolo[2,3-b]quinoline (DiMIQ, II)

kwasów do tworzenia koniugatów z chromoforami indolochinolinowymi była zawsze ściśle uzależniona od wyników badań aktywności cytotoksycznej poprzednich serii związków. Badania biologiczne wykonywano w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PA we Wrocławiu. Przeprowadzono również badania biologiczne otrzymanych pochodnych na aktywność przeciwdrobnoustrojową, które wykonano w Zakładzie Mikrobiologii Farmaceutycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego. Szczegółowe etapy pracy syntetycznej objęły: syntezę 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin sfunkcjonalizowanych grupą aminową w pozycjach 9 i 2, syntezę aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminy i 6,11-dimetylo- -6-indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminy, syntezę kwasu 6,11-dimetylo- -6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego i jego aminokwasowych pochodnych oraz badania biologiczne in vitro na aktywność przeciwnowotworową i przeciwdrobnoustrojową aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny. Synteza aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminy i 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminy Pierwszy etap prac badawczych obejmował syntezę 2-aminozwiazku (1) i 9-aminozwiązku (2), które otrzymano wg już opisanych procedur 10, 11), a następnie wykorzystano do budowy koniugatów z aminokwasami (rys. 5 i 6). W celu otrzymania pochodnych aminokwasowych zsyntetyzowane aminy (1) i (2) kondensowano z α -zabezpieczonymi aminokwasami wybranymi metodami sprzęgania zaczerpniętymi z chemii peptydów. Pracę rozpoczęto od wybrania najlepszej metody sprzęgania, którą potem zamierzano zastosować do pozostałych reakcji kondesacji α -blokowanych aminokwasów z chromoforami indolochinolinowymi. Sprawdzono 3 metody sprzęgania: metodę mieszanych bezwodników, metodę karbodiimidową z dodatkiem -hydroksybenzotriazolu oraz metodę soli uroniowych również z dodatkiem -hydroksybenzotriazolu 31). Modelową reakcją była kondensacja α -tert-butyloksykarbonylo-l- -leucyny z 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminą (2). W świetle otrzymanych wyników, biorąc pod uwagę wydajności reakcji sprzęgania, czystość produktu końcowego, czas trwania reakcji, a także same warunki reakcji (w metodzie mieszanych bezwodników konieczna jest bardzo niska temperatura) zdecydowano, że najkorzystniejszą metodą w syntezie pochodnych aminokwasowych aminoindolochinolin jest metoda soli uroniowych z zastosowaniem TBTU/Bt. Do reakcji sprzęgania wykorzystano handlowe α -tert- -butyloksykarbonyloaminokwasy (Boc-aminokwasy, Boc-AA). W przypadku przyłączania aminokwasów dwufunkcyjnych oprócz stosowania ochrony tert-butyloksykarbonylowej (Boc) dla grupy α-aminowej konieczne było również stosowanie dodatkowych ochron dla grup hydroksylowej, karboksylowej i aminowej w łańcuchach bocznych aminokwasów. Takimi pochodnymi były: -benzylo- α -tert-butyloksykarbonylo-l-seryna, kwas -benzylo- α -tert-butyloksykarbonylo-l-asparaginowy i α, ε - -di-tert-butyloksykarbonylo-l-lizyna. eakcje sprzęgania Boc-AA z 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminą (1) (rys. 5) zachodziły bez komplikacji i doprowadziły do otrzymania pochodnych 3 8. eakcje te przebiegały z dobrymi wydajnościami, ale w większości przypadków niezbędne było oczyszczanie tych związków za pomocą chromatografii kolumnowej. W kolejnym etapie usunięto grupy zabezpieczające Boc za pomocą roztworu chlorowodoru w metanolu. trzymano w ten sposób związki finalne 3a 8a, które wydzielono w postaci chlorowodorków, a następnie krystalizowano najczęściej z octanu etylu. eakcje sprzęgania Boc-AA z 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin- -9-yloaminą (2) doprowadziły do otrzymania pochodnych 9 18 (rys. 6). Wszystkie reakcje sprzęgania przebiegały z dobrymi wydajnościami. Jednak również i w tym przypadku konieczne było oczyszczanie otrzymanych pochodnych za pomocą chromatografii kolumnowej. Kolejnym etapem w syntezie związków docelowych było usunięcie grupy tert-butyloksykarbonylowej (Boc) zabezpieczającej grupy aminowe otrzymanych pochodnych, a także ewentualne 2 1 Boc-AA TBTU / Bt / DIEA 3 = Boc-Gly- 4 = Boc-L-Leu- 5 = Boc-L-Pro- 6 = Boc-L-Met- 7 = Boc-L-Lys(Boc)- 8 = Boc-L-is- Cl / Me 3a = Gly- 4a = L-Leu- 5a = L-Pro- 6a = L-Met- 7a = L-Lys- 8a = L-is- ys. 5. gólna metoda syntezy aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminy Fig. 5. The general method for synthesis of amino acid derivatives of 6,11-dimethyl-6-indolo[2,3-b]quinolin-2-ylamine 2 Boc-AA Cl/Me 2 TBTU,Bt,DIEA C 9 = Boc-Gly- 3 10 = Boc-L-Ala- 11 = Boc-L-Leu- 12 = Boc-L-Pro- 13 = Boc-L-Met- 14 = Boc-L-Lys(Boc)- 15 = Boc-L-is- 16 = Boc-L-Phe- 17 = Boc-L-Ser(Bzl)- 18 = Boc-L-Asp(Bzl)- 9a = Gly- 10a = L-Ala- 11a = L-Leu- 12a = L-Pro- 13a = L-Met- 14a = L-Lys- 15a = L-is- 16a = L-Phe- ys. 6. gólna metoda syntezy aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminy Fig. 6. The general method for synthesis of amino acid derivatives of 6,11-dimethyl-6-indolo[2,3-b]quinolin-9-ylamine 91/3(2012) 267

usunięcie grup zabezpieczających w łańcuchach bocznych aminokwasów. Dla związków 9 16 reakcja deprotekcji za pomocą roztworu chlorowodoru w metanolu przebiegała dobrze, a produkty finalne 9a 16a wydzielono w postaci chlorowodorków 32 34) (rys. 6). W przypadku pochodnej 17 najpierw usunięto grupę benzylową zabezpieczającą grupę hydroksylową w łańcuchu bocznym L-seryny (rys. 7). eakcję katalitycznego wodorowania, ze względu na małą rozpuszczalność pochodnej 17, prowadzono w dimetyloformamidzie (DMF) w obecności 5% Pd/C w temperaturze pokojowej, uzyskując produkt 17a, a po usunięciu grupy Boc otrzymano docelowy związek 17b. W przypadku związku 18, będącego pochodną kwasu asparaginowego, konieczne było odwrócenie kolejności usuwania grup ochronnych (rys. 7). I tak, najpierw usunięto grupę Boc, otrzymując z dobrą wydajnością pochodną 18a, a następnie na drodze katalitycznego wodorowania usunięto grupę benzylową i otrzymano związek finalny 18b. dwrotna kolejność usuwania ochron powodowała, że w trakcie końcowej reakcji usuwania grupy Boc powstawało wiele różnych zanieczyszczeń. Prawdopodobnie wśród nich był też cykliczny związek aspartaimid, którego powstawanie w warunkach kwaśnych lub zasadowych jest znaną reakcją uboczną w syntezie peptydów zawierających kwas asparaginowy 35). trzymane produkty końcowe 17b i 18b wydzielano także w postaci chlorowodorków 32 34). Synteza pochodnych aminokwasowych kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego W trakcie prac badawczych pojawił się pomysł, aby sprawdzić jak zmieni się aktywność cytotoksyczna koniugatów aminokwasów z chromoforem indolochinolinowym, gdy przyłączy się aminokwas poprzez jego grupę aminową, a nie jak w poprzednich seriach związków końcowych poprzez grupę karboksylową aminokwasu. W tym celu należało otrzymać chromofory indolochinolinowe sfunkcjonalizowane grupą karboksylową, a nie jak do tej pory grupą aminową, by w następnej kolejności sprzęgać odpowiednie estry aminokwasów z kwasem indolochinolinokarboksylowym. trzymanie kwasu indolochinolinokarboksylowego okazało się trudne, ponieważ niemożliwe było wprowadzenie grupy karboksylowej na wcześniejszych etapach syntezy szkieletu indolo[2,3-b] chinolinowego. Wprowadzenie tej grupy do gotowego już szkieletu chromoforowego możliwe było w zasadzie jedynie w reakcji acylowania Friedela i Craftsa z dalszym utlenieniem powstającego ugrupowania metyloketonowego. Acetylowanie 6,11-dimetylo-6- -indolo[2,3-b]chinoliny mogło prowadzić wyłącznie do acetylowej pochodnej w pozycji C-9, podobnie jak wprowadzenie grupy nitrowej w reakcji nitrowania. Zatem istniała szansa sfunkcjonalizowania szkieletu indolochinolinowego podstawnikiem karboksylowym jedynie w położeniu C-9. Związkiem wyjściowym do tej syntezy była 6,11-dimetylo-6- -indolo[2,3-b]chinolina (19), którą otrzymano wg znanej procedury 9). Związek 19 acylowano chlorkiem acetylu w obecności bezwodnego chlorku glinu w różnych rozpuszczalnikach (nitrobenzenie, chloroformie i w chlorku metylenu) oraz w różnych temperaturach. Zastosowanie jako medium reakcyjnego nitrobenzenu lub chloroformu, pomimo stosowania wyższych temperatur 40 50 C, oraz pomimo wydłużania czasu reakcji nawet do 48 h, dawało niską wydajność produktu. ajkorzystniejsze okazało się prowadzenie tej reakcji w chlorku metylenu, w temperaturze pokojowej, przez 24 h. Surowy produkt, będący kompleksem z chlorkiem glinu, rozłożono dodając do mieszaniny reakcyjnej wodę i przemywając wydzieloną warstwę organiczną roztworem wodorotlenku sodu i wodą. trzymaną w ten sposób 9-acetylo-6,11-dimetylo-6-indolo[2,3- -b]chinolinę (20) krystalizowano z octanu etylu, otrzymując czysty produkt. Strukturę związku 20 potwierdzono za pomocą widma 1 M. Utlenienie grupy acetylowej w związku 20 do grupy karboksylowej przeprowadzono w reakcji haloformowej. eakcję utleniania prowadzono w dioksanie, stosując brom i 3 M roztwór wodorotlenku potasu. statecznie otrzymano kwas 6,11-dimetylo- -6-indolo[2,3-b]-chinolino-9-karboksylowy (21, rys. 8) w postaci żółtych kryształów. Użycie w reakcji haloformowej słabszej zasady (takiej jak wodorotlenek sodu) powodowało, że reakcja w ogóle nie zachodziła. Strukturę otrzymanego kwasu 21 potwierdzono metodami spektroskopii I oraz 1 M 34). eakcje sprzęgania estrów metylowych glicyny, L-proliny i L-histydyny z kwasem 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]-chinolino- -9-karboksylowym (21) przeprowadzono metodą TBTU/Bt 2 /Pd Cl/Me 17 = Boc-L-Ser(Bzl)- 17a = Boc-L-Ser- 17b = L-Ser- Cl/Me 2 /Pd 18 = Boc-L-Asp(Bzl)- 18a = L-Asp(Bzl)- 18b = L-Asp- ys. 7. Końcowe etapy otrzymywania związków 17b i 18b Fig. 7. The final steps of a synthesis of compounds 17b and 18b CCl, AlCl 3 C (19) 3 (20) C Br 2, K, dioksan (21) C ys. 8. Synteza kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego Fig. 8. The synthesis of the 6,11-dimethyl-6-indolo[2,3-b]quinoline-9-carboxylic acid 268 91/3(2012)

(rys. 9). trzymane w wyniku sprzęgania związki 22 24 wymagały oczyszczania chromatograficznego i końcowe wydajności tych reakcji były dość niskie, rzędu 30 45%. atomiast reakcje hydrolizy estrów metylowych wymienionych pochodnych przebiegały z wysokimi wydajnościami. eakcje te prowadzono w 5 M roztworze wodorotlenku sodu, w obecności dimetyloformamidu i w temperaturze pokojowej, po czym zakwaszano mieszaniny poreakcyjne. trzymane w ten sposób pochodne 22a 24a zadano następnie roztworem chlorowodoru w metanolu i wyodrębniono je w postaci chlorowodorków. prócz sprzęgania estrów metylowych aminokwasów z kwasem 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]-chinolino-9-karboksylowym (21), przeprowadzono również reakcje sprzęgania tego kwasu z amidem glicyny oraz amidem L-proliny (rys. 9). eakcje te zachodziły jednak z małymi wydajnościami, rzędu 20 50%, i mimo przedłużania czasu reakcji w mieszaninie reakcyjnej pozostawał ciągle nieprzereagowany kwas 21. W ten sposób otrzymano związki końcowe 25 i 26, które wyodrębniono w postaci chlorowodorków. Badania rozpuszczalności w wodzie aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny Spośród wszystkich otrzymanych pochodnych aminokwasowych chinoliny I wybrano kilka i zbadano ich rozpuszczalność w wodzie wg zaleceń Europejskiej Farmakopei 36). Związki referencyjne chinolina I oraz DiMIQ II (rys. 4) okazały się praktycznie nierozpuszczalne w wodzie. Pochodne aminokwasowe 6-indolochinoliny wykazywały dobrą i bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie. Zatem przyłączenie aminokwasu do praktycznie nierozpuszczalnego w wodzie związku referencyjnego I spowodowało bardzo duży wzrost rozpuszczalności w wodzie otrzymanego koniugatu, co może zaowocować zwiększeniem biodostępności takiego koniugatu. Badania biologiczne trzymane serie aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo- -6-indolo[2,3-b]chinoliny zostały przebadane in vitro pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz przeciwnowotworowej. Do badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej wybranych pochodnych indolochinoliny użyto bakterii Gram-dodatnich, pałeczek Gram-ujemnych oraz drożdżaków. Badania aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybicznej wykazały, że aktywność tę wykazywała większość spośród przebadanych chlorowodorków aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b] chinoliny. ajwyższą aktywnością, 13 45 µg/ml, odznaczały się pochodne 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminy i 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminy zawierające jako podstawnik glicynę lub L-prolinę. atomiast pochodne kwasu 6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego nie wykazywały aktywności przeciwbakteryjnej. Wyniki badań aktywności cytotoksycznej in vitro wobec komórek ludzkiego raka szyjki macicy (KB) aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinoliny były bardzo zróżnicowane. Przede wszystkim, wszystkie pochodne 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-2-yloaminy i 6,11-dimetylo-6- -indolo[2,3-b]chinolin-9-yloaminy zawierające zabezpieczoną grupę α -aminową aminokwasu okazały się nieaktywne cytotoksycznie. Kryterium cytotoksyczności spełniły wyłącznie chlorowodorki aminokwasowych pochodnych 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b] chinolin-2-yloaminy i 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolin-9- -yloaminy i, co więcej, nadały nieaktywnemu chromoforowi znaczącą aktywność cytotoksyczną. Dla 2-podstawionych pochodnych aktywność antyproliferacyjna malała w szeregu: L-Pro > L-is > Gly >> L-Leu > L-Lys ~ L-Met, a dla pochodnych 9-podstawionych w szeregu: Gly > L-is > L-Ser >> L-Met ~ L-Pro ~ L-Phe ~ L-Asn. ajwyższą aktywność cytotoksyczną, porównywalną do związku referencyjnego DiMIQ, miały koniugaty 6,11-dimetylo- -6-indolo[2,3-b]chinoliny (chromofor nieaktywny cytotoksycznie) z glicyną w pozycji 9 (9a, ID 50 = 3,32 μm) i z L-proliną w pozycji 2 (5a, ID 50 = 4,39 μm). Dużą aktywność cytotoksyczną wykazały też koniugaty zawierające L-histydynę (8a) i glicynę (3a) w pozycji 2 oraz koniugaty zawierające L-histydynę (15a) i L-serynę (17b) w pozycji 9. Wartości ID 50 dla tych pochodnych zawierały się w przedziale 5,96 10,77 μm. Z kolei przyłączenie odpowiednich aminokwasów poprzez ich grupę α -aminową do kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego (21) dało koniugaty nieaktywne cytotoksycznie. Dotyczy to zarówno estrów metylowych przyłączonych aminokwasów do kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego, jak i aminokwasowych pochodnych kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego z wolną grupą karboksylową. ajaktywniejsze cytotoksycznie wobec komórek nowotworowych linii KB aminokwasowe pochodne 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b] chinoliny poddano badaniom wobec komórek ludzkich linii nowotworowych: raka płuca (A549), raka piersi (MCF-7) oraz raka jelita grubego (LV). Dodatkowo przeprowadzono również badania aktywności antyproliferacyjnej tych związków wobec komórek zdrowych, czyli mysich fibroblastów (Balb/3T3). Pochodne 5a i 9a zawierające jako podstawniki odpowiednio L-prolinę i glicynę wykazały podobną cytotoksyczność wobec komórek prawidłowych Balb/3T3 do cytotoksyczności cisplatyny. Jednocześnie związki te wykazały nieco większą aktywność antyproliferacyjną wobec komórek nowotworowych. Podsumowanie Przebadanie końcowych produktów pod względem aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz przeciwnowotworowej in vitro dało obraz kształtowania się aktywności tych związków w zależności od miejsca podstawienia 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b] chinoliny, rodzaju reszty aminokwasowej czy sposobu przyłączenia C AA- lub AA- 2 a TBTU / Bt / DIEA 21 22 = -Gly 23 = -L-Pro 24 = -L-is 25 = -Gly 2 26 = -L-Pro 2 22a = -Gly 23a = -L-Pro 24a = -L-is ys. 9. gólna metoda syntezy aminokwasowych pochodnych kwasu 6,11-dimetylo-6-indolo[2,3-b]chinolino-9-karboksylowego Fig. 9. The general method for the synthesis of amino acid derivatives of 6,11-dimethyl-6-indolo[2,3-b]quinoline-9-carboxylic acid 91/3(2012) 269

aminokwasu do pierścienia indolochinolinowego (poprzez grupę karboksylową bądź grupę α-aminową aminokwasu). Badania te pozwoliły wyselekcjonować kilka aminokwasów nadających nieaktywnemu chromoforowi wysoką aktywność. Użyto ich później do utworzenia koniugatów z aktywnym chromoforem 5,11-dimetylo-5- -indolo[2,3-b]chinolinowym 34, 37). Pierwsze wyniki badań aktywności przeciwnowotworowej in vitro oraz in vivo w modelu mysiego raka płuc (LLC) są bardzo obiecujące. Koniugaty te odznaczają się dużą aktywnością przeciwnowotworową przy obniżonej toksyczności. Zdecydowanie lepsza rozpuszczalność w wodzie aminokwasowych i peptydowych pochodnych 5,11-dimetylo-5-indolo[2,3-b]chinoliny potwierdza również zasadność użycia aminokwasów do budowy koniugatów. Pomyślne wyniki testów biologicznych skłaniają do dalszych badań w obrębie tej grupy pochodnych. Dotychczasowe wyniki syntezy stanowią cenny materiał dotyczący projektowania drogi syntezy nowych pochodnych indolo[2,3-b]chinoliny. Materiał ten z powodzeniem może być wykorzystany w badaniach dotyczących kolejnych modyfikacji chemicznych struktury wiodącej DiMIQ. Wyniki powyższych badań były podstawą jednej rozprawy doktorskiej wykonanej w Instytucie Farmaceutycznym 34) oraz przedmiotem dwóch zgłoszeń patentowych 33, 37). Zaprezentowane badania były finansowane w ramach badań statutowych Instytutu Farmaceutycznego (projekt IF, nr 1427,04). Podziękowania Autorzy składają serdeczne podziękowania pani prof. dr hab. Wandzie Peczyńskiej-Czoch z Zakładu Chemii rganicznej Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej oraz zespołowi pani dr hab. Joanny Wietrzyk z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PA we Wrocławiu za wykonanie badań biologicznych oraz wiele cennych wskazówek. trzymano:13-09-2011 LITEATUA 1. J. leński,. Dmochowska i in., ocznik demograficzny, GUS, Warszawa 2009 r. 2. K. rzechowska-juzwenko, Zarys chemioterapii nowotworów narządowych i układowych, Wrocław 2000 r. 3. Ł. Kaczmarek, P. antka-amirski, Pol. J. Pharmacol. Pharm. 1981, 33, 121. 4. J. Wieczorek, W. Peczyńska-Czoch, M. Mordarski, Ł. Kaczmarek, P. antka-amirski, Arch. Immun. Ther. Exp. 1986, 34, 315. 5. W. Peczyńska-Czoch, M. Mordarski, Ł. Kaczmarek, P. antka-amirski, Arch. Immun. Ther. Exp., 1987, 35, 89. 6. W. Peczyńska-Czoch, Arch. Immunol. Ther. Exp. 1987, 35, 97. 7. Ł. Kaczmarek,. Balicki, P. antka-amirski, W. Peczyńska-Czoch, M. Mordarski, Arch. Pharm. (Weinheim) 1988, 321, 463. 8. Ł. Kaczmarek, W. Łuniewski, B. Zagrodzki, J. Godlewska, J. siadacz, J. Wietrzyk, A. polski, W. Peczyńska-Czoch, Acta Polon. Pharm. 2002, 59, 199. 9. J. Godlewska, W. Łuniewski, B. Zagrodzki, Ł. Kaczmarek, A. Bielawska- Pohl, D. Dus, J. Wietrzyk, A. polski, M. Siwko, A. Jaromin, A. Jakubiak, A. Kozubek, W. Peczyńska-Czoch, Anticancer es. 2005, 25, 2857. 10. B. Zagrodzki, Synteza i wstępna ocena biologiczna (dialkiloamino) alkiloaminowych i (dialkiloamino)acyloaminowych pochodnych 6-indolo[2,3-b]chinoliny, jako nowej klasy związków o właściwościach przeciwnowotworowych, ozprawa doktorska, Wydz. Farmaceutyczny WUM, Warszawa 2001 r. 11. W. Łuniewski, Synteza nowych pochodnych 5- i 6-indolo[2,3-b] chinoliny o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym, ozprawa doktorska, Wydz. Farmaceutyczny WUM, Warszawa 2005 r. 12. J. Godlewska, K. Badowska-osłonek, J. amza, Ł. Kaczmarek, W. Peczyńska-Czoch, A. polski, adiol. ncol. 2004, 38, 137. 13. K. Badowska-osłonek, Ł. Kaczmarek, J. amza, J. Godlewska, A. polski, W. Peczyńska-Czoch, Polish J. Chem. 2005, 79, 369. 14. Dane niepublikowane. 15. A. Albert, ature 1958, 182, 421. 16. J. Valentino,. Borchardt, J. ageman,. liyai,. Maag, J. Tilley, Vincent de Groot, Prodrugs. Challenges and rewards, targeting cancer small molecules, Springer, 2007 r. 17.. Baurain, M. Masquelier, D. Deprez-De Campeneere, A. Trouet, J. Med. Chem. 1980, 23, 1171. 18. K. Breistol,.. endriks,. Fodstad, Eur. J. Cancer 1999, 35, 1143. 19. K. Breistol,.. endriks, D.P. Berger, S.P. Langdon,.. Fiebig, Eur. J. Cancer 1998, 34, 1602. 20. K. Krohn, M. Arcamone, Anthracycline. Chemistry and biology Part II, Mode of action, clinical aspects and new drugs, Spinger, 2008 r. 21. C. Monneret, Eur. J. Med. Chem. 2001, 36, 483. 22. V. Dubois, L. Dasnois, K. Lebtahi, F. Collot,. avaux, A. Fernandez, M. ieder, D. Shochat, A. Trouet, Cancer es. 2002, 62, 2327. 23. D. avel, V. Dubois, J. Quinonero, F. Meyer-Losic, J. Delord, P. ochaix, C. icolazzi, F. ibes, C. Mazerolles, E. Assouly, K. Vialatte, I. or, J. Kearsey, A. Trouet, Clin. Cancer es. 2008, 15, 1258. 24. E. Koivunen, B. Wang, E. uoslahti, J. Cell Biol. 1994, 124, 373. 25. F. Giancotti, E. uoslahti, Science 1999, 285, 1028. 26. Y. ensbergen,.j. Broxterman, Y.W. Elderkamp, J. Lankelma, J.C. Beers, M. eijn, E. Boven, K. oekman,.m. Pinedo, Biochem. Pharmacol. 2002, 63, 897. 27. C. ousselle, P. Clair, J.M. Lefauconnier, M. Kaczorek, J.M. Scherrmann, J. Temsamani, Mol. Pharmacol. 2000, 57, 679. 28. U. Krauss, F. Kratz, G. Sickonger, J. Mol. ecognit. 2003, 16, 280. 29. A.V. Shally, A. agy, Life Sci. 2003, 72, 2305 30. A. agy, P. Armatis,. Cai, K. Szepeshazi, G. almos, A. Schally, Proc. at. Acad. Sci. U.S.A. 1997, 94, 652. 31.. Sewald,.D. Jakubke, Peptides. Chemistry and biology, Wiley-VC, 2002 r. 32. K. Sidoryk, Ł. Kaczmarek, W.J. Szczepek, J. Wietrzyk, M. Świtalska, W. Peczyńska-Czoch, Polish J. Chem. 2008, 82, 2095. 33. K. Sidoryk, Ł. Kaczmarek, W.J. Szczepek, J. Wietrzyk, M. Świtalska, W. Peczyńska-Czoch, Zgł. pat. pol. P-385006 (2008). 34. K. Sidoryk, Synteza nowych pochodnych aminokwasowych i peptydowych 5- i 6-indolo[2,3-b]chinoliny o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym, ozprawa doktorska, Wydz. Farmaceutyczny WUM, Warszawa 2011 r. 35. P. Lloyd-Williams, F. Albericio, E. Giralt, Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins, 1997. 36. European Pharmacopoeia, General notices, 2008, 1, 1. 37. K. Sidoryk, Ł. Kaczmarek, W.J. Szczepek, J. Wietrzyk, M. Świtalska, W. Peczyńska-Czoch, Zgł. pat. pol. P-390846 (2010). Uwaga: Prenumeratorzy Przemysłu Chemicznego (prenumerata PLUS) otrzymują bezpłatny dostęp do bazy publikacji czasopisma z lat 1993 2010 zawierającej ponad 2500 ar tykułów naukowych i komentarzy. dpowiednie adresy i hasła podaje prenumeratorom Zakład Kolportażu Wydawnictwa SIGMA-T Sp. z o.o., ul. Ku Wisle 7, 00-707 Warszawa, tel.: (22) 840-35-89, 840-59-49, fax: (22) 891-13-74. a witrynie www.sigma-not.pl można przeszukać bazę publikacji Przemysłu Chemicznego i wyszukać publikacje na interesujący temat, wg słowa kluczowego, nazwiska autora, nazwy związku chemicznego. Baza jest dostępna dla wszystkich, ale instytucje i osoby nie prenumerujące pisma muszą wnieść opłatę w wysokości: 3,00 zł netto (3,69 zł brutto) publikacja krótka (do 1 strony), plik PDF 5,00 zł netto (6,15 zł brutto) za jedną publikacją dwu i więcej stronicową w formie pliku PDF 9,00 zł netto (11,07 zł brutto) za cały zeszyt Przemysłu Chemicznego w formie pliku PDF. Można wykupić dostęp czasowy do bazy, jego koszt wynosi 20,00 zł netto (24,60 zł brutto) za godzinę, 4 h 35,00 zł netto (43,05 zł brutto), 12 h 60 zł netto (73,80 zł brutto). płaty za elektroniczną wersję publikacji można wnosić w formie SMS, kartą kredytową i przelewem. 270 91/3(2012)