Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Wydział Medycyny Weterynaryjnej Katedra Biochemii, Farmakologii i Toksykologii Agnieszka Suszko WPŁYW EKSTRAKTÓW Z ZIELA CALTHA PALUSTRIS L. A KOMÓRKOWĄ I HUMORALĄ ODPOWIEDŹ IMMUOLOGICZĄ MYSZY W WARUKACH EKSPERYMETALEJ AUTOAGRESJI Rozprawa doktorska Promotor: prof. dr hab. Bożena Obmińska-Mrukowicz Wrocław 2011

Pracę tę dedykuję swoim ajukochańszym Rodzicom Pragnę złożyć serdeczne podziękowania Pani Promotor Prof. dr hab. Bożenie Obmińskiej-Mrukowicz za pomoc i opiekę oraz cenne wskazówki metodyczne i merytoryczne w prowadzeniu i opracowaniu wyników badań, Pani Prof. dr hab. Janinie Kuduk-Jaworskiej za współpracę i cenne uwagi, a także wszystkim Pracownikom, Koleżankom i Kolegom z Katedry za udzielone wsparcie i pomoc II

SPIS TREŚCI Spis treści...iii-iv Wykaz skrótów..v-vii Spis tabel zamieszczonych w tekście..viii Spis rycin zamieszczonych w tekście.ix Spis zdjęć zamieszczonych w tekście..x Spis tabel dokumentacji..xi-xii Wstęp 1-12 Autoagresja.1 Zapalenie stawów indukowane kolagenem - collagen-induced arthritis(cia) jako model reumatoidalnego zapalenia stawów.1-10 Caltha palustris L. knieć błotna...10-12 Cel i założenia pracy...13 Materiał i metody...14-29 Wyniki badań: 30-48 1. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny zapalenia stawów u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów...30-31 2. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.31-33 3. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę limfocytów grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych oraz współczynniki wagowe narządów limfatycznych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów...33-34 4. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na subpopulacje tymocytów myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów..34-37 5. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów...37-39 6. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B węzłów chłonnych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.40-42 III

7. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na populację limfocytów regulatorowych (Treg) myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów... 42-43 8. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na stężenie cytokin (IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF- α, IL-10 ) uwalnianych przez limfocyty Th1/Th2 myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.43-44 9. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na syntezę i uwalnianie interleukiny-1 (IL-1) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem stawów..44-45 10. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na wytwarzanie tlenku azotu (NO) przez mysie makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli w warunkach autoagresji wywołanej kolagenowym zapaleniem stawów...45 11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów 45-46 12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów.47 13. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź humoralną myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów i immunizowanych SRBC...47-48 Dyskusja..49-64 Wnioski...65 Piśmiennictwo 66-80 Streszczenie 81-82 Abstract 83 Dokumentacja-tabele.84-97 IV

WYKAZ SKRÓTÓW accp (anti-cyclic citrullinated peptide antibodies ) - przeciwciała przeciwko cyklicznemu cytrulinowanemu peptydowi AIA (adjuvant-induced arthritis) - adjuwantowe zapalenie stawów AICD (activation induced cell death) śmierć komórki indukowana aktywacją APC (antigen presenting cell) komórka prezentująca antygen ARAGAL (complex acidic heteropolysaccharide, containing mainly galactose and arabinose) - kompleks kwaśnych heteropolisacharydów zawierający galaktozę i arabinozę z gumy drzewa Anadenanthera colubrina BSA (bovine serum albumine) albumina bydlęca CD (cluster of differentiation) antygeny różnicowania CIA (collagen - induced arthritis) kolagenowe zapalenie stawów CME (Chelidonium majus extract) - ekstrakt z Chelidonium majus COMP (cartilage oligomeric matrix protein) oligomeryczne białko macierzy chrząstki CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4) antygen 4 związany z limfocytem T cytotoksycznym DMARD s (disease modifying antirheumatic drugs) - leki modyfikujące przebieg choroby ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test immunoenzymosorbcyjny ESR (erythrocyte sedimentation rate) wskaźnik sedymentacji erytrocytów EULAR (The European League Against Rheumathism) Europejska Liga do Walki z Reumatyzmem Fab (Fragment antigen-binding) fragment wiążący antygen FACS (fluorescent activated cell sorter ) sorter komórek aktywowany fluoresceiną Fc ( fragment crystallizable) fragment zdolny do krystalizacji FCS (fetal calf serum) płodowa surowica cielęca FITC ( fluorescein isothiocyanate) izotiocyjanian fluoresceiny fmpl (N-formyl-Met-Leu-Phe) N-formylometionyloleucylofenyloalanina Foxp3 (forkhead transcriptor factor box P3) czynnik transkrypcyjny V

GSPE (grape seed proanthocyanidin extract) - proantocyjanidowy ekstrakt z pestek winogron GvHD (Graft-versus-Host Disease) choroba przeszczep przeciwko gospodarzowi HEPp (hydroalcoholic extract of Pterodon pubescens seeds) - hydroalkoholowy ekstrakt z nasion Pterodon pubescens HLA (human leukocyte antigens) antygeny ludzkich leukocytów IFN (interferon) - interferon Ig (immunoglobulins) - przeciwciała IL (interleukin) - interleukina IL-1RI (Interleukin-1 Receptor I ) receptor typu I dla interleukiny-1 IPEX (immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy X-linked syndrome) zespół dysregulacji immunologicznej, poliendokrynopatii i entropatii sprzężony z chromosomem X JAK/STAT (Janus activated kinase / Signal Transducer and Activator of Transcription) kinaza aktywowana zielenią Janusową / przekaźnik sygnału i aktywator transkrypcji LDL (low density lipoprotein) lipoproteiny o małej gęstości LPS ( lipopolysaccharide) - lipopolisacharyd MCG barwienie preparatów metodą May-Grünwald-Giemsa (Pappenheima) MTX (methotrexate) - metotreksat NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells ) - czynnik jądrowy kappa z aktywowanych limfocytów B NO (nitric oxide) tlenek azotu NSAIDs (non-steroidal anti-inflammatory drugs) - niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ) OIA (oil-induced arthritis) - olejowe zapalenie stawów PBS (phosphate buffered saline) zbuforowany fosforanami 0,9% roztwór NaCl PE (phycoerythrin) - fikoerytryna PFC (plaque forming cells) komórki tworzące łysinki hemolityczne PGE 2 (prostaglandin E2) prostaglandyna E2 PHA (phytohaemagglutinin) fitohemaglutynina PMA (phorbol myristate acetate) octan mirytynianu forbolu PPE (pine pollen extract) ekstrakt z pyłku sosny RA (rheumathoid arthritis) reumatoidalne zapalenie stawów VI

RANKL (receptor activator of F-κB ligand) - ligand receptora aktywującego czynnik jądrowy kappa B RF (rheumatoid factor) czynnik reumatoidalny RGSE (red ginseng saponin extract) - ekstrakt saponin z korzenia rośliny Panas ginseng C. SLE (systemic lupus erythematosus) - toczeń rumieniowaty układowy SPS (salicornia polysaccharides) - polisacharydy Salicornia herbacea SRBC (sheep red blood cells) erytrocyty owcy TBL-II (Tonbiling II) wodny ekstrakt chińskiej, tradycyjnej mieszanki ziołowej z: Ramulus Cinnamomi Cassiae, Paeoniae alba Radix, Radix Aconiti Lateralis Preparata, Achyrantes bidentata Blume, Celastrus orbiculatus Thunb, Milentia reticulata Benth, Th1 (T-helper cells) limfocyty pomocnicze wspomagające odporność komórkową Th17(T- helper cells) limfocyty pomocnicze produkujące IL-17 Th2 (T-helper cells) limfocyty pomocnicze wspomagające odporność humoralną TNF (tumor necrosis factor ) czynnik martwicy nowotworu Treg (regulatory T cells) limfocyty T regulatorowe TWH (Tripterygium wilfordii Hook f.) - Tripterygium wilfordii Hook f. VII

SPIS TABEL zamieszczonych w tekście Tab.1. Ocena kliniczna zapalenia stawów..19 Tab.2. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na obraz krwi obwodowej myszy..32 Tab.3. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi obwodowej myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów..33 Tab.4. Wpływ kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na odsetek i liczbę limfocytów T w grasicy myszy..35 Tab.5. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek i liczbę limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów...36 Tab.6. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na na odsetek i liczbę limfocytów T grasicy myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów...37 Tab.7. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B śledziony myszy..38 Tab.8. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów..39 Tab.9. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B śledziony myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów..39 Tab.10. Wpływ wywołanego kolagenowego zapalenia stawów (CIA) na limfocyty T i B węzłów chłonnych krezkowych myszy..40 Tab.11. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów 41 Tab.12. Wpływ ekstraktów z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na limfocyty T i B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów 42 VIII

SPIS RYCI zamieszczonych w tekście Ryc.1. Schemat doświadczeń. 17 Ryc.2. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny eksperymentalnie wywołanego u myszy CIA.31 Ryc.3. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odsetek śledzionowych limfocytów Treg (CD4 + CD25 + Foxp3 + ) myszy z wywołanym CIA..43 Ryc.4. Wpływ ekstraktów C i B z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź humoralną myszy z wywołanym CIA..48 IX

SPIS ZDJĘĆ zamieszczonych w tekście Zdj.1-7. Ocena punktowa zmian klinicznych w przebiegu CIA. Zdj.1-0pkt..19 Zdj.2-1pkt..20 Zdj.3-2pkt..20 Zdj.4-3pkt..20 Zdj.5-3pkt..20 Zdj.6-4pkt..20 Zdj.7-4pkt..20 X

SPIS TABEL DOKUMETACJI Tab.1D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz kliniczny zapalenia stawów myszy z wywołanym CIA..84 Tab.2D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na obraz krwi obwodowej myszy z wywołanym CIA..85 Tab.3D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L.oraz metotreksatu na liczbę limfocytów grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych oraz indeks wagowy narządów limfatycznych myszy z wywołanym CIA..86 Tab.4D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i subpopulacje limfocytów T grasicy myszy z wywołanym CIA. 87 Tab.5D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i subpopulacje limfocytów T i B śledziony myszy z wywołanym CIA 88 Tab.6D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na liczbę i subpopulacje limfocytów T i B węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym CIA..89 Tab.7D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na indeks CD4 + /CD8 + grasicy, śledziony i węzłów chłonnych krezkowych myszy z wywołanym CIA.. 90 Tab.8D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na populację limfocytów regulatorowych śledziony myszy z wywołanym CIA.91 Tab.9D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na stężenia cytokin we krwi wytwarzanych przez limfocyty Th1/Th2 myszy z wywołanym CIA.92 Tab.10D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na wytwarzanie Il-1 przez makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro lps z E.coli myszy z wywołanym CIA 93 Tab.11D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na wytwarzanie tlenku azotu przez makrofagi otrzewnowe stymulowane in vitro LPS z E.coli myszy z wywołanym CIA..94 XI

Tab.12D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na aktywność fagocytarną granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym CIA.....95 Tab.13D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej myszy z wywołanym CIA. 96 Tab.14D. Wpływ ekstraktów B i C z ziela Caltha palustris L. oraz metotreksatu na odpowiedź humoralną myszy z wywołanym CIA i immunizowanych SRBC..97 XII

WSTĘP AUTOAGRESJA. Możliwość rozróżniania przez komórki układu immunologicznego tego co obce od tego co własne ma szczególnie istotne znaczenie dla zapewnienia stanu równowagi zdrowotnej organizmu, czyli jego homeostazy. Oprócz funkcji obronnej polegającej na destrukcji i eliminacji rozpoznanych struktur obcych, układ odpornościowy zobowiązany jest do zapewnienia tolerancji i ochrony własnych prawidłowych tkanek, a także do wywierania protroficznych wpływów polegających na wspieraniu procesów regeneracji własnych, rozpoznanych tkanek. Dzięki wielu wytworzonym w narządach limfatycznych mechanizmom możliwe jest utrzymanie stanu tolerancji, czyli braku reaktywności na własne antygeny. Komórki układu odpornościowego w pierwszej kolejności w czasie dojrzewania nabywają tolerancji na własne antygeny w procesie tolerancji centralnej (w centralnych narządach limfatycznych). Jednakże nie wszystkie autoreaktywne limfocyty mogą być eliminowane w ten sposób i te, które nie poddadzą się temu procesowi nabywają tolerancji obwodowej poprzez delecję klonalną, anergię i śmierć komórki indukowanej aktywacją (AICD-activation induced cell death). Mimo tak złożonego systemu selekcji w każdym ustroju znajduje się pula potencjalnie autoreaktywnych limfocytów T i B oraz autoprzeciwciał. Jeżeli dodatkowo zawiodą mechanizmy aktywnej supresji przez cytokiny czy supresja z udziałem hormonów nadnerczy (glikokortykosterydów) to wówczas mogą wystąpić odpowiednie warunki do rozwoju chorób autoimmunizacyjnych układowych (systemowych) lub narządowo swoistych. Autoagresja jest więc nabytą reaktywnością na własne antygeny. Czynniki, które wpływają na rozwój chorób z autoagresji to między innymi: podłoże genetyczne, wiek i płeć, infekcje oraz charakter autoantygenu, ale również stosowanie niektórych leków np. prokainamidu [115]. ZAPALENIE STAWÓW INDUKOWANE KOLAGENEM - COLLAGEN-INDUCED ARTHRITIS (CIA) JAKO MODEL REUMATOIDALNEGO ZAPALENIA STAWÓW. Modele zwierzęce chorób autoimmunizacyjnych są niezwykle pomocne w rozumieniu etiologii i mechanizmów patogenezy chorób o podłożu autoimmunologicznym oraz stanowią 1

kluczowe narzędzie służące do wstępnej oceny i przesiewowej weryfikacji nowych, potencjalnych środków terapeutycznych. Jednym z takich modeli jest model zapalenia stawów indukowanego kolagenem - collageninduced artritis (CIA), który odpowiada pod względem obrazu klinicznego i występujących zaburzeń immunologicznych reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RZS), schorzeniu występującemu u ludzi [90]. CIA może być indukowane u wrażliwych szczepów myszy jak i szczurów przez podskórne podanie heterologicznego (ksenogenicznego) kolagenu typu II w kompletnym (myszy) lub niekompletnym (szczury) adjuwancie Freunda [69]. W badaniach eksperymentalnych wykorzystuje się również inne modele zapalenia stawów, jakimi są u szczurów: zapalenie indukowane COMP (Cartilage oligomeric matrix protein-comp induced arthritis), zapalenie adjuwantowe (Adjuvant-induced arthritis - AIA), zapalenie indukowane awrydyną (Avridine-induced arthritis), olejowe zapalenie stawów (Oil-induced arthritis - OIA), streptokokowe zapalenie stawów (Streptococcal cell wall-induced arthritis), natomiast u myszy : proteoglikanowe zapalenie stawów (Proteoglycan-induced arthritis), gronkowcowe septyczne zapalenie stawów (S.aureus-induced septic arthritis), boreliozowe zapalenie stawów (Borrelia burgdorferii-induced arthritis) oraz spontaniczne zapalenie stawów u myszy modyfikowanych genetycznie [ 33]. Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą o podłożu autoimmunologicznym występującą u ludzi jak i zwierząt często opisywaną u psów [78,102]. Schorzenie to jest przewlekłym, progresywnym, autoimmunologicznym stanem zapalnym manifestującym się zapaleniem chrząstki stawowej (synovitis), jej ostrą destrukcją prowadzącą do zniekształcenia i zniszczenia stawów, a w konsekwencji do niepełnosprawności ruchowej różnego stopnia, kalectwa, jak również przedwczesnej śmierci. Immunopatogeneza przebiegu RZS i CIA jest bardzo złożona i wynika z zaburzeń funkcji wielu komórek takich jak: limfocytów T, zwłaszcza regulatorowych (Treg), limfocytów B, makrofagów, synowiocytów podobnych fibrolastom, komórek śródbłonka i komórek dendrytycznych [40,105]. Podobnie jak w przypadku reumatoidalnego zapalenia stawów w rozwoju kolagenowego zapalenia stawów udział biorą również cząsteczki MHC klasy II. W zależności od rodzaju szczepu zwierząt i pochodzenia kolagenu typu II podatność na wystąpienie CIA różni się. U ludzi skłonność do rozwinięcia się reumatoidalnego zapalenia stawów jest ściśle skorelowana z obecnością molekuł klasy II HLA-DR1 i HLA DR4, z kolei u myszy szczepu DBA/1 i B10.Q posiadanie haplotypu H-2 q i H-2 r (ekspresja molekuł klasy II I-Aq i I-Ar) warunkuje wysoki stopień podatności do wystąpienia CIA [ 16,30,147]. 2

Badania eksperymentalne Sveenssona i wsp. [132], w których autorzy udokumentowali, że u szczepów myszy z niedoborem limfocytów B nie dochodzi do rozwoju kolagenowego zapalenia stawów, świadczą o udziale limfocytów B w rozwoju CIA. W przebiegu tego zapalenia w wyniku niszczenia chrząstki stawowej dochodzi do uwalniania jej składników takich jak kolagen typu II. Doprowadza to do aktywacji limfocytów B i produkcji uszkadzających chrząstkę stawową autoprzeciwciał klasy IgG przeciw kolagenowi typu II (anty-cii). Powstają podklasy immunoglobuliny G tzn. IgG1 oraz IgG2 (IgG2a, IgG2b), a wielkość stężenia podklasy IgG2, a zwłaszcza IgG2a ściśle koreluje z ciężkością przebiegu zapalenia stawów [116]. Pasywny transfer surowic, pochodzących od myszy z CIA, zawierających swoiste przeciwciała skierowane przeciw kolagenowi typu II indukuje wystąpienie ostrego zapalenia stawów u myszy zdrowych [60,129]. Terato i wsp. [134] wykazali, że również jednoczesne podanie wielu przeciwciał monoklonalnych anty CII indukuje u zdrowych myszy rozwój CIA. Obie subklasy przeciwciał IgG2 tj. IgG2a i IgG2b są zdolne do aktywacji dopełniacza. Wykazano, że myszy szczepu DBA/1 genetycznie pozbawione C3 i C5 lub czynnika B pomimo wysokiego stężenia przeciwciał IgG2a anty-cii są wysoce oporne na indukcję CIA, co dowodzi, że aktywacja komplementu odgrywa istotną rolę w patogenezie CIA [57,142]. Limfocyty B mogą pełnić także funkcję komórek prezentujących antygen przez przetwarzanie i prezentowanie peptydów antygenowych limfocytom T, które następnie proliferują i manifestują swoje działania prozapalne (produkcja cytokin prozapalnych) [23,94]. Limfocyty B są bezpośrednio zaangażowane w podtrzymywanie ciągłości procesu zapalnego w synowium, jak również od tej populacji komórek jest zależna stymulacja i aktywacja limfocytów T, czego dowodzą badania Takemury i wsp. [133]. Aktywne limfocyty B produkują czynnik reumatoidalny RF (rheumatoid factor) oraz przeciwciała anty-cii i przeciw peptydom cytrulinowym anty-ccp [114]. Uważa się, że limfocyty B wykazujące zdolność wytwarzania RF mogą migrować do błony maziowej stawów pacjentów z RZS by przedstawić komórkom T szereg dla nich właściwych antygenów. To powoduje utrwalenie lokalnej odpowiedzi zapalnej i amplifikację produkcji RF w błonie maziowej. Czynnik reumatoidalny przedłuża czas przeżycia komórek B, a tym samym umożliwia utrzymanie własnego wytwarzania, co wraz z aktywacją dopełniacza przyczynia się do rozwoju kaskady zapalnej [ 35]. RF jest podstawowym i dobrze zwalidowanym markerem ostrości przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów, chociaż nie należy do specyficznych markerów tego schorzenia. Obecność czynnika reumatoidalnego stwierdza się także w modelowym CIA [ 61]. 3

Ponadto limfocyty B (zwłaszcza zlokalizowane w błonie stawowej) są czynnikiem stymulującym makrofagi do wytwarzania cytokin pozapalnych takich jak TNF-α [85,104]. Dowiedziono również możliwość indukcji kilkumiesięcznej remisji u pacjentów z RZS przez deplecję limfocytów B po zastosowaniu złożonej terapii immunosupresyjnej polegającej na podawaniu rituximabu (przeciwciało monoklonalne anty-cd20), cyklofosfamidu i prednizolonu [85]. Skuteczność powyższej terapii jest potwierdzeniem istotnego udziału limfocytów B w patogenezie tego schorzenia. Z kolei udział limfocytów T w patogenezie zapalenia stawów o podłożu automunologicznym jest bardziej złożony i przebiega dwutorowo [59]. Aktywowane limfocyty T zwłaszcza o funkcji indukująco-wspomagającej, poprzez wytwarzane cytokiny (IL-4 i IL-5) stymulują limfocyty B do syntezy i uwalniania autoprzeciwciał niszczących chrząstki stawowe [31]. Ponadto limfocyty T wytwarzają szereg innych cytokin takich jak IL-3, IL-6, IL-17 o bezpośrednim wpływie na rozwój CIA lub też przez produkowane cytokiny aktywują inne komórki, głównie makrofagi do wytwarzania cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6 i TNF-α), które wywierają działanie niszczące na chrząstki stawowe i kości. Aktywowane limfocyty T przez prezentację im antygenu przez komórki APC zaczynają wytwarzać IL-2 i ulegają klonalnej ekspansji, proliferują i zaczynają ekspresjonować na swojej powierzchni molekuły, takie jak: CD69 - zaangażowaną w aktywację makrofagów, TNF-α zaangażowany w aktywację fibroblastów synowium i receptora aktywującego czynnik jądrowy kappa B (RANKL) odgrywający rolę w aktywacji osteoklastów. Jednocześnie zmianom na powierzchni limfocytów T towarzyszy wzrost syntezy i uwalniania IL-17, cytokiny biorącej udział w procesie aktywacji osteoklastów powodujących resorpcję kości [79]. Aktywowane limfocyty T wytwarzają IFN-γ, który stymuluje makrofagi do wydzielania licznych cytokin prozapalnych (IL-1, IL-6, TNF-α) odpowiedzialnych za stymulację fibroblastów synowium i synowiocytów [17,32]. Te kluczowe cytokiny indukują zapalenie i powodują uwalnianie metaloproteinaz zrębu (matrix metalloproteinase) degradujących tkankę łączną i powodujących tworzenie się łuszczki [26]. Aktywowane komórki T ekspresjonują także ligand dla osteoprotegryny (RANKL), który razem z IL-1 stymuluje osteoklasty, doprowadzając tym samym do erozji kości. Ta sekwencja zdarzeń prowadzi do chronicznego stanu zapalnego powodującego zniszczenia chrząstki i kości w przebiegu RZS [ 26,104]. W reumatoidalnym zapaleniu stawów jak i w jego modelu CIA należy zwrócić szczególną uwagę na pulę limfocytów T regulatorowych (Treg), których główną rolą jest utrzymanie stanu tolerancji na obwodzie, a także określenie siły i czasu trwania odpowiedzi 4

immunologicznej. Limfocyty T regulatorowe stanowią od 5 do 10% subpopulacji limfocytów T CD4 + i ekspresjonują na powierzchni komórek łańcuch alfa dla receptora IL-2 (IL-2R), czyli CD25 +, co stanowi podstawę do ich identyfikacji [58]. Obecność limfocytów T regulatorowych (Treg) może wpływać hamująco na aktywację i proliferację limfocytów CD4 +, czego dowiedziono w badaniach in vivo [131] i in vitro [136]. Niedobór populacji limfocytów T (CD4 + CD25 + ) może prowadzić do spontanicznego rozwoju chorób autoimmunologicznych, a także, czego dowiódł w swoich badaniach Morgan i wsp.[97] zwiększa ciężkość objawów klinicznych w przebiegu CIA u myszy. Z kolei transfer adoptywny limfocytów T CD25 + jest efektywny w leczeniu kolagenowego zapalenia stawów [98]. Natomiast upośledzenie funkcji tej populacji, udokumentowane u chorych z RZS, jest efektem braku hamowania wytwarzania cytokin pozapalnych przez limfocyty efektorowe oraz monocyty, co wykazano w mieszanych hodowlach z limfocytami CD4 + CD25 + [36]. Autorzy powyższych badań wykazali także, że przywrócenie ochronnej funkcji limfocytom T CD4 + CD25 + jest możliwe przez zablokowanie syntezy i uwalniania TNF-α cytokiny odpowiedzialnej za rozwój zapalenia stawów o podłożu autoimmunologicznym, jak i ciężkość przebiegu autoagresji. Ponadto istotne jest upośledzenie interakcji między limfocytami T regulatorowymi a komórkami T efektorowymi i komórkami prezentującymi antygen (APC) [138,139]. Populacja limfocytów T regulatorowych u myszy zawiera ponadprzeciętna ilość wewnątrzkomórkowego białka (czynnika transkrypcyjnego ) - Foxp3 [72]. Mutacja genu dla Foxp3 koniecznego dla rozwoju limfocytów T regulatorowych prowadzi do zaburzeń odpowiedzi immunologicznej u myszy - tzw. scurfy mice oraz ludzi tzw. IPEX (immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome) - zespół dysregulacji immunologicznej, poliendokrynopatii i entropatii sprzężony z chromosomem X [13,62]. Obserwacje poczynione w tych eksperymentach potwierdzają rolę komórek Treg w zapewnieniu homeostazy układu odpornościowego. Obecnie przyjmuje się, że Foxp3 jest czynnikiem przeprogramowującym limfocyty T w limfocyty regulatorowe i jest regulatorem rozwoju, funkcji i homeostazy komórek tej populacji [42,149]. W przebiegu schorzeń autoimmunologicznych dochodzi do zjawiska dysregulacji w wytwarzaniu cytokin i zaburzenia równowagi między nimi [24]. Za rozwój reumatoidalnego zapalenia stawów odpowiedzialne są w szczególności cytokiny prozapalne takie jak IL-1, IL- 6 i TNF-α [38]. Cytokiny te mają zdolność do aktywacji komórek śródbłonka i krążących leukocytów oraz powodują zwiększoną ekspresję wielu molekularnych adhezyn odgrywających istotną rolę we wzmaganiu przylegania leukocytów do śródbłonka naczyń, co zapoczątkowuje przechodzenie leukocytów przez ścianę naczynia w drodze do ogniska 5

zapalnego [29]. Cytokiny te, wytwarzane głównie przez aktywowane makrofagi, przyspieszają resorpcję kości oraz biorą udział w niszczeniu chrząstek stawowych [66]. Zasadniczą rolę pełni wśród nich IL-1 [32]. Cytokina ta w przebiegu zapalenia stawów o podłożu autoimmunologicznym wykazuje najsilniejsze działanie niszczące kości i chrząstki oraz upośledza procesy naprawcze chrząstki przez hamowanie syntezy białek macierzy [55,70,140]. Z kolei plejotropowa IL-6 stymuluje zarówno limfocyty B do produkcji przeciwciał, jak również jest czynikiem wzrostu i różnicowania dla komórek T (różnicowanie do Th17), pobudza destrukcję kości przez indukcję proliferacji komórek synowium i różnicowanie osteoklastów [91]. Z kolei TNF-α powoduje wzrost ekspresji cząsteczek adhezyjnych śródbłonka naczyniowego zwiększając tym samym przenikanie limfocytów, makrofagów i neutrofilów do jamy stawowej oraz stymuluje wytwarzanie przez synowiocyty metaloproteinaz mających destruktywny wpływ na chrząstki i kości. Ponadto czynnik ten pobudza wytwarzanie i wydzielanie IL-1β i IL-6 czego następstwem jest reakcja ostrej fazy, a także powoduje wyzwolenie bólu przez uwrażliwienie nocyceptywnych włókien bólowych na prostaglandyny [17,22,38,51]. Wykazano również istotną rolę w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów IL-17, syntetyzowanej i uwalnianej przez limfocyty T CD4+. IL-17 pobudza komórki nabłonkowe, śródbłonkowe i fibroblasty do wytwarzania IL-6 i IL-8 oraz prostaglandyny PGE 2 - mediatora odczynu zapalnego. Cytokina ta prowadzi również do pobudzenia wytwarzania mediatorów odczynu zapalnego poprzez zwiększenie poziomu ICAM-1 na powierzchni komórek docelowych oraz powoduje w tych komórkach aktywację czynnika jądrowego NF-κB [59,112]. IL-17 jest również silnym stymulatorem osteoklastogenezy [79,150], co potwierdza jej udział w degradacji chrząstki stawowej. Aktualnie dowiedziono również, że IL-3 bierze udział w rozwoju CIA u myszy [15]. We wczesnej fazie rozwoju kolagenowego zapalenia stawów cytokina ta jest odpowiedzialna za pobudzenie aktywności limfocytów T CD4+ wspomagających limfocyty B do syntezy i uwalniania autoprzeciwciał. Podsumowując występowanie obrzęku, naciek komórek złożony z limfocytów T i B, plazmocytów neutrofilów, makrofagów, mastocytów oraz komórek NK w obrębie błony maziowej, powstanie łuszczki, degradacja chrząstki i kości oraz udział MHC II to główne cechy CIA stanowiące o podobieństwie do RZS. Obecnie w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów stosuje się następujące grupy leków: 1) leki modyfikujące przebieg choroby (LMPCh z ang. DMARDs - disease modifying antirheumatic drugs) o działaniu immunosupresyjnym, 2) leki o działaniu przeciwzapalnym i 6

immunosupresyjnym lub o działaniu przeciwzapalnym i przeciwbólowym, 3) leki biologiczne. Do pierwszej grupy należą: sole złota, azatiopryna, cyklosporyna, penicylamina, lefunomid, metotreksat, sulfasalazyna, cyklofosfamid. Do drugiej grupy leków stosowanych w terapii RZS należą glikokortykosteroidy i niesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ z ang. NSAID s) Z kolei do najnowocześniejszej grupy leków biologicznych stosowanych w terapii RZS należą inhibitory TNF (infliksymab, adalimumab, etanercept), anakinra - inhibitor IL-1, rytuksymab - przeciwciało monoklonale anty CD-20 przeciwko komórkom B, abatacept inhibitor stymulacji komórek T, tocilizumab - bloker dla IL-6. Obecnie zgodnie z zaleceniami EULAR (European League Against Rheumatism) opublikowanymi w 2010 roku lekiem pierwszego rzutu stosowanym w terapii RZS u ludzi jest metotreksat [126]. Metotreksat (MTX, kwas 4 amino-n10-metylofoliowy) jest analogiem kwasu foliowego, należącym do grupy antymetabolitów, cytostatyków, lekiem o działaniu immunosupresyjnym. Metotreksat jest antagonistą syntezy kwasu foliowego wchodzącego w skład enzymów uczestniczących w syntezie puryn i pirymidyn, a tym samym DNA i RNA w komórce. Lek ten uniemożliwia redukcję kwasu foliowego do kwasu tetrahydrofoliowego przez wiązanie się z reduktazą tetrahydrofoliową enzymem katalizującym tę reakcję. MTX blokuje kompetencyjnie również syntetazę tymidylową, inny enzym biorący udział w syntezie puryn i pirymidyn komórek. Zahamowanie syntezy tych związków prowadzi do zaburzeń wzrostu, funkcjonowania i w efekcie wywołuje śmierć komórki. Nukleotydy te są niezbędne także do rozwoju, przeżycia oraz stymulowanej antygenem proliferacji limfocytów T. Ponadto zahamowanie syntezy pirymidyn indukuje apoptozę [47]. Metotreksat wykazując zdolność indukcji apoptozy komórek immunologicznych wywołuje efekt immunosupresji. Zabija komórki znajdujące się w fazie S cyklu komórkowego - jest lekiem swoistym dla fazy [1,46]. Związek ten poprzez indukcję inhibitorów aktywności cytokin prozapalnych hamuje ich syntezę i/lub aktywność [49,100]. Metotreksat wywiera działanie hamujące na odpowiedź humoralną i komórkową. Skuteczność kliniczna tego związku została wykorzystana w terapii kilku poważnych schorzeń. Najistotniejsze zastosowanie to terapia reumatoidalnego zapalenia stawów, gdzie należy do grupy leków modyfikujących przebieg choroby [14]. Metotreksat działa wielokierunkowo, blokując różne składowe procesu chorobotwórczego przez wywieranie działania immunosupresyjnego, przeciwzapalnego, modulowanie wydzielania cytokin, indukcję apoptozy, czy też działanie cytostatyczne. Stosowany jest też w leczeniu innego schorzenia z autoagresji tj. układowej postaci tocznia rumieniowatego (SLE) [146]. Jednoczesne zastosowanie metotreksatu i glikokortykosterydów w terapii ciężkiej postaci SLE pozwala na redukcję dawki tych ostatnich [76]. Związek ten jest także 7

skuteczny w leczeniu łuszczycy powoduje hiperplazję komórek nabłonka, co jest związane z inhibicją syntezy DNA [93,144]. Metotreksat znalazł również zastosowanie kliniczne w profilaktyce i terapii choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD) oraz w chorobach nowotworowych w połączeniu z innymi cytostatykami [ 65]. Obecnie pomimo szerokiego wachlarza dostępnych leków stosowanych w terapii reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS), w dalszym ciągu prowadzone są intensywne poszukiwania nowych substancji czynnych o lepszej skuteczności terapeutycznej i przede wszystkim mniejszej toksyczności. Jedną z potencjalnych możliwości jest stosowanie w terapii RZS substancji czynnych, które mogłyby w sposób swoisty interferować z mechanizmami immunologicznymi charakterystycznymi dla immunopatogenezy RZS, poprzez blokowanie syntezy i uwalniania cytokin prozapalnych lub wywieranie działań korygujących funkcje komórek immunologicznych biorących udział w patogenezie tego schorzenia [119]. Leki biologiczne stały się niezwykle ważnym elementem terapii zaawansowanego stadium choroby. Pierwsze inhibitory TNF-α zostały opracowane w końcu lat dziewięćdziesiątych XX wieku i w aktualnie dostępnym piśmiennictwie dostępnych jest wiele badań potwierdzających ich kliniczną skuteczność. Adalimumab to w pełni humanizowane przeciwciało monoklonalne anty-tnf-α klasy G1 neutralizujące biologiczną czynność TNF-α przez inhibicję jego interakcji z receptorami p55 i p75 na powierzchni komórki oraz modulujące odpowiedzi biologiczne indukowane lub regulowane przez TNF-α [5,44, 111 ]. Etanercept to z kolei dimer łączący zewnątrzkomórkowy ligand wiążący domenę receptora 2 ludzkiego TNF (TNF-R2/p75) i region stały ludzkiej immunoglobuliny IgG1. Związek ten hamuje aktywność biologiczną TNF przez blokowanie wiązania się TNF z jego receptorem komórkowym [4,143]. Natomiast infliksimab to chimeryczne ludzko-mysie przeciwciało monoklonalne wiążące rozpuszczalną jak i błonową formę ludzkiego TNF-α tym samym tworząc stabilne kompleksy powoduje utratę jego aktywności biologicznej [9,145]. Liczba wprowadzonych do terapii inhibitorów TNF-α cały czas ulega poszerzeniu i niedawno zostały wprowadzone nowe przeciwciała monoklonalne z tej rodziny: golimumab i certolizumab pegol [125,151]. Certolizumab pegol to połączony z cząsteczką glikolu polietylenowego rekombinowany, humanizowany fragment Fab przeciwciała przeciwko TNF-α neutralizujący rozpuszczalną jak i błonową formę ludzkiego TNF-α. Cząsteczka tego leku to zdekompletowane przeciwciało pozbawione fragmentu Fc i dlatego w badaniach in vitro nie wiąże dopełniacza, nie powoduje cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC), nie indukuje apoptozy ludzkich monocytów, ani nie powoduje 8

degranulacji neutrofilów [3,99,126]. Natomiast golimumab jest ludzkim przeciwciałem monoklonalnym, które ma zdolność tworzenia stabilnych kompleksów z przezbłonową oraz z rozpuszczalną postacią TNF-α i tym samym neutralizuje działanie tej cytokiny [71]. Kolejnym rekombinowanym, humanizowanym przeciwciałem monoklonalnym jest tocilizumab, związek blokujący aktywność biologiczną IL-6 przez swoiste wiązanie się z jej receptorami rozpuszczalnymi i związanymi z błonami komórkowymi [10,80]. Z kolei anakinra to lek hamujący biologiczną aktywność IL-1α i IL-1β przez kompetencyjną inhibicję wiązania z receptorem dla IL-1 typu pierwszego (IL-1RI). Lek ten wykazuje się skutecznością w terapii umiarkowanego do ostrego RZS, postaci schorzenia wykazujących oporność na tradycyjne leczenie związkami należącymi do grupy LMPCh. Jednak anakinra jest mniej skuteczna w terapii RZS w porównaniu do leków biologicznych będących inhibitorami TNF [6,41,135]. Z kolei rytuksymab jest chimeryzowanym mysio-ludzkim przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko cząsteczkom CD20 występujących na powierzchni limfocytów B i jego stosowanie prowadzi do przejściowej deplecji limfocytów B CD20 + we krwi obwodowej. Rytuksymab jest lekiem stosowanym od lat 90- tych w leczeniu chłoniaków, a od 2006 roku jest również wykorzystywany w terapii RZS. Obecnie rytuksymab jest często stosowany w skojarzeniu z metotreksatem w terapii aktywnej postaci RZS [7,12,109]. Abatacept to z kolei białko fuzyjne, w którego skład wchodzi domena pozakomórkowa ludzkiego antygenu CTLA-4 oraz zmodyfikowany fragment Fc ludzkiej immunoglobuliny IgG1. Lek ten hamuje konieczne do przekazania sygnału i pobudzenia limfocytów wzajemne oddziaływanie cząstek CD80/CD86 na powierzchni komórek prezentujących antygen z receptorem CD28 na limfocytach T. Abatacept stosuje się u pacjentów z aktywnym RZS nie odpowiadających na terapię lekami z grupy LMPCh lub blokerami TNF-α [8,48]. Aktualnie w trakcie różnych faz badań klinicznych znajduje się wiele substancji mogących w przyszłości stanowić biologiczną terapię dla chorych na reumatoidalne zapalenie stawów. Są wśród nich: nowe inhibitory IL-1 (canakinumab), inhibitory cytokin z nadrodziny TNF (atacicept), inhibitory innych cytokin (AIN457- monoklonalne przeciwciało przeciw IL-17), inhibitory osteoklastogenezy (denosumab), inhibitory limfocytów B dla ich cząsteczek powierzchniowych (ocrelizumab, ofatumumab), inhibitory małych cząsteczek jak np. inhibitory ścieżki sygnałowej JAK/STAT, inhibitory kinazy Syk (fostamatinib) [119]. Niestety terapia biologiczna RZS jest bardzo droga, różnie tolerowana przez pacjentów, a ponadto jej skuteczność jest bardzo zróżnicowana, dlatego wciąż poszukuje się innych alternatyw. 9

Taką możliwością jest stosowanie fitoterapii w przebiegu RZS. Aktualnie prowadzonych jest wiele eksperymentalnych badań wskazujących na możliwość wykorzystania wyciągów roślinnych w terapii zapaleń stawów o podłożu autoimmunologicznym [25,124]. Wang i wsp. [141] zbadali wpływ ekstraktu z korzenia ziela Lindera aggragata podawanego doustnie w dawkach 50, 100 i 200 mg/kg na przebieg kolagenowego zapalenia stawów u myszy szczepu ICR. Autorzy badań stwierdzili, że wyizolowana frakcja alkaloidów podawana przez 20 kolejnych dni od indukcji zapalenia zmniejsza ostrość przebiegu choroby w sposób dawkozależny oraz redukuje stężenie przeciwciał anty-cii klasy IgG w surowicy. Ponadto chroni przed destrukcją stawy, czego dowiodła ocena histopatologiczna, a także hamuje in vitro proliferację, stymulowanych uprzednio kolagenem (CII) i konkanawaliną-a limfocytów z okolicznych węzłów chłonnych. Natomiast ekstrakt z pyłku sosnowego podawany doustnie w dawce 100 mg/kg przez 49 dni od indukcji CIA u myszy DBA/1J powoduje umiarkowane zmniejszenie objawów klinicznych oraz zmniejsza w surowicy krwi stężenie czynnika reumatoidalnego, przeciwciał anty-cii, cytokin TNF, IL-1 i IL-6 i LDL [86]. Z kolei Cai i wsp. [18] ocenili wpływ mieszanki 5 chińskich ziół w preparacie o nazwie QFGJS na powstawanie i przebieg kolagenowego zapalenia stawów u szczurów samic szczepu Wistar. Zbadano wpływ preparatu w dwóch układach: 1) podawanie profilaktyczne od dnia 0 - czyli indukcji CIA i 2) stosowanie terapeutyczne od pierwszego dnia objawów klinicznych dzień 13 doświadczenia. W obydwu układach podawano preparat do dnia 30 eksperymentu, doustnie, w 3 różnych dawkach. Badacze stwierdzili supresję początku choroby (redukcja incydentów CIA, redukcja indeksu zapalenia) w przypadku stosowania profilaktycznego i zmniejszenie opuchnięcia łap oraz wartości OB (Odczyn Biernackiego z ang. ESR - erytrocyte sedimentation rate) w przypadku stosowania terapeutycznego. Potwierdzono także redukcję zmian w obrębie stawów w badaniu radiologicznym i histopatologicznym w stosunku do kontroli otrzymującej tylko vehiculum, ponadto wykazano spadek stężenia w surowicy TNF-α, Il-1β i IL-6. CALTHA PALUSTRIS L.- KNIEĆ BŁOTNA Caltha palustris L. to inaczej knieć błotna lub kaczeniec gatunek byliny należący do rodziny jaskrowatych (Raunculaceae). Jest szeroko rozprzestrzeniona na całej półkuli północnej: występuje w całej niemal Europie (z wyjątkiem Hiszpanii i południowych Włoch), Azji i Ameryce Północnej. W Polsce występuje pospolicie na niżu i w niższych położeniach 10

górskich. Rośnie na torfowiskach niskich, podmokłych łąkach i w zaroślach, na bagiennych brzegach zbiorników, strumieni, rowów i w lasach łęgowych [27,50]. Jest rośliną leczniczą stosowaną w leczeniu trądu, reumatyzmu, rzeżączki w medycynie ludowej mieszkańców zachodnich Himalajów w Indiach [121], a także w Korei w leczeniu zapalenia stawów [73]. W kanadyjskiej medycynie ludowej Caltha palustris L. i inne rośliny z rodziny jaskrowatych wykorzystywane są również do leczenia rozmaitych zmian skórnych (otarć, czyraków, pęknięć) oraz w przypadkach bólu mięśni, przeziębień, chorób górnych dróg oddechowych, bólu głowy [137]. W Azji Caltha palustris L. stosowana jest u zwierząt w postaci pasty z korzenia na rany skórne [53]. Roślina ta zawiera protoanemoniny i świeżo zerwana jest w większych ilościach trująca, natomiast po wysuszeniu traci te właściwości [137]. Doniesienia o pomyślnym stosowaniu Caltha palustris L. w medycynie ludowej oraz wyniki badań fitochemicznych i biologicznych wskazywały, że roślina ta może być wartościowym źródłem standaryzowanych preparatów lub zidentyfikowanych związków o potencjalnych właściwościach leczniczych. W szczególności z materiału roślinnego wyizolowano wiele związków o potencjalnej aktywności biologicznej, m.in. należących do klasy alkaloidów, flawonoidów, triterpenów, karotenoidów i kumaryn [81]. Interesującym materiałem do podjęcia badań biologicznych i farmakologicznych wydają się być frakcje polisacharydowe pozyskane z kaczeńca (Caltha palustris L.). Kuduk i wsp. [ 81] uzyskali z suchego ziela Caltha palustris L. 4 polisacharydowe frakcje tj.: frakcję Afpochodząca z ekstrakcji za pomocą wody, frakcję Bf- pochodząca z ekstrakcji za pomocą 0.1 M NaOH, frakcję Cf pochodzącą z ekstrakcji za pomocą 5% CH3COOH oraz frakcję Dfpochodząca z ekstrakcji za pomocą 1 M NaOH. Dokładny opis procedury otrzymywania ekstraktów i wyodrębnionych z nich frakcji, ich skład, właściwości fizyczne (m.in. wielkości mas cząsteczkowych i widm spektroskopowych) i chemiczne oraz cytotoksyczność w stosunku do prawidłowych komórek linii limfocytarnych człowieka zostały opublikowane w przez Kuduk-Jaworską [81] i Gąsiorowskiego [45]. Na podstawie przeprowadzonych in vitro badań stwierdzono, że istnieją różnice w efekcie immunotropowego działania frakcji B i C ekstraktów z ziela Caltha palustris L. Frakcja C wywiera in vitro działanie immunostymulujące tj. nasila aktywność proliferacyjną prawidłowych limfocytów człowieka po stymulacji fitohemaglutyniną (PHA) oraz zwiększa aktywność bójczą granulocytów człowieka, zarówno spoczynkowych jak i stymulowanych octanem mirystynianu forbolu (PMA). Nie wpływa natomiast na zdolność proliferacji i indeks mitotyczny komórek białaczki człowieka (linii Raji). Z kolei frakcja B wykazuje działanie supresyjne tj. hamuje aktywność proliferacyjną prawidłowych limfocytów człowieka po 11

stymulacji PHA, upośledza zdolność wytwarzania reaktywnych form tlenu przez granulocyty człowieka, zarówno spoczynkowe jak i aktywowane PMA oraz hamuje aktywność proliferacyjną i zmniejsza indeks mitotyczny komórek linii Raji. W niniejszej dysertacji doktorskiej dla celów badawczych wykorzystano dwie z czterech w/w frakcji polisacharydowych: frakcję Cf i frakcję Bf. 12

CEL I ZAŁOŻEIA PRACY Celem pracy było określenie immunomodulującego działania dwóch ekstraktów otrzymanych z ziela Caltha palustris L. na odpowiedź komórkową i humoralną myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów, które stanowi eksperymentalny model reumatoidalnego zapalenia stawów (RZS) występującego u ludzi. W badaniach stosowano dwie frakcje polisacharydowe otrzymane z suchego ziela Caltha palustris L.: frakcja Cf pochodząca z ekstrakcji za pomocą 5% CH 3 COOH oznaczona jako ekstrakt C i frakcja Bf pochodząca z ekstrakcji za pomocą 0.1 M NaOH oznaczona jako ekstrakt B. Wpływ obu badanych ekstraktów na obraz kliniczny eksperymentalnie wywołanego CIA oraz wskaźniki immunologicznie został porównany do efektu działania metotreksatu leku aktualnie standardowo stosowanego w terapii RZS. Wykazanie, w kompleksowo przeprowadzonych badaniach podstawowych, immunomodulujacego i korekcyjnego działania aktywnych frakcji polisacharydowych ekstraktów z ziela Caltha palustris L. na przyjętym modelu badawczym w porównaniu do metotreksatu może stanowić przesłankę do wykorzystywania w przyszłości tychże polisacharydów roślinnych w celu restytucji układu odpornościowego w przebiegu reumatoidalnego zapalenia stawów lub terapii innych schorzeń o podłożu autoimmunologicznym. Celem poznawczym badań było stwierdzenie u myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów (CIA) : 1) czy badane ekstrakty wywierają wpływ na obraz kliniczny kolagenowego zapalenia stawów. 2) czy badane ekstrakty wpływają na subpopulacje limfocytów T grasicy oraz populacje limfocytów T i B i subpopulacje limfocytów T śledziony i węzłów chłonnych krezkowych a także odsetek śledzionowych limfocytów T regulatorowych (Treg) wykazujących ekspresję białka transkrypcyjnego Foxp3 (C25 + CD4 + Foxp3 + ). 3) czy badane ekstrakty wywierają wpływ na produkcje cytokin przez limfocyty T, funkcje wydzielnicze makrofagów otrzewnowych, aktywność fagocytarną i zdolność bójczą granulocytów i monocytów krwi obwodowej. 4) czy badane ekstrakty wpływają na pierwotną odpowiedź humoralną myszy stymulowanych antygenem grasiczozależnym jakim są erytrocyty owcy (SRBC). 13

MATERIAŁ I METODY Badania wykonano in vivo na myszach szczepu wsobnego DBA/1Lac J samcach i samicach w wieku 8-10 tyg. i masie ciała ok.20 g. Powyższy szczep myszy jest akceptowanym szczepem służącym do badań na mysim modelu kolagenowego zapalenia stawów typu II (CIA II collagen induced arthritis). Wybrany do badań model autoagresji jakim jest CIA II u myszy odpowiada pod względem obrazu klinicznego i występujących zaburzeń immunologicznych reumatoidalnemu zapaleniu stawów (RZS), schorzeniu występującemu u ludzi [90]. Myszy pochodziły z licencjonowanej hodowli zwierząt laboratoryjnych z Instytutu Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu. Badania przeprowadzono po uzyskaniu zgody II Lokalnej Komisji Etycznej do spraw Doświadczeń na Zwierzętach we Wrocławiu zgodnie z uchwałą nr 95/2009 z dnia 27.07.2009. Indukcja kolagenowego zapalenia stawów typu II (CIA II - collagen induced arthritis) została przeprowadzona przez podskórne podanie w okolicę nasady ogona kolagenu typu II uzyskanego z chrząstki mostka kurcząt (Sigma) w dawce 100 µg/mysz zawieszonego w 50 µl kompletnego adiuwantu Freunda. Przed podaniem kolagen został rozpuszczony przez okres 12 godzin w 0,05 M kwasie octowym w ilości 4 mg/ml a następnie połączony z kompletnym adiuwantem Freunda w równych częściach objętościowych tworząc jednolitą emulsję. Kompletny adiuwant Freunda został przygotowany przez połączenie niekompletnego adiuwantu Freunda (Difco) z inaktywowanymi prątkami Mycobacterium Tuberculosis H37 Ra w ilości 4 mg/ml (Difco). Po 3 tygodniach od pierwszego podania kolagenu zwierzęta otrzymały dawkę przypominającą (booster) tj. 100 µg kolagenu/mysz, zawieszonego w 50 µl niekompletnego adiuwantu Freunda. Powyższe czynności zostały wykonane w warunkach znieczulenia ogólnego, tj. po uprzednim dootrzewnowym podaniu myszom roztworu ketaminy (Ketamina10% - Biowet Puławy) i ksylazyny (Xylapan20mg/ml Vetoquinol Biowet) w dawce odpowiednio 100 mg/kg i 10 mg/kg. Badane ekstrakty z ziela Caltha palustris L., czyli frakcja Cf pochodząca z ekstrakcji za pomocą 5% CH 3 COOH oznaczona jako ekstrakt C i frakcja Bf pochodząca z ekstrakcji za pomocą 0.1 M NaOH oznaczona jako ekstrakt B uzyskane zostały wg sposobu otrzymania przedstawionego przez Kuduk Jaworską i wsp.[81]. Suche rozdrobnione ziele (1000g) 14

poddano ekstrakcji ciągłej metanolem (5dm 3 ) w aparacie Soxhleta, przez 2 dni. Następnie suchą pozostałość ziela ekstrahowano wodą (10 dm 3 ) w temperaturze 70 C przez 2 dni i kolejną suchą pozostałość poddano ekstrakcji 0,1 M NaOH (5dm 3 ) w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. W ten sposób otrzymano ekstrakt B i suchą pozostałość, którą poddano dalszej ekstrakcji (5% CH3COOH - 5dm 3, temperatura pokojowa, 1 dzień) i otrzymano ekstrakt C. Pozyskany ekstrakt B zagęszczano w wyparce próżniowej do objętości 2 dm 3, bez podgrzewania. Następnie traktowano 30 % TCA (kwas trichlorooctowy) (0,7dm 3 ) i odwirowywano. Supernatant zalewano 3 objętościami acetonu. Surowy produkt rozpuszczano w wodzie i wytrącano acetonem ( powtarzano 2 razy). Otrzymano jasnobrązową frakcję Bf - 2,5 g. Natomiast ekstrakt C zagęszczano w wyparce próżniowej w temperaturze 40 C do objętość 2dm 3 a następnie odwirowywano i supernatant traktowano TCA a potem wytrącano acetonem, ostatecznie otrzymując 0,6 g frakcji C. Ekstrakt C i ekstrakt B podawane były codziennie, dootrzewnowo, w dawce 10 mg/kg przez okres 21 dni, przy czym pierwsza dawka badanych związków została podana 24 godziny po wstrzyknięciu dawki przypominającej kolagenu. Każdy z ekstraktów rozpuszczany był w zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej PBS (Instytut Immunologii i terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu) i podawany w objętości 0,2 ml/mysz. Metotreksat (Methotrexat Ebewe, Ebewe Pharma GmbH Nfg. KG, Austria) podawany był 9 razy w przez okres 21 dni przy czym pierwsza dawka została podana 24 godziny po podaniu dawki przypominającej kolagenu. Lek podawano dootrzewnowo w cyklach tygodniowych 3 razy w tyg. co 48 godzin w dawce 6,6 mg/kg, w objętości 0,2 ml/mysz w celu osiągnięcia całkowitej dawki tygodniowej 20 mg/kg/mysz. Preparat rozpuszczany był każdorazowo ex tempore w 0.9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej (Inj. Natrii. Chloratii Izotonica, Polpharma 10 ml). Część myszy z wywołanym kolagenowym zapaleniem stawów immunizowano antygenem grasiczozależnym jakim są erytrocyty owcy (SRBC) w dawce 4 x 10 8 komórek/mysz (0,2 ml 10% zawiesiny erytrocytów owcy). SRBC zostało podane myszom dootrzewnowo po 24 godzinach od momentu podania ostatniej dawki odpowiednich ekstraktów oraz 72 godzinach od podania ostatniej dawki metotreksatu. Użyta do immunizacji myszy zawiesina erytrocytów owcy została uprzednio pobrana w sposób sterylny do płynu Alsevera i była przechowywana w nim co najmniej 3 doby w temperaturze +4 C. W obydwu układach doświadczalnych prowadzono grupy kontrolne ( kontrola negatywna i pozytywna) równolegle do grup badanych. Każda grupa kontrolna i doświadczalna zawierała 15

8 myszy. Obie grupy kontrolne otrzymywały jedynie zbuforowany roztwór soli fizjologicznej PBS w objętości 0,2 ml. Schemat I układu doświadczalnego: 1. kontrola negatywna - myszy zdrowe: PBS i.p. 21 x co 24 godz. 2. kontrola pozytywna - myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + PBS i.p. 21 x co 24 godz. 3. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt C w dawce 10 mg/kg i.p. 21x co 24 godz. 4. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt B w dawce 10 mg/kg i.p. 21x co 24 godz. 5. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + metotreksat w dawce 6,6mg/kg i.p. 9 x przez 21 dni, tj. 3 razy w tyg. co 48 godz. przez 3 tyg. Schemat II układu doświadczalnego: 1. kontrola negatywna - myszy zdrowe PBS i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC 2. kontrola pozytywna - myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + PBS i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC 3. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + Caltha palustris ekstrakt C w dawce 10 mg/kg i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC 4. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + SRBC + Caltha palustris ekstrakt B w dawce 10 mg/kg i.p. 21 x co 24 godz. + SRBC 5. myszy z wywołanym zapaleniem stawów (CIA) + metotreksat w dawce 6,6 mg/kg 9 x przez 21 dni, tj. 3 razy w tyg. co 48 godz. przez 3 tyg. + SRBC 16