ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII I IMMUNOLOGII DLA STUDENTÓW FARMACJI

ZAKŁAD MIKROBIOLOGII FARMACEUTYCZNEJ I DIAGNOSTYKI MIKROBIOLOGICZNEJ Katedra Biologii i Biotechnologii Farmaceutycznej Wydziału Farmaceutycznego ĆWICZENIA Z MIKROBIOLOGII I IMMUNOLOGII DLA STUDENTÓW FARMACJI POD REDAKCJĄ ELIGII M. SZEWCZYK Łódź 2014 1

AUTORZY: Bożena Dudkiewicz Wioletta Kmieciak Anna Kwaszewska Paweł Lisiecki Maria Sobiś-Glinkowska Jadwiga Szarapińska-Kwaszewska Magdalena Szemraj Eligia M. Szewczyk Piotr Wysocki ISBN: Wydanie drugie zmienione 2

Spis treści: MIKROBIOLOGIA Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów... 5 Rozdział 2 Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na podłożach.....19 Rozdział 3 Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej hodowli...33 Rozdział 4.. Wymagania wzrostowe bakterii......41 Rozdział 5 Wykorzystanie cech biochemicznych bakterii do ich Identyfikacji..51 Rozdział 6 Liczenie bakterii....69 Rozdział 7 Dezynfekcja i antyseptyka.....79 Rozdział 8 Wpływ czynników środowiskowych na wzrost i rozwój bakterii. Sterylizacja.... 91 Rozdział 9 Bakterie bytujące na skórze i błonach śluzowych...103 Rozdział 10 Bakterie w przewodzie pokarmowym.........123 Rozdział 11 Inne bakterie bytujące w środowisku człowieka.. 145 Rozdział 12 Bakterie wywołujące choroby o swoistym przebiegu, trudne do hodowli lub identyfikacji.. 153 Rozdział 13 Wirusologia.. 165 3

Rozdział 14 Mikologia...179 Rozdział 15 Bakterie w lekach kontrola czystości mikrobiologicznej.. 191 Rozdział 16 Schematy identyfikacyjne drobnoustrojów w badaniu leków wg Farmakopei Polskiej IX..205 Rozdział 17 Indukcja mutacji, wykrywanie mutagenów, przekazywanie Plazmidów. 211 Rozdział 18 Podstawy wiedzy o antybiotykach i antybiotykoterapii..217 IMMUNOLOGIA Rozdział 1 Podstawy diagnostyki immunologicznej i immunoprofilaktyki 233 4

Rozdział 1 Morfologia drobnoustrojów Cześć teoretyczna Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne Do mikroorganizmów prokariotycznych zaliczamy - bakterie i Archea, a do eukariotycznych - grzyby, glony i pierwotniaki. Te dwie grupy organizmów prezentują dwa odmienne typy budowy komórki. Choroby u ludzi wywołują zarówno drobnoustroje prokariotyczne (bakterie), jak i eukariotyczne (grzyby i pierwotniaki). Organizmy eukariotyczne mogą być zbudowane z jednej lub wielu komórek. Wszystkie drobnoustroje prokariotyczne są organizmami jednokomórkowymi. Podstawowe różnice w budowie komórki i replikacji materiału genetycznego pomiędzy komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi przedstawiono w tabeli 1. Morfologia komórki bakterii Wymiar większości komórek bakteryjnych pozwala na ich obserwację w mikroskopie świetlnym, gdyż mieści się w granicach od 1 do 10 µm. Przeciętna długość komórki bakteryjnej to 1-5 µm, a średnica od 1-2 µm. Jednak rozmiar najmniejszych bakterii wynosi od 0,15 do 0,2 µm i jest na granicy zdolności rozdzielczej mikroskopu świetlnego, ale największych wynosi od 250 do 600 µm. Komórki grzybów chorobotwórczych są znacznie większe od komórek bakteryjnych (do 40 μm). Ich wielkość waha się zależnie od gatunku i warunków hodowli. Bakterie różnią się między sobą kształtem. Wyróżniamy kształty: kulisty, cylindryczny i spiralny. 5

Tabela 1. Podstawowe różnice w strukturze i funkcji komórek prokariotycznych i eukariotycznych Cecha Komórka prokariotyczna Komórka eukariotyczna DNA wolny, zawieszony w cytoplazmie, zwykle jeden chromosom; plazmidy zawarty w jądrze, otoczonym błoną jądrową; jąderko Rozmnażanie Wymiana materiału genetycznego Ściana komórkowa Błona cytoplazmatyczna Układ błon wewnętrznych tylko bezpłciowe przez podział komórki poprzez koniugację, transdukcję i transformację zawiera peptydoglikan (u bakterii) lub inne polimery (Archea) brak steroli (poza mikoplazmami); zawiera hopanoidy (poza Archea) brak podział komórek przez mitozę; rozmnażanie płciowe z wytworzeniem gamet w czasie rozmnażania płciowego może zawierać chitynę, mannany, glukany (grzyby) lub celulozę obecne są sterole; organelle błonowe (lizosomy, peroksysomy). retikulum endoplazmatyczne, aparat Golgiego Mitochondria brak obecne Rybosomy 70 S 80S (cytoplazmatyczne), 70S (mitochondrialne) Rzęski z białka - flagelliny złożona, tubullarna struktura Bakterie kuliste, nazywane także ziarenkowcami, mogą być ułożone pojedynczo lub tworzyć charakterystyczne układy komórek. Powstawanie układów związane jest z płaszczyzną i liczbą podziałów komórek w trakcie rozmnażania oraz brakiem ich rozdziałów po podziale. Wśród bakterii kulistych wyróżniamy następujące układy popodziałowe: 6

dwoinki (Diplococcus) komórki po podziale pozostają po dwie, ziarniaki czworacze (Tetracocus) komórki dzielą się w dwóch płaszczyznach, pakietowce (Sarcina) komórki dzielą się w trzech płaszczyznach do siebie prostopadłych tworząc sześcianki, paciorkowce (Sterptococcus) komórki układają się w krótsze lub dłuższe łańcuszki, gronkowce (Staphylococcus) komórki mogą się dzielić w dwóch lub trzech płaszczyznach, tworząc skupiska przypominające kiście winogron. Do form cylindrycznych bakterii zaliczamy: pałeczki (Bacterium), laseczki (Bacillus), maczugowce (Corynebacterium), prątki (Mycobacterium), wrzecionowce (Fusobacterium). Niektóre formy bakterii cylindrycznych mogą także tworzyć charakterystyczne przestrzenne układy popodziałowe: dwoinki, krótsze lub dłuższe łańcuszki, palisady, ugrupowania w kształcie liter V, X, Y. Do form spiralnych bakterii zaliczamy: przecinkowce (Vibrio) z sierpowato zagiętą komórką, śrubowce (Spirillum), które tworzą pełną spiralę, krętki (Borrelia, Treponema, Leptospira), różniące się między sobą liczbą skrętów, grubością komórki i wyglądem jej biegunów. Niektóre gatunki bakterii wykazują tendencję do zmienności morfologicznej i wielokształtności komórek. Obok kulistych, mogą one tworzyć formy cylindryczne czy nitkowate. Zjawisko to nazywamy polimorfizmem (pleomorfizmem). Strukturami anatomicznymi występującymi w każdej komórce bakteryjnej są: nukleoid, rybosomy, cytoplazma i błona (membrana) cytoplazmatyczna. Wszystkie bakterie (z wyjątkiem mykoplazm) mają złożoną w swej strukturze ścianę komórkową. Niektóre bakterie wytwarzają warunkujące ruchliwość rzęski czy włókno osiowe, a także ważne dla kolonizacji fimbrie adhezyjne, dla wymiany materiału genetycznego fimbrie płciowe (pili), albo wpływającą na chorobotwórczość otoczkę. Niektóre rodzaje bakterii (Clostridium, Bacillus) mogą także tworzyć przetrwalniki (endospory) czy gromadzić w cytoplazmie materiały zapasowe, najczęściej kwas poli-β- 7

hydroksymasłowy, ziarnistości poli-metafosforanowe zwane wolutyną, ale także skrobię, glikogen czy koloidalną siarkę. Wytwarzanie tych struktur może zależeć od warunków środowiska. Cechy te jednak mają duże znaczenie dla taksonomii, a tym samym identyfikacji bakterii. W mikroskopie świetlnym, w mokrych preparatach możemy ocenić kształt i wielkość komórek drobnoustrojów, a także ich ruchliwość spowodowaną obecnością rzęsek lub włókna osiowego (preparat w kropli wiszącej ). Można także obserwować przetrwalniki jako struktury silniej załamujące światło niż reszta komórki bakteryjnej (mikroskop fazowo-kontrastowy). Barwienie trwałych preparatów bakterii metodą Grama wykorzystuje różnice w budowie ściany komórkowej dwóch grup bakterii. Jedne mają ścianę złożoną z grubej warstwy peptydoglikanu oraz kwasów tejchojowych, lipotejchojowych i białek te nazywamy gramdodatnimi, a ściana drugiej grupy jest złożona z cienkiej, zawieszonej w peryplazmie warstwie peptydoglikanu oraz lipopolisacharydu i białek tworzących tzw. błonę zewnętrzną te nazywamy gramujemnymi. Różnice w budowie ściany są przyczyną różnego zatrzymywania przez komórki barwników stosowanych w metodzie Grama i w efekcie pozwalają na łatwe przyporządkowanie bakterii do grupy. Ma to ogromne znaczenie dla identyfikacji bakterii. Ściana komórkowa niektórych bakterii zawiera dodatkowe składniki, które sprawiają, że barwienie metodą Grama jest trudne lub niejednoznaczne. Stosowane są wtedy inne metody (np. Mycobacterium spp.). Metodą Grama barwią się komórki, ale barwników nie przyjmują przetrwalniki, stąd metoda ta uwidacznia w komórkach te struktury. Komórka bakteryjna wytwarza tylko jeden przetrwalnik. Może on mieć kształt kulisty lub owalny i być umieszczony centralnie, podbiegunowo lub biegunowo. Przetrwalnik może mieć średnicę mniejszą lub większą od wymiaru poprzecznego komórki. W przypadku, gdy jest większa, powoduje zniekształcenie komórki i nadaje jej charakterystyczny kształt. Wytwarzane przez niektóre bakterie otoczki, także nie zabarwiają się w metodzie Grama, ale są widoczne, jeśli obok komórki zabarwimy tło - metodą pozytywno-negatywną. Otoczki te mają budowę wielocukrową, wielocukrowo-peptydową lub, najrzadziej, peptydową. 8

Stosując specjalne metody barwienia można zabarwić niektóre struktury komórkowe: rzęski, nukleoid, przetrwalniki. Dla celów taksonomicznych zastosowanie znajduje barwienie materiałów zapasowych. Funkcje jakie spełniają w komórkach poszczególne ich struktury przedstawiono w tabeli 2. Tabela 2. Podstawowe funkcje pełnione przez struktury komórki bakteryjnej. Struktura komórkowa Pełniona funkcja Nukleoid, plazmidy zapis potencjalnych możliwości komórki; genotyp Rybosomy synteza białek Błona cytoplazmatyczna umożliwia transport do wnętrza i na zewnątrz komórki; z nią związany jest metabolizm energetyczny Ściana komórkowa nadaje kształt, chroni przed uszkodzeniami mechanicznymi, jest barierą przepuszczalności dla substancji wielkocząsteczkowych; odgrywa rolę w patogenezie zakażeń Otoczka chroni przed fagocytozą; warunkuje przeżycie w organizmie gospodarza; bierze udział w adhezji bakterii do powierzchni Rzęski ruch Fimbrie udział w adhezji bakterii do powierzchni Fimbrie płciowe (pili) udział w procesie koniugacji przekazywania materiału genetycznego z komórki do komórki Przetrwalniki warunkują wyjątkową oporność na działanie czynników fizyko-chemicznych wytwarzających je bakterii 9

Metody Mikroskopowanie Do obserwacji bakterii wykorzystuje się przede wszystkim mikroskop z jasnym polem widzenia, którego zdolność rozdzielcza wynosi 0,2 µm. Zdolność rozdzielcza mikroskopu jest to najmniejsza odległość między dwoma punktami oglądanego obiektu, przy której widziane są one jako dwa oddzielne punkty. Preparaty trwałe barwione należy oglądać przy użyciu obiektywu immersyjnego dającego powiększenie 100 razy i okularów powiększających 5-10 razy przy maksymalnie podniesionym kondensorze. Pozwala to na osiągnięcie największego powiększenia (1000 razy), jakie możemy uzyskać w mikroskopie świetlnym. Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia okularu i powiększenia obiektywu. Obiektyw immersyjny wymaga zastosowania olejku immersyjnego, w którym należy zanurzyć soczewkę obiektywu przed przystąpieniem do oglądania preparatów. Promienie świetlne po przejściu przez szkiełko preparatu, wpadając do warstwy powietrza, ulegają załamaniu i większość z nich omijałaby soczewkę obiektywu immersyjnego. Wykorzystanie olejku immersyjnego niweluje to niekorzystne zjawisko. Po zakończeniu mikroskopowania z obiektywu należy usunąć pozostałości olejku bawełnianą szmatką. W przypadku zaschnięcia olejku na obiektywie, co grozi jego uszkodzeniem, usuwamy go specjalnym zmywaczem. Na jakość obrazu, jaki uzyskujemy w mikroskopie ma także wpływ oświetlenie oglądanego preparatu. Posługując się światłem dziennym, należy zastosować lusterko płaskie, a przy świetle sztucznym - lusterko wklęsłe. Preparaty przyżyciowe tzw. mokre oglądamy najczęściej przy pomocy obiektywów powiększających 40x lub 60x przy obniżonym kondensorze. Preparat w kropli spłaszczonej jest najłatwiejszy do wykonania. Badany materiał zawiesza się w kropli wody umieszczonej na szkiełku podstawowym i przykrywa się szkiełkiem nakrywkowym, które należy opuścić na szkiełko podstawowe ukośnie tak, aby do kropli nie dostały się 10

pęcherzyki powietrza. Jeśli badany materiał jest płynny, przenosi się kroplę wprost na szkiełko. Niekiedy stosuje się barwienie przyżyciowe, co ułatwia obserwację kształtu drobnoustrojów. Preparat w "kropli wiszącej" umożliwia obserwację ruchu bakterii. Wykonuje się go używając szkiełka podstawowego z wgłębieniem ("łezką") i szkiełka nakrywkowego. Przygotowanie rozmazów do preparatów trwałych Rozmazy wykonuje się na odtłuszczonych w płomieniu palnika szkiełkach podstawowych. Jeśli sporządza się rozmaz z bakterii zebranych z hodowli stałej, na szkiełko należy najpierw nanieść 1 oczko ezy wody, a następnie zawiesić w niej bardzo niewielką ilość masy bakteryjnej. Powstała zawiesina powinna lekko opalizować. Nie może być ona zbyt gęsta, gdyż nie uzyskamy wtedy obrazu pojedynczych komórek, co jest warunkiem prawidłowej oceny ich morfologii. Z hodowli płynnej nanosi się ezą na szkiełko 2-3 krople materiału. Każdą kroplę, przed naniesieniem następnej należy wysuszyć. Trzeba też pamiętać o przepaleniu ezy przed powtórnym zanurzeniem jej w hodowli. Przygotowane rozmazy suszy się w powietrzu lub w strumieniu ciepłego powietrza, trzymając szkiełko w palcach nad palnikiem. Utrwalenie preparatu osiąga się przez trzykrotne przeciągnięcie spodu szkiełka przez płomień palnika. Można też zalać szkiełko np. alkoholem metylowym i pozostawić do jego całkowitego odparowania. W trakcie wykonywania rozmazu wszystkie czynności należy wykonywać w pobliżu palnika, pamiętając o opalaniu ezy i wylotów probówek w trakcie pobierania materiału. Barwienie preparatów trwałych Bakterie najczęściej oglądamy w preparatach barwionych. Możemy w nich zaobserwować cechy morfologiczne komórek bakteryjnych, takie jak wymiar, kształt, sposób układania się komórek i nieliczne struktury anatomiczne. Barwienie pozwala także na różnicowanie bakterii między sobą i odróżnienie ich od składników otoczenia, w którym się znajdują. 11

Barwniki wykorzystywane w pracowni mikrobiologicznej dzielimy na barwniki kwaśne i barwniki zasadowe. Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a anion jest jonem barwnym. Do najczęściej wykorzystywanych należą nigrozyna, tusz chiński, kolargol, zieleń malachitowa i eozyna. W barwnikach zasadowych jonem barwnym jest kation. Do najczęściej wykorzystywanych zaliczamy fiolet krystaliczny, fuksynę zasadową, safraninę i błękit metylenowy. Mechanizm barwienia polega na adsorpcji barwnika na powierzchni komórki i na łączeniu się go ze związkami chemicznymi, głównie białkami, wchodzącymi w skład komórki bakteryjnej. W ph hodowli zwykle obojętnym lub lekko zasadowym białka bakteryjne mają ładunek ujemny. Kwasy nukleinowe, z którymi też będą łączyć się barwniki, w tych warunkach również wykazują ujemne naładowanie. Dlatego właśnie do barwienia bakterii używa się barwników zasadowych. Barwniki kwaśne stosowane są do barwienia tła otoczenia, w którym znajdują bakterie. Barwienie komórek bakteryjnych określamy barwieniem pozytywnym. Barwienie tła, otoczenia, w którym znajdują się komórki określamy barwieniem negatywnym. Metoda Grama Barwienie metodą Grama jest podstawowym barwieniem różnicującym stosowanym w mikrobiologii, dzielącym bakterie na dwie grupy: gramdodatnie i gramujemne. W metodzie tej wykorzystuje się kolejno następujące odczynniki: barwnik podstawowy fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (gencjana); zaprawę w postaci roztworu jodu w jodku potasu (płyn Lugola); odbarwiacz - alkohol etylowy; barwnik kontrastowy - alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (fuksyna 1:10). Wykonanie barwienia - na utrwalony preparat należy nalać świeżo przesączony przez bibułę roztwór gencjany na 2 minuty; - preparat spłukać wodą; 12

- nalać płyn Lugola na 1 minutę; - spłukać wodą; - odbarwiać alkoholem przez 15-20 sekund; - spłukać wodą; - dobarwić przez zalanie na 20 sekund roztworem fuksyny; - spłukać wodą; - osuszyć lekko odciskając w bibule. Wynik barwienia: Bakterie gramdodatnie fioletowogranatowe, gramujemne - różowe. O wyniku barwienia w metodzie Grama decyduje grubość warstwy peptydoglikanu ściany komórkowej. Warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich jest grubsza niż u bakterii gramujemnych. Fiolet krystaliczny przedostaje się do wnętrza komórki i łącząc się z jodem tworzy nierozpuszczalny w wodzie kompleks, który zabarwia ją na kolor fioletowy. Alkohol stosowany jako odbarwiacz, rozpuszcza błonę cytoplazmatyczną bakterii gramdodatnich oraz błonę cytoplazmatyczną i błonę zewnętrzną bakterii gramujemnych. Powoduje on również odwodnienie peptydoglikanu, uszczelniając w ten sposób ścianę komórkową. Gruba warstwa peptydoglikanu bakterii gramdodatnich skutecznie zatrzymuje barwny kompleks jodu z fioletem krystalicznym. W przypadku bakterii gramujemnych kompleks ten wydostaje się na zewnątrz przez cienką warstwę peptydoglikanu. Fuksyna jako barwnik kontrastowy zabarwia komórki bakterii gramujemnych na różowo. Metoda barwienia negatywno-pozytywnego Barwienie metodą negatywno-pozytywną jest jedną z technik wykrywania otoczek u bakterii. Komórka bakteryjna zabarwiana jest barwnikiem zasadowym, a tło kwaśnym. W metodzie tej można używać różnych barwników. Dla zabarwienia komórki - najczęściej stosuje się fuksynę z dodatkiem fuksyny karbolowej, dla zabarwienia tła - nigrozynę lub kolargol. 13

Zadania do wykonania Zadanie 1 Mikroskopowanie pod immersją i ocena preparatów Otrzymujesz gotowy preparat wykonany z hodowli Bacillus subtilis i zabarwiony metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. - Narysuj obraz preparatu widzianego w mikroskopie. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy obserwowany przez ciebie drobnoustrój należy do bakterii gramdodatnich czy gramujemnych? Powiększenie: To bakterie gram... 14

Zadanie 2 Przygotowanie i barwienie preparatów Otrzymujesz hodowlę stałą Pseudomonas aeruginosa lub Staphylococcus aureus w płytce Petriego. Bakterie posiane zostały w sposób pasmowy. - Wykonaj preparat z hodowli jednego z drobnoustrojów i zabarw go metodą Grama. - Nastaw i obejrzyj go pod mikroskopem wykorzystując obiektyw immersyjny. Narysuj obraz mikroskopowy. - Określ powiększenie oglądanego preparatu, kształt i sposób układania się komórek bakteryjnych. - Czy badany przez ciebie drobnoustrój okazał się bakterią gramdodatnią czy gramujemną? Powiększenie: To bakterie gram... 15

Efekty uzyskiwane na poszczególnych etapach barwienia metodą Grama Wypełnienie poniższej tabeli pozwoli ci zapamiętać sposób reagowania bakterii na odczynniki wykorzystywane w metodzie Grama. Napisz, jaką barwę przyjmują komórki lub jakie zachodzą reakcje. Używane odczynniki Bakterie gramdodatnie Bakterie gramujemne Fenolowy roztwór fioletu krystalicznego (Gencjana) Roztwór jodu w jodku potasu (płyn Lugola) Alkohol etylowy Alkoholowo-wodny roztwór fuksyny zasadowej (Fuksyna 1:10) 16

17

18

Rozdział 2 Pożywki, morfologia wzrostu bakterii na podłożach Cześć teoretyczna Czynniki warunkujące wzrost bakterii na podłożach Bakterie mogą się rozwijać tylko w takich środowiskach, które zaspokajają ich wymagania pokarmowe. Pobrane składniki są źródłem substancji budulcowych komórki oraz energii potrzebnej dla rozmnażania i wzrostu. Do elementów pokarmowych, bez których wzrost nie jest możliwy należą: węgiel (C), azot (N), fosfor (P), siarka (S), tlen (O), wodór (H). Pierwiastki te wchodzą w skład większości związków organicznych tworzących komórkę i określane są jako pierwiastki budulcowe lub biogenne. Pewne grupy bakterii nie są zdolne do wzrostu, jeśli nie dostarczymy im gotowych związków, które nazywamy czynnikami wzrostowymi. Należą do nich witaminy szczególnie z grupy B, zasady purynowe i pirymidynowe, a także niekiedy cholesterol, hem, hemina, NAD, NADP i nienasycone kwasy tłuszczowe. Bakterie do wzrostu wymagają znacznych ilości wody. W wodzie rozpuszczone są związki odżywcze dla bakterii. Woda jest także środowiskiem, w którym zachodzą procesy metaboliczne, a także jest istotnym źródłem wodoru i tlenu. Większość bakterii nie wzrasta, jeśli zawartość wody w środowisku jest niższa niż 20%. Zawartość wody w podłożach hodowlanych wynosi 50-90%. Wzrost bakterii zależny jest także od obecności soli mineralnych. Jony Mg 2+, Fe 2+, Ca 2+, Mn 2+, Zn 2+ są aktywatorami niektórych reakcji enzymatycznych lub grupami prostetycznymi enzymów. Sole mineralne są również czynnikami regulującymi ciśnienie osmotyczne komórki. 19

Podłoża do hodowli bakterii Pożywki (podłoża) bakteriologiczne służą do hodowli bakterii w warunkach laboratoryjnych. Odpowiednie dobranie składu podłoża pozwala na przeniesienie bakterii z ich naturalnych środowisk (organizm człowieka, gleba, woda) i namnożenie. Bakterie hodujemy na stałych lub w płynnych pożywkach, które umieszczone zostały w naczyniach hodowlanych (płytki Petriego, kolby Erlenmayera, probówki). Wzrost i rozwój bakterii na pożywkach pozwala na ich wyodrębnienie i zbadanie ich cech morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych i serologicznych. Większość bakterii rośnie na sztucznych podłożach. Nie ma jednak uniwersalnej pożywki umożliwiającej wzrost wszystkim bakteriom. Pożywki stosowane do namnażania bakterii powinny: zawierać odpowiednie składniki pokarmowe, mieć odpowiednią wilgotność, mieć odpowiednie ph, mieć odpowiednie ciśnienie osmotyczne, być jałowe. Biorąc pod uwagę ich skład chemiczny, podłoża bakteriologiczne dzielimy na syntetyczne (ściśle zdefiniowane chemiczne) i złożone (kompleksowe). Skład pożywek syntetycznych jest dokładnie zdefiniowany i oparty na syntetycznych związkach organicznych i nieorganicznych. Jest więc zawsze możliwy do dokładnego odtworzenia. Pożywki te znajdują niekiedy zastosowanie w laboratoriach badawczych. Pożywki złożone to podłoża zawierają dodatkowo surowce pochodzenia naturalnego, których skład nie jest dokładnie określony. Są to ekstrakty mięsne, hydrolizaty kwaśne i enzymatyczne białek i inne składniki. Podłoża złożone mają szerokie zastosowanie w laboratoriach diagnostycznych i naukowych. Pożywki dzielimy na proste (podstawowe), stosowane do hodowli drobnoustrojów o małych wymaganiach pokarmowych i wzbogacone, które służą do hodowli drobnoustrojów o dużych wymaganiach odżywczych. 20

Podstawową pożywką płynną jest bulion odżywczy, a stałą agar odżywczy. Bulion odżywczy zawiera wyciąg mięsny, pepton i NaCl. Poprzez dodanie do bulionu odżywczego agaru w stężeniu 1,5-2% otrzymujemy podłoże stałe. Agar to wielocukier otrzymywany z glonów morskich. Silnie chłonie wodę, upłynnia się w temperaturze 100 C, a zestala w temperaturze 45-48 C. W temperaturze 37 C, a więc optymalnej dla wzrostu większości bakterii ma konsystencję stałą. Służy on do zestalenia pożywki. Nie jest wykorzystywany przez bakterie jako składnik odżywczy. Agar odżywczy przygotowywany jest w postaci skosów agarowych, słupków lub płytek agarowych. Podłoża wzbogacone to najczęściej podłoża podstawowe zawierające dodatkowe składniki odżywcze. Elementami wzbogacającymi mogą być: węglowodany (np. glukoza), białka zwierzęce (surowica lub krew), hydrolizaty białek (np. kazeiny). Powszechnie wykorzystywanym w badaniach mikrobiologicznych podłożem wzbogaconym jest agar z krwią. Zawiera on 5-10% odwłóknionej jałowej krwi (najczęściej baraniej), zmieszanej z roztopionym agarem odżywczym. Po wylaniu na płytkę Petriego otrzymujemy tak zwaną płytkę krwawą. Innym, często wykorzystywanym podłożem wzbogaconym jest agar czekoladowy. Zawiera on agar odżywczy i zdenaturowaną termicznie krew. Po zestaleniu podłoża ma ono barwę czekoladową, stąd jego nazwa. Pożywki mogą zawierać dodatkowe składniki, które wpływają na rozwój hodowanych na nich bakterii. Ze względu na wynikające z ich składu zastosowanie, podłoża możemy podzielić na: namnażające lub namnażająco-wybiórcze, wybiórcze (selektywne), diagnostyczne (różnicujące), transportowe. Pożywki namnażające lub namnażająco-wybiórcze są to najczęściej podłoża płynne, wykorzystywane do namnażania bakterii występujących w niewielkiej ilości w badanej próbce, często jako pojedyncze komórki, w licznej populacji bakterii towarzyszących. Skład pożywki i warunki hodowli umożliwiają namnożenie się tylko bakterii poszukiwanych. 21

Pożywki wybiórcze (selektywne) oprócz składników odżywczych zawierają składniki wybiórcze, które powodują całkowite zahamowanie wzrostu pewnych gatunków bakterii lub znaczne ograniczenie ich wzrostu. Czynnikiem decydującymi o wybiórczości podłoża może być azydek sodu, sole kwasów żółciowych niektóre barwniki i antybiotyki. Są to najczęściej podłoża stałe. Przykładem podłoża wybiórczego może być podłoże Loewensteina-Jensena do hodowli prątków gruźlicy. Pożywki różnicujące (diagnostyczne) pozwalają na zmierzające do identyfikacji, różnicowanie bakterii. Zawierają one substrat diagnostyczny, który może być rozłożony enzymatycznie tylko przez określone gatunki bakterii. Do podłoża często dodawany jest wskaźniki, który, na przykład zmienia swoje zabarwienie w zależności od ph pożywki. Dlatego właśnie rozkład substratu manifestuje się zmianą zabarwienia pożywki (podłoża stałe lub podłoża płynne) lub odpowiednim zabarwieniem wyrosłych kolonii (podłoża stałe). Stałe podłoża różnicujące mogą być jednocześnie podłożami wybiórczym dla określonej grupy bakterii i są nazywane wybiórczo-różnicującymi. Przykładem takiej pożywki może być podłoże SS (Salmonella-Shigella) służące do izolacji pałeczek z rodzajów Salmonella i Shigella oraz podłoże Chapmana służące do izolacji gronkowców. Pożywki transportowe nie zawierają składników pokarmowych. Zawierają składniki optymalne dla przeżycia bakterii, w tym roztwory buforowe i sole mineralne. Zadaniem tych pożywek jest utrzymanie żywotności bakterii w próbce, zanim trafi ona do laboratorium mikrobiologicznego. Na rynku dostępne są podłoża o wystandaryzowanym składzie, jałowe i gotowe do użycia, w jednorazowych naczyniach, o określonej dacie przydatności. Zastosowanie gotowych podłoży znacznie skraca czas przygotowań do badań mikrobiologicznych. Można też je przygotowywać samodzielnie korzystając z pożywek w proszku o wystandaryzowanym składzie i innych chemicznych składników. Własnoręczne komponowanie pożywek wymaga zastosowania procedur i kontroli zapewniających powtarzalność ich składu pozwalającą na porównywanie wyników hodowli otrzymywanych w różnym czasie i w różnych laboratoriach. Bezpośrednio po przygotowaniu, takie pożywki należy wyjałowić, stanowią bowiem podłoże wzrostu także dla drobnoustrojów licznie obecnych w użytych 22

składnikach i otoczeniu. Sterylizacji tej dokonuje się najczęściej w autoklawie lub w aparacie Kocha. Czas generacji bakterii, optymalny czas hodowli W podłożu zawierającym niezbędne do wzrostu składniki, bakterie podwajają swoją masę i replikują swój materiał genetyczny, co w konsekwencji prowadzi do ich podziału. Wzrost populacji bakterii odbywa się zgodnie z postępem geometrycznym (2 0,2 1,2 2, 2 3 2 n ). Czas generacji (okres międzypodziałowy) jest to czas potrzebny do podwojenia liczby komórek w populacji. Szybkość wzrostu bakterii jest cechą charakterystyczną rodzaju (gatunku). Zależy ona także od rodzaju podłoża wzrostowego oraz warunków środowiskowych. W optymalnych warunkach wzrostu w laboratorium okres międzypodziałowy większości bakterii wynosi od 20 do 40 minut, ale może też być znacznie dłuższy - od kilku do kilkunastu godzin. Stąd, czas potrzebny na wyhodowanie bakterii na pożywce tak, aby ich wzrost był widoczny gołym okiem jest różny, ale dla większości bakterii chorobotwórczych wynosi 18-24 godziny. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli płynnej Bakterie na podłożach płynnych można namnażać w warunkach hodowli okresowej (zwykłej) lub ciągłej. W hodowli okresowej bakterie namnażają się w systemie zamkniętym (probówki, kolbki, butelki, bioreaktory) do momentu wyczerpania substancji odżywczych zawartych w pożywce lub nagromadzenia w niej dużej ilości toksycznych dla bakterii produktów ich metabolizmu. W hodowli ciągłej, którą prowadzi się w bioreaktorach, wzrost bakterii można utrzymywać nieskończenie długo. Możliwe jest to dzięki ciągłemu dostarczaniu do bioreaktora świeżej pożywki z jednoczesnym odprowadzeniem takiej samej objętości pożywki zawierającej wyrosłe bakterie i produkty ich metabolizmu. Objętość płynu hodowlanego w trakcie prowadzenia hodowli utrzymuje się na stałym poziomie. 23

Wzrost bakterii w hodowli okresowej można przedstawić graficznie pod postacią krzywej, którą nazywamy krzywą wzrostu hodowli bakteryjnej. Jest to krzywa w układzie półlogarytmicznym. Opisuje ona zależność logarytmu dziesiętnego liczby żywych komórek bakterii od czasu hodowli i ilustruje wzrost populacji (rycina 1). Obraz krzywej wzrostu dla większości bakterii jest bardzo podobny i można w nim wyróżnić sześć faz. Czas trwania poszczególnych faz wzrostu jest zależny od rodzaju bakterii i warunków hodowli. Poszczególne fazy wzrostu różnią się częstością podziałów komórek i szybkością ich wymierania. Faza pierwsza, nazywana jest fazą zastoju. Bakterie przystosowuj swój metabolizm do nowego środowiska. Wzrasta ilość rybosomów i zawartość RNA. Pojedyncze komórki powiększają swój wymiar i przygotowują się do podziału. Faza druga - przyspieszonego wzrostu. Komórki wykazują intensywny metabolizm. Rozpoczynają się podziały komórkowe. Faza trzecia, nazywana fazą wzrostu wykładniczego (logarytmicznego), jest okresem rzeczywistego rozwoju hodowli. Metabolizm komórek jest bardzo intensywny. Liczba żywych komórek przyrasta w postępie geometrycznym. W populacji prawie wszystkie komórki są żywe. W tej fazie wzrostu bakterie są najbardziej wrażliwe na działanie fizycznych i chemicznych czynników środowiskowych. Faza czwarta jest fazą zwolnionego wzrostu. Rozmiar komórek maleje. Zmniejsza się ilość rybosomów i zawartość RNA. Zwiększa się liczba komórek martwych. Częstość podziałów maleje. Faza piąta, nazywana fazą stacjonarną (równowagi), charakteryzuje się stałą liczbą żywych komórek w hodowli. Z powodu braku substancji pokarmowych komórki zużywają własne materiały zapasowe. Sporadyczne podziały komórkowe rekompensują ubytki komórek spowodowane ich wymieraniem. Faza szósta zamierania. Wzrasta liczba martwych komórek. Zaczynają się procesy autolizy, czyli samorozpuszczania się bakterii pod wpływem własnych enzymów. Zmniejsza się liczba żywych komórek i ogólna biomasa hodowli. Brak podziałów komórkowych. 24

lg liczby żywych komórek 4 5 5 6 3 1 2 czas hodowli Rycina 1. Krzywa wzrostu bakterii w hodowli okresowej: 1- faza zastoju, 2 faza przyspieszonego wzrostu, 3 faza wzrostu logarytmicznego, 4 faza zwolnionego wzrostu, 5 faza stacjonarna, 6 faza zamierania Wzrost bakterii na podłożach płynnych i stałych Wygląd wzrostu na podłożach może stanowić ważne kryterium przy identyfikacji bakterii. Na podłożach płynnych bakterie wyrastają w postaci jednolitego zmętnienia, osadu na dnie naczynia, kożuszka lub błonki na powierzchni płynu. Czasami zmętnieniu towarzyszy delikatny osad lub zagęszczenie przy powierzchni, a na granicy faz (pożywka-powietrze) tworzy się przylegająca do ścianek naczynia warstwa biofilmu. Na podłożach stałych możemy oceniać wygląd kolonii bakteryjnych. Istotna może być też ocena obfitości wzrostu lub obserwacja zdolności bakterii do wzrostu mgławicowego. Kolonię bakteryjną definiujemy jako widoczne makroskopowo na powierzchni lub w głębi stałej pożywki skupisko bakterii wyrosłe z jednej jednostki wzrostowej (jtk jednostka tworząca kolonie; CFU ang. colony forming unit). Przez jednostkę wzrostową rozumiemy jedną lub kilka 25

komórek bakteryjnych, które nie rozdzieliły się po podziale (układ popodziałowy), a także przetrwalnik. Umiejętność oceny morfologii kolonii jest bardzo ważna, gdyż w przypadku niektórych bakterii może w istotny sposób ważyć na ich identyfikacji, jest też istotna przy określaniu czystości hodowli. W określonych warunkach środowiska kolonie charakteryzują się stałymi cechami. Metody Opis kolonii Dla celów diagnostycznych opisuje się kolonie wyrosłe na podłożach, które nie powodują ich nienaturalnego zabarwienia w wyniku oddziaływania zawartych w nich wskaźników czy barwników. Niekiedy jednak istotny także bywa opis ich wyglądu na podłożach diagnostycznych. Należy opisywać kolonie oddalone od pozostałych tak, aby ich wzrost nie był ograniczony przez zbyt liczne sąsiedztwo. W opisie kolonii należy wziąć pod uwagę następujące jej elementy: wielkość - średnica (mm); kształt - okrągła, owalna, nitkowata, rozgałęziona nieregularna,..; brzeg - równy, postrzępiony, falisty, ząbkowany,... ; powierzchnię - gładka, lśniąca, matowa, pomarszczona, grudkowata,... ; wzniesienie (profil kolonii) - płaska, wypukła, pępkowata, wrastająca w podłoże,... ; przejrzystość - przezroczysta, opalizująca, mętna,... ; barwę - biała, kremowa, szara, czerwona,... ; otoczenie kolonii - zabarwienie, zmiana cech podłoża. 26

Metody sterylizacji pożywek Jednym z podstawowych wymogów, jakie muszą spełniać podłoża bakteriologiczne, jest ich jałowość (sterylność). Sterylizacja to proces prowadzący do całkowitego zniszczenia form wegetatywnych i przetrwalników drobnoustrojów. Do sterylizacji pożywek najczęściej wykorzystuje się wysoką temperaturę gorąco wilgotne (para wodna). Proces sterylizacji prowadzi się w autoklawie w temperaturze 121 C przy nadciśnieniu 1 atm przez 30 minut, gdy składniki pożywki są względnie termostabilne lub metodą tyndalizacji w aparacie Kocha, gdy pożywka zawiera składniki termolabilne. Tyndalizacja polega na trzykrotnym 60- minutowym ogrzewaniu pożywki w temperaturze 100 C w odstępach 24 godzinnych. Szkło laboratoryjne, w którym umieszczamy pożywki wyjaławia się w suszarce wykorzystując działanie gorącego suchego powietrza. Czas sterylizacji zależy od zastosowanej temperatury. Najczęściej stosuje się temperaturę 160 C przez 2 godziny lub 180 C przez 30 minut. Szkło laboratoryjne można także jałowić w autoklawie. Metody kontroli urządzeń sterylizujących Niesterylność pożywek może wynikać z niewłaściwie przeprowadzonego procesu ich sterylizacji, wadliwie działających urządzeń sterylizujących lub być wynikiem późniejszego zakażenia w wyniku nieprzestrzegania zasad aseptyki w trakcie ich przechowywania lub wykonywania posiewów. Urządzenia sterylizujące muszą podlegać okresowej kontroli. Skuteczność procesu sterylizacji bada się za pomocą wskaźników fizycznych, chemicznych i biologicznych. Wskaźniki fizyczne - termometry, manometry, zegary, mierniki wilgotności, mierniki zawartości gazu i inne przyrządy wmontowane do urządzenia sterylizującego informują tylko o jego stanie technicznym. Mierzą punktowo dany parametr. Oprócz obserwacji wskazań tych przyrządów, coraz częściej stosuje się system rejestracji podstawowych parametrów fizycznych w postaci wydruków, wykresów lub raportów. Wskaźniki chemiczne zawierają substancje chemiczną, która trwale zmienia swoje zabarwienie, kiedy zostaną osiągnięte właściwe parametry 27

sterylizacji. Testy te mają postać rurek, pasków czy taśm. Wskaźniki chemiczne informują jedynie, czy w danym cyklu pracy zostały osiągnięte warunki sterylizacji, nie dają one gwarancji, że poddany sterylizacji materiał został wyjałowiony. W tak zwanych wskaźnikach jednoparametrowych zmiana barwy następuje pod wpływem osiągnięcia jednego z parametrów sterylizacji, najczęściej temperatury. Nie wykazują one jednak, jak długo ta temperatura utrzymywała. Chemiczne wskaźniki wieloparametrowe wykazują, że w trakcie sterylizacji zostały osiągnięte wartości wszystkich lub kilku (przynajmniej dwóch) parametrów sterylizacji. Informują one zatem o prawidłowości przebiegu procesu sterylizacji. Wskaźniki biologiczne - zawierają określoną liczbę żywych, zdolnych do przejścia w formy wegetatywne, wysoce opornych na działanie temperatury przetrwalników bakteryjnych. Wykorzystywane są przetrwalniki Geobacillus stearothermophilus lub Bacillus subtilis zawarte, odpowiednio, w zestawach testowych Sporal A (kontrola autoklawów) i Sporal S (kontrola suszarek). Wskaźniki te informują o fakcie zabicia przetrwalników. Wskaźniki biologiczne dają gwarancję jałowości - jeżeli użyte w teście przetrwalniki zostały zabite, oznacza to, iż zostały zabite wszystkie bardziej wrażliwe drobnoustroje zanieczyszczające sterylizowany materiał. Dla uzyskania pełnej informacji o urządzeniu niezbędne jest monitorowanie procesu sterylizacji za pomocą wszystkich trzech metod. Skuteczność urządzeń sterylizujących powinna być kontrolowana przy użyciu wskaźników fizycznych i chemicznych w czasie każdego procesu sterylizacji. Ponadto okresowo należy je kontrolować przy użyciu wskaźników biologicznych. 28

Zadania do wykonania Zadanie 1 Charakterystyka kolonii bakteryjnej - Obejrzyj płytkę z podłożem agarowym, na której wyrosły pojedyncze kolonie. Powstały one w wyniku rozmnożenia się komórek bakterii i przetrwalników, które opadły na podłoże (sedymentowały) z powietrza. - Wybierz jedną kolonię i opisz ją uwzględniając wszystkie jej cechy. 29

Zadanie 2 Kontrola skuteczności sterylizacji w suszarce za pomocą testu biologicznego Sporal S - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu S. - Sprawdź temperaturę suszarki (180 C) i umieść w niej torebkę w szklanym otwartym naczyniu. Zanotuj czas. - Po 30 minutach sterylizacji wyjmij Sporal S z suszarki. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą i jałowo (przy palniku) przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (37 C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch) czy też bulion jest klarowny. - Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia Zadanie 3 Kontrola skuteczności sterylizacji w autoklawie za pomocą testu biologicznego Sporal A - Wyjmij z opakowania foliowego torebkę papierową z krążkiem Sporalu A. - Włóż torebkę do probówki i umieść ją w autoklawie. Zamknij pokrywę i włącz urządzenie. 30

- Po zakończonym cyklu sterylizacji otwórz autoklaw i wyjmij z niego Sporal A. - Otwórz papierową torebkę, posługując się jałową pęsetą jałowo przenieś krążek do probówki zawierającej bulion z glukozą. - Po inkubacji (55 C, 7 dni) oceń, czy w probówce pojawił się wzrost (zmętnienie, kożuch) czy bulion jest klarowny. Zinterpretuj wynik wykonanego doświadczenia 31

32

Rozdział 3 Posiew bakterii na podłoża; otrzymywanie czystej hodowli Część teoretyczna Populację bakterii rosnącą na podłożu stałym lub płynnym nazywamy hodowlą. Hodowlę składającą się z różnych gatunków bakterii nazywamy hodowlą mieszaną. Czystą hodowlą nazywamy hodowlę bakterii jednego rodzaju. Szczep to populacja drobnoustrojów w obrębie gatunku wyróżniająca się określonymi cechami. Szczepy wyprowadzone z pojedynczej komórki nazywamy klonami. W większości przypadków, przy badaniu bakteriologicznym wody, żywności, wymazów pobranych od pacjentów, zanieczyszczonych leków, spodziewamy się w próbce więcej niż jednego rodzaju drobnoustrojów. Ocena drobnoustrojów występujących w badanym materiale, może nastąpić dopiero po ich wyodrębnieniu i uzyskaniu czystych hodowli. Do tego celu wykorzystuje się metodę posiewu redukcyjnego. Taki typ posiewu pozwala na ocenę morfologii wyrosłych kolonii. Zakłada się, choć jest to pewne uproszczenie, że każda z nich powstaje z jednej komórki bakterii lub jednej jednostki wzrostowej. A zatem, ile typów kolonii, tyle rodzajów bakterii w hodowli. Ponieważ morfologia kolonii różnych gatunków czy nawet rodzajów może być zbliżona, czasem pomocnym w odróżnieniu kolonii jest posiew redukcyjny na płytkę z podłożem diagnostycznym. Izolacja pojedynczej kolonii z takiego posiewu prowadzi zwykle do uzyskania hodowli czystej. Metody Posiew bakterii na podłoża Materiał zawierający bakterie posiewa się na podłoża stałe (skos agarowy, płytka agarowa) lub płynne (bulion) ezą, pipetą lub wacikiem. Posiewając ezą, należy ją wyjałowić wyżarzając w płomieniu palnika przed i po 33

wykonaniu posiewu. Używamy też wyjałowionych, odpowiednio opakowanych pipet szklanych, końcówek do pipet automatycznych lub wacików. W trakcie posiewania bakterii na podłoża płynne należy także pamiętać o opalaniu wylotu naczyń w płomieniu palnika po otwarciu i przed ich zamknięciem. Ma to zapobiec zakażeniu pożywki drobnoustrojami z zewnątrz i zapewnić bezpieczeństwo osobie pracującej. Każda próbka pobierana do posiewu z hodowli lub zawiesiny bakterii, którą zakażamy świeże podłoże stanowi inokulum. Posiew na podłoże płynne ezą polega na uwolnieniu z niej materiału stanowiącego inokulum do pożywki przez pocieranie o ścianki naczynia (probówki lub kolbki). Przy posiewaniu do naczyń zawierających większe objętości pożywki konieczne jest zachowanie odpowiednich proporcji między wielkością inokulum a objętością podłoża. Zwykle stosuje się zasadę, że inokulum stanowi 5% końcowej objętości pożywki. Posiewu możemy dokonywać pipetą wprowadzając np. 5 ml hodowli stanowiącej inokulum do 95 ml pożywki. Posiewu na podłoża stałe na płytkach Petriego dokonuje w różny sposób zależnie od celu takiego posiewu. Ważnym, często stosowanym przy izolacji bakterii sposobem, prowadzącym do otrzymania pojedynczych kolonii jest posiew redukcyjny. Posiew ten wykonujemy tak, aby w kolejnych sektorach na powierzchni płytki znajdowało się coraz mniej bakterii. Sposób wykonania takiego posiewu przedstawia rycina 1. W poszczególnych etapach raz naniesiony materiał zostaje rozprowadzany na kolejne sektory płytki. Każdorazowe opalanie ezy przed rozsianiem bakterii w kolejnych strefach powoduje redukcję ich liczby do takiej ilości, przy której w ostatniej strefie uzyskany zostanie wzrost w postaci pojedynczych kolonii. Czasem wykonuje się posiew redukcyjny z materiału z wacika. Oznacza to, że pierwsza jego strefa posiana jest wacikiem, którym np. pobrano materiał kliniczny wymaz, a następne już w klasyczny sposób ezą z zachowaniem zasady jej przepalania w trakcie posiewu. Można wykonać na płytce także posiew pasmowy lub punktowy, który pozwala umieścić na płytce wiele próbek, których cechy chcemy 34

porównywać. Polega on na naniesieniu na płytkę inokulum z ezy w postaci pasma różnej długości. Czasem istnieje potrzeba zasiania całej powierzchni płytki i uzyskania wzrostu w postaci jednolitej murawy. Takiego posiewu można dokonać wacikiem (tzw. wymazówką). Inokulum stanowi zwykle próbka pobrana z podłoża płynnego (nadmiar płynu z wacika należy w trakcie pobierania odcisnąć o ścianki naczynia), którą rozprowadza się równomiernie na powierzchni podłoża w płytce. Czasem zawiesina stanowiąca inokulum w tej metodzie posiewu jest w odpowiedni sposób standaryzowana. Inokulum o określonej objętości, zwykle 0,1 ml można także rozprowadzić głaszczką lub odpowiednio zagiętą ezą. A B C D Rycina 1. Posiew redukcyjny 35

Przy posiewie na podłoże stałe w postaci skosu agarowego w probówce należy wprowadzić ezę z inokulum do dna probówki i rozprowadzić na powierzchni skosu. Prowadzi się w tym celu ezę zygzakowatym ruchem od ścianki do ścianki próbówki, przesuwając ją ku wylotowi naczynia. W zależności od rodzaju posiewanego materiału i wykorzystywanego podłoża spotykamy się z następującymi możliwościami przesiewania bakterii. Na pożywkę płynną (pipeta, eza) Z pożywki płynnej Na skos agarowy (eza) Na płytkę agarową (eza, wacik, pipeta) Z pożywki stałej (płytka agarowa, skos agarowy) Na pożywkę płynną (eza) Na skos (eza) Na płytkę agarową (eza) 36

Otrzymywanie czystych hodowli Postępowanie zmierzające do otrzymania czystych hodowli z nieznanych próbek sprowadza się do następujących kroków. Badany materiał posiewa się redukcyjnie na odpowiednio dobrane podłoże. Po inkubacji (czasem wydłużonej nawet do 5 dni) w temperaturze optymalnej dla oczekiwanych drobnoustrojów ocenia się morfologię wyrosłych kolonii. Obecność różnic w ich wyglądzie wskazuje, że mamy do czynienia z hodowlą mieszaną. Izoluje się wtedy pojedyncze kolonie i posiewa się je redukcyjnie na oddzielne płytki. Otrzymana w wyniku takiego posiewu hodowla może być uznana za czystą, jeśli kolonie posiadają jednakową morfologię. Namnożona (na skosie, w pożywce płynnej lub w inny sposób) pojedyncza kolonia z takiej płytki może być materiałem dla wykonywania prób i posiewów identyfikacyjnych, czy służących do określenia właściwości fizjologicznych, biochemicznych i antygenowych bakterii. Szybką, choć czasem zawodną metodą sprawdzenia czystości hodowli płynnej jest ocena morfologii komórek tworzących ją bakterii w preparatach barwionych metodą Grama. Zadania do wykonania Zadanie 1. Otrzymywanie czystej hodowli - Materiał z otrzymanej hodowli płynnej posiej redukcyjnie na płytkę agarową. - Podpisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). - Obejrzyj posiew zwracając szczególną uwagę na pojedyncze kolonie w trzeciej i czwartej strefie posiewu. - Opisz każdy z widocznych rodzajów kolonii. 37

- Wykonaj z każdej z nich preparat barwiony metodą Grama i uzupełnij opis kolonii o morfologię komórki. - Każdą z wybranych kolonii posiej redukcyjnie na nową płytkę. Opisz płytkę, inkubuj w cieplarce (37 C, 24 godziny). Kolonia: Preparat: Kolonia: Preparat: 38

Kolonia: Preparat: Jeśli na każdej z posianych płytek wyrosną kolonie tylko jednego rodzaju, o wyglądzie zgodnym z wcześniej wykonanym opisem, otrzymałeś czyste hodowle tych bakterii czyli hodowle jednego gatunku pochodzące z pojedynczej kolonii, a zatem czyste hodowle poszczególnych szczepów bakteryjnych. 39

40

Rozdział 4 Wymagania wzrostowe bakterii Część teoretyczna Wymagania pokarmowe Bakterie, podobnie jak inne organizmy żywe, potrzebują dostępu do odpowiednich składników odżywczych, umożliwiających im prawidłowy wzrost i rozmnażanie. Wymagania pokarmowe bakterii są bardzo różnorodne, od bakterii skrajnie wymagających, które mają najmniejsze zdolności biosyntetyczne i wymagają do wzrostu związków wielkocząsteczkowych, poprzez stanowiące największą grupę bakterie o wymaganiach pośrednich, do których zalicza się większość bakterii chorobotwórczych, aż do skrajnie niewymagających, które wykorzystują jako źródło węgla CO 2. Wymagania pokarmowe są w dużej mierze związane ze stopniem pasożytnictwa poszczególnych drobnoustrojów. Źródła węgla i azotu Węgiel jest podstawowym pierwiastkiem budulcowym organizmów żywych. W zależności od źródeł, z jakich bakterie mogą go pozyskiwać podzielono je na: autotrofy czerpiące węgiel tylko z CO 2 i przekształcające go do związków organicznych; heterotrofy czerpiące węgiel ze związków organicznych. Heterotrofy do prawidłowego wzrostu potrzebują w środowisku co najmniej jednego związku organicznego. Najwięcej drobnoustrojów ma zdolność do rozkładu glukozy, ale zdarzają się także bakterie mogące korzystać z mleczanu, bursztynianu, metanu, a także bardziej złożonych związków, jak lignina czy węglowodory aromatyczne. Heterotrofy zostały podzielone na: 41

- prototrofy drobnoustroje o małych wymaganiach pokarmowych, którym do wzrostu wystarczy jeden prosty związek organiczny i sole mineralne, co świadczy o ich dużych, gwarantujących szerokie rozprzestrzenienie, możliwościach enzymatycznych; - auksotrofy drobnoustroje o dużych wymaganiach odżywczych, rosnące jedynie w obecności co najmniej dwóch związków organicznych stanowiących źródło węgla i azotu, których nie są w stanie same syntetyzować, co w znacznym stopniu uzależnia je od środowiska. Zarówno prototrofizm, jak i auksotrofizm, mogą być wykorzystywane dla celów diagnostycznych, na przykład w identyfikacji pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, czy przy ustalaniu gatunku pałeczek z rodzaju Haemophilus. Bakterie auksotroficzne często wymagają do wzrostu specjalnych czynników wzrostowych, którymi mogą być aminokwasy, puryny i pirymidyny lub witaminy. Azot, który jest ważnym pierwiastkiem wchodzącym w skład białek i kwasów nukleinowych, prototrofy mogą pozyskiwać ze związków nieorganicznych (np. soli amonowych, azotanów i azotynów), a auksotrofy wykorzystują organiczne źródła azotu. Źródła energii oraz donatory elektronów Drobnoustroje mają zdolność wykorzystywania energii słonecznej lub energii chemicznej uwalnianej ze związków wysokoenergetycznych. Pozwala to wyróżnić wśród bakterii: fototrofy które korzystają z energii słonecznej (bakterie fotosyntetyzujące), chemotrofy korzystające z energii pochodzącej z rozkładu związków organicznych i nieorganicznych. W zależności od donatorów elektronów dzielimy bakterie na: litotrofy - korzystające z donatorów nieorganicznych, organotrofy - korzystające z donatorów organicznych. 42

Zatem, zależnie od wykorzystywanych przez bakterie źródeł energii i donatorów elektronów, możemy wyróżnić cztery typy pokarmowe: fotolitotrofy, fotoorganotrofy, chemolitotrofy i chemoorganotrofy. Bakterie stanowiące florę człowieka i te, które są dla niego chorobotwórcze, są chemoorganotrofami pozyskującymi węgiel ze związków organicznych. Wymagania tlenowe bakterii Bakterie różnią się pomiędzy sobą zapotrzebowaniem na tlen. Bezwzględnie tlenowe rosną tylko w jego obecności, bezwzględnie beztlenowe rosną przy jego braku, a względnie beztlenowe rosną zarówno przy dostępie jak i braku tlenu. Różnice te wynikają ze sposobu pozyskiwania energii przez bakterie w procesie oddychania. Oddychanie tlenowe jest możliwe tylko u organizmów, u których końcowym akceptorem przenoszonych przez łańcuch oddechowy elektronów jest tlen cząsteczkowy. W przypadku oddychania beztlenowego końcowym akceptorem elektronów w łańcuchu oddechowym są związki nieorganiczne: azotany, siarczany. Możliwe jest jeszcze pozyskiwanie energii w procesie fermentacji, gdzie akceptorem elektronów jest związek organiczny. Bakteriom bezwzględnie tlenowym tlen jest niezbędny do prawidłowego wzrostu i rozmnażania. W przypadku braku tlenu giną, gdyż przenoszenie elektronów łańcucha oddechowego zostaje zahamowane i nie jest magazynowana energia. Bakterie te mają enzymy, które chronią je przed toksycznym działaniem tlenu. Dysmutaza nadtlenkowa wiąże wolne rodniki z wodorem, w wyniku czego powstaje nadtlenek wodoru.jest on rozkładany przez dwa inne enzymy: katalazę i peroksydazę do wody i tlenu. Do bezwzględnie tlenowych, chorobotwórczych bakterii zaliczane są m.in. bakterie z rodzajów Mycobacterium, Bacillus, Nocardia. Bakterie względnie beztlenowe mogą rosnąć zarówno w obecności tlenu, jak i przy jego braku w środowisku o obniżonym potencjale oksydacyjnoredukcyjnym. Do tej grupy należy wiele bakterii, w tym też chorobotwórczych. Jeżeli tlen jest obecny w środowisku, mogą korzystać z energii pozyskiwanej w wyniku oddychania tlenowego. Przy braku tlenu mogą 43