PRZECIWCIA A MONOKLONALNE I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII PRZEP YWOWEJ

POSTÊPY PRZECIWCIA A BIOLOGII MONO- KOMÓRKI I POLIKLONALNE I TOM ICH ZASTOSOWANIE 35 2008 SUPLEMENT W CYTOMETRII... NR 24 (17 34) 17 PRZECIWCIA A MONOKLONALNE I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII PRZEP YWOWEJ THE APPLICATION OF MONOCLONAL AND POLICLONAL ANTIBODIES IN FLOW CYTOMETRY ukasz SÊDEK 1, Bogdan MAZUR 2 1 Katedra i Klinika Pediatrii, Hematologii i Onkologii Dzieciêcej oraz 2 Katedra i Zak³ad Mikrobiologii i Immunologii Œl¹skiego Uniwersytetu Medycznego Streszczenie: Przeciwcia³a to substancje bia³kowe zdolne do swoistego wi¹zania siê z antygenem. Przeciwcia³a poliklonalne to grupa przeciwcia³, które rozpoznaj¹ ró ne epitopy tego samego antygenu. Przeciwcia³a monoklonalne to przeciwcia³a rozpoznaj¹ce wy³¹cznie jeden epitop. Obydwa typy przeciwcia³ maj¹ zastosowanie diagnostyczne jednak tylko przeciwcia³a monoklonalne maj¹ zastosowanie w cytometrii przep³ywowej. Dziêki sprzêganiu przeciwcia³ z barwnikami fluorescencyjnymi mo liwe jest wykrywanie antygenów ró nych typów komórek. Rozwi¹zania techniczne wspó³czesnych cytometrów przep³ywowych daj¹ mo liwoœæ odczytu do kilkunastu ró nych fluorescencji jednoczeœnie, co w praktyce oznacza mo liwoœæ jednoczesnej oceny ekspresji do kilkunastu ró nych antygenów jednej komórki. Summary: Antibodies are protein particles capable of specific antigen binding. Policlonal antibodies comprise of a group of antibodies that recognize different epitopes of the same antigen. Monoclonal antibodies recognize and bind to only one specific epitope. Both types of antibodies have their applications in diagnostic techniques, however only monoclonal antibodies are used in flow cytometry. Conjugation of monoclonal antibodies with fluorescent dyes enables the detection of antigens of different cell types. Contemporary flow cytometers can simultaneously detect more than ten different fluorescences, which gives the possibility of simultaneous assessment of many different antigens of the same cell. I. PRZECIWCIA A Przeciwcia³a, czyli immunoglobuliny, to substancje bia³kowe wytwarzane przez w pe³ni zró nicowane limfocyty B plazmocyty, zdolne do swoistego ³¹czenia siê z antygenem. Cz¹steczka przeciwcia³a sk³ada siê z czterech ³añcuchów polipeptydowych: dwóch lekkich i dwóch ciê kich po³¹czonych ze sob¹ mostkami disiarczkowymi (ryc. 1). Wyró nia siê 5 typów ³añcuchów ciê kich: α, δ, ε, γ, µ

18. SÊDEK, B. MAZUR RYCINA 1. Schemat budowy przeciwcia³a: V H czêœæ zmienna ³añcucha ciê kiego, V L czêœæ zmienna ³añcucha lekkiego, C H czêœæ sta³a ³añcucha ciê kiego, C L czêœæ sta³a ³añcucha lekkiego, CDR1-3 regiony determinuj¹ce dopasowanie (ang. complementarity determinig regions) (na podst. [1] zmodyfikowane) oraz 2 typy ³añcuchów lekkich: κ i λ. W zale noœci od typu ³añcucha ciê kiego wyró nia siê 5 klas immunoglobulin,odpowiednio: IgA, IgD, IgE, IgG oraz IgM. Zarówno ³añcuchy lekkie, jak i ciê kie zawieraj¹ czêœci sta³e (C) znajduj¹ce siê w ich odcinkach C-koñcowych (z wolnymi grupami karboksylowymi ³añcuchów polipeptydowych) oraz czêœci zmienne obejmuj¹ce odcinki N-koñcowe (z wolnymi grupami aminowymi). Czêœci sta³e ³añcuchów ciê kich i lekkich s¹ identyczne dla wszystkich przeciwcia³ danej klasy. Natomiast czêœci zmienne, kodowane przez wiele genów o skomplikowanych mechanizmach regulacji ekspresji, mog¹ ró niæ siê znacznie nawet w obrêbie jednej klasy. Czêœæ zmienna ka dego ³añcucha sk³ada siê z 3 regionów hiperzmiennych, zwanych te regionami determinuj¹cymi dopasowanie CDR (ang. complementarity determining regions) i 4 przylegaj¹cych do nich regionów zrêbowych FR (ang. frame regions). Czêœci zmienne ³añcuchów ciê kich i lekkich tworz¹ miejsce wi¹ ¹ce antygen, a przestrzenna konfiguracja tych czêœci, a zw³aszcza le ¹cych w ich obrêbie regionów CDR determinuje swoistoœæ przeciwcia³a, czyli jego selektywne ³¹czenie siê z okreœlonym antygenem [1, 2]. Miejsce wi¹ ¹ce antygen zwane jest paratopem i jest przestrzennie dopasowane do determinanty antygenowej (epitopu), czyli okreœlonego fragmentu przestrzennej struktury antygenu. Wed³ug obowi¹zuj¹cej nomenklatury przeciwcia³om nadaje siê nazwê wskazuj¹c¹ na antygen, jaki rozpoznaj¹, jednak e okreœlenie przeciwcia³o przeciwko danemu antygenowi nie jest do koñca jednoznaczne. I chocia do niektórych celów dalsze precyzowanie tego pojêcia nie jest konieczne, istniej¹ takie zastosowania, dla których œcis³e okreœlenie swoistoœci przeciwcia³a jest kluczowe. Jednym z takich zastosowañ jest cytometria przep³ywowa. Dlatego nale y wprowadziæ i zdefiniowaæ pojêcia przeciwcia³a poliklonalnego i monoklonalnego. I.1. Przeciwcia³a poliklonalne Podczas produkcji przeciwcia³ poprzez immunizacjê zwierzêcia okreœlonym antygenem, nawet o bardzo wysokiej czystoœci, ka dy klon limfocytów B, który bierze udzia³ w odpowiedzi immunologicznej wytwarza immunoglobuliny swoiœcie rozpoz-

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 19 naj¹ce okreœlony epitop tego antygenu [3, 4]. Bior¹c pod uwagê fakt, e w odpowiedzi immunologicznej bierze udzia³ wiele klonów limfocytów B oraz e na jednym antygenie mo e byæ obecnych co najmniej kilka ró nych epitopów, mo na siê spodziewaæ powstania mieszaniny przeciwcia³ rozpoznaj¹cych ró ne determinanty, ró ni¹cych siê równie powinowactwem, czyli stopniem dopasowania i si³¹ wi¹zania z antygenem. Taka grupa przeciwcia³, rozpoznaj¹ca zasadniczo jeden antygen, ale reaguj¹ca z ró nymi jego epitopami to przeciwcia³a poliklonalne (pochodz¹ce od wielu klonów limfocytów B). I.1.1. Zalety i wady stosowania przeciwcia³ poliklonalnych Jak ju wspomniano, wybór rodzaju przeciwcia³ zale y od specyfiki celu, do jakiego maj¹ byæ u yte. Do wielu badañ, obejmuj¹cych równie niektóre zastosowania w diagnostyce i terapii, przeciwcia³a poliklonalne s¹ w zupe³noœci wystarczaj¹ce. Ich niew¹tpliwym atutem jest stosunkowo niski w porównaniu z przeciwcia³ami monoklonalnych koszt uzyskiwania. Zdolnoœæ do rozpoznawania ró nych determinant antygenu sprawia, e przeciwcia³a poliklonalne maj¹ bardzo wysok¹ zach³annoœæ (awidnoœæ), która wynika z faktu, e ca³kowita si³a oddzia³ywania przeciwcia³ poliklonalnych z wieloma ró nymi epitopami antygenu jest znacznie wiêksza ni prosta suma pojedynczych oddzia³ywañ, poniewa zwi¹zanie jednego przeciwcia³a zwiêksza prawdopodobieñstwo przy³¹czenia kolejnego przeciwcia³a przez s¹siedni epitop [1 4]. Dziêki tej w³aœciwoœci, za pomoc¹ przeciwcia³ poliklonalnych ³atwo i z wysok¹ czu³oœci¹ mo na stwierdziæ obecnoœæ lub brak danego antygenu oraz okreœliæ jego stê enie. Ponadto, przeciwcia³a poliklonalne bardzo dobrze sprawdzaj¹ siê w badaniu z³o onych antygenów, w reakcjach immunoprecypitacji lub aglutynacji. Szczególnym zastosowaniem przeciwcia³ poliklonalnych s¹ ró ne surowice odpornoœciowe, gdy dziêki wysokiej zach³annoœci przeciwcia³a te maj¹ wysok¹ zdolnoœæ neutralizacji toksyn [3, 5]. Wa n¹ zalet¹ przeciwcia³ poliklonalnych jest te fakt, e trwa³oœæ powsta³ych z antygenem kompleksów w mniejszym stopniu ni w przypadku przeciwcia³ monoklonalnych zale y od w³aœciwoœci roztworu (np. ph) [6]. Przeciwcia³a poliklonalne nie sprawdzaj¹ siê jednak w wykrywaniu subtelnych ró nic w budowie antygenów. Je eli dwa antygeny ró ni¹ siê tylko jednym epitopem, to przeciwcia³a poliklonalne w reakcji krzy owej rozpoznaj¹ obydwa antygeny. Ponadto próba wykrycia konkretnego antygenu o wielu epitopach w mieszaninie antygenów za pomoc¹ przeciwcia³ poliklonalnych bêdzie nieœæ ze sob¹ wysokie ryzyko zajœcia reakcji krzy owych i uzyskania fa³szywie pozytywnych wyników. Problemem jest te zró nicowane powinowactwo przeciwcia³ poliklonalnych do antygenu, rzutuj¹ce na wiarygodnoœæ, spójnoœæ i powtarzalnoœæ wyników. Z wymienionych powodów przeciwcia³a poliklonalne nie maj¹ zastosowania w czu³ych i precyzyjnych technikach, takich jak cytometria przep³ywowa [1, 3]. I.2. Przeciwcia³a monoklonalne Przeciwcia³a monoklonalne s¹ to przeciwcia³a produkowane przez nieró nicuj¹ce siê, stanowi¹ce jeden klon limfocyty B, rozpoznaj¹ tylko jedn¹, œciœle okreœlon¹ determinantê antygenow¹ [1, 2, 4]. Produkcja przeciwcia³ monoklonalnych jest

20. SÊDEK, B. MAZUR RYCINA 2. Produkcja przeciwcia³ monoklonalnych (opis w tekœcie) bardziej skomplikowana ni przeciwcia³ poliklonalnych (ryc. 2). Jedn¹ z metod jest metoda opracowana w 1975 r. przez Köhlera i Milsteina polegaj¹ca na fuzji komórki plazmatycznej produkuj¹cej przeciwcia³a z komórk¹ szpiczaka (Nagroda Nobla w dziedzinie medycyny w 1984 r.) [7]. Do fuzji u ywane s¹ komórki plazmatyczne wyizolowane z immunizowanej okreœlonym antygenem myszy oraz komórki szpiczaka z defektem metabolicznym (np. nieprodukuj¹ce enzymu fosforybozylotransferazy hipoksantyno-guaninowej HGPRT). Hodowla mieszaniny komórek poddanych fuzji na specjalnym medium selekcyjnym pozwala pozbyæ siê niesfuzjowanych plazmocytów oraz komórek szpiczaka, a pozwala jedynie na prze ycie produktów fuzji komórek szpiczaka i plazmocytów (hybrydom). Spoœród otrzymanych hybrydom izoluje siê i klonuje te, które najbardziej wydajnie produkuj¹ przeciwcia³a. W ten sposób otrzymane hybrydy produkuj¹ce przeciwcia³a o okreœlonej swoistoœci mo na dowolnie d³ugo hodowaæ in vitro [1 3].

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 21 I.2.1. Zalety i wady stosowania przeciwcia³ monoklonalnych Przeciwcia³a monoklonalne u ywane s¹ wszêdzie tam, gdzie przede wszystkim wymagana jest wysoka specyficznoœæ i powtarzalnoœæ reakcji z antygenem w ogóle. W szczególnoœci w³aœnie ten typ przeciwcia³ znalaz³ zastosowanie w cytometrii przep³ywowej. Za takim wyborem przemówi³y równie inne unikalne w³asnoœci przeciwcia³ monoklonalnych. Bardzo wa n¹ zalet¹ przeciwcia³ monoklonalnych jest fakt, e dziêki wysokiej specyficznoœci mo na u ywaæ ich w bardzo ma³ych stê eniach eliminuj¹c przy tym sk³onnoœæ do krzy owych reakcji z innymi bia³kami oraz wi¹zanie niespecyficzne (t³o). Poza tym, przeciwcia³a monoklonalne umo liwiaj¹ odró nienie od siebie minimalnie ró ni¹cych siê antygenów, np. punktow¹ zmian¹ jednego aminokwasu w obrêbie epitopu. Przeciwcia³a monoklonalne pozwalaj¹ te na wykrywanie innych modyfikacji antygenu, takich jak: utlenienie, fosforylacja, czy proteoliza. Przy pomocy przeciwcia³ monoklonalnych jest ponadto mo liwe odró nienie od siebie izoenzymów, proenzymów od enzymów w³aœciwych, bia³ek prawid³owych od nowotworowych, szczepów bakterii lub mutantów wirusów. Oprócz swoich niew¹tpliwych zalet, przeciwcia³a monoklonalne maj¹ tak e pewne ograniczenia. Paradoksalnie, niektóre z nich wynikaj¹ równie z ich wysokiej specyficznoœci. Na przyk³ad badanie wieloepitopowego antygenu przy pomocy jed-nego rodzaju przeciwcia³ monoklonalnych mog¹cego wi¹zaæ siê tylko do jednego epitopu mo e daæ wynik nieadekwatny do rzeczywistoœci. W przypadku skrajnie rzadko wystêpuj¹cych lub niedostatecznie wyeksponowanych epitopów uzyskany wynik bêdzie mocno zani ony. Ta niska w porównaniu z przeciwcia³ami poliklonalnymi zach³annoœæ, powoduje, e przeciwcia³a monoklonalne maj¹ tak e ograniczone zastosowanie w testach opartych na reakcjach immuno-precypitacji i aglutynacji. Inna wada przeciwcia³ monoklonalnych wynika z faktu, e wi¹ ¹ siê specyficznie z okreœlonym epitopem, czyli pewnym tylko fragmentem przestrzennej struktury bia³ka, a nie z antygenem jako ca³oœci¹. Z tego powodu dane przeciwcia³o monoklonalne mo e rozpoznawaæ dwa ró ne antygeny, na których obecny jest ten sam epitop. Prawdopodobieñstwo takiej krzy owej reakcji jest tym wiêksze, im mniejszy jest epitop rozpoznawany przez dane przeciwcia³o monoklonalne. Stosowanie przeciwcia³ monoklonalnych w diagnostyce niektórych rodzajów nowotworów równie mo e napotkaæ pewne ograniczenia. Znane s¹ przypadki, gdy u chorych na szpiczaka mnogiego dochodzi do delecji pewnych fragmentów produkowanych w ich organizmach immunoglobulin. Je eli stosowane do wykrycia tych patologicznych immunoglobulin przeciwcia³o monoklonalne jest skierowane akurat przeciwko temu fragmentowi, który uleg³ delecji, to uzyskany wynik jest fa³szywie negatywny. Dlatego, aby zapobiec takim sytuacjom, prawdopodobne jest, e w przysz³oœci, przynajmniej do niektórych rodzajów badañ z u yciem przeciwcia³, bêd¹ stosowane mieszaniny przeciwcia³ monoklonalnych lub przeciwcia³a poliklonalne [1 5]. I.3. Nazewnictwo przeciwcia³ Praca z przeciwcia³ami mo e w niektórych przypadkach nastrêczyæ pewnych problemów. Dotyczy to obydwu typów przeciwcia³, jednak nie jest zwi¹zane z ich

22. SÊDEK, B. MAZUR funkcjonalnoœci¹, lecz z ugruntowanym historycznie zamieszaniem w ich nazewnictwie. Pocz¹tkowo, w momencie pierwszego otrzymania, przeciwcia³om nadawano nazwy bezpoœrednio kojarz¹ce siê z ich funkcjami, jak np. przeciwcia³o CALLA przeciwko antygenowi powszechnej ostrej bia³aczki limfoblastycznej (ang. common acute lymphoblastic leukemia antigen). Poniewa ró ne firmy zajmuj¹ce siê produkcj¹ przeciwcia³ nie mog³y u ywaæ tych samych nazw, przeciwcia³a rozpoznaj¹ce ten sam antygen (zgodnie z obowi¹zuj¹c¹ nomenklatur¹: CD4) otrzyma³y ró ne nazwy, jak np. Leu3, L3T4, OKT4, W3/25, T4 [3, 8]. W 1982 r. w Pary u odby³a siê pierwsza miêdzynarodowa Konferencja poœwiêcona antygenom ró nicowania ludzkich leukocytów HLDA (ang. Human Leucocyte Differentiation), której celem by³o ujednolicenie nazewnictwa tych antygenów [9]. Konsekwencj¹ by³o wprowadzenie jednolitego systemu nomenklatury przeciwcia³ zgodnego z nazewnictwem przedzia³ów antygenów ró nicowania CD (ang. cluster of differentiation lub cluster designation) struktur wystêpuj¹cych na powierzchni komórek, g³ównie leukocytów. Klasyfikacja antygenów oparta by³a na badaniu ich rozmieszczenia na ró nych typach komórek technikami cytometrii przep³ywowej, mikroskopii fluorescencyjnej oraz immunohistologii. Okreœlone zosta³y te masy cz¹steczkowe antygenów metod¹ radioimmunoprecypitacji. Na 1. Konferencji HLDA wyodrêbniono 15 przedzia³ów CD, w których sklasyfikowano oko³o 150 przeciwcia³. Do 6. Konferencji HLDA, która odby³a siê w 1996 r. w Kobe w Japonii, sklasyfikowano ponad 1000 przeciwcia³ w 166 przedzia³ach CD obejmuj¹cych limfocyty T i B, komórki NK, komórki mieloidalne, monocyty, p³ytki krwi [9 14]. Dla porównania, na ostatniej, 8. Konferencji HLDA, która odby³a siê w 2004 r. w Adelaide w Australii, wyszczególniono 339 przedzia³ów CD, a w niektórych z nich dodatkowo subprzedzia³y. Przy okazji ostatniej Konferencji HLDA zmieniono jej nazwê na HCDM (ang. Human Cell Differentiation Molecules), jednoczeœnie rozszerzaj¹c pole badañ na komórki inne ni leukocyty, takie jak np. komórki œródb³onka [8, 15 19]. II. ZASADY BARWIENIA KOMÓREK Rezultaty eksperymentów na komórkach czêsto nie s¹ mierzalne poprzez zwyk³¹ obserwacjê preparatu pod mikroskopem. Aby naprawdê przekonaæ siê o wyniku eksperymentu, nale y najpierw w jakiœ sposób uwidoczniæ jego przedmiot komórki. Istnieje kilka sposobów uwidaczniania, czyli barwienia komórek: A. barwienie poœrednie z u yciem przeciwcia³: sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi, sprzê onych z enzymami, sprzê onych z biotyn¹, wyznakowanych radioizotopami; B. barwienie poœrednie z u yciem cz¹steczek innych ni przeciwcia³a, sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi,

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 23 C. barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi, D. barwienie wolnymi barwnikami niefluorescencyjnymi. Trzy pierwsze g³ówne typy barwieñ maj¹ zastosowanie w cytometrii przep³ywowej i zostan¹ omówione szerzej w kolejnych podrozdzia³ach. Wybór okreœlonego sposobu barwienia komórek zale y od celu, w jakim barwienie siê przeprowadza. Warto dodaæ, e wymienione rodzaje barwieñ mog¹ uwidoczniæ struktury powierzchniowe, wewn¹trzkomórkowe lub jedne i drugie jednoczeœnie (por. ryc. 4 i 5). II.1. Barwienie poœrednie z u yciem przeciwcia³ Przeciwcia³a s¹ bardzo precyzyjnym narzêdziem, dziêki któremu mo na selektywnie wybarwiæ po ¹dan¹ strukturê komórkow¹ antygen. W wi¹zaniu przeciwcia³a z antygenem uczestnicz¹ 4 typy oddzia³ywañ: si³y elektrostatyczne (pomiêdzy grupami + R-NH 3 i R-COO ), wi¹zania wodorowe, oddzia³ywania hydrofobowe oraz si³y van der Waalsa [1, 3, 4]. Na skutek tych oddzia³ywañ dochodzi do trwa³ego i swoistego zwi¹zania siê przeciwcia³a z antygenem i utworzenia kompleksu immunologicznego. Trwa³oœæ kompleksu zale y od si³y oddzia³ywania przeciwcia³a z antygenem (powinowactwa), od iloœci determinant antygenu i od tego czy przeciwcia³o jest poliklonalne czy monoklonalne. Te dwa ostatnie warunki okreœlaj¹ zach³annoœæ wi¹zania antygen-przeciwcia³o. Stabilnoœæ kompleksu immunologicznego zale y te od proporcji pomiêdzy przeciwcia³em a antygenem, temperatury oraz ph i si³y jonowej roztworu, w którym zachodzi reakcja. Przy równowadze lub nadmiarze przeciwcia³ w stosunku do antygenu tworz¹ siê du e kompleksy, które maj¹ sk³onnoœæ do precypitacji [3, 4]. Samo zwi¹zanie przeciwcia³a z antygenem nie wystarczy do uwidocznienia kompleksu. Wiod¹ce zastosowanie w cytometrii przep³ywowej ma barwienie z u yciem przeciwcia³ monoklonalnych sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi. II.1.1. Barwienie poœrednie z u yciem przeciwcia³ sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi Najszerzej stosowanym w cytometrii przep³ywowej sposobem wykrywania kompleksów antygen-przeciwcia³o jest u ycie przeciwcia³ monoklonalnych sprzê onych z barwnikiem fluorescencyjnym, tzw. fluorochromem lub fluoroforem, czyli cz¹steczk¹ maj¹c¹ zdolnoœæ emisji œwiat³a poprzez fluorescencjê po wzbudzeniu œwiat³em o okreœlonej d³ugoœci fali. ród³em œwiat³a s¹ lasery gazowe lub oparte na cia³ach sta³ych (kryszta³ach). W cytometrii przep³ywowej znalaz³o zastosowanie wiele ró nych fluorochromów (tab. I). Ka dy fluorochrom ma charakterystyczne dla siebie widmo absorpcji i emisji, dlatego nie ka dy fluorochrom mo e byæ wzbudzany przez ka dy laser. Dobór barwników fluorescencyjnych zale y od tego, w jakie lasery wyposa ony jest cytometr, od liczby detektorów fluorescencji, a tak e od tego, jakie przeciwcia³a, przeciwko jakim antygenom maj¹ byæ u ywane w danym badaniu. Warto zwróciæ uwagê, e niektóre fluorochromy nie mog¹ byæ stosowane jednoczeœnie, ze wzglêdu na zbyt podobne widmo emisji, wymagaj¹ce zastosowania tego samego filtru optycznego (np. PE-Cy5, PerCP, PerCp-Cy5.5).

24. SÊDEK, B. MAZUR TABELA I. Przyk³ady fluorochromów, z którymi sprzêgane s¹ przeciwcia³a stosowane w cytometrii przep³ywowej. FITC izotiocyjanian fluoresceiny, PE fikoerytry na, PE Cy5 (-Cy7)-fikoerytryna-cyjanina 5 (7), PerCP(-Cy5.5) peridininochlorofil (-cyjanina 5.5), APC(-Cy7) allofikocyjanina (-cyjanina 7) [52, 53] Laser(d³. fali) Fioletowy (407 Niebieski(488 nm) nm) Fluorochro m Pacific Blu e 450/50 Am-Cyan 525/50 Cascade Yellow 550/30 Charakterystyk a filtru optycznego FITC 530/30 PE 575/26 Texas Red 630/30 PE-Cy5 695/40 PerCP PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 780/60 ó³ty (594 nm) Alexa 594 618/25 Czerwony (635 nm) APC 670/30 Alexa 680 712/20 Alexa 700 730/40 APC-Cy7 780/60 Stosowanie wielu fluorochromów jednoczeœnie w wielokolorowej cytometrii przep³ywowej, oprócz oczywiœcie du ych mo liwoœci analizy i precyzji w okreœleniu immunofenotypu populacji komórek, niesie ze sob¹ pewne problemy. Mianowicie stosuj¹c jedynie filtry optyczne nie da siê unikn¹æ konsekwencji faktu, e widma emisji poszczególnych fluorochromów zachodz¹ na siebie (ryc. 3). Zachodzenie widm emisji powoduje, e dany detektor mierzy nie tylko œwiat³o wyemitowane przez przypisany do niego fluorochrom, lecz tak e tê czêœæ œwiat³a wyemitowan¹ przez inny fluorochrom, która mieœci siê w oknie przepuszczalnoœci spektralnej filtru optycznego umieszczonego przed danym detektorem. Efekt ten przynajmniej czêœciowo jest niwelowany poprzez odejmowanie od sygna³u mierzonego w danym kanale czêœci sygna³u pochodz¹cego od innych fluorochromów. Operacja ta zwana jest kompensacj¹ i jest przeprowadzana przez komputer steruj¹cy cytometrem dla ka dej pary fluorochromów z RYCINA 3. Widma emisji ró nych fluorochromów zachodz¹ na siebie. Stosowanie filtrów umo liwia rozdzielenie od siebie sygna³ów pochodz¹cych od ró nych fluorochromów i wydzielenie interesuj¹cego wycinka spektrum [64]

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 25 osobna. Podstaw¹ obliczenia optymalnej kompensacji jest jednak odpowiednie ustawienie napiêæ na fotopowielaczach sygna³u mierzonej fluorescencji (PMT), gwarantuj¹ce umiejscowienie wszystkich komórek, w zakresie mierzalnoœci, w sposób taki, aby mo liwe by³o rozró nienie pomiêdzy komórkami negatywnymi, s³abo pozytywnymi lub silnie pozytywnymi na dany antygen. Zadanie to nie jest ³atwe bior¹c pod uwagê ró ne charakterystyki spektralne stosowanych fluorochromów oraz odmienne zachowania ró nych przeciwcia³ sprzê onych z tym samym barwnikiem [20 24]. Maj¹c do dyspozycji odpowiednie przeciwcia³a sprzêgniête z barwnikami fluorescencyjnymi mo na okreœliæ sk³ad antygenowy komórek w próbce. Okreœlanie sk³adu antygenowego z u yciem przeciwcia³ nazywa siê immunofenotypowaniem, a same przeciwcia³a stosowane w cytometrii przep³ywowej powinny byæ przeciwcia³ami monoklonalnymi. Warunkiem przeprowadzenia pomiaru cytometrycznego jest uzyskanie zawiesiny komórek (lub ich fragmentów) w odpowiednim buforze. O ile tkanki p³ynne (krew, szpik kostny, p³yn mózgowo-rdzeniowy) przewa nie nie wymagaj¹ adnego wstêpnego przygotowania przed barwieniem, o tyle w przypadku tkanek sta³ych (wêz³ów ch³onnych, bioptatów) konieczna jest homogenizacja i filtracja. Niektóre rodzaje materia³u, jak krew i szpik kostny wymagaj¹ zastosowania antykoagulantów (takich jak EDTA, heparyna) oraz lizy erytrocytów [20, 25]. Dla niektórych zastosowañ, takich jak immunofenotypizacja szpiku kostnego w diagnostyce bia³aczek lub ocena liczebnoœci CD34-pozytywnych komórek macierzystych, kluczowym jest, by badane komórki by³y ywe przed barwieniem [20]. Podstawowym warunkiem zapewnienia maksymalnej ywotnoœci komórek i integralnoœci ich b³ony komórkowej jest badanie przeprowadzone na œwie o pobranym materiale. Komórki martwe bowiem czêsto niespecyficznie wi¹ ¹ przeciwcia³a, co powoduje zafa³szowanie wyników i znacznie utrudnia póÿniejsz¹ analizê [26 27]. W szczególnoœci do analizy cytometrycznej nie nadaje siê wiêc materia³ rozmra any. Cytometria przep³ywowa pozwala na jednoczesn¹ ocenê ywotnoœci badanych komórek. Osi¹gn¹æ to mo na stosuj¹c równolegle do barwienia przeciwcia³ami, barwienie np. jodkiem propidyny (PI), który wnika do martwych komórek i wi¹ e siê z ich DNA (por. ni ej). Przygotowanie próbki do pomiaru cytometrycznego zale y od tego, czy badany antygen znajduje siê na powierzchni komórki, czy wewn¹trz niej (cytoplazma, j¹dro komórkowe). II.1.1.1. Barwienie powierzchniowe z u yciem przeciwcia³ sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi Barwienie powierzchniowe przeprowadza siê bezpoœrednio po uzyskaniu zawiesiny materia³u, poprzez inkubacjê z przeciwcia³em monoklonalnym lub czêœciej z wieloma przeciwcia³ami sprzê onymi z ró nymi fluorochromami. Barwienie powinno odbywaæ siê w ciemnoœci, w temperaturze pokojowej. Nastêpnie, komórki musz¹ zostaæ poddane dzia³aniu buforu utrwalaj¹cego barwienie, który dodatkowo powoduje lizê erytrocytów niezbêdn¹ do analizy próbek z krwi i szpiku kostnego. W jednym z wariantów protoko³u barwienia, po etapie lizy, komórki wymagaj¹ przep³ukania buforem, najczêœciej specjalnie wzbogaconym roztworem PBS w celu usuniêcia niezwi¹zanych przeciwcia³ oraz resztek roztworu lizuj¹cego. Wi¹zanie przeciwcia³o-antygen jest na ogó³ silne i kompleksy takie s¹ trwa³e

26. SÊDEK, B. MAZUR przez d³u szy czas. Przechowywanie wybarwionych próbek nie jest jednak wskazane ze wzglêdu na fakt, e zdolnoœæ emisji fluorescencji przez fluorochromy mo e znacz¹co obni yæ siê [28]. Technik¹ cytometrii przep³ywowej mo na badaæ rozmaite antygeny powierzchniowe. Najczêœciej s¹ to ró ne antygeny ró nicowania cz¹steczki CD, wystêpuj¹ce g³ównie na leukocytach, antygeny p³ytkowe, erytrocytarne, antygeny komórek macierzystych i wiele innych (ryc. 4). II.1.1.2. Barwienie wewn¹trzkomórkowe z u yciem przeciwcia³ Barwienie antygenów wewn¹trzkomórkowych, zarówno cytoplazmatycznych, jak i j¹drowych, wymaga wczeœniejszego utrwalenia komórek, najczêœciej poprzez inkubacjê w roztworze zawieraj¹cym formaldehyd. Po utrwaleniu, komórki musz¹ zostaæ poddane permeabilizacji ³agodnym detergentem. Jest to proces, w którym b³ona komórkowa jest czêœciowo dezintegrowana i staje siê przepuszczalna dla cz¹stek okreœlonych rozmiarów, przy czym komórka jako ca³oœæ nie traci swej integralnoœci. Równoczeœnie z dzia³aniem œrodka permeabilizuj¹cego, komórki inkubuje siê z przeciwcia³em monoklonalnym przeciwko wewn¹trzkomórkowemu antygenowi. Odpowiedni dobór roztworu permeabilizuj¹cego pozwala na przejœcie do wnêtrza komórki nawet tak du ych cz¹steczek jak pentameryczne przeciwcia³o klasy IgM. Podobnie jak przy barwieniu powierzchniowym konieczne jest odp³ukanie roztworu utrwalaj¹cego i permeabilizuj¹cego oraz niezwi¹zanych przeciwcia³ roztworem PBS [28]. Najczêœciej oznaczanymi za pomoc¹ przeciwcia³ monoklonalnych antygenami cytoplazmatycznymi s¹ cytoplazmatyczne immunoglobuliny (np. cigµ [29]), enzymy (np. mieloperoksydaza MPO [30]), cytokiny wewn¹trzkomórkowe (np. TNFα [31]) oraz cz¹steczki przekaÿników sygna³u (np. ZAP-70 [32]). Z antygenów j¹drowych nale y wymieniæ wa ny w diagnostyce ostrych bia³aczek limfoblastycznych enzym transferazê nukleotydów terminalnych (TdT [33]) (ryc. 4). Utrwalanie komórek przed barwieniem wewn¹trzkomórkowym niesie jednak ze sob¹ pewien efekt uboczny, polegaj¹cy na zmianie charakterystyki rozproszenia œwiat³a przez komórki. Nie stanowi to jednak wiêkszego problemu przy analizie takich próbek. Mo na natomiast wykorzystaæ obraz rozproszenia komórek utrwalonych i nieutrwalonych do porównania zmian spowodowanych u yciem œrodka utrwalaj¹cego [20]. II.1.2. Barwienie poœrednie z u yciem przeciwcia³ sprzê onych z biotyn¹ lub enzymami Alternatyw¹ dla przeciwcia³ sprzê onych z fluorochromami jest ich sprzêganie z biotyn¹. Do wykrywania kompleksów z antygenem stosuje siê w takich uk³adach awidynê lub streptawidynê bia³ka o wysokim powinowactwie do biotyny, które sprzêgane s¹ z barwnikiem fluorescencyjnym. Jedna cz¹steczka awidyny lub streptawidyny mo e zwi¹zaæ 4 cz¹steczki biotyny, co zwiêksza czu³oœæ testu [34]. Przeciwcia³a mog¹ byæ równie sprzêgane z enzymami. Takie uk³ady nie maj¹ jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej, lecz w innej grupie technik, zwanych immunoenzymatycznymi. Do najwa niejszych z nich nale y technika ELISA (ang. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), Western Blot oraz techniki PAP i APAAP.

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 27 RYCINA 4. Ró ne rodzaje barwieñ i ró ne typy prezentacji wyników pomiaru cytometrycznego: A barwienie powierzchniowe antygenu CD3 (histogram), B barwienie wewn¹trzkomórkowe enzymu j¹drowego transferazy nukleotydów terminalnych TdT po³¹czone z barwieniem powierzchniowym antygenu CD10 (wykres kropkowy, prezentacja fluorescencji pochodz¹cej od dwóch ró nych fluorochromów), C barwienie wewn¹trzkomórkowe enzymu cytoplazmatycznego mieloperoksydazy MPO (wykres kropkowy, po³¹czenie obrazu fluorescencji i rozproszenia bocznego SSC) W najczêœciej stosowanych odmianach testu ELISA przeciwcia³o jest zwi¹zane ze sta³ym pod³o em. Nastêpnie dodawana jest próbka zawieraj¹ca oznaczany antygen. Kompleks antygenu z przeciwcia³em wykrywany jest przeciwcia³ami sprzê onymi z enzymem, np. peroksydaz¹ chrzanow¹ (HRP) lub alkaliczn¹ fosfataz¹ (AP). W ostatnim etapie testu dodawany jest substrat dla enzymu sprzê onego z przeciwcia³em (np. dichlorowodorek p-fenylenodiaminy dla peroksydazy chrzanowej lub np. fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indoksylowy (BCIP) lub b³êkit nitrotetrazolowy (NBT) dla alkalicznej fosfatazy) [35]. Produkt reakcji jest barwny i oznacza siê go metod¹ spektrofotometryczn¹. Natê enie barwy produktu jest proporcjonalne do iloœci enzymu, która z kolei jest proporcjonalna do iloœci oznaczanego antygenu [36, 37]. Inna z metod Western Blot opiera siê o wykrywanie bia³ek przeniesionych po elektroforezie z elu na specjaln¹ membranê nitrocelulozow¹ lub nylonow¹.

28. SÊDEK, B. MAZUR Przeniesione na zasadzie elektrotransferu bia³ka wykrywane s¹ na membranie przeciwcia³ami rozpoznaj¹cymi badany antygen. Kompleksy antygen-przeciwcia³o wykrywane s¹ metod¹ immunoenzymatyczn¹, po inkubacji z przeciwcia³ami drugorzêdowymi sprzê onymi z enzymem, podobnie jak w teœcie ELISA [38]. Techniki PAP (peroksydaza-antyperoksydaza) i APAAP (alkaliczna fosfatazaantyalkaliczna fosfataza) s¹ równie przyk³adami barwieñ komórek z u yciem przeciwcia³ sprzê onych z enzymami. Ich g³ównym zastosowaniem jest barwienie rozmazów krwi lub szpiku kostnego. [35]. Metody te polegaj¹ na trzyetapowym barwieniu antygenu przeciwcia³ami pierwszo-, drugo- i trzeciorzêdowymi. Przeciwcia³o trzeciorzêdowe jest przeciwcia³em rozpoznaj¹cym w³aœciwy dla siebie enzym (peroksydazê lub alkaliczn¹ fosfatazê). Wykrywanie kompleksu odbywa siê po dodaniu roztworów odpowiedniego enzymu, a nastêpnie substratu. Takie wielostopniowe barwienie zapewnia wysok¹ czu³oœæ i stabilnoœæ powsta³ych kompleksów. Jednak ze wzglêdu na pracoch³onnoœæ tych technik zosta³y one prawie ca³kowicie zast¹pione prostszymi, lecz równie czu³ymi metodami [34]. II.1.3. Inne barwienia z u yciem przeciwcia³ Do barwienia komórek i uwidaczniania kompleksów antygen-przeciwcia³o mog¹ s³u yæ te przeciwcia³a znakowane radioizotopami. Takie przeciwcia³a nie maj¹ jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej. Technikami alternatywnymi do cytometrii przep³ywowej opartymi na wykrywaniu radioizotopów s¹ metody emisyjnej tomografii pozytonowej PET (ang. Positron Emission Tomography) i emisyjnej tomografii pojedynczego fotonu SPECT (ang. Single Photon Emission Computed Tomography) [39, 40]. II.2. Barwienie poœrednie z u yciem cz¹steczek innych ni przeciwcia³a, sprzê onych z barwnikami fluorescencyjnymi Z barwnikami fluorescencyjnymi mog¹ byæ równie sprzêgane inne ni przeciwcia³a cz¹steczki. Przyk³adami mog¹ byæ lektyny wi¹ ¹ce wêglowodany [41] oraz tzw. przeciwcia³a antyfosfolipidowe, których przedstawicielem jest np. aneksyna V. Ten ostatni zwi¹zek ma zdolnoœæ wi¹zania siê z fosfatydyloseryn¹ fosfolipidem b³onowym. W warunkach fizjologicznych fosfolipid ten znajduje siê po wewnêtrznej (cytoplazmatycznej) stronie b³ony komórkowej. Kiedy jednak komórka wchodzi na drogê apoptozy, fosfatydyloseryna zostaje przemieszczona na zewnêtrzn¹ stronê b³ony. Fakt ten zosta³ wykorzystany w jednej z metod wykrywania apoptozy, w której aneksyna V jest stosowana w parze z jodkiem propidyny (ryc. 5). Test z u yciem aneksyny V i jodku propidyny jest przyk³adem jednoczesnego barwienia powierzchniowego i wewn¹trzkomórkowego [42 44]. II.3. Barwienie wolnymi barwnikami fluorescencyjnymi W przypadku barwienia z u yciem przeciwcia³ sprzê onych z fluorochromami, ka dy ze sk³adników odgrywa swoj¹ rolê: przeciwcia³o wi¹ e siê swoiœcie z odpowiednim antygenem, natomiast fluorochrom pozwala wykryæ utworzony

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 29 kompleks. Barwniki fluorescencyjne stosowane samodzielnie mog¹ spe³niaæ obydwie te funkcje jednoczeœnie: wi¹ ¹ siê z odpowiedni¹ dla siebie struktur¹ docelow¹ i daj¹ wykrywalny sygna³ utworzenia kompleksu. Spektrum barwników fluorescencyjnych, które mo na stosowaæ w stanie wolnym, niesprzê onym z przeciwcia³ami jest szerokie, podobnie jak spektrum zastosowañ takich barwieñ. Barwniki fluorescencyjne w stanie wolnym, w wiêkszoœci maj¹ zdolnoœæ wi¹zania siê z DNA, co zna-az³o zastosowanie m.in. w testach okreœlaj¹cych zawartoœæ DNA w komórce. Za pomoc¹ innych wolnych barwników RYCINA 5. Wykrywanie apoptozy: æwiartka Q1 mo liwe jest badanie procesów oksydacyjnych (wybuch tlenowy), badanie apoptozy (wybarwione zarówno aneksyn¹ V, jak i komórki nekrotyczne (wybarwione jedynie jodkiem propidyny), æwiartka Q2 komórki w póÿnej fazie zmian potencja³u b³onowego, zdolnoœci jodkiem propidyny), æwiartka Q3 komórki ywe, fagocytarnej komórek, wewn¹trzkomórkowego ph, czy aktywnoœci æwiartka Q4 komórki we wczesnej fazie apoptozy (wybarwione tylko aneksyn¹ V) enzymatycznej. Najwa niejsze barwniki wraz z zastosowaniami zosta³y zebrane w tabeli II. II.3.1. Barwniki wi¹ ¹ce siê z DNA Barwniki fluorescencyjne (jak np. bromek etydyny czy jodek propidyny) wi¹ ¹ siê z DNA poprzez interkalacjê pomiêdzy komplementarnymi zasadami obydwu jego nici. Jest to wi¹zanie stechiometryczne, dziêki czemu mo liwa jest nie tylko jakoœciowa ocena reakcji tych barwników z DNA, ale równie i iloœciowa. Barwienie DNA danej próbki mo e daæ dwa rodzaje informacji: na temat ploidii DNA oraz proporcji pomiêdzy komórkami znajduj¹cymi siê w poszczególnych fazach cyklu komórkowego (ryc. 6). Ta grupa barwników znalaz³a wiêc szczególne zastosowanie w diagnostyce ró nych chorób przebiegaj¹cych z zaburzeniem ploidii DNA, b¹dÿ cyklu komórkowego [20, 45]. Poprzez porównanie po³o enia piku odpowia- RYCINA 6. Profil DNA. Najwy szy pik to komórki niedziel¹ce siê, bêd¹ce w fazie G 0 lub G 1 cyklu komórkowego (komórki diploidalne). Drugi mniejszy pik to komórki w fazie G 2 i M (mitozy), o podwojonej iloœci DNA (komórki tetraploidalne). Pomiêdzy pikami znajduj¹ siê komórki w fazie S (syntezy DNA)

30. SÊDEK, B. MAZUR TABELA II. Barwniki fluorescencyjne stosowane w stanie wolnym zastosowanie Barwnik PI* (jodek propidyny) EtBr* (bromek etydyny) DAPI* (4',6-diamidino-2-fenylindol) Hoechst 33258*, 33342* Mo liwe zastosowani e do barwiena i badanie ywotnoœci komórek,wykrywani e apoptozy, ocena fazy cyklu komórkowego, ocena ploidii DNA,wykrywanie aneuploidii F DA** (dwuoctan fluoresceiny) pomiar wybuchu tlenowego, badanie ywotnoœci komórek HE** (hydroetydyna) DCFH-DA** (dwuoctan dichlorofluoresceiny) komórek i ich Literatur a [20], [28], [44], [54], [55] [55], [56] p omiar wybuchu tlenoweg o [57, 58] [57, 59, 60] D HR** (dihydrorodamina 123) pomiar wybuchu tlenowego, badanie aktywnoœci enzymów r ó ne estry fluoresceiny** badanie aktywnoœci enzymów, ocena zdolnoœci fagocytarnej komórek diacetoksy-2,3-dicyjanobenzen CFSE** * barwniki wi¹ ¹ce przez enzym [57, 59] b adanie wewn¹trzkomórkowego ph [62] badanie odpowiedzi limfocytów T na ró ne antygeny siê z DNA; ** barwniki nabywaj¹ce w³aœciwoœci fluorescencyjne [58, 60, 61] [63] po przekszta³ceniu daj¹cego fazie G 0 /G 1 (faza spoczynku) pomiêdzy próbk¹ badan¹ a diploidaln¹ próbk¹ kontroln¹, mo na okreœliæ jej ploidiê. Natomiast okreœlenie proporcji komórek w poszczególnych fazach cyklu wymaga podzielenia histogramu na trzy regiony odpowiadaj¹ce fazom G 0 /G 1, S (faza syntezy DNA) i G 2 /M (faza po zakoñczeniu replikacji i mitoza) oraz obliczenia powierzchni pod pikami (fazy G 0 /G 1 i G 2 /M) i pomiêdzy nimi (faza S). II.3.2. Barwniki nabywaj¹ce w³aœciwoœci fluorescencyjnych po przekszta³ceniu przez enzym Istniej¹ te barwniki, które dopiero po przekszta³ceniu przez enzym nabywaj¹ zdolnoœci do emisji fluorescencji (tab. II). Stosuje siê je do pomiarów aktywnoœci enzymów, które tê konwersjê przeprowadzaj¹. Najszersze zastosowanie maj¹ zwi¹zki, które nabywaj¹ w³aœciwoœci fluorescencyjnych po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu, takie jak: nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) produkt aktywnoœci dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), a tak e rodnik hydroksylowy ( o OH) oraz tlen singletowy ( 1 O 2 ). Reaktywne formy tlenu s¹ wytwarzane przez aktywowane inicjacj¹ fagocytozy granulocyty w procesie zwanym wybuchem tlenowym, najczêœciej jako odpowiedÿ na infekcje bakteryjne. W wybuchu tlenowym granulocyty, a tak e

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 31 monocyty, przy udziale enzymu mieloperoksydazy (MPO) mog¹ produkowaæ kwas podchlorawy (HClO) [46 48]. II.4. Barwienie wolnymi barwnikami niefluorescencyjnymi Istnieje jeszcze du a grupa barwników, które nie wykazuj¹ w³aœciwoœci fluorescencyjnych, jednak s¹ szeroko stosowane do barwienia komórek. Barwienie komórek z u yciem tego typu barwników nie ma jednak zastosowania w cytometrii przep³ywowej. Barwniki te stosuje siê np. do barwienia rozmazów krwi lub szpiku kostnego (barwienie metodami May-Grünwald-Giemsy, Wrighta, Romanovsky'ego, Pappenheima), a tak e w testach ywotnoœci (b³êkit trypanu) [49]. Do tej grupy barwników nale ¹ te zwi¹zki, które daj¹ barwny produkt w wyniku reakcji enzymatycznej. Przyk³adem mo e byæ b³êkit nitrotetrazolowy (NBT), który w formie zredukowanej tworzy niebieskie kryszta³y. Wykorzystuje siê go do oceny aktywnoœci enzymów oksydoredukcyjnych (g³ównie alkalicznej fosfatazy) i zdolnoœci fagocytarnej komórek [35, 50]. Innym zwi¹zkiem s³u ¹cym do badania aktywnoœci enzymów oksydoredukcyjnych (g³ównie peroksydazy) jest diaminobenzydyna (DAB), daj¹ca po utlenieniu barwny produkt [35, 51]. Inne barwniki z tej grupy maj¹ zastosowanie w diagnostyce bia³aczek i zespo³ów limfoproliferacyjnych. Nale ¹ tu np. Sudan czarny B barwi¹cy lipidy obojêtne, fosfolipidy i cerebrozydy, PAS (periodic-acid-schiff) wi¹ ¹cy siê z glikogenem, a tak e estry fosforanów substraty enzymu lizosomalnego kwaœnej fosfatazy oraz wspomniane wczeœniej fosforany zwi¹zków aromatycznych, bêd¹ce substratem dla alkalicznej fosfatazy granulocytów (FAG) [35, 51]. LITERATURA [1] GO B J, JAKÓBISIAK M, LASEK W. Immunologia. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2002. [2] ROITT I, BROSTOFF J, MALE D. t³um. pod red. J. eromskiego. Immunologia. Wydawnictwo Medyczne S³otwiñski Verlag, Brema 1996. [3] KEREN DF. Background on surface marker assays and immunologic reagents. W: Keren DF, McCoy Jr. JP, Carey JL. [red.] Flow cytometry in clinical diagnosis. ASCP Press, American Society for Clinical Pathology, Chicago 2001: 1 26. [4] BOENISCH T. Antibodies.W: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook. Dako Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 5 11. [5] PETERS JH, BAUMGARTEN H. [red.] Monoclonal antibodies. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg: 1992. [6] BOENISCH T. Diluent buffer ions and ph: their influence on the performance of monoclonal antibodies in immunohistochemistry. Appl Immunohistochem 1999; 7(4): 300 306. [7] KOHLER G, MILSTEIN C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 445 497. [8] ZOLA H, SWART B, NICHOLSON I, AASTED B, BENSUSSAN A, BOUMSELL L, BUCKLEY C, CLARK G, DRBAL K, ENGEL P, HART D, HOREJSI V, ISACKE C, MACARDLE P, MALAVASI F, MASON D, OLIVE D, SAALMUELLER A, SCHLOSSMAN SF, SCHWARTZ-ALBEIZ R, SIMMONS P, TEDDER TF, UGUCCIONI M. WARREN H. CD molecules 2005: human cell differentiation molecules. Blood 2005;106(9): 3123 3126. [9] BERNARD A, BOUMSELL L, DAUSSET J et al. [red.] Leucocyte typing. Springer-Verlag, Berlin: 1984. [10] RENHERZ EL, HAYNES BF, NADLER LM et al. [red.] Leukocyte typing II. Springer-Verlag, New York, NY: 1986.

32. SÊDEK, B. MAZUR [11] MCMICHAEL AJ. [red.] Leukocyte typing III. Oxford University Press, Oxford: 1987. [12] KNAPP W, DORKEN B, GILKS WR et al. [red.] Leucocyte typing IV. Oxford University Press, Oxford: 1990. [13] SCHLOSSMANN SF, BOUMSELL L, GILKS W et al. [red.] Leukocyte typing V. Oxford University Press, New York, NY: 1995. [14] KISHIMOTO T, KIKUTANI H, VON DEM BORNE A et al. [red.] Leukocyte typing VI. Garland Publishing Inc, New York, NY: 1997. [15] ABDO M, IRVING B, HUDSON P, ZOLA H. Development of a cluster of differentiation antibody-based protein microarray. J Immunol Methods 2005; 305(1): 3 9. [16] ALGANIK MP, HARDIE DL, SWART B, DANDIE GW, ZOLA H, SHAW S, SHAPIRO H, TINCKAM K, MILFORD EL, WAND MP. Detecting antibodies with similar reactivity patterns in the HLDA8 blind panel of flow cytometry data. J Immunol Methods 2005; 305(1): 67 74. [17] VIDAL-LALIENA M, ROMERO X, MARCH S, REQUENA V, PETRIZ J, ENGEL P. Characterization of antibodies submitted to the B cell section of the 8th Human Leukocyte Differentiation Antigens Workshop by flow cytometry and immunohistochemistry. Cell Immunol 2005 Sep 10 [w druku]. [18] REDDY M, WONG J, DAVIS C, PRABHAKAR U. Co-expression of IL-12 receptors along with CXCR3 and CD25 on activated peripheral blood T lymphocytes. Cell Immunol 2005 Sep 12 [w druku]. [19] HALDER S, HARDIE DL, SCHEEL-TOELLNER D, SALMON M, BUCKLEY CD. Generation and characterization of novel stromal specific antibodies. Cell Res 2005; 15(9): 739 744. [20] MCCOY JR. JP. Basic principles in clinical flow cytometry. W: Keren DF, McCoy Jr. JP, Carey JL. [red.] Flow cytometry in clinical diagnosis. ASCP Press, American Society for Clinical Pathology, Chicago 2001: 45 57. [21] KANTORSKI J. Podstawy cytometrii przep³ywowej. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 87 93. [22] RADCLIFF G, JAROSZEWSKI MJ. Basics of flow cytometry. Methods Mol Biol 1998; 91: 1 24. [23] GIVAN AL. Flow cytometry: an introduction. Methods Mol Biol 2004; 263: 1 32. [24] MAECKER HT, TROTTER J. Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry Part A 2006; 69A: 1037 1042. [25] EROMSKI J, DWORACKI G. Ocena immunofenotypu komórek limfoidalnych przy pomocy cytometrii przep³ywowej uwagi praktyczne i zastosowanie kliniczne. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 99 106. [26] ORFAO A, SCHMITZ G, BRANDO B, RUIZ ARGUELLES A, BASSO G, BRAYLAN R et al. Clinically useful information provided by the flow cytometric immunophenotyping of hematological malignancies: current status and future directions. Clin Chem 1999; 45: 1708 1717. [27] PITUCH-NOWOROLSKA A. Zastosowanie cytometrii przep³ywowej do diagnostyki bia³aczek i ch³oniaków nieziarniaczych. Centr Eur J Immunol 1996; 21: 138 146. [28] SÊDEK, MAZUR B. Wieloparametryczna cytometria przep³ywowa jako nowa technika w rêku diagnosty laboratoryjnego cz. II. Laboratorium. Przegl¹d Ogólnopolski 2007; 4: 42 46. [29] KONIKOVA E, BABUSIKOVA O, MESAROSOVA A, KUSENDA J, GLASOVA M. Cytoplasmic and surface membrane phenotypic markers in cells of B cell chronic lymphocytic leukemia. Neoplasma 1994; 41(2): 69 74. [30] PEFFAULT DE LATOUR R, LEGRAND O, MOREAU D, PERROT JY, BLANC CM, CHAOUI D, CASADEVALL N, MARIE JP. Comparison of flow cytometry and enzyme cytochemistry for the detection of myeloperoxydase in acute myeloid leukaemia: interests of a new positivity threshold. Br J Haematol 2003; 122(2): 211 216. [31] ROSTAING L, PERES C, TKACZUK J, CHARLET JP, BORIES P, DURAND D, OHAYON E, DE PREVAL C, ABBAL M. Ex vivo flow cytometry determination of intracytoplasmic expression of IL-2, IL-6, IFN-gamma, and TNF-alpha in monocytes and T lymphocytes, in chronic hemodialysis patients. Am J Nephrol 2000; 20(1): 18 26. [32] WIESTNER A. Flow cytometry for ZAP-70: New colors for chronic lymphocytic leukemia. Cytometry B Clin Cytom 2006; 70(4): 201 203. [33] FARAHAT N, LENS D, MORILLA R, MATUTES E, CATOVSKY D. Differential TdT expression in acute leukemia by flow cytometry: a quantitative study. Leukemia 1995; 9(4): 583 587. [34] BOENISCH T. Staining methods.w: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook. Dako Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 26 31. [35] BOENISCH T. Basic Enzymology.W: Boenisch T. [red.] Immunochemical Staining Methods Handbook. Dako Corporation, Carpinteria, California, 3rd Edition, 2001: 14 16. [36] MADERSBACHER S, WOLF H, GERTH R, BERGER P. Increased ELISA sensitivity using a modified method for conjugating horseradish peroxidase to monoclonal antibodies. J Immunol Methods 1992; 152(1): 9 13.

PRZECIWCIA A MONO- I POLIKLONALNE I ICH ZASTOSOWANIE W CYTOMETRII... 33 [37] MARKHAM R, YOUNG L, FRASER IS. An amplified ELISA for human tumour necrosis factor alpha. Eur Cytokine Netw 1995; 6(1): 49 54. [38] LAZZAROTTO T, MAINE GT, DAL MONTE P, RIPALTI A, LANDINI MP. A novel Western blot test containing both viral and recombinant proteins for anticytomegalovirus immunoglobulin M detection. J Clin Microbiol 1997; 35(2): 393 397. [39] VEREL I, VISSER GW, VOSJAN MJ, FINN R, BOELLAARD R, VAN DONGEN GA. High-quality 124Ilabelled monoclonal antibodies for use as PET scouting agents prior to 131I-radioimmunotherapy. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2004; 31(12):1645 1652. [40] BOUCEK JA, TURNER JH. Validation of prospective whole-body bone marrow dosimetry by SPECT/CT multimodality imaging in 131I-anti-CD20 rituximab radioimmunotherapy of non-hodgkin's lymphoma. Eur J Nucl Med Mol Imaging 2005; 32(4): 458 469. [41] GUASCH RM, GUERRI C, O'CONNOR JE. Study of surface carbohydrates on isolated Golgi subfractions by fluorescent-lectin binding and flow cytometry. Cytometry 1995; 19(2): 112 118. [42] WILKINS RC, KUTZNER BC, TRUONG M, SANCHEZ-DARDON J, MCLEAN JR. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry 2002; 48(1): 14 19. [43] DARZYNKIEWICZ Z, HUANG X, OKAFUJI M, KING MA. Cytometric methods to detect apoptosis. W: Darzynkiewicz Z, Roederer M, Tanke HJ [red.] Cytometry, 4th Edition: New Developments. Methods in Cell Biology. Elsevier Academic Press 2004; 75: 325 327. [44] HERMES I, HAANEN C, STEFFENS-NAKKEN H, REUTELINGSPERGER C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled annexin V. J Immunol Methods 1995; 184: 39. [45] TRAGANOS F. Mechanism of antitumor drug action assessed by cytometry. W: Darzynkiewicz Z, Roederer M, Tanke HJ [red.] Cytometry, 4th Edition: New Developments. Methods in Cell Biology. Elsevier Academic Press 2004; 75: 265 273. [46] ZIELIÑSKA M, FENRYCH W, KOSTRZEWA A, WIKTOROWICZ K. Cytometryczny pomiar wybuchu oddechowego. Diagn Lab 1997; 33: 47 57. [47] ALVAREZ-LARRAN A, TOLL T, RIVES S, ESTELLA J. Assessment of neutrophil activation in whole blood by flow cytometry. Clin Lab Hematol 2005; 27(1): 41 46. [48] MIÊDZOBRODZKI J, ZEMANEK G, BARAN J. Chemiluminescencja opis zjawiska, mo liwoœci jego detekcji i wykorzystania. Mikrobiologia Medycyna 1999; 1(18). [49] PAWELSKI S. [red.] Wyposa enie i organizacja pracowni hematologicznej Mariañska B. PZWL, Wyd. III, Warszawa 1990: 22 24. [50] PAWELSKI S. [red.] Badania krwinek bia³ych Mariañska B. PZWL, Wyd. III, Warszawa 1990: 139. [51] PAWELSKI S. [red.] Diagnostyczne badania cytochemiczne i cytoenzymatyczne Litwin J. PZWL, Wyd. III, Warszawa 1990: 148 161. [52] WOOD B. 9 and 10 color flow cytometry in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med 2006; 130: 680 690. [53] www.bdbiosciences.com/spectra [54] MAZZINI G, FERRARI C, ERBA E. Dual excitation multi-fluorescence flow cytometry for detailed analyses of viability and apoptotic cell transition. Eur J Histochem 2003; 47(4): 289 298. [55] JAYPAL V, SHARMILA KM, SELVIBAI G, THYAGARAJAN SP, SHANMUGASUNDRAM N, SUBRA- MANIAN S. Fluorescein diacetate and ethidium bromide staining to determine the viability of Mycobacterium smegmatis and Escherichia coli. Lepr Rev 1991; 62(3): 310 314. [56] CLARKE JM, GILLINGS MR, ALTAVILLA N, BEATTIE AJ. Potential problems with fluorescein diacetate assays of cell viability when testing natural products for antimicrobial activity. J Microbiol Methods 2001; 46(3): 261 267. [57] WALRAND S, VALEIX S, RODRIGUEZ C, LIGOT P, CHASSAGNE J, VASSON MP. Flow cytometry study of polymorphonuclear neutrophil oxidative burst: a comparison of three fluorescent probes. Clin Chim Acta 2003; 331(1 2): 103 110. [58] PERTICARARI S, PRESANI G, MANGIAROTTI MA, BANFI E. Simultaneous flow cytometric method to measure phagocytosis and oxidative products by neutrophils. Cytometry 1991; 12(7): 687 693. [59] SMITH JA, WEIDEMANN MJ. Further characterization of the neutrophil oxidative burst by flow cytometry. J Immunol Methods 1993; 162(2): 261 268. [60] CASADO JA, MERINO J, CID J, SUBIRA ML, SANCHEZ-IBARROLA A. Simultaneous evaluation of phagocytosis and Fc R-mediated oxidative burst in human monocytes by a simple flow cytometry method. J Immunol Methods 1993; 159(1 2): 173 176.

34. SÊDEK, B. MAZUR [61] CONRADS G, HERRLER A, MOONEN I, LAMPERT F, SCHNITZLER N. Flow cytometry to monitor phagocytosis and oxidative burst of anaerobic periodontopathogenic bacteria by human polymorphonuclear leukocytes. J Periodontal Res 1999; 34(3): 136 144. [62] COOK JA, FOX MH. Intracellular ph measurements using flow cytometry with 1,4-diacetoxy-2,3- dicyanobenzene. Cytometry 1988; 1: 143 151. [63] LYONS AB, HASBOLD J, HODGKIN PD. Flow cytometric analysis of cell division history using dilution of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, a stably integrated fluorescent probe. Methods Cell Biol 2001; 63: 375 398. [64] BD FACSDiva Software Reference Manual. Bogdan Mazur ul. Jordana 19, 41-808 Zabrze e-mail: bmazur@slam.katowice.pl